Stosowanie pionowo ustawionych układów nanowłókien węglowych na sztywnych lub elastycznych podłożach do dostarczania biomolekuł i barwników do roślin

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metody mikrofabrykacji pionowo ustawionych nanowłókien węglowych (VACNF), przenoszenia VACNFów na elastyczne podłoża i stosowania VACNFów zarówno na sztywnych, jak i elastycznych podłożach do roślin w celu dostarczania biomolekuł i barwników.

Streszczenie

Dostarczanie biomolekuł i nieprzepuszczalnych barwników do nienaruszonych roślin jest dużym wyzwaniem. Nanomateriały to rozwijające się narzędzia do dostarczania DNA roślinom. Choć te nowe narzędzia są ekscytujące, nie zostały jeszcze powszechnie zastosowane. Nanomateriały wytwarzane na sztywnym podłożu (podłożu) są szczególnie trudne do skutecznego zastosowania w zakrzywionych strukturach roślin. Badanie to opisuje proces mikrowytwarzania pionowo ustawionych matryc z nanowłókien węglowych i przenoszenia ich ze sztywnego podłoża na elastyczne podłoże. Szczegółowo opisujemy i pokazujemy, w jaki sposób te włókna (zarówno na sztywnych, jak i elastycznych podłożach) mogą być wykorzystywane do przejściowej przemiany lub dostarczania barwnika (np. fluoresceiny) do roślin. Pokazujemy, w jaki sposób można przenieść VACNF ze sztywnego podłoża krzemowego na elastyczne podłoże epoksydowe SU-8 w celu utworzenia elastycznych układów VACNF. Aby przezwyciężyć hydrofobowy charakter SU-8, włókna w elastycznej folii pokryto cienką warstwą tlenku krzemu (2-3 nm). Aby użyć tych włókien do dostarczenia do zakrzywionych organów roślinnych, umieszczamy 1 μl kropli barwnika lub roztworu DNA po stronie włókien folii VACNF, czekamy 10 minut, umieszczamy folie na organie roślinnym i używamy wacika z ruchem tocznym, aby wprowadzić włókna do komórek roślinnych. Dzięki tej metodzie uzyskaliśmy dostarczanie barwnika i DNA do organów roślinnych o zakrzywionych powierzchniach.

Wprowadzenie

Transformacja roślin (zarówno przejściowa, jak i stabilna) nie stała się jeszcze powszechnie osiągalna we wszystkich tkankach i gatunkach roślin. Przejściowa transformacja roślin to proces, w którym geny kodowane w plazmidach są tymczasowo wprowadzane do roślin, ale nie są stabilnie włączane do genomu. Tradycyjne metody, które wykorzystują bombardowanie cząstkami, agrobakterie, elektroporację lub obróbkę protoplastów glikolem polietylenowym, są powolne lub mogą być kłopotliwe. Co więcej, nie mają one zastosowania do każdego gatunku roślin^1,2,3,4. Wykorzystanie nanomateriałów do dostarczania DNA to rozwijająca się dziedzina, która wciąż jest w powijakach⁵. Nanomateriały, w szczególności nanowłókna węglowe, zostały również z powodzeniem wykorzystane do dostarczania białek, dektransu i barwników do liści roślin bez wywoływania reakcji na rany⁶. Celem tych prac jest opracowanie szczegółowego protokołu wykorzystania jednego rodzaju nanomateriału, nanowłókien węglowych, do dostarczania biomolekuł lub barwników roślinom. Tutaj skupiamy się na DNA jako biomolekułach z wyboru, która umożliwia przejściową transformację komórek w różnych organach roślinnych.

Poprzednio, Morgan et al.⁷ zademonstrowali użycie nanowłókien węglowych przymocowanych do sztywnego podłoża krzemowego do przejściowego przekształcania liści sałaty, N. benthamiana i topoli, a także liści i korzeni Arabidopsis. Chociaż transformacje zakończyły się sukcesem na różnych narządach, włókna były trudniejsze do zastosowania w tkankach roślinnych o zakrzywionych powierzchniach, takich jak korzenie czy owoce. Doszliśmy do wniosku, że elastyczny nośnik dla nanowłókien może poprawić ich wydajność dostarczania poprzez lepsze dopasowanie do kształtu narządu.

Tutaj szczegółowo opisujemy metody wykorzystywane do wytwarzania i projektowania pionowo ustawionych nanowłókien węglowych, przenoszenia VACNFów na elastyczne podłoża i stosowania VACNFów zarówno na sztywnych, jak i elastycznych podłożach dla roślin, aby dostarczyć biomolekuły i barwniki. Nanowłókna węglowe wyprodukowano metodą katalitycznego osadzania chemicznego z fazy gazowej wspomaganej plazmą prądu stałego (dc C-PECVD) z katalizatorem Ni. Położenie, średnica i wysokość kropek katalizatora Ni były kontrolowane za pomocą kombinacji litografii wiązką elektronów, parowania metalu i procesów lift-off, zgodnie z opisem Melechko et al.^8,9. Korzystając z dwuwarstwowego rezystu wiązki elektronów, grubszy katalizator Ni może zostać osadzony na podłożu, aby uzyskać dłuższe włókna¹⁰. Przenoszenie włókien ze sztywnego podłoża na elastyczne opiera się na modyfikacji metod opisanych w Fletcher et al.¹¹, przy czym obecne metody rezygnują z użycia amorficznej warstwy węgla lub protektorowej warstwy fotorezystu. Start SU-8 z transferem włókien uzyskuje się poprzez wykorzystanie wewnętrznego naprężenia rozciągającego wynikającego z niedopieczenia i niedoświetlenia SU-8^12,13,14. SU-8, złożony polimer, jest naturalnie hydrofobowy, co utrudnia jego wykorzystanie do ułatwiania dostarczania DNA. Aby przeciwdziałać hydrofobowej naturze SU-8, nakładamy cienką warstwę tlenku krzemu poprzez osadzanie warstwy atomowej¹⁵ po osadzeniu włókien w SU-8. Nakładanie włókien na sztywne podłoże w celu dostarczania biomolekuły/barwnika wykorzystuje siłę uderzenia pęsety opisaną w Davern et al.⁶ oraz metody on-plant i on-chip opisane w Morgan et al.⁷. Elastyczne folie VACNF są nakładane na zakrzywione powierzchnie roślin poprzez najpierw półsuszenie kropelek DNA lub barwnika na folii, tak jak w przypadku metody on-chip firmy Morgan et al.⁷, a następnie zwijanie folii na zakrzywionych powierzchniach roślin za pomocą małego aplikatora do makijażu^16,17. Rysunek 1 przedstawia różne podejścia do stosowania włókien w sztywnych i elastycznych podłożach dla roślin.

