Artykuł metodologiczny

Stosowanie pionowo ustawionych układów nanowłókien węglowych na sztywnych lub elastycznych podłożach do dostarczania biomolekuł i barwników do roślin

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65602

⸱

21 lipca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biophysical Sciences, The University of Chicago, 2Molecular Genetics and Cell Biology, The University of Chicago, 3Center for Nanophase Materials Sciences, Oak Ridge National Laboratory, 4Pritzker School of Molecular Engineering, The University of Chicago, 5Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory, 6Department of Chemistry, East Tennessee State University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metody mikrofabrykacji pionowo ustawionych nanowłókien węglowych (VACNF), przenoszenia VACNFów na elastyczne podłoża i stosowania VACNFów zarówno na sztywnych, jak i elastycznych podłożach do roślin w celu dostarczania biomolekuł i barwników.

Streszczenie

Dostarczanie biomolekuł i nieprzepuszczalnych barwników do nienaruszonych roślin jest dużym wyzwaniem. Nanomateriały to rozwijające się narzędzia do dostarczania DNA roślinom. Choć te nowe narzędzia są ekscytujące, nie zostały jeszcze powszechnie zastosowane. Nanomateriały wytwarzane na sztywnym podłożu (podłożu) są szczególnie trudne do skutecznego zastosowania w zakrzywionych strukturach roślin. Badanie to opisuje proces mikrowytwarzania pionowo ustawionych matryc z nanowłókien węglowych i przenoszenia ich ze sztywnego podłoża na elastyczne podłoże. Szczegółowo opisujemy i pokazujemy, w jaki sposób te włókna (zarówno na sztywnych, jak i elastycznych podłożach) mogą być wykorzystywane do przejściowej przemiany lub dostarczania barwnika (np. fluoresceiny) do roślin. Pokazujemy, w jaki sposób można przenieść VACNF ze sztywnego podłoża krzemowego na elastyczne podłoże epoksydowe SU-8 w celu utworzenia elastycznych układów VACNF. Aby przezwyciężyć hydrofobowy charakter SU-8, włókna w elastycznej folii pokryto cienką warstwą tlenku krzemu (2-3 nm). Aby użyć tych włókien do dostarczenia do zakrzywionych organów roślinnych, umieszczamy 1 μl kropli barwnika lub roztworu DNA po stronie włókien folii VACNF, czekamy 10 minut, umieszczamy folie na organie roślinnym i używamy wacika z ruchem tocznym, aby wprowadzić włókna do komórek roślinnych. Dzięki tej metodzie uzyskaliśmy dostarczanie barwnika i DNA do organów roślinnych o zakrzywionych powierzchniach.

Wprowadzenie

Transformacja roślin (zarówno przejściowa, jak i stabilna) nie stała się jeszcze powszechnie osiągalna we wszystkich tkankach i gatunkach roślin. Przejściowa transformacja roślin to proces, w którym geny kodowane w plazmidach są tymczasowo wprowadzane do roślin, ale nie są stabilnie włączane do genomu. Tradycyjne metody, które wykorzystują bombardowanie cząstkami, agrobakterie, elektroporację lub obróbkę protoplastów glikolem polietylenowym, są powolne lub mogą być kłopotliwe. Co więcej, nie mają one zastosowania do każdego gatunku roślin1,2,3,4. Wykorzystanie nanomateriałów do dostarczania DNA to rozwijająca się dziedzina, która wciąż jest w powijakach5. Nanomateriały, w szczególności nanowłókna węglowe, zostały również z powodzeniem wykorzystane do dostarczania białek, dektransu i barwników do liści roślin bez wywoływania reakcji na rany6. Celem tych prac jest opracowanie szczegółowego protokołu wykorzystania jednego rodzaju nanomateriału, nanowłókien węglowych, do dostarczania biomolekuł lub barwników roślinom. Tutaj skupiamy się na DNA jako biomolekułach z wyboru, która umożliwia przejściową transformację komórek w różnych organach roślinnych.

Poprzednio, Morgan et al.7 zademonstrowali użycie nanowłókien węglowych przymocowanych do sztywnego podłoża krzemowego do przejściowego przekształcania liści sałaty, N. benthamiana i topoli, a także liści i korzeni Arabidopsis. Chociaż transformacje zakończyły się sukcesem na różnych narządach, włókna były trudniejsze do zastosowania w tkankach roślinnych o zakrzywionych powierzchniach, takich jak korzenie czy owoce. Doszliśmy do wniosku, że elastyczny nośnik dla nanowłókien może poprawić ich wydajność dostarczania poprzez lepsze dopasowanie do kształtu narządu.

Tutaj szczegółowo opisujemy metody wykorzystywane do wytwarzania i projektowania pionowo ustawionych nanowłókien węglowych, przenoszenia VACNFów na elastyczne podłoża i stosowania VACNFów zarówno na sztywnych, jak i elastycznych podłożach dla roślin, aby dostarczyć biomolekuły i barwniki. Nanowłókna węglowe wyprodukowano metodą katalitycznego osadzania chemicznego z fazy gazowej wspomaganej plazmą prądu stałego (dc C-PECVD) z katalizatorem Ni. Położenie, średnica i wysokość kropek katalizatora Ni były kontrolowane za pomocą kombinacji litografii wiązką elektronów, parowania metalu i procesów lift-off, zgodnie z opisem Melechko et al.8,9. Korzystając z dwuwarstwowego rezystu wiązki elektronów, grubszy katalizator Ni może zostać osadzony na podłożu, aby uzyskać dłuższe włókna10. Przenoszenie włókien ze sztywnego podłoża na elastyczne opiera się na modyfikacji metod opisanych w Fletcher et al.11, przy czym obecne metody rezygnują z użycia amorficznej warstwy węgla lub protektorowej warstwy fotorezystu. Start SU-8 z transferem włókien uzyskuje się poprzez wykorzystanie wewnętrznego naprężenia rozciągającego wynikającego z niedopieczenia i niedoświetlenia SU-812,13,14. SU-8, złożony polimer, jest naturalnie hydrofobowy, co utrudnia jego wykorzystanie do ułatwiania dostarczania DNA. Aby przeciwdziałać hydrofobowej naturze SU-8, nakładamy cienką warstwę tlenku krzemu poprzez osadzanie warstwy atomowej15 po osadzeniu włókien w SU-8. Nakładanie włókien na sztywne podłoże w celu dostarczania biomolekuły/barwnika wykorzystuje siłę uderzenia pęsety opisaną w Davern et al.6 oraz metody on-plant i on-chip opisane w Morgan et al.7. Elastyczne folie VACNF są nakładane na zakrzywione powierzchnie roślin poprzez najpierw półsuszenie kropelek DNA lub barwnika na folii, tak jak w przypadku metody on-chip firmy Morgan et al.7, a następnie zwijanie folii na zakrzywionych powierzchniach roślin za pomocą małego aplikatora do makijażu16,17. Rysunek 1 przedstawia różne podejścia do stosowania włókien w sztywnych i elastycznych podłożach dla roślin.

