Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus

2.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65631

⸱

2 czerwca 2023

 ,  ,  , 
1Medicine School, Huaqiao University, 2Engineering Research Centre of Molecular Medicine of Ministry of Education

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę oczyszczania powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus, która jest prosta, tania i efektywna.

Streszczenie

Enzym fibrynolityczny z Sipunculus nudus (sFE) to nowy czynnik fibrynolityczny który może zarówno aktywować plazminogen do plazminy, jak i bezpośrednio rozkładać fibrynę, wykazując ogromne zalety w porównaniu z tradycyjnymi środkami trombolitycznymi. Jednak ze względu na brak informacji strukturalnych wszystkie programy oczyszczania sFE opierają się na wieloetapowych oczyszczaniach chromatograficznych, które są zbyt skomplikowane i kosztowne. W tym przypadku po raz pierwszy opracowano protokół oczyszczania powinowactwa sFE w oparciu o strukturę krystaliczną sFE; obejmuje przygotowanie próbki surowej i kolumny chromatografii powinowactwa matrycy lizyny/argininy-agarozy, oczyszczanie powinowactwa i charakterystykę oczyszczonego sFE. Zgodnie z tym protokołem partię sFE można oczyścić w ciągu 1 dnia. Co więcej, czystość i aktywność oczyszczonego sFE wzrasta do 92% i 19,200 U/mL, odpowiednio. Jest to więc proste, niedrogie i wydajne podejście do oczyszczania sFE. Opracowanie tego protokołu ma ogromne znaczenie dla dalszego wykorzystania sFE i innych podobnych środków.

Wprowadzenie

Zakrzepica jest poważnym zagrożeniem dla zdrowia publicznego, zwłaszcza po globalnej pandemii Covid-191,2. Klinicznie wiele aktywatorów plazminogenu (PA), takich jak tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) i urokinaza (Wielka Brytania), jest szeroko stosowanych jako leki trombolityczne. PA mogą aktywować plazminogen pacjentów do aktywnej plazminy w celu degradacji fibryny. W związku z tym ich skuteczność trombolityczna jest silnie ograniczona przez status plazminogenu pacjentów3,4. Leki fibrynolityczne, takie jak plazmina metaloproteinazy i plazmina serynowa, są innym rodzajem klinicznych leków trombolitycznych, które obejmują również enzymy fibrynolityczne (FE), takie jak plazmina, które mogą bezpośrednio rozpuszczać skrzepy, ale są szybko inaktywowane przez różne inhibitory plazminy5. Następnie doniesiono o nowym typie środka fibrynolitycznego, który może rozpuścić skrzeplinę, nie tylko poprzez aktywację plazminogenu w plazminę, ale także bezpośrednią degradację fibryny6-enzym fibrynolitytyczny ze starożytnego robaka arachidowego Sipunculus nudus (sFE)6. Ta dwufunkcyjna daje sFE inne zalety w porównaniu z tradycyjnymi lekami trombolitycznymi, zwłaszcza pod względem nieprawidłowego statusu plazminogenu. W porównaniu z innymi dwufunkcyjnymi środkami fibrynolitycznymi7,8,9, sFE wykazuje kilka zalet, w tym bezpieczeństwo, w porównaniu ze środkami niepochodzącymi z żywności w opracowywaniu leków, zwłaszcza w przypadku leków doustnych. Dzieje się tak dlatego, że bezpieczeństwo biologiczne i biokompatybilność Sipunculus nudus zostały dobrze ugruntowane10.

Podobnie jak w przypadku innych naturalnych czynników fibrynolitycznych wyizolowanych z mikroorganizmów, dżdżownic i grzybów, oczyszczanie sFE z S. nudus jest bardzo skomplikowane i obejmuje wiele etapów, takich jak homogenizacja tkanek, wytrącanie siarczanu amonu, odsalanie, chromatografia wymiany anionowej, chromatografia oddziaływań hydrofobowych i przesiewanie molekularne10,11,12. Taki system oczyszczania zależy nie tylko od biegłych umiejętności i drogich materiałów, ale także wymaga kilku dni na wykonanie całej procedury. Dlatego prosty program oczyszczania sFE ma ogromne znaczenie dla dalszego rozwoju sFE. Na szczęście dwa kryształy sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) zostały pomyślnie uzyskane (patrz Plik Uzupełniający 1 i Plik Uzupełniający 2). Dzięki analizie strukturalnej i eksperymentom dokowania molekularnego odkryliśmy, że katalityczny rdzeń sFE może specyficznie wiązać się z celami zawierającymi reszty argininy lub lizyny.