Protokół

1. Produkcja VACNFs (Rysunek 2 i Rysunek 3)

1. Przędzić płytkę krzemową polimetakrylanem metylu (PMMA) 495 A4 o temperaturze 4000 obr./min i piec w temperaturze 180 °C przez 5 min.
   UWAGA: Pozwól wafli ostygnąć przez 10 sekund przed przejściem do następnego kroku.
2. Drugą warstwę materiału rezystancyjnego (PMMA 950 A2) pokryć warstwą rezystancji i piec w temperaturze 180 °C przez 5 minut.
3. Litografia wiązką elektronów służy do definiowania kropek katalizatora o średnicy 300 nm w określonych odstępach bocznych (skok: 10 μm lub 35 μm) w układach 3 mm x 3 mm.
4. Rozwinąć rezystant w 30-40 ml ketonu metylowo-izobutylowego w stosunku 1:3: alkohol izopropylowy (IPA) przez 1,5 minuty, a następnie przepłukać go IPA i wysuszyć N₂,
   UWAGA: Sprawdź układ punktów za pomocą mikroskopu jasnego pola (obiektyw 20x).
5. Oczyść płytkę z resztkowego oporu za pomocą 6-sekundowej ekspozycji w plazmie tlenowej (descum) w wytrawiaczu krzemowym.
6. Za pomocą parowania wiązką elektronów należy najpierw nałożyć warstwę kleju z metalu (Ti lub Cr, 10 nm), a następnie nałożyć drugą warstwę, którą jest katalizator Ni (130 nm lub 150 nm). Podczas osadzania metalu Ti lub Ni należy utrzymywać prąd poniżej 0,2 A przy 10 kV, ciśnienie poniżej 5 x ^10-6 Torr, a szybkość stapiania na poziomie ~1 A/s dla osadzania w linii wzroku.
7. Użyj sekwencyjnej sonikacji w kąpieli, aby usunąć metal (Ni) osadzony na leżącej poniżej warstwie rezystancyjnej, pozostawiając Ni osadzony bezpośrednio na płytce krzemowej. Ten proces nazywa się lift-off.
   1. W tym celu należy przygotować 3 pojemniki z acetonem i zanurzyć płytkę w sonikacji w acetonie przez 1 minutę; powtórzyć 3 razy w temperaturze pokojowej (RT, 20 °C) z częstotliwością 35 kHz. Spłukać IPA i osuszyć N₂,
      UWAGA: Nigdy nie pozwól, aby aceton wyschł na płytce. Po ostatniej sonikacji acetonu natychmiast spłukać IPA, a następnie osuszyć gazem_N2. Jeśli w którymkolwiek momencie wafel stanie się przedwcześnie suchy (przed płukaniem IPA), istnieje możliwość, że nie cały nadmiar metalu i oporu zostanie usunięty, a aceton może pozostawić osad.
8. Sprawdź geometrię kształtu katalizatora za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Aby przechwycić obrazy SEM chipów VACNF, przechyl stolik pod kątem 30° i użyj napięcia 1-3 kV, z prądem wiązki ~100 pA i odległością roboczą ~5 mm.
   UWAGA: Katalizator powinien wyglądać jak krążek hokejowy (kompaktowy cylinder) (Rysunek 4). Wysokość zwartego cylindra powinna odzwierciedlać grubość Ni osadzonego na płytce krzemowej. Jeśli profil kropki Ni jest wysoki i wydaje się być wklęsły u góry, przypominając wulkan (Rysunek 4), to jest bardziej prawdopodobne, że katalizator rozpadnie się na wiele kropelek Ni, co spowoduje rozgałęzienie się nanowłókien węglowych9(Rysunek 4 i Rysunek 5). Takie problemy mogą wynikać z odporności na topnienie podczas parowania metalu z powodu długiego czasu osadzania lub problemów z procedurą podnoszenia (Rysunek 4 i Rysunek 5).
9. Poćwiartuj płytkę krzemową na ćwiartki i umieść ją w komorze do chemicznego osadzania z fazy gazowej wzmocnionej plazmą prądu stałego (dc-PECVD) z mieszaniną acetylenu i amoniaku. Zoptymalizuj parametry wzrostu, aby kontrolować długość i stożek nanowłókien (końcówki <200 nm).
   1. Użyj prądu 1-1,5 A i voltage zakres 440-560 V. Podczas uprawy włókien należy zastosować fazę obróbki wstępnej z przepływem amoniaku, podczas gdy maszyna i podłoże nagrzewają się do 620 °C. Upewnij się, że włączyłeś źródło węgla (acetylen) 10 s przed uruchomieniem plazmy.
      UWAGA: Ćwiartki wafli stosuje się w przypadku, gdy konieczna jest optymalizacja parametrów pracy maszyny PECVD. Do produkcji włókien o długości większej niż 40 μm i końcówkach o średnicy mniejszej niż 200 nm sugeruje się następujące parametry: przy grubości katalizatora Ni 130 nm należy użyć prądu 1,75 A, czasu wzrostu 70 min i stosunku acetylenu do amoniaku 45 standardowych centymetrów sześciennych na minutę (sccm) : 100 sccm. Przy grubości Ni 150 nm należy użyć prądu 1,5 A, czasu wzrostu 80 min i stosunku acetylenu do amoniaku 48 sccm : 100 sccm. Do hodowli VACNF należy użyć następujących parametrów, niezależnie od grubości katalizatora: temperatura wzrostu 620 °C, ciśnienie 10 torów podczas plazmy i wysokość głowicy prysznicowej 20 mm (Rysunek 6).
10. Oceń geometrię powstałych włókien za pomocą SEM przy nachyleniu 30° z potencjałem przyspieszenia 1 kV.
    UWAGA: Optymalne włókna będą proste i nierozgałęzione. Niemożliwe jest kontrolowanie orientacji krystalicznej katalizatora Ni za pomocą parownika wiązki elektronów. W rezultacie niektóre włókna będą się rozgałęziać z powodu odwilżania katalizatora⁹. Ponadto orientacja kryształów powoduje, że VACNF rosną do różnych wysokości, więc jednolita wysokość na wszystkich VACNF jest trudna.
11. Pokryj warstwę fotorezystu (SPR955) na włóknach z prędkością 1000 obr./min przez 45 s. Następnie pokrój 1/4 wafla w kostkę na tablice 3 mm x 3 mm za pomocą piły do krojenia w kostkę. W tym momencie przechowuj włókna do późniejszego wykorzystania.
    UWAGA: Nie wykonuj kroku 1.11, jeśli planujesz przenieść włókna na elastyczne podłoże.

