Obecny protokół opisuje kompleksową strategię oceny działania farmakologicznego i mechanizmu salidrozydu w hamowaniu proliferacji i migracji komórek MCF-7.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie działania farmakologicznego i mechanizmu molekularnego salidrozydu w hamowaniu proliferacji i migracji komórek MCF-7
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Salidroside (Sal) zawiera przeciwnowotworowe, przeciw-hipoksyjne i przeciwzapalne działanie farmakologiczne. Jednak leżące u jego podstaw mechanizmy przeciw rakowi piersi zostały tylko nie w pełni wyjaśnione. W związku z tym protokół ten miał na celu rozszyfrowanie potencjału Sal w regulacji szlaku PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 w złośliwej proliferacji ludzkich komórek MCF-7 raka piersi. Po pierwsze, aktywność farmakologiczną Sal przeciwko MCF-7 oceniano za pomocą testów CCK-8 i zadrapań komórkowych. Ponadto oporność komórek MCF-7 mierzono za pomocą testów migracji i inwazji Matrigel. W przypadku apoptozy komórkowej i testów cyklicznych, komórki MCF-7 przetwarzano etapami za pomocą aneksyny V-FITC/PI i zestawów do wykrywania barwienia cyklu komórkowego do analiz cytometrii przepływowej. Poziomy reaktywnych form tlenu (ROS) i Ca2+ badano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego DCFH-DA i Fluo-4 AM. Aktywność Na+-K+-ATPazy iCa2+-ATPazy określono przy użyciu odpowiednich zestawów komercyjnych. Poziomy ekspresji białek i genów w apoptozie i szlaku PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 określono dalej za pomocą analiz western blot i qRT-PCR. Odkryliśmy, że leczenie Sal znacznie ograniczało proliferację, migrację i inwazję komórek MCF-7 z efektami zależnymi od dawki. Tymczasem podawanie Sal dramatycznie zmusiło komórki MCF-7 do poddania się apoptozie i zatrzymaniu cyklu komórkowego. Testy immunofluorescencyjne wykazały, że Sal obserwacyjnie stymulował produkcję ROS i Ca2+ w komórkach MCF-7. Dalsze dane potwierdziły, że Sal promował poziomy ekspresji białek proapoptotycznych, Bax, Bim, rozszczepionej kaspazy-9/7/3 i odpowiadających im genów. Konsekwentnie, interwencja Sal znacznie zmniejszyła ekspresję białek Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α i FoxO1 oraz odpowiadających im genów. Podsumowując, Sal może być stosowany jako potencjalny związek pochodzenia ziołowego w leczeniu raka piersi, ponieważ może zmniejszać złośliwą proliferację, migrację i inwazję komórek MCF-7 poprzez hamowanie szlaku PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.
Wprowadzenie
Jako jeden z najczęściej diagnozowanych nowotworów i najczęściej diagnozowanych nowotworów, najnowsze statystyki wskazują, że do 2020 roku na całym świecie pojawiło się 2,3 miliona przypadków raka piersi, co stanowi 11,7% wszystkich przypadków raka1. Typowe objawy raka piersi to tkliwość i mrowienie piersi, guzki i ból piersi, upławy z brodawek, nadżerka lub zapadnięta skóra oraz powiększone pachowe węzły chłonne1,2. Jeszcze bardziej niepokojące jest to, że liczba nowych przypadków i ogólna częstość występowania raka piersi nadal rosną w przytłaczającym tempie każdego roku, odpowiadając....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ogniwa MCF-7 użyte w niniejszym badaniu zostały uzyskane z komercyjnego źródła (zobacz Tabelę Materiałów).
1. Hodowla komórkowa
- Hodować komórki MCF-7 w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C z DMEM zawierającym 10% FBS i 1% penicyliny (10 000 U/ml)/streptomycyny (10 000 μg/ml) (patrz tabela materiałów).
