Artykuł metodologiczny

Badanie działania farmakologicznego i mechanizmu molekularnego salidrozydu w hamowaniu proliferacji i migracji komórek MCF-7

DOI:

10.3791/65634

⸱

9 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pathology Department, Suining Central Hospital, 2General Surgery Day Ward, Department of General Surgery, the Third People's Hospital of Chengdu & the Affiliated Hospital of Southwest Jiaotong University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje kompleksową strategię oceny działania farmakologicznego i mechanizmu salidrozydu w hamowaniu proliferacji i migracji komórek MCF-7.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salidroside (Sal) zawiera przeciwnowotworowe, przeciw-hipoksyjne i przeciwzapalne działanie farmakologiczne. Jednak leżące u jego podstaw mechanizmy przeciw rakowi piersi zostały tylko nie w pełni wyjaśnione. W związku z tym protokół ten miał na celu rozszyfrowanie potencjału Sal w regulacji szlaku PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 w złośliwej proliferacji ludzkich komórek MCF-7 raka piersi. Po pierwsze, aktywność farmakologiczną Sal przeciwko MCF-7 oceniano za pomocą testów CCK-8 i zadrapań komórkowych. Ponadto oporność komórek MCF-7 mierzono za pomocą testów migracji i inwazji Matrigel. W przypadku apoptozy komórkowej i testów cyklicznych, komórki MCF-7 przetwarzano etapami za pomocą aneksyny V-FITC/PI i zestawów do wykrywania barwienia cyklu komórkowego do analiz cytometrii przepływowej. Poziomy reaktywnych form tlenu (ROS) i Ca2+ badano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego DCFH-DA i Fluo-4 AM. Aktywność Na+-K+-ATPazy iCa2+-ATPazy określono przy użyciu odpowiednich zestawów komercyjnych. Poziomy ekspresji białek i genów w apoptozie i szlaku PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 określono dalej za pomocą analiz western blot i qRT-PCR. Odkryliśmy, że leczenie Sal znacznie ograniczało proliferację, migrację i inwazję komórek MCF-7 z efektami zależnymi od dawki. Tymczasem podawanie Sal dramatycznie zmusiło komórki MCF-7 do poddania się apoptozie i zatrzymaniu cyklu komórkowego. Testy immunofluorescencyjne wykazały, że Sal obserwacyjnie stymulował produkcję ROS i Ca2+ w komórkach MCF-7. Dalsze dane potwierdziły, że Sal promował poziomy ekspresji białek proapoptotycznych, Bax, Bim, rozszczepionej kaspazy-9/7/3 i odpowiadających im genów. Konsekwentnie, interwencja Sal znacznie zmniejszyła ekspresję białek Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α i FoxO1 oraz odpowiadających im genów. Podsumowując, Sal może być stosowany jako potencjalny związek pochodzenia ziołowego w leczeniu raka piersi, ponieważ może zmniejszać złośliwą proliferację, migrację i inwazję komórek MCF-7 poprzez hamowanie szlaku PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako jeden z najczęściej diagnozowanych nowotworów i najczęściej diagnozowanych nowotworów, najnowsze statystyki wskazują, że do 2020 roku na całym świecie pojawiło się 2,3 miliona przypadków raka piersi, co stanowi 11,7% wszystkich przypadków raka1. Typowe objawy raka piersi to tkliwość i mrowienie piersi, guzki i ból piersi, upławy z brodawek, nadżerka lub zapadnięta skóra oraz powiększone pachowe węzły chłonne1,2. Jeszcze bardziej niepokojące jest to, że liczba nowych przypadków i ogólna częstość występowania raka piersi nadal rosną w przytłaczającym tempie każdego roku, odpowiadając za 6,9% zgonów związanych z rakiem1. Obecnie interwencja w kierunku raka piersi nadal obejmuje głównie chemioterapię, chirurgię, radioterapię i kompleksowe leczenie. Chociaż leczenie może skutecznie zmniejszyć częstość nawrotów i śmiertelność pacjentów, długotrwałe stosowanie leczenia często powoduje oporność wielolekową, wypadanie włosów na dużych obszarach, nudności i wymioty oraz poważne obciążenie psychiczne i psychiczne2,3. Warto zauważyć, że potencjalne ryzyko przerzutów raka piersi do wielu narządów zmusza również ludzi do poszukiwania nowych ziołowych źródeł terapii lekowej4,5.