2. Transfering VACNFs do elastycznego podłoża (Rysunek 7 i Rysunek 8)

1. Po zsyntetyzowaniu włókien, spincoat SU-8 2015 fotorezystor na płytkach lub ćwiartkach płytek z prędkością 4000 obr./min przez 45 s.
2. Piecz wafel na miękko przez 3 minuty w temperaturze 95 °C.
3. Za pomocą wyrównywacza kontaktowego naświetl płytkę z maską o wzorze 3 mm i średnicy 3 mm, która jest zgodna ze zdefiniowanym wzorem z litografii wiązką elektronów przy 95 mJ/cm²,
   UWAGA: Użyj trybu kontaktu zbliżeniowego z odstępem ekspozycji o 20 μm większym niż w przypadku najwyższego włókna. Istnieje możliwość, że włókna mogą zostać przewrócone na tym etapie procesu.
4. Piecz po ekspozycji przez 6 minut w temperaturze 95 °C.
5. Rozwijaj wafel w wywoływaczu SU-8 przez 15 s, opłucz go IPA i wysusz wafel za pomocą N₂, przesuwając się od góry do dołu.
   UWAGA: Podczas opracowywania wafla upewnij się, że jest on całkowicie zanurzony.
6. Wafle wzorzyste Spincoat z ochronną warstwą cienkiego fotorezystu (SPR 955 CM 0,7) przy 3000 obr./min przez 45 s i softbake przez 30 s w temperaturze 90 °C.
7. Umieścić cienką warstwę tlenku krzemu na płytce (2-3 nm), umieszczając ją w warstwie atomowej osadzanej przez 22 cykle w temperaturze 100 °C.
8. Za pomocą piły do krojenia w kostkę pokrój wafel na kwadraty o wymiarach 3 mm x 3 mm. Dopasuj piłę do krojenia w kostkę do istniejącego wcześniej wzoru na płytce.
9. Oceń geometrię powstałych włókien za pomocą SEM przy nachyleniu 30° z potencjałem przyspieszenia 3 kV.
10. Zatrzymaj się tutaj, jeśli przechowujesz chipsy do długotrwałego użytku (>1 tydzień). Przechowuj chipsy w ciemności.
11. Aby oddzielić podłoża elastyczne od sztywnych, należy umieścić pojedyncze wióry w acetonie na 30 minut lub do momentu, gdy SU-8 zacznie się zwijać.
12. Folie SU-8 (dołączone lub oderwane od sztywnych podłoży) myć IPA przez 5 minut, a następnie wodą przez 5 minut. Podczas transportu umieść chipsy w komercyjnym pudełku z lepką podkładką.
13. OPCJONALNIE: Umieść bezwłóknistą stronę folii SU-8 na taśmie rozpuszczalnej w wodzie lub na cienkiej gumie silikonowej z cienkim podłożem z politereftalanu etylenu (PET) (o grubości 12,5 μm).
    1. Użyj pęsety, aby przenieść folię SU-8. Naciśnij krawędzie kwadratu SU-8, aby pomóc mu przykleić się do taśmy/gumy silikonowej-PET; Ma to na celu uniknięcie zrywania włókien. W tym momencie folie VACNF są gotowe do natychmiastowego użycia.
    2. Aby przygotować uchwyt z gumy silikonowej/PET, wykonaj następujące czynności: używając 2-częściowego zestawu do gumy silikonowej, wymieszaj ze sobą dwie części (elastomer i środek sieciujący). Następnie wytnij kwadrat PET i przyklej go taśmą do przezroczystego plastikowego naczynia. Wylej bardzo cienką warstwę gumy silikonowej na wierzch PET i utwardź go w temperaturze 80 °C przez 1-2 godziny.

3. Metoda na roślinie (gdzie kropla roztworu do dostarczenia jest umieszczana na powierzchni rośliny) przy użyciu włókien w sztywnym podłożu (Rysunek 1A)

1. Przed użyciem usunąć fotorezystor za pomocą stopniowego płukania acetonem (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) i ddH₂O (5 min).
2. Umieść tkankę roślinną, która ma zostać nabity, na twardej powierzchni, aby uzyskać podparcie.
3. Umieść 1 μl kropli barwnika lub DNA (200 ng) na powierzchni tkanki roślinnej.
4. Umieść chip VACNF ze sztywnym podłożem na wierzchu kropli, z włóknami zorientowanymi tak, aby miały kontakt z kroplą.
   UWAGA: Orientację wiórów można określić na podstawie "połysku" płytki. Błyszcząca strona chipa ma włókna, a nieprzezroczysta strona nie.
5. Używając płaskiej strony pęsety, dotknij chipa. Zaznacz obszar rośliny, z którym zetknął się wiór, za pomocą markera z miękką końcówką. Wyjmij chipy VACNF po dostarczeniu.
   UWAGA: Siła przyłożona podczas stukania będzie się różnić w zależności od rodzaju użytej tkanki roślinnej. Zaleca się przećwiczenie stukania wiórów przed przystąpieniem do nabijania włókien. Unikaj uszkodzeń tkanek roślinnych. Uszkodzenie jest widoczne, gdy można zobaczyć zarys chipa VACNF w tkance roślinnej.
6. Powtórz kroki 3.1-3.5 dla kontroli (+Barwnik/DNA, -Włókna; -Barwnik/DNA, +Włókna; i -Barwnik/DNA, -Włókna). -Włókna to bezwłóknowa strona chipa.
7. W razie potrzeby przechowuj nienaruszone rośliny lub wycięte organy roślinne w wilgotnych komorach w warunkach długiego dnia (16 godzin światła, 8 godzin ciemności). Do wycinania narządów należy używać plastikowej szalki Petriego z mokrymi ręcznikami papierowymi.

4. Metoda on-chip (gdzie kropla roztworu do dostarczenia jest umieszczana na chipie VACNF), sztywne podłoże (Rysunek 1B)

1. Przed użyciem usunąć fotorezystor za pomocą stopniowego płukania acetonem (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) i ddH₂O (5 min).
2. Upuść 1 μl kropli barwnika lub plazmidowego DNA (200 ng) na stronę włókna chipa VACNF ze sztywnym podłożem. Upewnij się, że umieściłeś kroplę na środku chipa i przykryj kilka włókien. Pozostaw kroplę do wyschnięcia na 15 min.
   UWAGA: Orientację wiórów można określić na podstawie "połysku" płytki. Błyszcząca strona chipa ma włókna, a nieprzezroczysta strona nie.
3. Podczas pracy z liśćmi lub innymi wyciętymi narządami umieść je na twardej powierzchni. Podczas pracy z nienaruszonymi roślinami umieść twardą powierzchnię pod organem, na który nakładane są VACNF.
4. Po 15-minutowym etapie suszenia ustaw chip VACNF tak, aby strona włókna stykała się z tkanką roślinną. Dotknij chipa tylnym końcem pęsety.
   UWAGA: Siła przyłożona podczas stukania będzie się różnić w zależności od rodzaju użytej tkanki roślinnej. Zaleca się ćwiczenie stukania wiórów.
5. Powtórzyć kroki 3.6-3.7 metody roślinnej.

5. Zastosowanie VACNFów w foliach SU-8 do tkanki roślinnej metodą on-chip (Rysunek 1C)

1. Umieść 1 μl kropelki barwnika lub DNA (200 ng) po stronie włókien folii SU-8 i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut. Pamiętaj, aby umieścić kroplę na środku chipa.
   UWAGA: Czas schnięcia różni się w zależności od użytego podłoża.
2. Za pomocą ostrej pęsety umieść folię VACNF na powierzchni rośliny.
   UWAGA: Im dłużej folie SU-8 są pozostawione w powietrzu, tym bardziej stają się kruche. Aby ograniczyć ryzyko utraty folii SU-8, należy upewnić się, że wszystkie rośliny/próbki i sprzęt znajdują się w pobliżu folii SU-8.
3. Delikatnie natocz mały aplikator do makijażu po folii VACNF. Zaznacz obszary, w których umieszcza się elastyczne podłoża, markerem z miękką końcówką. Usuń elastyczne podłoża z powierzchni rośliny za pomocą taśmy.
   UWAGA: Siła przyłożona podczas zwijania aplikatora do makijażu będzie się różnić w zależności od użytych tkanek roślinnych. Przećwicz nakładanie folii VACNF przed przeprowadzeniem biomolekuły lub dostarczania barwnika. Widoczne uszkodzenia tkanek roślinnych są widoczne, gdy można zobaczyć kontury filmu VACNF w tkance roślinnej.
4. Powtórzyć kroki 5.1-5.3 dla roślin kontrolnych i magazynowych, jak wspomniano w kroku 3.7 metody na roślinie.