Protokół

1. Produkcja VACNFs (Rysunek 2 i Rysunek 3)

  1. Przędzić płytkę krzemową polimetakrylanem metylu (PMMA) 495 A4 o temperaturze 4000 obr./min i piec w temperaturze 180 °C przez 5 min.
    UWAGA: Pozwól wafli ostygnąć przez 10 sekund przed przejściem do następnego kroku.
  2. Drugą warstwę materiału rezystancyjnego (PMMA 950 A2) pokryć warstwą rezystancji i piec w temperaturze 180 °C przez 5 minut.
  3. Litografia wiązką elektronów służy do definiowania kropek katalizatora o średnicy 300 nm w określonych odstępach bocznych (skok: 10 μm lub 35 μm) w układach 3 mm x 3 mm.
  4. Rozwinąć rezystant w 30-40 ml ketonu metylowo-izobutylowego w stosunku 1:3: alkohol izopropylowy (IPA) przez 1,5 minuty, a następnie przepłukać go IPA i wysuszyć N2,
    UWAGA: Sprawdź układ punktów za pomocą mikroskopu jasnego pola (obiektyw 20x).
  5. Oczyść płytkę z resztkowego oporu za pomocą 6-sekundowej ekspozycji w plazmie tlenowej (descum) w wytrawiaczu krzemowym.
  6. Za pomocą parowania wiązką elektronów należy najpierw nałożyć warstwę kleju z metalu (Ti lub Cr, 10 nm), a następnie nałożyć drugą warstwę, którą jest katalizator Ni (130 nm lub 150 nm). Podczas osadzania metalu Ti lub Ni należy utrzymywać prąd poniżej 0,2 A przy 10 kV, ciśnienie poniżej 5 x 10-6 Torr, a szybkość stapiania na poziomie ~1 A/s dla osadzania w linii wzroku.
  7. Użyj sekwencyjnej sonikacji w kąpieli, aby usunąć metal (Ni) osadzony na leżącej poniżej warstwie rezystancyjnej, pozostawiając Ni osadzony bezpośrednio na płytce krzemowej. Ten proces nazywa się lift-off.
    1. W tym celu należy przygotować 3 pojemniki z acetonem i zanurzyć płytkę w sonikacji w acetonie przez 1 minutę; powtórzyć 3 razy w temperaturze pokojowej (RT, 20 °C) z częstotliwością 35 kHz. Spłukać IPA i osuszyć N2,
      UWAGA: Nigdy nie pozwól, aby aceton wyschł na płytce. Po ostatniej sonikacji acetonu natychmiast spłukać IPA, a następnie osuszyć gazemN2. Jeśli w którymkolwiek momencie wafel stanie się przedwcześnie suchy (przed płukaniem IPA), istnieje możliwość, że nie cały nadmiar metalu i oporu zostanie usunięty, a aceton może pozostawić osad.
  8. Sprawdź geometrię kształtu katalizatora za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Aby przechwycić obrazy SEM chipów VACNF, przechyl stolik pod kątem 30° i użyj napięcia 1-3 kV, z prądem wiązki ~100 pA i odległością roboczą ~5 mm.
    UWAGA: Katalizator powinien wyglądać jak krążek hokejowy (kompaktowy cylinder) (Rysunek 4). Wysokość zwartego cylindra powinna odzwierciedlać grubość Ni osadzonego na płytce krzemowej. Jeśli profil kropki Ni jest wysoki i wydaje się być wklęsły u góry, przypominając wulkan (Rysunek 4), to jest bardziej prawdopodobne, że katalizator rozpadnie się na wiele kropelek Ni, co spowoduje rozgałęzienie się nanowłókien węglowych9(Rysunek 4 i Rysunek 5). Takie problemy mogą wynikać z odporności na topnienie podczas parowania metalu z powodu długiego czasu osadzania lub problemów z procedurą podnoszenia (Rysunek 4 i Rysunek 5).
  9. Poćwiartuj płytkę krzemową na ćwiartki i umieść ją w komorze do chemicznego osadzania z fazy gazowej wzmocnionej plazmą prądu stałego (dc-PECVD) z mieszaniną acetylenu i amoniaku. Zoptymalizuj parametry wzrostu, aby kontrolować długość i stożek nanowłókien (końcówki <200 nm).
    1. Użyj prądu 1-1,5 A i voltage zakres 440-560 V. Podczas uprawy włókien należy zastosować fazę obróbki wstępnej z przepływem amoniaku, podczas gdy maszyna i podłoże nagrzewają się do 620 °C. Upewnij się, że włączyłeś źródło węgla (acetylen) 10 s przed uruchomieniem plazmy.
      UWAGA: Ćwiartki wafli stosuje się w przypadku, gdy konieczna jest optymalizacja parametrów pracy maszyny PECVD. Do produkcji włókien o długości większej niż 40 μm i końcówkach o średnicy mniejszej niż 200 nm sugeruje się następujące parametry: przy grubości katalizatora Ni 130 nm należy użyć prądu 1,75 A, czasu wzrostu 70 min i stosunku acetylenu do amoniaku 45 standardowych centymetrów sześciennych na minutę (sccm) : 100 sccm. Przy grubości Ni 150 nm należy użyć prądu 1,5 A, czasu wzrostu 80 min i stosunku acetylenu do amoniaku 48 sccm : 100 sccm. Do hodowli VACNF należy użyć następujących parametrów, niezależnie od grubości katalizatora: temperatura wzrostu 620 °C, ciśnienie 10 torów podczas plazmy i wysokość głowicy prysznicowej 20 mm (Rysunek 6).
  10. Oceń geometrię powstałych włókien za pomocą SEM przy nachyleniu 30° z potencjałem przyspieszenia 1 kV.
    UWAGA: Optymalne włókna będą proste i nierozgałęzione. Niemożliwe jest kontrolowanie orientacji krystalicznej katalizatora Ni za pomocą parownika wiązki elektronów. W rezultacie niektóre włókna będą się rozgałęziać z powodu odwilżania katalizatora9. Ponadto orientacja kryształów powoduje, że VACNF rosną do różnych wysokości, więc jednolita wysokość na wszystkich VACNF jest trudna.
  11. Pokryj warstwę fotorezystu (SPR955) na włóknach z prędkością 1000 obr./min przez 45 s. Następnie pokrój 1/4 wafla w kostkę na tablice 3 mm x 3 mm za pomocą piły do krojenia w kostkę. W tym momencie przechowuj włókna do późniejszego wykorzystania.
    UWAGA: Nie wykonuj kroku 1.11, jeśli planujesz przenieść włókna na elastyczne podłoże.

2. Transfering VACNFs do elastycznego podłoża (Rysunek 7 i Rysunek 8)

  1. Po zsyntetyzowaniu włókien, spincoat SU-8 2015 fotorezystor na płytkach lub ćwiartkach płytek z prędkością 4000 obr./min przez 45 s.
  2. Piecz wafel na miękko przez 3 minuty w temperaturze 95 °C.
  3. Za pomocą wyrównywacza kontaktowego naświetl płytkę z maską o wzorze 3 mm i średnicy 3 mm, która jest zgodna ze zdefiniowanym wzorem z litografii wiązką elektronów przy 95 mJ/cm2,
    UWAGA: Użyj trybu kontaktu zbliżeniowego z odstępem ekspozycji o 20 μm większym niż w przypadku najwyższego włókna. Istnieje możliwość, że włókna mogą zostać przewrócone na tym etapie procesu.
  4. Piecz po ekspozycji przez 6 minut w temperaturze 95 °C.
  5. Rozwijaj wafel w wywoływaczu SU-8 przez 15 s, opłucz go IPA i wysusz wafel za pomocą N2, przesuwając się od góry do dołu.
    UWAGA: Podczas opracowywania wafla upewnij się, że jest on całkowicie zanurzony.
  6. Wafle wzorzyste Spincoat z ochronną warstwą cienkiego fotorezystu (SPR 955 CM 0,7) przy 3000 obr./min przez 45 s i softbake przez 30 s w temperaturze 90 °C.
  7. Umieścić cienką warstwę tlenku krzemu na płytce (2-3 nm), umieszczając ją w warstwie atomowej osadzanej przez 22 cykle w temperaturze 100 °C.
  8. Za pomocą piły do krojenia w kostkę pokrój wafel na kwadraty o wymiarach 3 mm x 3 mm. Dopasuj piłę do krojenia w kostkę do istniejącego wcześniej wzoru na płytce.
  9. Oceń geometrię powstałych włókien za pomocą SEM przy nachyleniu 30° z potencjałem przyspieszenia 3 kV.
  10. Zatrzymaj się tutaj, jeśli przechowujesz chipsy do długotrwałego użytku (>1 tydzień). Przechowuj chipsy w ciemności.
  11. Aby oddzielić podłoża elastyczne od sztywnych, należy umieścić pojedyncze wióry w acetonie na 30 minut lub do momentu, gdy SU-8 zacznie się zwijać.
  12. Folie SU-8 (dołączone lub oderwane od sztywnych podłoży) myć IPA przez 5 minut, a następnie wodą przez 5 minut. Podczas transportu umieść chipsy w komercyjnym pudełku z lepką podkładką.
  13. OPCJONALNIE: Umieść bezwłóknistą stronę folii SU-8 na taśmie rozpuszczalnej w wodzie lub na cienkiej gumie silikonowej z cienkim podłożem z politereftalanu etylenu (PET) (o grubości 12,5 μm).
    1. Użyj pęsety, aby przenieść folię SU-8. Naciśnij krawędzie kwadratu SU-8, aby pomóc mu przykleić się do taśmy/gumy silikonowej-PET; Ma to na celu uniknięcie zrywania włókien. W tym momencie folie VACNF są gotowe do natychmiastowego użycia.
    2. Aby przygotować uchwyt z gumy silikonowej/PET, wykonaj następujące czynności: używając 2-częściowego zestawu do gumy silikonowej, wymieszaj ze sobą dwie części (elastomer i środek sieciujący). Następnie wytnij kwadrat PET i przyklej go taśmą do przezroczystego plastikowego naczynia. Wylej bardzo cienką warstwę gumy silikonowej na wierzch PET i utwardź go w temperaturze 80 °C przez 1-2 godziny.