Sygnalizacja za pośrednictwem kinazy fosfoinozytolu 3 (PI3K) jest zaangażowana we wzrost, proliferację i przeżycie raka piersi poprzez splicing, który wpływa na ekspresję wielu genów6. Jako białko PI3K wykrywające sygnał, liczne dowody sugerują, że kinaza białkowa B (AKT) może łączyć się z celem ssaków białka rapamycyny (mTOR) w celu dalszego wzrostu raka piersi7,8,9. Co więcej, dezaktywacja sygnalizacji PI3K/AKT/mTOR została również uznana za kluczowy składnik leków hamujących złośliwą proliferację i stymulujących apoptozę w raku piersi10,11,12. Powszechnie wiadomo, że ekstremalne niedotlenienie w mikrośrodowisku guza wymusza ogromny wzrost indukowanego hipoksją czynnika 1 alfa (HIF-1α), co dodatkowo pogarsza postęp raka piersi13,14,15. Równolegle stymulacja AKT prowadzi również do nadmiernej akumulacji HIF-1α, ograniczając apoptozę w próbkach raka piersi16,17. Co ciekawe, potwierdzono, że aktywacja sygnalizacji PI3K-AKT-HIF-1α jest zaangażowana w patologiczną progresję i przerzuty w różnych nowotworach, w tym w raku płuc18, raku jelita grubego19, raku jajnika20 i raku prostaty21. Oprócz tego, że jest koordynowany przez HIF-1α, nadekspresja czynnika transkrypcyjnego 1 (FoxO1) rozwidlonej głowy jest również wywoływana przez stymulację sygnalizacji AKT, która sprzyja zatrzymaniu cyklu i zahamowaniu apoptozy w komórkach raka piersi22,23. Podsumowując, powyższe solidne dowody sugerują, że hamowanie kaskady sygnalizacji PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 może być potencjalnym nowym celem terapii lekowej w raku piersi.

Salidroside (Sal) ma szeroko udowodnione działanie przeciwnowotworowe24,25, anti-hypoxia26,27,28,29 oraz działania farmakologiczne wzmacniające odporność30. Jest to jasnobrązowy lub brązowy proszek, który jest łatwo rozpuszczalny w wodzie, jest rodzajem glikozydu fenyloetanoidowego i ma wzór struktury chemicznej C14H20O7 i masę cząsteczkową 300,3 < sup class = "xref" >31,32. Nowoczesne badania farmakologiczne wykazały, że Sal może promować apoptozę komórek raka żołądka poprzez hamowanie sygnalizacji PI3K-AKT-mTOR24. Dalsze dowody sugerują również, że tłumienie sygnalizacji PI3K-AKT-HIF-1α przez leczenie Sal może przyczyniać się do apoptozy komórek rakowych poprzez zwiększenie ich wrażliwości na środki chemioterapeutyczne25. Dowody sugerują również, że Sal ogranicza migrację i inwazję komórek oraz powoduje zatrzymanie cyklu poprzez promowanie apoptozy w ludzkich komórkach MCF-7 raka piersi33,34. Jednak dopiero okaże się, czy Sal może regulować sygnalizację PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 i hamować złośliwą proliferację komórek MCF-7. Dlatego protokół ten miał na celu zbadanie wpływu Sal na migrację komórek MCF-7, inwazję, cykl komórkowy i apoptozę za pośrednictwem szlaku PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Zintegrowane strategie badawcze obejmujące konwencjonalne, tanie i niezależne eksperymenty, takie jak ocena migracji i inwazji komórek, apoptoza i wykrywanie cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej, reaktywne formy tlenu (ROS) i oznaczanie fluorescencji Ca2 + itp., mogą stanowić punkt odniesienia dla ogólnego projektu eksperymentów w badaniach przeciwnowotworowych z tradycyjną medycyną ziołową. Proces eksperymentalny tego badania jest pokazany na Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogniwa MCF-7 użyte w niniejszym badaniu zostały uzyskane z komercyjnego źródła (zobacz Tabelę Materiałów).