6. Mikroskopia i analiza obrazu dla wszystkich metod dostarczania

1. Zobrazuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego przy użyciu długości fal emisji i wzbudzenia odpowiednich dla dostarczonej sondy fluorescencyjnej/reportera.
   UWAGA: Czas potrzebny na przejściową przemianę różni się w zależności od gatunku rośliny i dostarczonego markera. Na przykład ekspresję markerów fluorescencyjnych wykryto po 48 godzinach u Arabidopsis w porównaniu z 96 godzinami u liści sałaty⁷.
2. Podczas obrazowania spróbuj skupić się na regionie z oderwanymi włóknami. Włókna będą miały różne orientacje. Powodzenie dostawy nie zależy od pojawienia się zerwanych włókien.
   UWAGA: Włókna będą fluorescencyjne z najczęstszymi ustawieniami wzbudzenia/emisji ze względu na tworzenie się warstwy azotku krzemu wynikającej z powstania światłowodu w PECVD¹⁸.
3. Uchwyć co najmniej 5 obrazów dla każdej próbki. Wynikowy sygnał będzie się różnił.
4. Zmierz wartości fluorescencji jako całkowitą fluorescencję (gęstość zintegrowaną) w konfokalnych obszarach obrazu o wymiarach 20 μm x 20 μm⁷ za pomocą ImageJ¹⁹.

Wyniki

Niewątpliwą zaletą chipów VACNF na sztywnych lub elastycznych podłożach jest możliwość dostarczania biomolekuł lub barwników do określonych miejsc na roślinie (Rysunek 1). W tym przypadku wykorzystaliśmy odczyty fluorescencyjne do oceny porodu. Korzystając z różnych roślin, substratów i metod dostarczania (on-chip lub on-plant), mogą wystąpić różnice w czasie pojawienia się barwnika fluoresceiny. Aby określić, czy chipy/folie VACNF sprawdzają się podczas dostarczania, szybkim podejściem jest użycie włókien do dostarczania barwnika (Rysunek 9). Obrazy oznaczone różnymi czasami w Rysunek 9 to różne pola widzenia z tych samych próbek. W przypadku stosowania metody roślinnej barwnik fluoresceinowy można obserwować natychmiast po podaniu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Dodatkowo, jeśli to samo pole widzenia jest obrazowane w czasie po dostarczeniu barwnika fluoresceinowego do rośliny, intensywność sygnału staje się z czasem mniej jasna (Rysunek 10). Barwnik fluoresceinowy może potencjalnie przemieszczać się z pola widzenia do innych obszarów liścia przez plazmodesmata^20,21. W porównaniu z metodą on-plant, w metodzie on-chip z włóknami na sztywnym podłożu, barwnik porusza się wolniej w całym nabijanym obszarze (ilustracja 9). Może to być wynikiem odrywania się barwnika od włókien / ponownego nawodnienia w komórkach, a tym samym zabierania więcej czasu na przemieszczanie się.

Włókna w elastycznym podłożu były odpowiednie do dostarczania barwnika na zakrzywione powierzchnie, takie jak truskawki i jabłka (Rysunek 11 i Rysunek 12). Używając elastycznego podłoża z truskawkami, od razu zaobserwowano silny sygnał fluoresceiny (Ryc. 11), podczas gdy potrzeba było 2 godzin, aby zobaczyć silny sygnał fluoresceiny w jabłkach (Rysunek 12B,D). Pomyślne dostarczenie plazmidów kodujących markery fluorescencyjne można określić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu znalezienia wynikowego sygnału (Rysunek 12F, Rysunek 13 i Rysunek 14). Kontrole są konieczne, aby określić, czy wybrana roślina nie ma autofluorescencji podobnej do markera fluorescencyjnego, który chcemy dostarczyć za pomocą włókien. Użycie samych włókien jest pomocne w ustaleniu, czy siła uderzenia przyłożona pęsetą powoduje uszkodzenie tkanki roślinnej, czy też obserwowana fluorescencja w próbce jest spowodowana przez VACNF, które są z natury fluorescencyjne ze względu na warstwę azotku krzemu¹⁸ (Rysunek 13C-D). Włókna wbite w tkankę roślinną nie wywołują reakcji rany, co oceniano za pomocą H₂O₂ production⁶. Wreszcie, korzystając z kontroli +DNA, -Fibers jest niezbędne do potwierdzenia, że DNA nie dostaje się do rośliny poprzez samo opukiwanie i potwierdza, że włókna są niezbędne do dostarczenia do komórek roślinnych (Rysunek 13E-F). Nie powinno być wyraźnej różnicy w przypadku stosowania metod dostarczania na roślinie lub na chipie za pomocą VACNF na sztywnym podłożu, na co wskazuje brak znaczącej różnicy w wartościach fluorescencji (Rysunek 13I). Użycie elastycznych folii VACNF z dostarczaniem DNA na chipie zaowocowało udaną przejściową transformacją komórek naskórka w kupionych w sklepie jabłkach i cebulach (Rysunek 12F i Rysunek 14).

Nieudane eksperymenty mogą mieć zerwane włókna w różnych polach widzenia, ale nie będzie wynikowego sygnału fluorescencji z próby dostarczenia plazmidowego DNA lub barwnika. Jeśli na roślinę zostanie przyłożony zbyt duży nacisk, nastąpi widoczne uszkodzenie tkanek (Rysunek 15). To mechaniczne uszkodzenie może wyglądać jak małe lub przezroczyste obszary w roślinie, tak jakby warstwa komórek została usunięta podczas oglądania rośliny pod mikroskopem. Czasami będą widoczne odciski chipa. Eksperyment, w którym ekspresja białka fluorescencyjnego nie jest wykrywana po dostarczeniu DNA, może być również spowodowany użyciem DNA niskiej jakości, dlatego przydatne może być przygotowanie świeżego DNA.

