Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pobieranie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi z żyły ogonowej bocznej u szczurów podczas zapisów EEG

4.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65636

⸱

1 września 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Rehabilitation, Section of Pharmacology, Universita degli Studi di Ferrara

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół pokazuje powtarzające się pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi od szczurów z padaczką, wykonywane równolegle z ciągłym monitorowaniem wideo-elektroencefalogramu (EEG). Są one niezbędne do zbadania możliwych powiązań między zmianami w różnych cząsteczkach płynów ustrojowych a aktywnością napadową.

Streszczenie

Ponieważ skład płynów ustrojowych odzwierciedla wiele fizjologicznych i patologicznych dynamik, próbki płynów biologicznych są powszechnie uzyskiwane w wielu kontekstach eksperymentalnych do pomiaru interesujących molekuł, takich jak hormony, czynniki wzrostu, białka lub małe niekodujące RNA. Konkretnym przykładem jest pobieranie próbek cieczy biologicznych w badaniach nad biomarkerami padaczki. W tych badaniach pożądane jest porównanie poziomów cząsteczek w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) i w osoczu, poprzez równoległe pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego i osocza oraz rozważenie odległości czasowej pobierania próbek od i do napadów. Połączone pobieranie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i osocza, w połączeniu z monitorowaniem wideo-EEG u zwierząt z padaczką, jest obiecującym podejściem do walidacji przypuszczalnych biomarkerów diagnostycznych i prognostycznych. W tym miejscu opisano procedurę połączonego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z cisterna magna i pobierania krwi z żyły ogonowej bocznej u szczurów z padaczką, które są stale monitorowane za pomocą wideo-EEG. Ta procedura ma znaczące zalety w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi technikami. Pozwala to na szybkie pobieranie próbek przy minimalnym bólu i inwazyjności oraz skróconym czasie znieczulenia. Dodatkowo może być używany do uzyskiwania próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i osocza zarówno u szczurów zarejestrowanych w EEG na uwięzi, jak i telemetrycznych, i może być używany wielokrotnie przez wiele dni eksperymentu. Oczekuje się, że dzięki zminimalizowaniu stresu spowodowanego pobieraniem próbek poprzez skrócenie znieczulenia izofluranem, pomiary będą dokładniej odzwierciedlać rzeczywiste poziomy badanych cząsteczek w płynach biologicznych. W zależności od dostępności odpowiedniego testu analitycznego, technika ta może być stosowana do pomiaru poziomów wielu, różnych cząsteczek przy jednoczesnym wykonywaniu zapisu EEG.

Wprowadzenie

Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) i pobieranie próbek krwi są ważne dla identyfikacji i walidacji biomarkerów padaczki, zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych1,2. Obecnie diagnostyka padaczki i większość badań nad biomarkerami padaczki koncentruje się na EEG i neuroobrazowaniu3,4,5. Podejścia te mają jednak kilka ograniczeń. Oprócz rutynowych pomiarów skóry głowy, w wielu przypadkach EEG wymaga inwazyjnych technik, takich jak elektrody głębokościowe6. Metody obrazowania mózgu mają słabą rozdzielczość czasową i przestrzenną oraz są stosunkowo drogie i czasochłonne7,8. Z tego powodu identyfikacja nieinwazyjnych, tanich biomarkerów opartych na biopłynach stanowiłaby bardzo atrakcyjną alternatywę. Ponadto te biomarkery płynów biologicznych można połączyć z dostępnymi metodami diagnostycznymi w celu poprawy ich predykcyjności.

Pacjenci, u których zdiagnozowano epilepsję, są rutynowo poddawani EEG9,10 i pobieranie krwi11,12,13,14, a wielu również do wycofania płynu mózgowo-rdzeniowego, aby wykluczyć przyczyny zagrażające życiu (np. ostre infekcje, autoimmunologiczne zapalenie mózgu)15. Te próbki krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego mogą być wykorzystane w badaniach klinicznych mających na celu identyfikację biomarkerów padaczki. Na przykład Hogg i współpracownicy odkryli, że wzrost liczby trzech fragmentów tRNA osocza poprzedza wystąpienie napadu w ludzkiej padaczce14. Podobnie, poziomy interleukiny-1beta (IL-1β) w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym i surowicy, wyrażone jako stosunek poziomów IL-1β w płynie mózgowo-rdzeniowym do surowicy, mogą przewidywać rozwój padaczki pourazowej po urazowym uszkodzeniu mózgu16. Badania te podkreślają znaczenie pobierania próbek płynów biologicznych dla badań nad biomarkerami padaczki, ale napotykają one wiele ograniczeń nieodłącznie związanych z badaniami klinicznymi, np. czynnik współtworzący leki przeciwpadaczkowe (AED) we krwi, częsty brak informacji o etiologii, nieodpowiednie kontrole, niewielka liczba pacjentów i inne17,18.