Tutaj po raz pierwszy zaproponowano system oczyszczania powinowactwa, oparty na strukturze krystalicznej sFE. Postępując zgodnie z tym protokołem, wysoce czysty i wysoce aktywny sFE może zostać oczyszczony z surowych ekstraktów w jednym etapie oczyszczania z powinowactwem. Opracowany tutaj protokół jest ważny nie tylko dla przygotowania sFE na dużą skalę, ale może być również stosowany do oczyszczania innych środków fibrynolitycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie

  1. Przykładowe traktowanie
    1. Ostrożnie wypreparuj świeży S. nudus (100 g) i zbierz jelito oraz jego płyn wewnętrzny.
    2. Dodać 300 ml buforu Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) do homogenizacji (1,000 obr./min, 60 s).
    3. Zamroź i rozmroź homogenat 3x.
    4. Odwirować próbkę (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) i zebrać supernatant. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  2. Wytrącanie białek
    1. Zmieszać supernatant z nasyconym roztworem siarczanu amonu (dziewięć objętości) i pozostawić mieszaninę na 12 godzin w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Protokół można wstrzymać w tym miejscu i kontynuować później.
    2. Odwirować (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) w celu uzyskania osadu białkowego; przechowywać go w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.
  3. Resuspensja białek
    1. Zawiesić osad białkowy za pomocą 30 ml buforu Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4). Przechowywać ten surowy roztwór białka w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.

2. Chromatografia powinowactwa

  1. Filtracja roztworu
    1. Przefiltrować surowy roztwór białka przez membranę filtracyjną o wielkości 0,22 μm. Przechowywać tę próbkę w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania.
  2. Wypełnienie kolumn
    1. Kolumnę chromatograficzną powinowactwa do matrycy argininowo-agarozowej i kolumnę chromatografii powinowactwa do chromatografii z matrycą lizyny-agarozy należy załadować odpowiednią ilość pożywki z matrycy lizyny-agarozy i pożywki z matrycą argininowo-agarozową do 5 ml pustych kolumn chromatograficznych.
      UWAGA: Kolumna może być przechowywana w temperaturze 2-8 °C, z matrycą zanurzoną w buforze magazynowym (20% etanolu).
  3. Oczyszczanie powinowactwa
    1. Zrównoważyć kolumnę chromatograficzną powinowactwa najpierw z ddH2O (1 ml/min, 10 objętości kolumny), a następnie buforem Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, 1 ml/min, 5 objętości kolumny).
    2. Załadować próbkę roztworu białka do wstępnie zrównoważonej kolumny (1 ml/min, objętość 1/3 kolumny).
      UWAGA: Objętość załadowanej próbki zależy od stężenia sFE.
    3. Przemyć kolumnę buforem Tris-HCl (0,02 M, pH 8,0, pięć objętości kolumny).
    4. Eluować kolumnę kolejno 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M i 0,65 M NaCl (1 ml / min, pięć objętości kolumny).
    5. Poszukaj piku elucji, który powinien pojawić się w elucji 0,15 M NaCl, a następnie zbierz frakcje w probówkach o pojemności 5 ml.
    6. Zagęścić próbkę elucyjną przy użyciu ultrafiltra odśrodkowego o masie 3 kD (3,944 × g, 1,5 h, 4 °C). Przechowywać tę próbkę w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.