3. Metoda na roślinie (gdzie kropla roztworu do dostarczenia jest umieszczana na powierzchni rośliny) przy użyciu włókien w sztywnym podłożu (Rysunek 1A)

  1. Przed użyciem usunąć fotorezystor za pomocą stopniowego płukania acetonem (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) i ddH2O (5 min).
  2. Umieść tkankę roślinną, która ma zostać nabity, na twardej powierzchni, aby uzyskać podparcie.
  3. Umieść 1 μl kropli barwnika lub DNA (200 ng) na powierzchni tkanki roślinnej.
  4. Umieść chip VACNF ze sztywnym podłożem na wierzchu kropli, z włóknami zorientowanymi tak, aby miały kontakt z kroplą.
    UWAGA: Orientację wiórów można określić na podstawie "połysku" płytki. Błyszcząca strona chipa ma włókna, a nieprzezroczysta strona nie.
  5. Używając płaskiej strony pęsety, dotknij chipa. Zaznacz obszar rośliny, z którym zetknął się wiór, za pomocą markera z miękką końcówką. Wyjmij chipy VACNF po dostarczeniu.
    UWAGA: Siła przyłożona podczas stukania będzie się różnić w zależności od rodzaju użytej tkanki roślinnej. Zaleca się przećwiczenie stukania wiórów przed przystąpieniem do nabijania włókien. Unikaj uszkodzeń tkanek roślinnych. Uszkodzenie jest widoczne, gdy można zobaczyć zarys chipa VACNF w tkance roślinnej.
  6. Powtórz kroki 3.1-3.5 dla kontroli (+Barwnik/DNA, -Włókna; -Barwnik/DNA, +Włókna; i -Barwnik/DNA, -Włókna). -Włókna to bezwłóknowa strona chipa.
  7. W razie potrzeby przechowuj nienaruszone rośliny lub wycięte organy roślinne w wilgotnych komorach w warunkach długiego dnia (16 godzin światła, 8 godzin ciemności). Do wycinania narządów należy używać plastikowej szalki Petriego z mokrymi ręcznikami papierowymi.

4. Metoda on-chip (gdzie kropla roztworu do dostarczenia jest umieszczana na chipie VACNF), sztywne podłoże (Rysunek 1B)

  1. Przed użyciem usunąć fotorezystor za pomocą stopniowego płukania acetonem (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) i ddH2O (5 min).
  2. Upuść 1 μl kropli barwnika lub plazmidowego DNA (200 ng) na stronę włókna chipa VACNF ze sztywnym podłożem. Upewnij się, że umieściłeś kroplę na środku chipa i przykryj kilka włókien. Pozostaw kroplę do wyschnięcia na 15 min.
    UWAGA: Orientację wiórów można określić na podstawie "połysku" płytki. Błyszcząca strona chipa ma włókna, a nieprzezroczysta strona nie.
  3. Podczas pracy z liśćmi lub innymi wyciętymi narządami umieść je na twardej powierzchni. Podczas pracy z nienaruszonymi roślinami umieść twardą powierzchnię pod organem, na który nakładane są VACNF.
  4. Po 15-minutowym etapie suszenia ustaw chip VACNF tak, aby strona włókna stykała się z tkanką roślinną. Dotknij chipa tylnym końcem pęsety.
    UWAGA: Siła przyłożona podczas stukania będzie się różnić w zależności od rodzaju użytej tkanki roślinnej. Zaleca się ćwiczenie stukania wiórów.
  5. Powtórzyć kroki 3.6-3.7 metody roślinnej.

5. Zastosowanie VACNFów w foliach SU-8 do tkanki roślinnej metodą on-chip (Rysunek 1C)

  1. Umieść 1 μl kropelki barwnika lub DNA (200 ng) po stronie włókien folii SU-8 i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut. Pamiętaj, aby umieścić kroplę na środku chipa.
    UWAGA: Czas schnięcia różni się w zależności od użytego podłoża.
  2. Za pomocą ostrej pęsety umieść folię VACNF na powierzchni rośliny.
    UWAGA: Im dłużej folie SU-8 są pozostawione w powietrzu, tym bardziej stają się kruche. Aby ograniczyć ryzyko utraty folii SU-8, należy upewnić się, że wszystkie rośliny/próbki i sprzęt znajdują się w pobliżu folii SU-8.
  3. Delikatnie natocz mały aplikator do makijażu po folii VACNF. Zaznacz obszary, w których umieszcza się elastyczne podłoża, markerem z miękką końcówką. Usuń elastyczne podłoża z powierzchni rośliny za pomocą taśmy.
    UWAGA: Siła przyłożona podczas zwijania aplikatora do makijażu będzie się różnić w zależności od użytych tkanek roślinnych. Przećwicz nakładanie folii VACNF przed przeprowadzeniem biomolekuły lub dostarczania barwnika. Widoczne uszkodzenia tkanek roślinnych są widoczne, gdy można zobaczyć kontury filmu VACNF w tkance roślinnej.
  4. Powtórzyć kroki 5.1-5.3 dla roślin kontrolnych i magazynowych, jak wspomniano w kroku 3.7 metody na roślinie.

6. Mikroskopia i analiza obrazu dla wszystkich metod dostarczania

  1. Zobrazuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu długości fal emisji i wzbudzenia odpowiednich dla dostarczonej sondy fluorescencyjnej/reportera.
    UWAGA: Czas potrzebny na przejściową przemianę różni się w zależności od gatunku rośliny i dostarczonego markera. Na przykład ekspresję markerów fluorescencyjnych wykryto po 48 godzinach u Arabidopsis w porównaniu z 96 godzinami u liści sałaty7.
  2. Podczas obrazowania spróbuj skupić się na regionie z oderwanymi włóknami. Włókna będą miały różne orientacje. Powodzenie dostawy nie zależy od pojawienia się zerwanych włókien.
    UWAGA: Włókna będą fluorescencyjne z najczęstszymi ustawieniami wzbudzenia/emisji ze względu na tworzenie się warstwy azotku krzemu wynikającej z powstania światłowodu w PECVD18.
  3. Uchwyć co najmniej 5 obrazów dla każdej próbki. Wynikowy sygnał będzie się różnił.
  4. Zmierz wartości fluorescencji jako całkowitą fluorescencję (gęstość zintegrowaną) w konfokalnych obszarach obrazu o wymiarach 20 μm x 20 μm7 za pomocą ImageJ19.

Wyniki

Wyraźną zaletą chipów VACNF na podłożach sztywnych lub elastycznych jest możliwość dostarczania biomolekuł lub barwników do konkretnych miejsc w roślinie (Rycina 1). W tym przypadku do oceny dostarczenia wykorzystano odczyty fluorescencyjne. W zależności od zastosowania różnych roślin, podłoży i metod dostarczania (na chipie lub na roślinie), mogą wystąpić różnice w czasie pojawienia się fluoresceiny. Aby szybko określić, czy chipy/filmy VACNF nadają się do dostarczania substancji, można wykorzystać włókna do transportu barwnika (Rycina 9). Obrazy oznaczone różnymi przedziałami czasowymi na Rycynie 9 przedstawiają różne pola widzenia z tych samych próbek. Przy zastosowaniu metody na roślinie, barwnik fluoresceinę można zaobserwować natychmiast po dostarczeniu przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Ponadto, jeśli to samo pole widzenia jest obrazowane w czasie po dostarczeniu fluoresceiny do rośliny, intensywność sygnału z czasem maleje (Rycina 10). Fluoresceina może potencjalnie przemieszczać się z pola widzenia do innych obszarów liścia poprzez plazmodesmaty20,21. W porównaniu z metodą na roślinie, w metodzie na chipie z włóknami na sztywnym podłożu, barwnik przemieszcza się wolniej w obszarze nakłucia (Rycina 9). Może to być wynik odrywania się barwnika od włókien/rehydratacji w komórkach, co wydłuża czas jego przemieszczania się.