UWAGA: Komórki pokrywające 90% dna naczynia wykorzystano do eksperymentu i przydzielono do następujących grup: grupa kontrolna, grupa chlorowodorku doksorubicyny (DXR, 5 μM) i grupa Sal (20 μM, 40 μM i 80 μM) lub grupa kontrolna, grupa LY294002 (10 μM,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wpływ Sal na hamowanie nadmiernej proliferacji i opóźnianie gojenia ran w komórkach MCF-7
Aby zbadać potencjał Sal w walce z rakiem piersi, najpierw przetestowano jego właściwości przeciwnowotworowe, wykorzystując testy toksyczności proliferacyjnej oraz testy zarysowania (scratch assays) na ludzkiej linii komórkowej raka piersi MCF-7. Komórki te inkubowano wspólnie z serią stężeń Sal (5-320 µM) przez 24 h, a proliferację komórek oceniono za pomocą testu CCK-8. Zaobserwowano zależny od dawki efekt ham.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rak piersi dotyka osoby w każdym wieku i powoduje nieobliczalne obciążenie fizyczne i psychiczne oraz dużą presję ekonomiczną1. Rak piersi, ze względu na rosnącą z roku na rok zachorowalność i śmiertelność, przyciągnął również uwagę całego świata w zakresie poszukiwania skutecznych terapii ziołowych poza konwencjonalnymi metodami leczenia 4,5. Obiecująco, duża liczba dowodów ujawniła przeciwnowotworowe działanie Sal 24,25,38.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Komisję Zdrowia Prowincji Syczuan (120025).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1% penicylina/streptomycyna | HyClone | SV30010 | |
| przeciwciało AKT | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
| Zestaw Aneksin V-FITC/PI | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
| Automatyczny czytnik mikropłytek | Urządzenia molekularne | SpectraMax iD5 | |
| Bax przeciwciało | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
| Zestaw BCA | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
| Bcl-2 | przeciwciało Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
| Technologia sygnalizacji komórkowej | przeciwciał Bim | #2933 | |
| Ca2+– Zestaw do oznaczania ATPazy | Instytut Bioinżynierii Nanjing Jiancheng | A070-4-2 | |
| Zestaw do liczenia komórek-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
| Zestaw do barwienia cyklu komórkowego | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
| rozszczepiona kaspaza-3 | Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc. | #9661 | |
| rozszczepiona kaspaza-7 | Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc. | #8438 | |
| rozszczepiona kaspaza-9 | Technologia sygnalizacji komórkowej, Inc. | #20750 | |
| Roztwór fioletu krystalicznego | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| DMEM pożywka do hodowli wysokiego poziomu glukozy | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
| Chlorowodorek doksorubicyny | MedChemExpress | HY-15142 | |
| Roztwór chemiluminescencyjny ECL | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
| Płodowa surowica bydlęca | Procell Nauki przyrodnicze i Technologia Co., Sp. z o.o. | 164210 | |
| Cytometr przepływowy | BD | FACSCanto  | |
| Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
| Przeciwciało FoxO1 | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
| Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
| Oprogramowanie GraphPad Prism | La Jolla | Wersja 6.0 | |
| HIF-1 i alfa | przeciwciało Powinowactwo Biosciences | BF8002 | |
| Ludzka linia komórkowa raka piersi MCF-7 | Procell Nauki przyrodnicze i Technologia Co., Sp. z o.o. | CL-0149 | |
| Bufor załadowczy | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
| LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
| Matrigel | Thermo | ||
| przeciwciało mTOR | Servicebio Technology Co., Ltd. | ||
| Na+– K+– Zestaw do oznaczania ATPazy | Instytut Bioinżynierii Nanjing Jiancheng | A070-2-2 | |
| Mikroskop optyczny | Olympus | IX71PH | |
| przeciwciało p-AKT | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
| Przeciwciało PI3K | Servicebio Technology Co., Ltd. | ||
| przeciwciało p-PI3K | Affinity Biosciences | AF3241 | |
| Ilościowy system obrazowania western blot | Touch Image Pro | eBlot | |
| Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA z odwrotną transkrypcją | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
| ROS | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA jest dołączona tutaj |
| Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | Zestaw H-040 | |
| SDS-PAGE | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
| Zestaw do izolacji całkowitego RNA | Foregene | RE-03014 | |
| Hyklon trypsyny | SH30042.01 | ||
| i beta;-aktyny | Powinowactwo Biosciences | AF7018 |
Bibliografia
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
- Franzoi, M. A., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