Rysunek 1: Schemat dostarczania barwnika/DNA do tkanki roślinnej za pomocą włókien na sztywnych i elastycznych podłożach. (A) Na roślinie, za pośrednictwem błonnika/dostarczania DNA. Kroplę 1 μl roztworu barwnika/DNA umieszcza się na powierzchni liścia, a chip VACNF umieszcza się na wierzchu kropli. Za pomocą pęsety chip jest delikatnie wkłuwany w tkankę. Sztywne podłoże jest usuwane, pozostawiając nanowłókna w tkance. (B) Dostarczanie DNA za pośrednictwem błonnika na chipie. Kroplę o objętości 1 μl barwnika lub roztworu DNA kroplą na chip VACNF i suszy przez 15 minut. Chip z częściowo wysuszonym DNA umieszcza się na powierzchni liścia i wkłuwa w tkankę, jak w panelu A. (C) Dostarczanie na chipie filmu DNA SU-8. Włókna są przenoszone ze sztywnego podłoża krzemowego na elastyczny nośnik SU-8. Kroplę o objętości 1 μl roztworu barwnika/DNA kroplowo na folię VACNF i suszy przez 10 minut. Folia VACNF z częściowo wysuszonym barwnikiem/DNA jest następnie nawijana na zakrzywioną powierzchnię rośliny za pomocą aplikatora do makijażu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przepływ pracy do tworzenia pionowo ustawionych układów z nanowłókien węglowych. Aby wytworzyć VACNF, podwójna warstwa polimetakrylanu metylu (PMMA 495 A4, a następnie PMMA 950 A2) jest powlekana przędzowo na płytce krzemowej. Litografia wiązką elektronów służy do zdefiniowania układu kropek o średnicy 300 nm. Rezystor jest następnie wytwarzany w ketonie metylowo-izobutylowym/izopropanolu (MIBK/IPA) w stosunku 1:3 przez 1,5 min. Za pomocą metalowego parownika na płytkę nakłada się warstwę kleju Ti (10 nm), a następnie warstwę Ni (130 nm lub 150 nm). Pozostały opór jest następnie usuwany poprzez lift-off (sonikacja kąpieli w acetonie). Geometria kropek katalizatora jest kontrolowana za pomocą SEM. Jeśli katalizatory przypominają krążki hokejowe i są płaskie, umieszcza się je w maszynie do chemicznego osadzania z fazy gazowej wzmocnionej plazmą (PECVD) i hoduje się włókna. Włókna zostały następnie sprawdzone za pomocą SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Obrazy SEM idealnie ustawionych pionowo nanowłókien węglowych. (A) Mikrografia elektronowa VACNF o skoku ~35 μm i wysokości 10-15 μm, zobrazowana pod kątem 30°. Ten obraz jest zduplikowany w Rysunek 7C. (B) Mikrografia elektronowa VANCF o skoku ~20 μm i wysokości 20-30 μm, zobrazowana pod kątem 30°. (C) Mikrografia elektronowa VANCF o rozstawie ~35 μm, wysokości 50-60 μm i zobrazowana pod kątem 30°. (D) Mikrofotografia elektronowa końcówki VACNF o średnicy <200 nm. Średnice końcówek włókien są zróżnicowane (150-300 nm). Ponieważ włókna zostały zobrazowane pod kątem 30 °, wysokości wydają się być mniejsze niż rzeczywista wysokość o współczynnik sin(30°) = 1/2. Panele A i B zostały przedrukowane za zgodą Morgan et al.⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obrazy SEM geometrii katalizatora przed wzrostem VACNF. (A) Obraz SEM katalizatora po starcie. Należy pamiętać, że fotorezystor jest obecny wokół krawędzi katalizatora, co daje kształt wulkanu. (B,C) Obrazy SEM pokazują wulkaniczne kształty katalizatora po użyciu jednowarstwowego rezystu PMMA. (D) Pożądany kształt katalizatora krążka hokejowego wykonany z podwójnych warstw PMMA. Ponieważ włókna zostały zobrazowane pod kątem 30° w panelach A, B i D, wysokości wydają się być mniejsze niż rzeczywista wysokość o współczynnik sin(30°) = 1/2. Podziałka liniowa reprezentuje 100 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wpływ rozmiaru kropki katalizatora na wzrost włókien: Aby ustalić optymalną średnicę materiału katalizatora, włókna zostały wyhodowane z kropek o rozmiarach od 200 do 600 nm. Rozmiary kropek w zakresie 400-600 nm doprowadziły do odwilżenia katalizatora i wzrostu wielu włókien. Najlepszą geometrię włókien uzyskano przy średnicy 300 nm. Mniejsze kropki prowadziły do niewystarczającej wysokości włókien. Ze względu na fakt, że włókna zostały zobrazowane pod kątem 30°, wysokości wydają się być mniejsze niż rzeczywista wysokość o współczynnik sin(30°) = 1/2. Zdjęcia wykonano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Schematyczna ilustracja systemu prądu stałego - plazmowego wspomaganego chemicznego osadzania z fazy gazowej (dc-PECVD) używanego w Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Niestandardowy system w ORNL ma dużą głowicę prysznicową, która służy jako reaktor dla gazów zasilających i wyjście dla plazmy. Głowica prysznicowa była utrzymywana na potencjale prądu stałego wynoszącym 300 V w stosunku do stopnia nagrzania podłoża. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Przepływ pracy przy przenoszeniu włókien ze sztywnego podłoża na elastyczne podłoże. Po syntezie i kontroli nanowłókien każda płytka jest powlekana spinowo SU-8 2015 przy 4000 obr./min przez 45 s. Wafel jest następnie pieczony na miękko przez 3 minuty w temperaturze 95 °C. Następnie wafel jest wystawiany na działanie światła UV i układany w nakładce na maskę o ciśnieniu 95 mJ/^cm2. Po wypieku przez 6 minut w temperaturze 95 °C, wafel jest wywoływany w wywoływaczu SU-8 przez 15 s, płukany IPA i suszony gazem_N2. Warstwa ochronna z tworzywa SPR 955 CM 0,7 jest wirowana na płytce z prędkością 3000 obr./min i wypalana na miękko w temperaturze 90 °C przez 30 s. Warstwa tlenku krzemu (2-3 nm) jest następnie dodawana do płytki poprzez osadzanie warstwy atomowej (ALD) (22 cykle w temperaturze 100 °C), aby elastyczne podłoże stało się hydrofilowe¹⁵. Wafel jest następnie krojony w kostkę na kwadraty o wymiarach 3 mm x 3 mm za pomocą piły do krojenia w kostkę. W momencie użycia poszczególne wióry umieszcza się w acetonie, aż SU-8 zacznie się zwijać i stanie się wklęsły (>30 min). W tej chwili warstwę SU-8 na większości chipów można chwycić za krawędź ostrymi pęsetami i oderwać od leżącego pod spodem krzemu jako nienaruszoną kwadratową folię o średnicy 3 mm. Folia jest następnie myta kolejno w IPA i wodzie po 5 minut każdy i natychmiast używana. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Obrazy SEM transferu włókien ze sztywnego podłoża na elastyczne podłoże. Pokazane obrazy są reprezentatywne, ale pochodzą z różnych próbek. (A) Długie włókna po wzroście PECVD (ten sam obraz, co w Rysunek 2C). (B,C) Włókna po zastosowaniu SU-8. Żywica epoksydowa wzbiera wokół podstawy włókien. Długość odsłoniętych włókien wahała się od 5 μm do 30 μm. (D) Włókna osadzone w Su-8 po starcie zachowały swoją geometrię. Ze względu na fakt, że włókna zostały zobrazowane pod kątem 30 °, wysokości wydają się być mniejsze niż rzeczywista wysokość o współczynnik sin (30 °) = 1/2. Panel A został przedrukowany za zgodą Morgan et al.⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Dostarczanie barwnika do liści Arabidopsis przy użyciu metod on-chip i on-plant z włóknami na sztywnych podłożach. (A-P) Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda on-chip (A-H): 1 μL barwnika fluoresceinowego o wielkości 10 μM suszono przez 15 minut na chipach VACNF, a następnie wiórki wkłuwano pęsetą w stronę aosiową liści Arabidopsis. (A-D) Liście obrazowane w ciągu 5-15 minut po porodzie. (E-H) Liście sfotografowane 1 h po porodzie. (A,E) +Barwnik, +Włókna. Kontrole: (B,F) -barwnik, -włókna; (C,G) -barwnik, +włókna; (D,H) + Barwnik, -Włókna. (I-P) Metoda roślinna: 1 μl barwnika fluoresceinowego o stężeniu 10 μM umieszczono na powierzchni rośliny, wiórki umieszczono tak, aby stykały się z kropelką, a następnie użyto pęsety do wbicia wióra w stronę adoksyjną liści rzodkiewnika. (I-L) zobrazowane w ciągu 5-15 minut po porodzie i (M-P) zobrazowane 1 godzinę po porodzie. (I,M) +Barwnik, +Włókna. Kontrole: (J,N) -Barwnik, -Włókna; (K,O) -Barwnik, +Włókna; (L,P) + barwnik, -włókna. Panele A-P są pojedynczymi płaskimi obrazami z z-stacków. Podziałka wynosi 20 μm. Włókna mają podziałkę 35 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Przebieg czasowy dostarczania barwnika u Arabidopsis metodą na roślinie ze sztywnym podłożem. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stosując metodę roślinną, 1 μl kropli roztworu barwnika fluoresceiny (10 μM) umieszczono na powierzchni liścia, a chip VACNF umieszczono na wierzchu kropli. Za pomocą pęsety chip został delikatnie wbity w tkankę. Obrazy +Dye, +Fibers tego samego obszaru były pozyskiwane co 5 minut. Podziałka wynosi 20 μm. Włókna mają podziałkę 35 μm. Panele są pojedynczymi płaskimi obrazami z z-stacków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11: Dostarczanie barwnika do owoców truskawek za pomocą folii VACNF. (A-H) Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metodą on-chip kropelki barwnika suszono na foliach VACNF, które następnie wałkowano na powierzchnie owoców za pomocą aplikatora do makijażu. Barwnik fluoresceinowy (10 μM) dostarczono do komórek truskawek i zobrazowano po (A) 10 minutach i (B) 1 godzinie. (C,D) Brak kontroli leczenia (-Barwnik, -Włókna). (E,F) -Barwnik, +Włókna kontrole odpowiednio po 10 minutach i 1 godzinach. (G,H) + Barwnik, -Włókna kontrole odpowiednio po 10 minutach i 1 godzinach. Podziałki mają wielkość 40 μm. Panele A-H to maksymalne rzuty 188 μm z-stacks. Włókna mają podziałkę 35 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 12: Dostarczanie barwnika i przejściowa transformacja jabłek za pomocą folii VACNF. (A-F) Obrazy zostały wygenerowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metodą on-chip 1 μl barwnika fluoresceinowego (10 μM, B i D) lub 1 μl plazmidu kodującego pUBQ₁₀:YFP (DNA−YFP) (200 ng) suszono na foliach VACNF, które następnie rozwałkowano na powierzchnie owoców za pomocą aplikatora do makijażu. Barwnik fluoresceinowy został dostarczony do naskórka jabłka i zobrazowany po (B) 10 minutach i (D) 2 godzinach. (D) Barwnik potrzebował trochę czasu, aby dyfundować do komórek po podaniu. Dostarczanie i ekspresja DNA-YFP za pośrednictwem folii VACNF po (F) 48 godzinach. (A,C,E) bez kontroli leczenia (-Dye/DNA-YFP, -Fibers). Paski skali mają rozmiar 40 μm. Panele A-D to pojedyncze obrazy płaskie ze stosów z. Panele E i F to maksymalna projekcja stosów z 53 μm. Podziałka włókien wynosi 35 μm. Strzałki oznaczają sygnały fluoresceiny lub YFP. * oznacza włókna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 13: Przejściowa transformacja liści Arabidopsis przy użyciu metod VACNFs na roślinie lub na chipie. (Za-H) Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej 48 godzin po dostarczeniu DNA. (A,C,E,G) Metoda roślinna: 1 μl plazmidu kodującego pUBQ₁₀:YFP (DNA−YFP) (200 ng) umieszczono po stronie abaksjalnej liści Arabidopsis. Wióry były umieszczane w taki sposób, aby stykały się z kroplą, a pęseta służyła do wkłuwania wióra w tkankę liścia. (B,D,F,H) Metoda na chipie: 1 μl DNA−YFP (200 ng) suszono przez 15 minut na chipach VACNF, a następnie chipsy wbito pęsetą w stronę abaksjalną liści Arabidopsis. +DNA-YFP, +Włókna dla (A) na roślinie i (B) na chipie. Kontrole: (C,D) -DNA-YFP, + Włókna; (E,F) +DNA-YFP, -Włókna; i (G,H) -DNA, −Włókna. (I) Wykres względnej średniej intensywności sygnału fluorescencji w obszarach 25, 20 × 20 μm na podstawie obrazów 5 powtórzeń biologicznych połączonych z 2-3 eksperymentów z wykorzystaniem fluorescencji z kanału YFP. Regiony zawierające aparaty szparkowe (*) zostały wykluczone z powodu autofluorescencji. Średnia intensywność fluorescencji z warunku -DNA-YFP, -Fibers została odjęta od każdej średniej. Do testowania istotności użyto 2-kierunkowej ANOVA (i testu Tukeya), a słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej. Różne litery wskazują na istotne różnice między zabiegami (P < 0,0001). Wszystkie pokazane obrazy są maksymalnymi projekcjami 40 μm z−stosów. Podziałka wynosi 20 μm. Białe strzałki wskazują włókna na obrazach. Podziałka włókien wynosi 35 μm. Ten rysunek został przedrukowany za zgodą Morgan et al.⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 14: Przejściowa transformacja cebuli za pomocą folii VACNF. Obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej 48 godzin po dostarczeniu DNA. Metodą on-chip kropelki 1 μl plazmidowego DNA kodującego pUBQ₁₀:YFP (DNA-YFP) (200 ng) suszono na foliach VACNF przez 10 minut, a następnie zwijano na powierzchnię organów roślinnych. (A) DNA-YFP został dostarczony do naskórka cebuli, a YFP uległ ekspresji w naskórku. (B) Brak kontroli leczenia; (C) kontrola (+DNA-YFP, -Włókna) i (D) kontrola (-DNA-YFP, +Włókna). Podziałka ma wielkość 40 μm. Włókna mają podziałkę 35 μm. Obrazy są maksymalnymi projekcjami 115 μm z-stacks. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 15: Uszkodzenie tkanki w sałacie spowodowane nałożeniem folii VACNF. (A-D) Obrazy zostały wygenerowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. (A) Metodę on-chip wykorzystano do dostarczenia DNA do liści sałaty za pomocą folii VACNF. pUBQ₁₀: Kropelki DNA YFP (200 ng) suszono przez 10 minut na foliach VACNF, które następnie zwijano na stronę odklejonych liści sałaty i przechowywano w komorze wilgotnościowej przez 4 dni. (B) kontrola (-DNA-YFP, +Włókna). (C) kontrola (+DNA-YFP, -Włókna) i (D) brak leczenia (-DNA-YFP, -Włókna). Podziałki mają wielkość 40 μm. VACNF mają podziałkę 35 μm. Strzałki wskazują na uszkodzenia roślin wynikające z toczenia elastycznego podłoża ze zbyt dużą siłą. Zauważ, że udane dostarczanie DNA za pośrednictwem VACNF do sałaty zostało osiągnięte w innych eksperymentach⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 16: Przebieg pracy dostarczania za pośrednictwem VACNF w roślinach. W Etapie I sprawdź geometrię włókien za pomocą SEM. Do prawidłowego dostarczania włókna potrzebują końcówki o średnicy <200 nm. W przypadku stosowania włókien na elastycznym podłożu, następnym krokiem byłoby potwierdzenie, że włókna są przenoszone do SU-8 i sprawdzenie wysokości odsłoniętych włókien za pomocą SEM. W etapie II przetestowaliśmy przydatność włókien, próbując dostarczyć barwnik do wybranej rośliny/organu za pomocą sztywnego lub elastycznego podłoża. Użyj 1 μl kropli, umieszczając ją na powierzchni rośliny lub krótko susząc na wiórach/folii. W przypadku tego kroku i wszystkich innych kroków konieczne jest użycie odpowiednich elementów sterujących (-Barwnik,-Włókna; -Barwnik, +Włókna; i +Barwnik,-Włókna), aby mieć pewność, że sygnał pochodzi z dostarczenia barwnika w dobrej wierze. W etapie III potwierdź, że interesujący Cię gen jest obecny w plazmidzie, określ stężenie DNA do dostarczenia i przetestuj optymalny czas po dostarczeniu, aby sprawdzić ekspresję. W etapie IV wynik oceniano za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu sprawdzenia ekspresji dostarczonego markera. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Morgan et al.⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym artykule przedstawiliśmy metody konstruowania pionowo ustawionych układów nanowłókien węglowych, przenoszenia włókien na elastyczne podłoże i nakładania włókien na sztywnym lub elastycznym podłożu do roślin w celu wykorzystania w dostarczaniu biomolekuł lub barwników do roślin. Opisaliśmy dwa ogólne podejścia, metodę on-chip i metodę on-plant, do osadzania wprowadzonych materiałów i wykazaliśmy pomyślne wyniki we włóknach na sztywnym podłożu, a także w metodzie on-chip z wykorzystaniem folii VACNF. Zastosowanie tych włókien jest prostsze w praktyce i teorii niż tradycyjne metody transformacji roślin (bombardowanie cząstkami, transformacja protoplastów za pomocą PEG lub elektroporacji) i mogą być stosowane w przypadku roślin opornych na przemiany za pośrednictwem Agrobacterium. Jednak tylko kilka komórek ulega transformacji.