Włókna w elastycznym podłożu nadawały się do dostarczania barwnika do zakrzywionych powierzchni, takich jak truskawki i jabłka (Rysunek 11 oraz Rysunek 12). Przy zastosowaniu elastycznego podłoża u truskawek natychmiast zaobserwowano silny sygnał fluoresceiny (Rysunek 11), podczas gdy w przypadku jabłek uzyskanie silnego sygnału fluoresceiny zajęło 2 h (Rysunek 12B,D). Pomyślne dostarczenie plazmidów kodujących markery fluorescencyjne można określić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu wykrycia powstałego sygnału (Rysunek 12F, Rysunek 13 oraz Rysunek 14). Kontrole są niezbędne do ustalenia, czy wybrana roślina nie wykazuje autofluorescencji podobnej do markera fluorescencyjnego, który chcemy dostarczyć za pomocą włókien. Stosowanie samych włókien jest pomocne w określeniu, czy siła nacisku przykładana pęsetą powoduje uszkodzenie tkanki roślinnej lub czy obserwowana fluorescencja w próbce wynika z obecności VACNFs, które wykazują naturalną fluorescencję ze względu na warstwę azotku krzemu18 (Rysunek 13C-D). Włókna wprowadzone w tkankę roślinną nie indukują odpowiedzi na zranienie, co oceniano na podstawie produkcji H2O26. Wreszcie, zastosowanie kontroli +DNA, -Fibers jest konieczne, aby potwierdzić, że DNA nie przenika do rośliny przez samo wbijanie i potwierdzić, że włókna są niezbędne do dostarczenia materiału do komórek roślinnych (Rysunek 13E-F). Nie powinno być wyraźnej różnicy przy zastosowaniu metod dostarczania on-plant lub on-chip z użyciem VACNFs na sztywnym podłożu, co wskazuje brak istotnych różnic w wartościach fluorescencji (Rysunek 13I). Zastosowanie elastycznych filmów VACNF z dostarczaniem DNA on-chip doprowadziło do udanej przejściowej transformacji komórek epidermalnych w zakupionych w sklepie jabłkach i cebuli (Rysunek 12F oraz Rysunek 14).

W przypadku nieudanych eksperymentów włókna mogą zostać odłamane w różnych polach widzenia, jednak nie pojawi się sygnał fluorescencji będący wynikiem próby dostarczenia plazmidowego DNA lub barwnika. Jeśli do rośliny zostanie przyłożony zbyt duży nacisk, wystąpi widoczne uszkodzenie tkanki (Rysunek 15). To uszkodzenie mechaniczne, podczas obserwacji rośliny pod mikroskopem, może wyglądać jak małe otwory lub przeźroczyste obszary, sugerujące usunięcie warstwy komórek. Czasami widoczne mogą być odciski chipa. Eksperyment, w którym po dostarczeniu DNA nie wykryto ekspresji białka fluorescencyjnego, może być również wynikiem zastosowania DNA niskiej jakości, dlatego przydatne może być przygotowanie świeżego DNA.

figure-results-1
Rycina 1: Schemat dostarczania barwnika/DNA do tkanki roślinnej za pomocą włókien na podłożach sztywnych i elastycznych. (A) Dostarczanie barwnika/DNA za pośrednictwem włókien bezpośrednio na roślinie. Kropla 1 µL roztworu barwnika/DNA jest umieszczana na powierzchni liścia, a na niej kładzie się chip VACNF. Za pomocą pęsety chip jest delikatnie wbijany w tkankę. Sztywne podłoże zostaje usunięte, pozostawiając nanowłókna wewnątrz tkanki. (B) Dostarczanie DNA za pośrednictwem włókien na chipie. Kropla 1 µL roztworu barwnika lub DNA jest nanoszona na chip VACNF i suszona przez 15 min. Chip z częściowo wysuszonym DNA jest kładziony na powierzchni liścia i wbijany w tkankę, analogicznie jak w panelu A. (C) Dostarczanie DNA za pomocą folii SU-8 na chipie. Włókna są przenoszone z sztywnego podłoża krzemowego na elastyczną podstawę z SU-8. Kropla 1 µL roztworu barwnika/DNA jest nanoszona na folię VACNF i suszona przez 10 min. Folia VACNF z częściowo wysuszonym barwnikiem/DNA jest następnie nawijana na zakrzywioną powierzchnię rośliny za pomocą aplikatora do makijażu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat wytwarzania pionowo ustawionych macierzy nanowłókien węglowych. W celu otrzymania VACNF-ów na płytkę krzemową nanosi się metodą spin-coatingu podwójną warstwę polimetakrylanu metylu (PMMA 495 A4, a następnie PMMA 950 A2). Do zdefiniowania macierzy punktów o średnicy 300 nm wykorzystuje się litografię wiązką elektronów. Następnie rezyst wywołuje się w mieszaninie metyloizobutyloketonu i izopropanolu (MIBK/IPA), 1:3 przez 1,5 min. Za pomocą parowania metalu na płytkę nanosi się warstwę adhezyjną Ti (10 nm), a następnie warstwę Ni (130 nm lub 150 nm). Pozostały rezyst usuwa się metodą lift-off (sonikacja w kąpieli acetonowej). Geometrię punktów katalizatora sprawdza się za pomocą SEM. Jeśli katalizatory mają kształt przypominający krążki hokejowe i są płaskie, próbki umieszcza się w urządzeniu do chemicznego osadzania z fazy gazowej wspomaganego plazmą (PECVD) i hoduje włókna. Następnie włókna poddaje się analizie za pomocą SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Zdjęcia SEM idealnie pionowo wyrównanych nanowłókien węglowych. (A) Mikrofotografia elektronowa VACNF z rozstawem ~35 µm i wysokością 10-15 µm, wykonana pod kątem 30°. Ten obraz został powtórzony na Rysunku 7C. (B) Mikrofotografia elektronowa VANCF z rozstawem ~20 µm i wysokością 20-30 µm, wykonana pod kątem 30°. (C) Mikrofotografia elektronowa VANCF z rozstawem ~35 µm, wysokością 50-60 µm, wykonana pod kątem 30°. (D) Mikrofotografia elektronowa końcówki VACNF o średnicy <200 nm. Występują różnice w średnicach końcówek włókien (150-300 nm). Ponieważ obrazy włókien wykonano pod kątem 30°, wysokości wydają się być mniejsze od rzeczywistych o czynnik sin(30°)=1/2. Panele A i B zostały przedrukowane za zgodą Morgan i wsp.7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Obrazy SEM geometrii katalizatora przed wzrostem VACNFs. (A) Obraz SEM katalizatora po procesie lift-off. Zauważalna jest obecność fotorezystu wokół krawędzi katalizatora, co nadaje mu kształt wulkanu. (B,C) Obrazy SEM pokazują kształty wulkaniczne katalizatora po zastosowaniu pojedynczej warstwy resistu PMMA. (D) Pożądany kształt katalizatora przypominający krążek hokejowy, wykonany z podwójnych warstw PMMA. Ponieważ włókna na panelach A, B i D były obrazowane pod kątem 30°, wysokości wydają się być mniejsze od rzeczywistej wysokości o współczynnik sin(30°) = 1/2. Paski skali reprezentują 100 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5: Wpływ rozmiaru kropki katalizatora na wzrost włókien: Aby ustalić optymalną średnicę materiału katalitycznego, wyhodowano włókna z kropek o rozmiarach od 200 do 600 nm. Rozmiary kropek w zakresie 400-600 nm prowadziły do dewettingu katalizatora i wzrostu wielu włókien. Najlepszą geometrię włókien uzyskano przy średnicy 300 nm. Mniejsze kropki skutkowały niewystarczającą wysokością włókien. Ze względu na to, że obrazy włókien wykonano pod kątem 30°, wysokości wydają się być mniejsze od rzeczywistej wysokości o współczynnik sin(30°) = 1/2. Obrazy wykonano przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rycina 6: Schematyczny rysunek systemu chemicznego osadzania z fazy gazowej wspomaganego plazmą z prądem stałym (dc-PECVD) wykorzystanego w Oak Ridge National Laboratory (ORNL).Dostosowany system w ORNL posiada duży rozdzielacz gazu (showerhead), który służy jako reaktor dla gazów doprowadzanych i wyjście dla plazmy. Rozdzielacz utrzymywano pod potencjałem DC wynoszącym 300 V względem podgrzewanego podłoża dla próbki. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-7
Rycina 7: Schemat przeniesienia włókien z podłoża sztywnego na podłoże elastyczne. Po syntezie i inspekcji nanowłókien, na każdy wafer nakłada się metodą spin-coatingu SU-8 2015 przy 4000 rpm przez 45 s. Następnie wafer jest poddawany wstępnemu wypalaniu (soft-bake) przez 3 min w temperaturze 95 °C. Następnie wafer jest naświetlany światłem UV i wzorowany w urządzeniu do wyrównywania masek przy dawce 95 mJ/cm2. Po wypalaniu końcowym (post-bake) przez 6 min w 95 °C, wafer jest wywoływany w wywoływaczu do SU-8 przez 15 s, płukany IPA i suszony gazem N2. Na wafer nanosi się metodą spin-coatingu ochronną warstwę resistu SPR 955 CM 0.7 przy 3000 rpm, a następnie poddaje wstępnemu wypalaniu w 90 °C przez 30 s. Następnie na wafer nanosi się warstwę tlenku krzemu (2-3 nm) metodą osadzania warstw atomowych (ALD) (22 cykle w 100 °C), aby uczynić podłoże elastyczne hydrofilowym15. Wafer jest następnie cięty na kwadraty o wymiarach 3 mm x 3 mm za pomocą piły do dicingu. W momencie użycia poszczególne chipy umieszcza się w acetonie, aż SU-8 zacznie się zwijać i stanie się wklęsły (>30 min). W tym momencie warstwę SU-8 na większości chipów można chwycić za krawędź ostrymi pęsetami i oddzielić od podległego podłoża krzemowego jako nienaruszony film w kształcie kwadratu o boku 3 mm. Film jest następnie kolejno płukany w IPA i wodzie przez 5 min każdy i używany niezwłocznie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-8
Rysunek 8: Zdjęcia SEM transferu włókien z podłoża sztywnego na podłoże elastyczne. Przedstawione obrazy są reprezentatywne, lecz pochodzą z różnych próbek. (A) Długie włókna po wzroście metodą PECVD (ten sam obraz co na Rysunku 2C). (B,C) Włókna po aplikacji SU-8. Żywica epoksydowa wypływa wokół podstawy włókien. Eksponowana długość włókien wynosiła od 5 µm do 30 µm. (D) Włókna zatopione w Su-8 po procesie lift-off zachowały swoją geometrię. Ze względu na to, że włókna obrazowano pod kątem 30°, ich wysokości wydają się być mniejsze od rzeczywistej wysokości o czynnik sin(30°)=1/2. Panel A został przedrukowany za zgodą Morgan et al.7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rycina 9: Dostarczanie barwnika do liści Arabidopsis przy użyciu metod on-chip i on-plant z zastosowaniem włókien na sztywnych podłożach. (A-P) Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda on-chip (A-H): 1 µL barwnika fluoresceiny o stężeniu 10 µM wysuszano przez 15 min na chipach VACNF, a następnie chipy wbijano pęsetą w stronę abaksjalną liści Arabidopsis. (A-D) Liście obrazowane w ciągu 5-15 min po dostarczeniu. (E-H) Liście obrazowane 1 h po dostarczeniu. (A,E) +barwnik, +włókna. Kontrole: (B,F) -barwnik, -włókna; (C,G) -barwnik, +włókna; (D,H) +barwnik, -włókna. (I-P) Metoda on-plant: 1 µL barwnika fluoresceiny o stężeniu 10 µM naniesiono na powierzchnię rośliny, chipy ustawiono tak, aby stykały się z kroplą, a następnie za pomocą pęsety wbijano chip w stronę abaksjalną liści Arabidopsis. (I-L) obrazy z przedziału 5-15 min po dostarczeniu oraz (M-P) obrazy z 1 h po dostarczeniu. (I,M) +barwnik, +włókna. Kontrole: (J,N) -barwnik, -włókna; (K,O) -barwnik, +włókna; (L,P) +barwnik, -włókna. Panele A-P przedstawiają pojedyncze obrazy płaskie z serii z-stack. Paski skali wynoszą 20 µm. Włókna mają rozstaw 35 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-10
Rycina 10: Przebieg czasowy dostarczania barwnika do Arabidopsis metodą on-plant z zastosowaniem sztywnego podłoża. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stosując metodę on-plant, kroplę 1 µL roztworu barwnika fluoresceinowego (10 µM) umieszczono na powierzchni liścia, a na wierzchu kropli położono chip VACNF. Za pomocą pęsety chip delikatnie wciśnięto w tkankę. Obrazy obszaru +Dye i +Fibers pozyskiwano co 5 min. Paski skali wynoszą 20 µm. Włókna mają skok 35 µm. Panele przedstawiają pojedyncze obrazy płaskie z serii z-stack. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