1. Hodowla komórkowa

  1. Hodować komórki MCF-7 w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C z DMEM zawierającym 10% FBS i 1% penicyliny (10 000 U/ml)/streptomycyny (10 000 μg/ml) (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Komórki pokrywające 90% dna naczynia wykorzystano do eksperymentu i przydzielono do następujących grup: grupa kontrolna, grupa chlorowodorku doksorubicyny (DXR, 5 μM) i grupa Sal (20 μM, 40 μM i 80 μM) lub grupa kontrolna, grupa LY294002 (10 μM, inhibitor PI3K), Grupa Sal (80 μM) i grupa LY294002 (10 μM) + grupa Sal (80 μM) (patrz tabela materiałów).

2. Test żywotności komórek

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tej procedury, zapoznaj się z poprzednim raportem27.

  1. Wysiewaj komórki MCF-7 o gęstości 8 x 104 komórki/basenik na 96-dołkowych płytkach i inkubuj z Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM i 320 μM) przez 24 godziny lub Sal (20, 40, 80 μM) przez 12 godzin/24 godziny/36 godzin/48 godzin przez noc, aż komórki będą przylegać.
  2. Po poddaniu działaniu substancji należy inkubować komórki MCF-7 z 10 μl/studzienkę roztworu CCK-8 (patrz tabela materiałów) przez 2 godziny. Następnie zmierz gęstość optyczną przy 450 nm (OD450) za pomocą automatycznego czytnika mikropłytek.

3. Migracja i inwazja komórek

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tej procedury, zapoznaj się z poprzednim raportem35.

  1. Inkubować 2 ml komórek 5 x 10po 6 komórek/ml wysianych na płytkach 6-dołkowych, aby pokryć 90% dna naczynia.
  2. Wykonaj liniowe zadrapanie nawinięte wzdłuż środka monowarstwy komórki za pomocą sterylnej końcówki pipety. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu optycznego po 0 godzinach, 24 godzinach i 48 godzinach.
  3. Użyj oprogramowania Image J, aby zmierzyć szerokość ran po zadrapaniach.
  4. W przypadku testu transwell, zawiesić komórki MCF-7 bez pożywki surowicy i wysiew w górnej komorze transwell wstępnie pokryte Matrigelem lub bez niego (patrz Tabela materiałów).
  5. Na dnie komory transwell użyj kompletnego medium DMEM jako induktora chemicznego. Po 24 godzinach usuń komórki z górnej komory i utrwal pozostałe komórki inwazyjne i migrujące w metanolu35.
  6. Wybarwić ogniwa MCF-7 roztworem fioletu krystalicznego (patrz Tabela materiałów). Uchwyć obrazy za pomocą mikroskopu optycznego.

4. Ocena aktywności Na+-K+-ATPazy i Ca2+-Mg2+-ATPazy

  1. Użyj zestawu kwasu bicinchoninowego (BCA) do pomiaru stężenia białka w lizowanych komórkach MCF-7, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
    1. Dodaj próbki zlizowanych komórek w odpowiadających im grupach do 96-dołkowych płytek. Następnie dodać roztwór roboczy, aby kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Na koniec zmierz wartości OD636 za pomocą wielofunkcyjnego czytnika mikropłytek.

5. Analiza apoptozy i cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tej procedury, zapoznaj się z poprzednim raportem31.

  1. Trawić komórki i zbierać w celu ponownego zawieszenia w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) na 20 minut barwienia aneksyną V-FITC i jodkiem propidyny (PI) (patrz Tabela materiałów), a następnie określić liczbę komórek apoptotycznych za pomocą cytometru przepływowego.
  2. Zmieszać zawieszony roztwór próbki z roztworem PI przez 30 minut inkubacji, a następnie wykryć za pomocą cytometru przepływowego.

6. Barwienie fluorescencyjne DCFH-DA i Fluo-4 AM

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tej procedury, zapoznaj się z poprzednim raportem29.