Pionowo ustawione nanowłókna węglowe zostały wyprodukowane w Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences za pomocą ich programu użytkownika. Użytkownicy mogą ubiegać się o korzystanie z tego obiektu do produkcji VACNF. Alternatywnie, chipy VACNF mogą być produkowane w pomieszczeniach czystych za pomocą maszyn do chemicznego osadzania z fazy gazowej wzmocnionej plazmą prądu stałego ze źródłem węgla^22,23. Dzięki opisanym metodom istnieje kilka kroków, które mają kluczowe znaczenie dla produkcji włókien, przenoszenia włókien i stosowania chipów/folii VACNF. Aby aplikacja włókien działała, włókna muszą być proste i mieć zwężającą się średnicę <200 nm na końcu, aby dostarczyć je do komórek roślinnych, aby były skuteczne ^6,7 (rysunek 3). Aby stworzyć nanowłókna węglowe o określonym rozmiarze i skoku, istnieje wiele parametrów, które można zmienić, w tym rozmiar kropki, skok boczny i ilość osadzonego katalizatora. Aby wybrać optymalny rozmiar kropki, który zostanie użyty do produkcji nanowłókien węglowych, włókna wyhodowano z różnych rozmiarów kropek (jak pokazano na rysunku 5). Odkryliśmy, że średnice 300 nm wytwarzają najlepsze włókna, stąd wybrano ten rozmiar kropki (ryc. 5). Po znalezieniu odpowiednich parametrów postanowiliśmy użyć wiórów, które mają >50% włókien o idealnej geometrii (proste i średnica końcówki <200 nm). Aby sprawdzić geometrię włókien, użyliśmy skaningowej mikroskopii elektronowej do zobrazowania losowych pól widzenia na próbce chipów/filmów VACNF.