figure-results-11
Rysunek 11: Dostarczanie barwnika do owoców truskawki przy użyciu folii VACNF. (A-H) Obrazy pozyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stosując metodę on-chip, krople barwnika wysuszono na foliach VACNF, które następnie naniesiono na powierzchnię owoców za pomocą aplikatora do makijażu. Barwnik fluoresceinowy (10 µM) dostarczono do komórek truskawki i obrazowano po (A) 10 min oraz (B) 1 h. (C,D) Kontrole bez zabiegu (-Barwnik, -Włókna). (E,F) Kontrole -Barwnik, +Włókna odpowiednio po 10 min i 1 h. (G,H) Kontrole +Barwnik, -Włókna odpowiednio po 10 min i 1 h. Paski skali wynoszą 40 µm. Panele A-H przedstawiają maksymalne projekcje stosów z-stack o grubości 188 µm. Włókna mają skok 35 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-12
Rycina 12: Dostarczanie barwnika i przejściowa transformacja jabłek za pomocą filmów VACNF. (A-F) Obrazy zostały wykonane przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Stosując metodę on-chip, krople 1 µL barwnika fluoresceiny (10 µM, B i D) lub 1 µL plazmidu kodującego pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) wysuszono na filmach VACNF, które następnie naniesiono na powierzchnię owoców za pomocą aplikatora do makijażu. Barwnik fluoresceiny został dostarczony do epidermy jabłka i zobrazowany po (B) 10 min oraz (D) 2 h. (D) Dyfuzja barwnika do komórek po dostarczeniu zajęła pewien czas. Dostarczanie i ekspresja DNA-YFP za pomocą filmów VACNF po (F) 48 h. (A,C,E) kontrole bez opracowania (-Barwnik/DNA-YFP, -Włókna). Paski skali wynoszą 40 µm. Panele A-D to pojedyncze obrazy płaskie z serii z-stack. Panele E i F to projekcje maksymalne serii z-stack o grubości 53 µm. Skok włókien wynosi 35 µm. Strzałki oznaczają sygnały fluoresceiny lub YFP. * oznacza włókna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-13
Rycina 13: Przejściowa transformacja liści Arabidopsis z wykorzystaniem metod VACNF on-plant lub on-chip. (A-H) Obrazy zarejestrowano przy użyciu mikroskopii konfokalnej 48 h po dostarczeniu DNA. (A,C,E,G) Metoda on-plant: 1 µL plazmidu kodującego pUBQ10:YFP (DNA−YFP) (200 ng) naniesiono na stronę abaksjalną liści Arabidopsis. Chipy rozmieszczono tak, aby stykały się z kroplą, a następnie za pomocą pęsety wciśnięto chip w tkankę liścia. (B,D,F,H) Metoda on-chip: 1 µL DNA−YFP (200 ng) suszono przez 15 min na chipach VACNF, a następnie chipy wciśnięto pęsetą w stronę abaksjalną liści Arabidopsis. +DNA-YFP, +Włókna dla (A) on-plant i (B) on-chip. Kontrole: (C,D) -DNA-YFP, +Włókna; (E,F) +DNA-YFP, -Włókna; oraz (G,H) -DNA, −Włókna. (I) Wykres względnej średniej intensywności sygnału fluorescencji z 25 obszarów o wymiarach 20 × 20 µm z obrazów 5 powtórzeń biologicznych połączonych z 2-3 eksperymentów z wykorzystaniem fluorescencji z kanału YFP. Obszary zawierające szparki (*) wykluczono ze względu na autofluorescencję. Od każdej średniej odjęto średnią intensywność fluorescencji dla warunków -DNA-YFP, -Włókna. Do testowania istotności użyto dwuczynnikowej analizy wariancji 2-way ANOVA (oraz testu Tukeya), a słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej. Różne litery wskazują istotne różnice między traktowaniami (P < 0.0001). Wszystkie przedstawione obrazy są maksymalnymi projekcjami stosów z oraz z głębokością 40 µm. Paski skali wynoszą 20 µm. Białe strzałki na obrazach wskazują włókna. Rozstaw włókien wynosi 35 µm. Rycina ta została przedrukowana za zgodą Morgan et al.7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-14
Rycina 14: Przejściowa transformacja cebuli z wykorzystaniem filmów VACNF. Obrazy pozyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej 48 h po dostarczeniu DNA. Stosując metodę on-chip, kropelki 1 µL plazmidowego DNA kodującego pUBQ10:YFP (DNA-YFP) (200 ng) suszono na filmach VACNF przez 10 min, które następnie przetoczono po powierzchniach organów roślinnych. (A) DNA-YFP zostało dostarczone do epidermy cebuli, w której wyeksprimowano YFP. (B) Kontrola bez traktowania; (C) kontrola (+DNA-YFP, -Włókna) oraz (D) kontrola (-DNA-YFP, +Włókna). Paski skali wynoszą 40 µm. Włókna mają skok 35 µm. Obrazy stanowią maksymalne projekcje stosów z o grubością 115 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-15
Rycina 15Uszkodzenia tkanek sałaty po zastosowaniu folii VACNF. (A-DObrazy zostały wykonane przy użyciu mikroskopii konfokalnej.AMetodę on-chip wykorzystano do dostarczenia DNA do liści sałaty za pomocą filmów VACNF. pUBQ10Krople DNA YFP (200 ng) suszono przez 10 min na foliach VACNF, które następnie nawinięto na stronę abaksjalną odciętych liści sałaty i przechowywano w komorze wilgotnościowej przez 4 dni.B) kontrolna (-DNA-YFP, +Włókna). (C) kontrolna (+DNA-YFP, -Włókna) oraz (D) bez traktowania (-DNA-YFP, -Włókna). Paski skali wynoszą 40 µmVACNF posiadają 35 µm pochylenie. Strzałki wskazują uszkodzenia roślin wynikające ze zbyt silnego rolowania elastycznego podłoża. Należy odnotować, że w innych eksperymentach udało się przeprowadzić skuteczne dostarczanie DNA do sałaty za pomocą metody VACNF7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-16
Rycina 16Schemat dostarczania za pośrednictwem VACNF w roślinach. W Etapie I należy sprawdzić geometrię włókien za pomocą SEM. Aby zapewnić prawidłowe dostarczanie, włókna muszą posiadać końcówkę o średnicy <200 nm. W przypadku stosowania włókien na podłożu elastycznym kolejnym krokiem byłoby potwierdzenie, że włókna zostały przeniesione na SU-8, oraz sprawdzenie wysokości odsłoniętych włókien za pomocą SEM. W etapie II przetestowano przydatność włókien, próbując wprowadzić barwnik do wybranego organizmu/organu roślinnego, wykorzystując podłoże sztywne lub elastyczne. Użycie 1 µL kroplę, kładąc ją na powierzchni rośliny lub krótko osuszając na chipie/folii. Na tym etapie, jak i we wszystkich pozostałych, niezbędne jest zastosowanie odpowiednich kontroli (-Barwnik, -Włókna; -Barwnik, +Włókna oraz +Barwnik, -Włókna), aby mieć pewność, że sygnał pochodzi z bona fide dostarczenie barwnika. W Etapie III potwierdzono obecność genu docelowego w plazmidzie, określono stężenie DNA do dostarczenia oraz przetestowano optymalny czas po dostarczeniu w celu sprawdzenia ekspresji. W Etapie IV wynik oceniono za pomocą mikroskopii konfokalnej, aby sprawdzić ekspresję dostarczonego markera. Rysunek został zmodyfikowany za zgodą Morgan i wsp.7. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