  1. Inkubować komórki MCF-7 przez 20 minut za pomocą sondy fluorescencyjnej 10 μM DCFH-DA (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C. Po dokładnym usunięciu nadmiaru DCFH-DA poprzez trzykrotne przemycie PBS, należy zbadać intensywność fluorescencji przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 488 nm i 525 nm za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
  2. Inkubować komórki MCF-7 w roztworze sondy fluorescencyjnej Fluo-4 AM o wielkości 5 μM (patrz tabela materiałów) przez 45 minut w temperaturze 37 °C. Po trzykrotnym przemyciu PBS oznaczyć wartości intensywności fluorescencji przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 488 nm i 516 nm za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

7. Western blot

  1. Dodać 2 ml zawiesin komórkowych 5 x 106 komórek/ml zawierających różne leki do płytek 6-dołkowych i hodować w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny
    UWAGA: Grupy do analizy western blot zostały ustalone w następujący sposób: grupa kontrolna, grupa LY294002 (10 μM), grupa Sal (80 μM) i grupa LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (patrz Tabela materiałów).
  2. Zebrać komórki i supernatant i odwirować w temperaturze 560 × g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć wstępnie schłodzonym PBS. Po każdym myciu odwirować komórki w temperaturze 560 × g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty.
  3. Dodać 50 μl buforu do lizy do próbki komórki z kroku 7.2 na 15-minutową kąpiel lodową. Wirować w temperaturze 8550 × g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu zebrania próbki białka sklarowanego nad osadem.
  4. Po wykryciu stężenia białka metodą BCA, wymieszać próbkę białka w kroku 7.3 z buforem ładującym w stosunku 4:1, denaturować w temperaturze 100 °C przez 10 minut w kąpieli metalowej i schłodzić do temperatury pokojowej.
  5. Dodać 20 μg próbki białka z kroku 7.4, oddzielić białka o różnych masach cząsteczkowych35za pomocą 10% SDS-PAGE (patrz tabela materiałów), a następnie przenieść na membrany PVDF o grubości 0,22 μm. Po zablokowaniu 5% BSA, inkubować błony z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Rozcieńczone stężenie następujących przeciwciał pierwszorzędowych wynosi 1:1,000: rozszczepiona kaspaza-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 i β-aktyna (patrz Tabela materiałów).
  6. Następnego dnia inkubować błony z kozim przeciwciałem drugorzędowym anty-króliczym IgG przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Rozwinąć błony za pomocą roztworu chemiluminescencyjnego ECL i uchwycić obrazy za pomocą bezkontaktowego ilościowego systemu obrazowania western blot (patrz tabela materiałów).