Dodatkowo włókna muszą mieć określoną minimalną długość, aby osiągnąć dostawę w komórkach roślinnych. Znaczenie wytwarzania włókien o różnej długości polega na tym, że dłuższe włókna mogą być używane do penetracji głębszych warstw tkanek. Dłuższe włókna (o długości >40 μm) są niezbędne w przypadku folii elastycznych, ponieważ przenoszenie włókien polega na oderwaniu włókien od ich podstawy i wymaga nałożenia warstw SU-8 na wierzch włókien. Grubość robocza warstwy SU-8 użytej w tym protokole wynosi 20-35 μm. Minimalna wysokość niezbędna do przeprowadzenia porodu w obrębie naskórka różnych roślin (zakrzywionych lub płaskich) wynosi 10-15 μm ^6,7. W związku z tym włókna o długościach >40 μm są niezbędne do produkcji folii VACNF. Istnieje kilka różnych parametrów, które należy wziąć pod uwagę podczas produkcji nanowłókien węglowych: materiał katalizatora, geometria katalizatora, grubość materiału katalizatora, a także warunki w komorze PECVD (stosunek gazu, ciśnienie, temperatura, prąd, wysokość głowicy prysznicowej i czas wzrostu)8,9,24,25. Aby wytworzyć nanowłókna węglowe dłuższe niż 25 μm używane przez Morgana i ^wsp.7 oraz Daverna i wsp.6, zwiększyliśmy ilość katalizatora Ni, zmieniliśmy stosunek acetylenu do amoniaku oraz zwiększyliśmy prąd i czas wzrostu. Dodatkowo zwróciliśmy większą uwagę na geometrię materiału katalizatora. Aby wytworzyć wysokie, proste włókna, osadzony katalizator musiał mieć kształt krążka hokejowego, a nie kształt przypominający wulkan (ryc. 4). Struktury wulkaniczne powstają z resztek fotorezystu po starcie. Aby zapobiec powstawaniu wulkanów, podczas litografii wiązką elektronów użyto podwójnej warstwy PMMA do stworzenia podcięcia²⁶. Podcięcie pomaga w unoszeniu się osadzonego katalizatora metalowego (rysunek 2). Gruba warstwa katalizatora jest ważna dla wzrostu wysokich VACNF. Morfologia VACNF została zbadana przez Merkulova i ^wsp.24. Pionowe ustawienie VACNF wynika zarówno ze wzrostu końcówki katalizatora Ni, jak i z wyrównania potencjału prądu stałego prostopadłego do podłoża (ilustracja 6). Głowica prysznicowa opisuje geometrię reaktora PECVD (rysunek 6) i służy jako źródło potencjału pola elektrycznego²⁷.

Aby zdefiniować układ kropek katalizatora za pomocą litografii wiązką elektronów, zastosowaliśmy rezystancję wiązki elektronów (polimetakrylan metylu), a następnie użyliśmy wiązki elektronów do wykonania małych otworów w rezyście o określonym kształcie i w określonych miejscach na płytce. Otwory o żądanej średnicy umieszczano na regularnej siatce o zdefiniowanym rozstawie (skoku), a przed załadowaniem podłoża do maszyny do narzędzia do litografii wiązką elektronów ładowano plik określający pożądany wzór. Oprócz wysokości włókien, kolejnym krytycznym parametrem dla udanego transferu włókien jest ilość czasu spędzonego w kąpieli acetonowej. Folie VACNF należy pozostawić w kąpieli acetonowej na tyle długo, aby ich krawędzie zaczęły się zwijać; Jeśli zostaną pozostawione w kąpieli acetonowej zbyt krótko, trudniej będzie je oderwać od wiórów i mogą pęknąć. Im starsze są wióry, tym dłużej będą musiały pozostać w kąpieli acetonowej. Po kąpieli acetonowej folie/wióry umieszczono w izopropanolu i wodzie w celu usunięcia acetonu dostępowego, a także usunięcia ochronnego fotorezystu z włókien.

Aby wykonać powlekanie wirowe, wafle lub kawałki wafli umieszcza się na uchwycie próżniowym w powlekarce wirowej, a środkowe położenie płytki jest weryfikowane za pomocą funkcji testowej powlekarki wirowej. Mała kałuża (~ 2,5 cm średnicy) rezystu jest nakładana na środek wafla i przędzona (3000 obr./min przez 45 s) Obrazy włókien przed i po powlekaniu wirowania są zawarte na rysunku 8 pokazującym zachowanie geometrii włókien (wysokość, orientacja i skok). Obecność włókien powoduje pęcznienie oporu u podstawy włókien i skutkuje grubszymi niż oczekiwano warstwami. Powlekanie wirowe po wzroście VACNF było badane przez inne grupy^11,18.