W tym artykule przedstawiliśmy metody konstruowania pionowo ustawionych układów nanowłókien węglowych, przenoszenia włókien na elastyczne podłoże i nakładania włókien na sztywnym lub elastycznym podłożu do roślin w celu wykorzystania w dostarczaniu biomolekuł lub barwników do roślin. Opisaliśmy dwa ogólne podejścia, metodę on-chip i metodę on-plant, do osadzania wprowadzonych materiałów i wykazaliśmy pomyślne wyniki we włóknach na sztywnym podłożu, a także w metodzie on-chip z wykorzystaniem folii VACNF. Zastosowanie tych włókien jest prostsze w praktyce i teorii niż tradycyjne metody transformacji roślin (bombardowanie cząstkami, transformacja protoplastów za pomocą PEG lub elektroporacji) i mogą być stosowane w przypadku roślin opornych na przemiany za pośrednictwem Agrobacterium. Jednak tylko kilka komórek ulega transformacji.

Pionowo ustawione nanowłókna węglowe zostały wyprodukowane w Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences za pomocą ich programu użytkownika. Użytkownicy mogą ubiegać się o korzystanie z tego obiektu do produkcji VACNF. Alternatywnie, chipy VACNF mogą być produkowane w pomieszczeniach czystych za pomocą maszyn do chemicznego osadzania z fazy gazowej wzmocnionej plazmą prądu stałego ze źródłem węgla22,23. Dzięki opisanym metodom istnieje kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla produkcji włókien, przenoszenia włókien i stosowania chipów/folii VACNF. Aby aplikacja włókien działała, włókna muszą być proste i mieć zwężającą się średnicę <200 nm na końcu, aby dostarczyć je do komórek roślinnych, aby były skuteczne 6,7 (rysunek 3). Aby stworzyć nanowłókna węglowe o określonym rozmiarze i skoku, istnieje wiele parametrów, które można zmienić, w tym rozmiar kropki, skok boczny i ilość osadzonego katalizatora. Aby wybrać optymalny rozmiar kropki, który zostanie użyty do produkcji nanowłókien węglowych, włókna wyhodowano z różnych rozmiarów kropek (jak pokazano na rysunku 5). Odkryliśmy, że średnice 300 nm wytwarzają najlepsze włókna, stąd wybrano ten rozmiar kropki (ryc. 5). Po znalezieniu odpowiednich parametrów postanowiliśmy użyć wiórów, które mają >50% włókien o idealnej geometrii (proste i średnica końcówki <200 nm). Aby sprawdzić geometrię włókien, użyliśmy skaningowej mikroskopii elektronowej do zobrazowania losowych pól widzenia na próbce chipów/filmów VACNF.

Dodatkowo włókna muszą mieć określoną minimalną długość, aby osiągnąć dostawę w komórkach roślinnych. Znaczenie wytwarzania włókien o różnej długości polega na tym, że dłuższe włókna mogą być używane do penetracji głębszych warstw tkanek. Dłuższe włókna (o długości >40 μm) są niezbędne w przypadku folii elastycznych, ponieważ przenoszenie włókien polega na oderwaniu włókien od ich podstawy i wymaga nałożenia warstw SU-8 na wierzch włókien. Grubość robocza warstwy SU-8 użytej w tym protokole wynosi 20-35 μm. Minimalna wysokość niezbędna do przeprowadzenia porodu w obrębie naskórka różnych roślin (zakrzywionych lub płaskich) wynosi 10-15 μm 6,7. W związku z tym włókna o długościach >40 μm są niezbędne do produkcji folii VACNF. Istnieje kilka różnych parametrów, które należy wziąć pod uwagę podczas produkcji nanowłókien węglowych: materiał katalizatora, geometria katalizatora, grubość materiału katalizatora, a także warunki w komorze PECVD (stosunek gazu, ciśnienie, temperatura, prąd, wysokość głowicy prysznicowej i czas wzrostu)8,9,24,25. Aby wytworzyć nanowłókna węglowe dłuższe niż 25 μm używane przez Morgana i wsp.7 oraz Daverna i wsp.6, zwiększyliśmy ilość katalizatora Ni, zmieniliśmy stosunek acetylenu do amoniaku oraz zwiększyliśmy prąd i czas wzrostu. Dodatkowo zwróciliśmy większą uwagę na geometrię materiału katalizatora. Aby wytworzyć wysokie, proste włókna, osadzony katalizator musiał mieć kształt krążka hokejowego, a nie kształt przypominający wulkan (ryc. 4). Struktury wulkaniczne powstają z resztek fotorezystu po starcie. Aby zapobiec powstawaniu wulkanów, podczas litografii wiązką elektronów użyto podwójnej warstwy PMMA do stworzenia podcięcia26. Podcięcie pomaga w unoszeniu się osadzonego katalizatora metalowego (rysunek 2). Gruba warstwa katalizatora jest ważna dla wzrostu wysokich VACNF. Morfologia VACNF została zbadana przez Merkulova i wsp.24. Pionowe ustawienie VACNF wynika zarówno ze wzrostu końcówki katalizatora Ni, jak i z wyrównania potencjału prądu stałego prostopadłego do podłoża (ilustracja 6). Głowica prysznicowa opisuje geometrię reaktora PECVD (rysunek 6) i służy jako źródło potencjału pola elektrycznego27.