8. qRT-PCR

  1. Przeprowadzić wirowanie w celu zebrania komórek MCF-7 w temperaturze 560 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty i dodać 500 μl buforu RL1 do 5 × 106 komórek. Przedmuchać i kilkakrotnie wymieszać pipetą, aż nie będą widoczne masy komórek.
    UWAGA: Bufor RL1 jest jednym ze składników kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).
  2. Przenieść homogenaty komórkowe opisane w kroku 8.1 do kolumny czyszczącej DNA umieszczonej w probówce zbiorczej i odwirować przy 8,550 × g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty. Wyjąć kolumnę czyszczącą DNA i utrzymać supernatant w probówce zbiorczej.
    UWAGA: Kolumna czyszcząca DNA i probówka do pobierania to dwa składniki kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).
  3. Dodać 800 μl buforu RL2 do 500 μl supernatantu z kroku 8.2 i delikatnie wymieszać.
    UWAGA: Bufor RL2 jest jednym ze składników kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów). Przed użyciem dodać 120 ml bezwodnego etanolu do 60 ml buforu RL2.
  4. Przenieść 700 μl mieszaniny z etapu 8.3 do kolumny zawierającej tylko RNA umieszczonej w probówce zbiorczej i odwirować przy 8 550 × g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Wyrzucić odpady cieczy do probówki zbiorczej.
    UWAGA: Kolumna zawierająca tylko RNA jest jednym ze składników kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).
  5. Powtórz krok 8.4, aby przetworzyć pozostałą mieszaninę z kroku 8.3.
  6. Dodać 500 μl buforu RW1 do kolumny zawierającej tylko RNA i odwirować przy 8 550 × g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Wyrzucić odpady cieczy do probówki zbiorczej.
    UWAGA: Bufor RW1 jest jednym ze składników kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).
  7. Dodać 700 μl buforu RW2 do kolumny zawierającej tylko RNA i odwirować przy 8 550 × g w temperaturze 4 ◦C przez 1 minutę. Wyrzucić odpady cieczy do probówki zbiorczej. Powtórz krok 8.7 raz.
    UWAGA: Bufor RW2 jest jednym ze składników kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).
  8. Umieścić kolumnę zawierającą tylko RNA z powrotem w probówce zbiorczej i odwirować w temperaturze 8550 × g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty w celu usunięcia pozostałego buforu RW2.
  9. Przenieść kolumnę zawierającą tylko RNA do nowej probówki zbiorczej i wlać 100 μl wolnego od RNaz ddH2O podgrzanego w temperaturze 65 °C do środka membrany dla kolumny zawierającej tylko RNA. Umieścić w temperaturze 25 °C na 2 minuty i zebrać roztwór RNA przez odwirowanie w temperaturze 8 550 × g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę
    UWAGA: DDH2O bez RNaz jest jednym ze składników kompletnego zestawu do izolacji RNA (patrz Tabela materiałów).
  10. Dodać 4 μl 5x buforu reakcyjnego, 1 μl startera oligo (dT)18, 1 μl losowego startera heksameru, 1 μl startera specyficznego dla genu (patrz Tabela 1), 1 μl mieszaniny enzymów i 5 μg roztworu RNA z kroku 8.9 do 100 μl 8-probówkowego paska. Uzupełnij układ reakcyjny wodą wolną od RNaz do 20 μl.
  11. Ustawić warunki reakcji układu w następujący sposób: (1): 95 °C, 30 s, 1 cykl; (2): 95 °C, 5 s, 50 cykli, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 cykl, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; i (4): 42 °C, 30 s, 1 cykl. Wykonaj procedurę qRT-PCR.
    UWAGA: Względne poziomy ekspresji docelowych genów analizowano ilościowo metodą 2−ΔΔCT 36,37. Informacje o starterach każdego genu użytego do analizy qRT-PCR są wymienione w Tabeli 1.