Kolejnym krokiem w procesie, który ma kluczowe znaczenie, jest zapewnienie, że do chipów/folii VACNF zostanie przyłożona odpowiednia siła. Mechanizm dostarczania jest zależny od włókien tworzących małe nakłucia w ścianach komórkowych za pomocą siły impulsu pęsety stukającej w sztywne podłoża ^6,7 lub toczącej się mini-aplikatorem do makijażu na elastycznych podłożach. Włókna mogą, ale nie muszą, odrywać się i pozostawać osadzone w komórkach roślinnych ^6,7 bez wpływu na wynik, ale praktyka w połączeniu z badaniem pod kątem wychwytu barwnika i uszkodzenia tkanek jest konieczna, aby uzyskać właściwe ciśnienie. Ponadto ważne jest, aby wybrać odpowiednie punkty czasowe obrazowania po dostarczeniu DNA za pomocą chipów/folii VACNF, ponieważ czas do wykrytej ekspresji różni się w zależności od gatunku rośliny i typów dostarczanych wektorów⁷ (Figura 16).

Choć metoda ta ma szerokie zastosowanie do roślin, ma kilka ograniczeń. Na przykład dodanie cienkiej warstwy tlenku krzemu do folii VACNF nie zawsze powoduje, że folie są całkowicie hydrofilowe ze względu na ochronną warstwę fotorezystu dodaną na wierzch SU-8. Jeśli ten problem się zmaterializuje, grubsze warstwy tlenku krzemu mogą zostać zastosowane do VACNF. Aby sprawdzić, czy folie są hydrofobowe czy hydrofilowe, można je umieścić w wodzie. Jeśli folie toną, są hydrofilowe, a jeśli unoszą się na wodzie, są hydrofobowe. Dodatkowo mogą występować różnice między partiami wyprodukowanych włókien. Istnieje kilka parametrów, które można zmienić podczas uprawy włókien w maszynie dc -PECVD; to, co jest opisane w tym protokole, to zestaw parametrów dla dwóch różnych ilości katalizatora Ni. Dodatkowo, orientacja krystaliczna katalizatora Ni nie może być kontrolowana²⁸ i pewne rozgałęzienia nieuchronnie doprowadzą do powstania włókien.

Podczas gdy w tym artykule wykazaliśmy dostarczanie barwnika fluoresceiny i DNA do komórek roślinnych przy użyciu zarówno sztywnych, jak i elastycznych substratów, metoda ta powinna mieć szerokie zastosowanie w przypadku innych biomolekuł i podejść do modyfikacji genetycznej, na przykład wyciszania RNAi dla systemów roślinnych, takich jak jabłka lub inne owoce, gdzie wytworzenie stabilnych linii transgenicznych zajęłoby lata. Co więcej, włókna te mogą być również wykorzystywane do dostarczania materiałów do edycji genetycznej lub do stabilnych przemian w roślinach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
13" x 13" Biały 1/4-krotny wytrzymały przemysłowy ręcznik sklepowy Brawny 70Ct	Fastenal
2-Propanol (IPA)	Fischer Scientific	A451-4
4" Pokrywa	Entegris	H22-401-0615	Nośniki wafli
4" Taca	Entegris	H22-40-0615	Nośniki wafli Piła
do krojenia w kostkę Accretech SS10 Accreteck		SS10
Aceton	Fischer Scientific	A18-4
Aceton stosowany w pomieszczeniu czystym w ORNL	JT Baker	9005-05
Jabłka	Sklep spożywczy	Brak numeru
Arabidopsis thaliana	Nasiona akcesji Columbia z laboratorium profesora Jeana Greenberga na Uniwersytecie w Chicago	Brak numeru
Maszyna do chemicznego osadzania z fazy gazowej wzmocnionej plazmą węglową	Oak Ridge National Laboratory	Sałata
	Nasiona z laboratorium profesora Richarda Michelmore'a na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis	Brak numeru produktu	Sałata maślana
Barwnik fluoresceinowy	Sigma Aldrich	F2456-2.5G
Gel-box	Żel-Pak	AD-23C-00-X4
Heidelberg DWL 66 narzędzie do litografii bezpośredniego zapisu	Heidelberg	DWL 66
ImageJ	Narodowe Instytuty Zdrowia	Brak numeru
Izoproponal (IPA) stosowany w pomieszczeniach czystych w ORNL	Doe and Ingalls	CMOS Grade 9079-05
JEOL 9300FS 100kV system litografii wiązką elektronów	JEOL	8100
Kimwipes	Kimtech	Kimberly-Clark Professional 34120
Kord-Valmark jednorazowa polistyrenowa szalka Petriego	VWR	11019-554
Edytor układu	juspertor GmbH	Brak numeru produktu
Mikroskop konfokalny LSM 710	Zeiss	Brak numeru
Mikroskop konfokalny LSM 800	Zeiss	Brak numeru
Aplikator do makijażu	Amazon	G2PLUS	500 SZTUK Jednorazowe mikro aplikatory Pędzel do makijażu i higieny osobistej (średnica głowy: 1,5 mm) - 5 x 100 sztuk
Skaningowy mikroskop elektronowy z emisją pola Merlin	Zeiss	Merlin
MIBK/IPA  (keton metylowo-izobutylowy/izopropanol) (1:3)	Microchem	M089025
Cebula	Sklep spożywczy	Brak numeru
Oxford FlexAl Osadzanie warstw atomowych	Oxford	FlexAl
PMMA 495 A4	Microchem	M130004
PMMA 950 A4	Microchem	M230004	Może rozcieńczać do A2
Politereftalan etylenu (PET)	Amazon	KS-6304-21-11	Typ D Przezroczysty arkusz PET (poliester) .0005" Gruby x 27" Szerokość x 10 stóp Długość 1 szt
Precyzyjna pęseta	Aven Inc.	18032TT
pUBQ10:YFP-GW	Arabidopsis Biological Resource Center	CD3-1948
Wytrawiacz krzemowy (używany do descum)	Oxford	Plasmalab
Zestaw gumy silikonowej	Smooth-On Inc	Ecoflex 00-20
Wafle silikonowe	Pure Wafer	4N0.001-.005SSP-INV
Powlekarka wirowa	Brewer Sciences	Model 100CB
SPR 955cm 0,7	Megaposit	10018314
Truskawki	Sklep spożywczy	Brak numeru
SU-8 2015	Microchem	SU-8 2000	Series Toksyczny. Obchodź się ostrożnie. Podczas pracy z SU-8 2000 należy nosić okulary chemiczne, rękawice chemiczne i odpowiednią odzież ochronną. Nie dostać się do oczu, na skórę lub ubranie.
SU-8 developer	Microchem	SU-8 2000 Series	Obchodzić się ostrożnie. Podczas pracy z SU-8 2000 należy nosić okulary chemiczne, rękawice chemiczne i odpowiednią odzież ochronną. Nie dostać się do oczu, na skórę lub ubranie.
Suss MicroTec aligner kontaktowy	Suss MicroTec	MA6/BA6
Mikroskop stołowy	Phenom XL	służy do sprawdzania katalizatorów Ni po osadzaniu
Parownik e-beam Thermionics VE-240	Thermionics	VE-240