Aby zdefiniować układ kropek katalizatora za pomocą litografii wiązką elektronów, zastosowaliśmy rezystancję wiązki elektronów (polimetakrylan metylu), a następnie użyliśmy wiązki elektronów do wykonania małych otworów w rezyście o określonym kształcie i w określonych miejscach na płytce. Otwory o żądanej średnicy umieszczano na regularnej siatce o zdefiniowanym rozstawie (skoku), a przed załadowaniem podłoża do maszyny do narzędzia do litografii wiązką elektronów ładowano plik określający pożądany wzór. Oprócz wysokości włókien, kolejnym krytycznym parametrem dla udanego transferu włókien jest ilość czasu spędzonego w kąpieli acetonowej. Folie VACNF należy pozostawić w kąpieli acetonowej na tyle długo, aby ich krawędzie zaczęły się zwijać; Jeśli zostaną pozostawione w kąpieli acetonowej zbyt krótko, trudniej będzie je oderwać od wiórów i mogą pęknąć. Im starsze są wióry, tym dłużej będą musiały pozostać w kąpieli acetonowej. Po kąpieli acetonowej folie/wióry umieszczono w izopropanolu i wodzie w celu usunięcia acetonu dostępowego, a także usunięcia ochronnego fotorezystu z włókien.

Aby wykonać powlekanie wirowe, wafle lub kawałki wafli umieszcza się na uchwycie próżniowym w powlekarce wirowej, a środkowe położenie płytki jest weryfikowane za pomocą funkcji testowej powlekarki wirowej. Mała kałuża (~ 2,5 cm średnicy) rezystu jest nakładana na środek wafla i przędzona (3000 obr./min przez 45 s) Obrazy włókien przed i po powlekaniu wirowania są zawarte na rysunku 8 pokazującym zachowanie geometrii włókien (wysokość, orientacja i skok). Obecność włókien powoduje pęcznienie oporu u podstawy włókien i skutkuje grubszymi niż oczekiwano warstwami. Powlekanie wirowe po wzroście VACNF było badane przez inne grupy11,18.

Kolejnym krokiem w procesie, który ma kluczowe znaczenie, jest zapewnienie, że do chipów/folii VACNF zostanie przyłożona odpowiednia siła. Mechanizm dostarczania jest zależny od włókien tworzących małe nakłucia w ścianach komórkowych za pomocą siły impulsu pęsety stukającej w sztywne podłoża 6,7 lub toczącej się mini-aplikatorem do makijażu na elastycznych podłożach. Włókna mogą, ale nie muszą, odrywać się i pozostawać osadzone w komórkach roślinnych 6,7 bez wpływu na wynik, ale praktyka w połączeniu z badaniem pod kątem wychwytu barwnika i uszkodzenia tkanek jest konieczna, aby uzyskać właściwe ciśnienie. Ponadto ważne jest, aby wybrać odpowiednie punkty czasowe obrazowania po dostarczeniu DNA za pomocą chipów/folii VACNF, ponieważ czas do wykrytej ekspresji różni się w zależności od gatunku rośliny i typów dostarczanych wektorów7 (Figura 16).

Choć metoda ta ma szerokie zastosowanie do roślin, ma kilka ograniczeń. Na przykład dodanie cienkiej warstwy tlenku krzemu do folii VACNF nie zawsze powoduje, że folie są całkowicie hydrofilowe ze względu na ochronną warstwę fotorezystu dodaną na wierzch SU-8. Jeśli ten problem się zmaterializuje, grubsze warstwy tlenku krzemu mogą zostać zastosowane do VACNF. Aby sprawdzić, czy folie są hydrofobowe czy hydrofilowe, można je umieścić w wodzie. Jeśli folie toną, są hydrofilowe, a jeśli unoszą się na wodzie, są hydrofobowe. Dodatkowo mogą występować różnice między partiami wyprodukowanych włókien. Istnieje kilka parametrów, które można zmienić podczas uprawy włókien w maszynie dc -PECVD; to, co jest opisane w tym protokole, to zestaw parametrów dla dwóch różnych ilości katalizatora Ni. Dodatkowo, orientacja krystaliczna katalizatora Ni nie może być kontrolowana28 i pewne rozgałęzienia nieuchronnie doprowadzą do powstania włókien.