3. Ocena czystości

  1. Preparat w żelu do elektroforezy poliakryloamidowej dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE)
    1. Przygotuj żel SDS-PAGE zgodnie z metodą Laemmli, używając 5% skoncentrowanego żelu i 12% żelu separacyjnego13.
  2. Elektroforezy
    1. Wymieszać próbkę (15 μl) z 5x buforem ładującym białko SDS-PAGE (1/4 objętości), podgrzewać we wrzącej wodzie przez 5 minut, naładować na żel SDS-PAGE i uruchamiać żel przy napięciu 80 V, 60 mA przez 1,5 godziny.
  3. analiza
    1. Po elektroforezie należy wybarwić żel zestawem Silver Stain Kit, zgodnie z protokołem producenta, a następnie obserwować zabarwiony żel za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.
    2. Analizuj czystość białka docelowego, stosując następujący wzór: czystość białka docelowego = wartość intensywności białka docelowego/wartość intensywności białka całkowitego.

4. Ocena aktywności fibrynolitycznej

  1. Przygotowanie płytki fibrynowej
    1. Przygotuj roztwór fibrynogenu, mieszając 25 mg fibrynogenu z 1,25 ml soli fizjologicznej.
    2. Przygotować roztwór trombiny, całkowicie mieszając 100 j. trombiny z 1,05 ml soli fizjologicznej.
    3. Przygotować roztwór agarozy, dodając 0,5 g agarozy do 22,5 ml buforu Tris-HCl (0,02 mol/l, pH 7,4). Wymieszać i podgrzać roztwór agarozy w temperaturze 100 °C aż do całkowitego rozpuszczenia.
    4. Schłodzić roztwór agarozy do temperatury około 50 °C i dodać roztwór fibrynogenu. Następnie natychmiast dodaj roztwór trombiny, szybko wymieszaj i wlej do naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm.
  2. Ładowania
    1. Przebić dołki o średnicy 3 mm na przygotowanych płytkach fibrynowych za pomocą sterylnego świdra i napełnić studzienki próbkami o objętości 10 μl.
  3. analiza
    1. Po 18 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C zmierzyć aktywność fibrynolityczną poprzez obliczenie wielkości ich stref rozkładu. Aktywność fibrynolityczna = (wielkość strefy próbki/ wielkość strefy urokinazy) x 100 U. Wielkość strefy = średnica x średnica.
      UWAGA: Bufor soli fizjologicznej, białko surowe (próbka uzyskana w kroku protokołu 1.3.1) i urokinaza zostały użyte odpowiednio do ślepej próby, kontroli ujemnej i kontroli pozytywnej. W porównaniu z urokinazą stwierdziliśmy, że aktywność fibrynolityczna oczyszczonego sFE wynosiła ~19 200 U/ml.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zgodnie z niniejszym protokołem wyekstrahowano surowe lizaty tkankowe, przygotowano kolumny do chromatografii powinowactwa z macierzą arginino-agarozową oraz lizyno-agarozową, otrzymano oczyszczone sFE, a następnie za pomocą SDS-PAGE oraz płytek fibrynowych zmierzono odpowiednio czystość i aktywność fibrynolityczną oczyszczonego sFE.