9. Analiza statystyczna

  1. Wyraź dane jako średnią ± odchylenie standardowe trzech niezależnych eksperymentów.
  2. Analizuj porównania między wieloma grupami za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów i analizy (patrz tabela materiałów) z jednokierunkową analizą wariancji (ANOVA), a następnie testem Tukeya. W niniejszej pracy P < 0,05 określono jako istotne statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wpływ Sal na hamowanie nadmiernej proliferacji i opóźnianie gojenia się ran w komórkach MCF-7
Aby zbadać potencjał Sal w walce z rakiem piersi, najpierw przetestowaliśmy jego właściwości przeciwnowotworowe za pomocą testów toksyczności proliferacji komórek i zadrapań linii komórkowej MCF-7 ludzkiego raka piersi. Komórki te inkubowano jednocześnie z serią stężeń Sal (5-320 μM) przez 24 godziny, a proliferację komórek oceniano za pomocą testu CCK-8. Zaobserwowano zależny od dawki hamujący wpływ Sal na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak piersi dotyka osoby w każdym wieku i powoduje nieobliczalne obciążenie fizyczne i psychiczne oraz dużą presję ekonomiczną1. Rak piersi, ze względu na rosnącą z roku na rok zachorowalność i śmiertelność, przyciągnął również uwagę całego świata w zakresie poszukiwania skutecznych terapii ziołowych poza konwencjonalnymi metodami leczenia 4,5. Obiecująco, duża liczba dowodów ujawniła przeciwnowotworowe działanie Sal 24,25,38.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Komisję Zdrowia Prowincji Syczuan (120025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% penicylina/streptomycynaHyCloneSV30010
przeciwciało AKTImmunoWay Biotechnology CompanyYT0185
Zestaw Aneksin V-FITC/PIMultiSciences Biotech Co., Ltd.AP101
Automatyczny czytnik mikropłytekUrządzenia molekularneSpectraMax iD5
Bax przeciwciałoCell Signaling Technology, Inc.#5023
Zestaw BCABiosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2przeciwciało Cell Signaling Technology, Inc.#15071
Technologia sygnalizacji komórkowejprzeciwciał Bim#2933
Ca2+– Zestaw do oznaczania ATPazyInstytut Bioinżynierii Nanjing JianchengA070-4-2
Zestaw do liczenia komórek-8Biosharp Life SciencesBS350B
Zestaw do barwienia cyklu komórkowegoMultiSciences Biotech Co., Ltd.CCS012
rozszczepiona kaspaza-3Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc.#9661
rozszczepiona kaspaza-7Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc.#8438
rozszczepiona kaspaza-9Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc.#20750
Roztwór fioletu krystalicznegoBeyotime BiotechnologyC0121
DMEM pożywka do hodowli wysokiego poziomu glukozyServicebio Technology Co., Ltd.G4510
Chlorowodorek doksorubicynyMedChemExpressHY-15142
Roztwór chemiluminescencyjny ECLBiosharp Life SciencesBL520B
Płodowa surowica bydlęcaProcell Nauki przyrodnicze i Technologia Co., Sp. z o.o.164210
Cytometr przepływowyBDFACSCanto figure-materials-1
Fluo-4 AMBeyotime BiotechnologyS1060
Przeciwciało FoxO1ImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgGMultiSciences Biotech Co., Ltd.70-GAR0072
Oprogramowanie GraphPad PrismLa JollaWersja 6.0
HIF-1 i alfaprzeciwciało Powinowactwo BiosciencesBF8002
Ludzka linia komórkowa raka piersi MCF-7Procell Nauki przyrodnicze i Technologia Co., Sp. z o.o.CL-0149
Bufor załadowczyBiosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo 
przeciwciało mTORServicebio Technology Co., Ltd.
Na+– K+– Zestaw do oznaczania ATPazyInstytut Bioinżynierii Nanjing JianchengA070-2-2
Mikroskop optycznyOlympusIX71PH
przeciwciało p-AKTImmunoWay Biotechnology CompanyYP0006
Przeciwciało PI3KServicebio Technology Co., Ltd.
przeciwciało p-PI3KAffinity BiosciencesAF3241
Ilościowy system obrazowania western blotTouch Image ProeBlot
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA z odwrotną transkrypcjąServicebio Technology Co., Ltd.G3330-100
ROSBeyotime BiotechnologyS0033SDCFH-DA jest dołączona tutaj
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.Zestaw H-040
SDS-PAGEServicebio Technology Co., Ltd.G2003-50T
Zestaw do izolacji całkowitego RNAForegeneRE-03014
Hyklon trypsynySH30042.01
i beta;-aktynyPowinowactwo BiosciencesAF7018
, Inc.356234GB11405GB11525Zestaw testowy Sonda fluorescencyjna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
  3. Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
  4. Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285(2022).
  5. Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717(2022).
  6. Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Cancer Research. 82 (12), 2269-2280 (2022).
  7. Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
  8. Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748(2022).
  9. Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
  10. Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544(2022).
  11. Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191(2022).
  12. Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081(2022).
  13. Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
  14. You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
  15. La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
  16. Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
  17. Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
  18. Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940(2022).
  19. Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
  20. Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
  21. Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730(2019).
  22. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
  23. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
  24. Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726(2020).
  25. Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
  26. Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801(2019).
  27. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617(2021).
  28. Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015(2022).
  29. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278(2022).
  30. Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
  31. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  32. Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458(2020).
  33. Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
  34. Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
  35. Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847(2022).
  36. Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426(2020).
  37. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988(2022).
  38. Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine. 3, 100088(2022).
  39. Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
  40. Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188(2020).
  41. Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
  42. Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dzia anie salidrosydukom rki MCF 7rak piersimigracja kom rekszlak PI3K AKTapoptoza kom rekWestern blotcytometria przep ywowaqRT PCR

Powiązane artykuły