Podczas gdy w tym artykule wykazaliśmy dostarczanie barwnika fluoresceiny i DNA do komórek roślinnych przy użyciu zarówno sztywnych, jak i elastycznych substratów, metoda ta powinna mieć szerokie zastosowanie w przypadku innych biomolekuł i podejść do modyfikacji genetycznej, na przykład wyciszania RNAi dla systemów roślinnych, takich jak jabłka lub inne owoce, gdzie wytworzenie stabilnych linii transgenicznych zajęłoby lata. Co więcej, włókna te mogą być również wykorzystywane do dostarczania materiałów do edycji genetycznej lub do stabilnych przemian w roślinach.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Matryce z nanowłókien zostały wyprodukowane w Centrum Nauk o Materiałach Nanofazowych, które jest Biurem Naukowym Departamentu Energii (ID propozycji: CNMS2019-103 i CNMS2022-A-1182). Wsparcie ze strony CNMS jest przyznawane za pośrednictwem systemu wzajemnie ocenianych wniosków i jest udzielane bezpłatnie wybranym wnioskodawcom, którzy zamierzają opublikować swoje wyniki (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Dziękujemy Kevinowi Lesterowi i CNMS za pomoc w produkcji matryc z nanowłókien. Dziękujemy dr Johnowi Caughmenowi, dr Timothy'emu McKnightowi, dr Amber Webb, Darylowi Briggsowi i Travisowi Bee za krytyczne dyskusje na temat projektowania eksperymentalnego. Dziękujemy dr Adamowi Rondinone za schemat maszyny PECVD. Dziękujemy Leslie Carol za ilustracje naukowe. Praca ta została sfinansowana przez Bioimaging Science Program, Departament Energii Stanów Zjednoczonych, Biuro Nauki, Badań Biologicznych i Środowiskowych, DE-SC0019104 oraz Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, 2021-67013-34835. JMM był wspierany przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych: National Institute of Food and Agriculture: Stypendium przeddoktoranckie Agriculture and Food Research Initiative 2021-67034-35167.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
13" x 13" Biały 1/4-krotny wytrzymały przemysłowy ręcznik sklepowy Brawny 70CtFastenal 
2-Propanol (IPA) Fischer ScientificA451-4
4" PokrywaEntegrisH22-401-0615Nośniki wafli
4" TacaEntegrisH22-40-0615Nośniki wafli Piła
do krojenia w kostkę Accretech SS10 AccreteckSS10
AcetonFischer ScientificA18-4
Aceton stosowany w pomieszczeniu czystym w ORNLJT Baker9005-05
JabłkaSklep spożywczyBrak numeru
Arabidopsis thaliana Nasiona akcesji Columbia z laboratorium profesora Jeana Greenberga na Uniwersytecie w ChicagoBrak numeru
Maszyna do chemicznego osadzania z fazy gazowej wzmocnionej plazmą węglowąOak Ridge National Laboratory Sałata
 Nasiona z laboratorium profesora Richarda Michelmore'a na Uniwersytecie Kalifornijskim w DavisBrak numeru produktuSałata maślana
Barwnik fluoresceinowySigma AldrichF2456-2.5G
Gel-box Żel-Pak  AD-23C-00-X4
Heidelberg DWL 66 narzędzie do litografii bezpośredniego zapisu HeidelbergDWL 66
ImageJNarodowe Instytuty Zdrowia Brak numeru
Izoproponal (IPA) stosowany w pomieszczeniach czystych w ORNLDoe and IngallsCMOS Grade 9079-05
JEOL 9300FS 100kV system litografii wiązką elektronówJEOL8100
KimwipesKimtechKimberly-Clark Professional 34120
Kord-Valmark jednorazowa polistyrenowa szalka PetriegoVWR11019-554
Edytor układu   juspertor GmbHBrak numeru produktu 
Mikroskop konfokalny LSM 710ZeissBrak numeru
Mikroskop konfokalny LSM 800ZeissBrak numeru
Aplikator do makijażu AmazonG2PLUS500 SZTUK Jednorazowe mikro aplikatory Pędzel do makijażu i higieny osobistej (średnica głowy: 1,5 mm) - 5 x 100 sztuk
Skaningowy mikroskop elektronowy z emisją pola MerlinZeissMerlin
MIBK/IPA  (keton metylowo-izobutylowy/izopropanol) (1:3)MicrochemM089025
CebulaSklep spożywczyBrak numeru
Oxford FlexAl Osadzanie warstw atomowychOxfordFlexAl
PMMA 495 A4MicrochemM130004
PMMA 950 A4MicrochemM230004Może rozcieńczać do A2
Politereftalan etylenu (PET)AmazonKS-6304-21-11Typ D Przezroczysty arkusz PET (poliester) .0005" Gruby x 27" Szerokość x 10 stóp Długość 1 szt
Precyzyjna pęsetaAven Inc. 18032TT
pUBQ10:YFP-GWArabidopsis Biological Resource CenterCD3-1948
Wytrawiacz krzemowy (używany do descum) OxfordPlasmalab
Zestaw gumy silikonowejSmooth-On IncEcoflex 00-20
Wafle silikonowePure Wafer4N0.001-.005SSP-INV
Powlekarka wirowaBrewer SciencesModel 100CB
SPR 955cm 0,7 Megaposit10018314
TruskawkiSklep spożywczyBrak numeru
SU-8 2015MicrochemSU-8 2000Series Toksyczny. Obchodź się ostrożnie. Podczas pracy z SU-8 2000 należy nosić okulary chemiczne, rękawice chemiczne i odpowiednią odzież ochronną. Nie dostać się do oczu, na skórę lub ubranie.
SU-8 developerMicrochemSU-8 2000 SeriesObchodzić się ostrożnie. Podczas pracy z SU-8 2000 należy nosić okulary chemiczne, rękawice chemiczne i odpowiednią odzież ochronną. Nie dostać się do oczu, na skórę lub ubranie.
Suss MicroTec aligner kontaktowySuss MicroTecMA6/BA6
Mikroskop stołowyPhenom XLsłuży do sprawdzania katalizatorów Ni po osadzaniu
Parownik e-beam Thermionics VE-240ThermionicsVE-240
690535produktuproduktu prądem stałym zielona Cobham na zamówienieproduktuproduktuproduktuproduktuproduktumetalu

Bibliografia

  1. Canto, T. Transient expression systems in plants: potentialities and constraints. Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).
  2. Gou, Y. J., et al. Optimization of the protoplast transient expression system for gene functional studies in strawberry (Fragaria vesca). Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 141, 41-53 (2020).
  3. Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 1-26 (2017).
  4. Ren, R., et al. Highly efficient protoplast isolation and transient expression system for functional characterization of flowering related genes in Cymbidium orchids. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2264(2020).
  5. Kumar, S., et al. Nanovehicles for plant modifications towards pest-and disease-resistance traits. Trends in Plant Science. 25 (2), 198-212 (2020).
  6. Davern, S. M., et al. Carbon nanofiber arrays: a novel tool for microdelivery of biomolecules to plants. PLoS One. 11 (4), e0153621(2016).
  7. Morgan, J. M., et al. An efficient and broadly applicable method for transient transformation of plants using vertically aligned carbon nanofiber arrays. Frontiers in Plant Science. 13, 1051340(2022).
  8. Melechko, A. V., et al. Vertically aligned carbon nanofibers and related structures: Controlled synthesis and directed assembly. Journal of Physics D: Applied Physics. 97, 041301(2005).
  9. Melechko, A. V., Desikan, R., McKnight, T. E., Klein, K. L., Rack, P. D. Synthesis of vertically aligned carbon nanofibres for interfacing with live systems. Journal of Physics D: Applied Physics. 42 (19), 193001(2009).
  10. Nelson-Fitzpatrick, N. Novel Materials for the Design of Cantilever Transducers [dissertation]. , University of Alberta, Edmonton, Alberta. (2011).
  11. Fletcher, B. L., et al. Transfer of flexible arrays of vertically aligned carbon nanofiber electrodes to temperature-sensitive substrates. Advanced Materials. 18 (13), 1689-1694 (2006).
  12. Keller, S., Blagoi, G., Lillemose, M., Haefliger, D., Boisen, A. Processing of thin SU-8 films. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (12), 125020(2008).
  13. Wouters, K., Puers, R. Diffusing and swelling in SU-8: insight in material properties and processing. Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (9), 095013(2010).
  14. Jamal, M., Zarafshar, A. M., Gracias, D. H. Differentially photo-crosslinked polymers enable self-assembling microfluidics. Nature Communications. 2, 527(2011).
  15. Williams, R., Goodman, A. M. Wetting of thin layers of SiO2 by water. Applied Physics Letters. 25 (10), 531-532 (1974).
  16. Kundu, A., Nogueira Campos, M. G., Santra, S., Rajaraman, S. Precision vascular delivery of agrochemicals with micromilled microneedles (µMMNs). Scientific Reports. 9, 14008(2019).
  17. Acanda, Y., Welker, S., Orbović, V., Levy, A. A simple and efficient agroinfiltration method for transient gene expression in Citrus. Plant Cell Reports. 40 (7), 1171-1179 (2021).
  18. Pearce, R., et al. Synthesis and properties of SiNx coatings as stable fluorescent markers on vertically aligned carbon nanofibers. AIMS Materials Science. 1 (2), 87-102 (2014).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. Crafts, A. S. Translocation in plants. Plant Physiology. 13 (4), 791(1938).
  21. Martens, H. J., Hansen, M., Schulz, A. Caged probes: a novel tool in studying symplasmic transport in plant tissues. Protoplasma. 223, 63-66 (2004).
  22. Liu, J., Essner, J., Li, J. Hybrid supercapacitor based on coaxially coated manganese oxide on vertically aligned carbon nanofiber arrays. Chemistry of Materials. 22 (17), 5022-5030 (2010).
  23. Saleem, A. M., et al. Low temperature and cost-effective growth of vertically aligned carbon nanofibers using spin-coated polymer-stabilized palladium nanocatalysts. Science and Technology of Advanced Materials. 16, 015007(2015).
  24. Merkulov, V. I., Lowndes, D. H., Wei, Y. Y., Eres, G., Voelkl, E. Patterned growth of individual and multiple vertically aligned carbon nanofibers. Applied Physics Letters. 76 (24), 3555-3557 (2000).
  25. Retterer, S. T., Melechko, A., Hensley, D. K., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. Positional control of catalyst nanoparticles for the synthesis of high density carbon nanofiber arrays. Carbon. 46 (11), 1378-1383 (2008).
  26. Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist. Journal of Vacuum Science & Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).
  27. Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer. Vacuum. 163, 37-44 (2019).
  28. Fowlkes, J. D., et al. Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis. Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dostarczanie biomolekułdostarczanie barwnikówpodłoża sztywnetransformacja roślintransformacja przejściowadostarczanie fluoresceinydostarczanie plazmidóworgany roślinne
Stosowanie pionowo ustawionych układów nanowłókien węglowych na sztywnych lub elastycznych podłożach do dostarczania biomolekuł i barwników do roślin
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.