Po wirowaniu zebrany nadsącz stanowił przezroczysty, beżowy, lepki płyn. Wytrącanie rozpoczęło się po zmieszaniu tego nadsączu z nasyconym roztworem siarczanu amo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ze względu na niedostępność dokładnej sekwencji genu sFE, obecnie stosowany sFE został wyekstrahowany ze świeżego S. nudus14. Co więcej, procedury oczyszczania sFE opisywane w literaturze były skomplikowane i kosztowne, ponieważ opierały się na pewnych ogólnych cechach sFE, takich jak masa cząsteczkowa, punkt izoelektryczny, siła jonowa i polarność15,16. Do tej pory nie zgłoszono żadnego protokołu oczyszczania powinowactwa sFE. W ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Biuro Nauki i Technologii miasta Xiamen (3502Z20227197) oraz Biuro Nauki i Technologii prowincji Fujian (nr 2019J01070, No.2021Y0027).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
30% Akrylamid-Bisakryloamid (29:1)Biosharp
2-merkaptoetanolSolarbio
Agaroza G-10Biowest
Nadsiarczan amonuSINOPHARM
Siarczan amonuSINOPHARM
Arginina-Sefaroza 4BSolarbioMatryca argininowo-agarozowa
Niebieski bromoksylenol (BPB)Solarbio
Fast Silver BejcaBeyotime
FibrinogenMerck
GlicynaSolarbio
Kwas solnySINOPHARM
KinazaRHAWN
Lizyna-Sefaroza 4BSolarbiolizynowo-agarozowa
N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)Sigma-Aldrich
Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)Beyotime
Chlorek soduSINOPHARM
Dodecylosiulfonian sodu (SDS)Sigma-Aldrich
Wodorotlenek soduSINOPHARM
TrombinMeilunbio
Tris(Hydroksymetylo)AminometanSolarbio
Tris(Hydroksymetylo)Aminometan ChlorowodorekSolarbio
Equipment
AKT Aprotein Purification System czystyGE
Automatyczny pionowy sterylizator parowy MLS-3750chemiluminescencyjnego SANYO
Pompa o stałym przepływie GE
DGG-9140ADSENXIN
Elektryczny homogenizator szkła DY89-IISCIENTZ
Elektroniczna waga analitycznaDENVER
Elektrotermostatyczna łaźnia wodna DK-S12SENXIN
Pozioma wytrząsarka do odbarwianiaKylin-Bell
Maszyna do lodu AF 103Scotsman
KQ-500E Myjka ultradźwiękowaShuMei
Mieszadło magnetyczneZhi wei
chłodzeniem H1650-WCence
Kuchenka mikrofalowaGalanz
Milli-Q Referencyjnamiliporowa
Thermo Fisher Scientific
Precyzyjny pH-metr na biurkoSartorious
Mały oscylator wirowyKylin-Bell
Pionowy system elektroforezyBio-Rad
Materiał eksploatacyjny 
200 i mikro; L Probówka do PCR (200 &mikro; L)Axygene
(1,5 ml)
(5 mL)Biosharp
(50 ml)
(7 mL)Biosharp
(60 mm)
(0,22 &mikro; m)Millex GP
ParafilmBemis
(1 ml) KońcówkaKIRGEN
(10 &mikro; L)Axygene
(200 &mikro; L)Axygene
Ultra Filtr odśrodkowy TZAKZY
(4 ml 3 KDa)Uniwersalny
Macierz System obrazowania Inkubator stałej temperatury BT-100 QITE Wirówka z chłodzeniem JINGHONG 3-30KS SIGMA DHG Series Piec grzewczy i suszący Mikrowirówka z pipeta Probówka wirówkowa Probówka wirówkowa Biosharp Probówka wirówkowa Probówka wirówkowa NEST Naczynie hodowlane Membrana filtracyjna NEST Końcówka do pipet do pipet Końcówka do pipet Specjalny papier wskaźnikowy (15 ml 3 KDa)Filtr ultra odśrodkowy Millipore odczynnik SSS do wskaźnika pH Millipore

Bibliografia

  1. Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
  2. Schultz, N. H., et al. Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England. Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).
  3. von Kaulla, K. N. Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots. Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).
  4. Van de Werf, F., et al. Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).
  5. Schaller, J., Gerber, S. S. The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).
  6. Ge, Y. -H., et al. A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).
  7. Liu, X., et al. Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus. Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).
  8. Choi, J. -H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -J. Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential. Biochimie. 105, 45-57 (2014).
  9. Liu, H., et al. A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419(2022).
  10. Wu, Y., et al. Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta. Marine Drugs. 18 (3), 158(2020).
  11. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
  12. Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus. Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).
  13. Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).
  14. Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus. Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).
  15. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).
  16. Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin. The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).
  17. Wiman, B. Affinity-chromatographic purification of human α2-antiplasmin. The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).
  18. Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors. The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).
  19. Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments. Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).
  20. Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants. Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).
  21. Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients. Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wytrącanie białekagaroza z argininąagaroza z lizynąchromatografia powinowactwatest na płytkach z fibrynąelucja gradientowaaktywność fibrynolityczna
Oczyszczanie powinowactwa enzymu fibrynolitycznego z Sipunculus nudus
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.