Badania przedkliniczne oferują inne możliwości badania cząsteczek w płynach biologicznych jako potencjalnych biomarkerów padaczki. W rzeczywistości możliwe jest pobranie osocza i/lub płynu mózgowo-rdzeniowego od zwierząt podczas wykonywania zapisów EEG. Co więcej, pobieranie próbek może być wykonywane wielokrotnie przez wiele dni eksperymentu, a liczba grup kontrolnych dopasowanych do wieku, płci i epilepsji może być wykorzystana w celu poprawy wiarygodności badania. W tym miejscu szczegółowo opisano elastyczną technikę pozyskiwania płynu mózgowo-rdzeniowego z cisterna magna z równoległym wycofywaniem osocza z żyły ogonowej u szczurów monitorowanych pod kątem EEG. Prezentowana technika ma kilka zalet w porównaniu z metodami alternatywnymi. Dzięki zastosowaniu metody igłowej możliwe jest kilkukrotne pobranie płynu mózgowo-rdzeniowego bez uszczerbku dla funkcji elektrod EEG lub podobnych implantów głowy. Stanowi to udoskonalenie procedur pobierania cewnika dooponowego, które wiążą się ze stosunkowo wysokim ryzykiem infekcji. Ponadto, zgłoszone podejście do swobodnego opadania stosowane do pobierania krwi jest lepsze od innych podejść do pobierania krwi z żył ogonowych ze względu na znacznie zmniejszone ryzyko hemolizy, ze względu na fakt, że krew nie przepływa przez rurki i nie stosuje się podciśnienia. Jeśli jest wykonywany w ściśle wolnych od zarazków, ryzyko infekcji u zwierząt jest szczególnie niskie. Ponadto, rozpoczynając pobieranie krwi na samym końcu ogonów zwierząt, pobieranie próbek można powtórzyć kilka razy. Takie techniki są łatwe do opanowania i mogą być stosowane w wielu badaniach przedklinicznych zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Ferrarze oraz przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (autoryzacja: D.M. 603/2022-PR) zgodnie z wytycznymi określonymi w Dyrektywie Rady Wspólnot Europejskich z dnia 24 listopada 1986 r. (86/609/EWG) w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych. Protokół ten jest specjalnie dostosowany do dalszych ilościowych analiz łańcuchowej reakcji polimerazy (qPCR) małych niekodujących kwasów rybonukleinowych (sncRNA) w płynie mózgowo-rdzeniowym szczura i osoczu uzyskanym pod kontrolą EEG u zwierząt padaczkowych. Jeśli chcesz, zapoznaj się z powiązanym filmem JoVE, aby lepiej zrozumieć i udoskonalić procedurę19,20,21.

1. Przygotowanie zwierząt do chirurgicznego wszczepienia elektrod lub telemetrów

UWAGA: Technika chirurgii stereotaktycznej różni się w zależności od używanego systemu EEG. Poniższa sekcja metody zawiera opis kroków, które są wspólne dla tych dwóch rodzajów operacji.

  1. Używaj szczurów Sprague-Dawley (SD) (samce w wieku 7-8 tygodni, o wadze 250-290 g) utrzymywane zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Trzymanie zwierząt w standardowych warunkach ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody pitnej.
  2. Kontynuuj obchodzenie się ze szczurami przez kilka dni przed operacją i procedurami protokołu eksperymentalnego.
  3. Użyj aparatu stereotaktycznego do implantacji elektrod lub telemetrów. Postępuj zgodnie ze współczesnymi standardami dotyczącymi operacji aseptycznych. Używaj sterylnych i dobrze działających elektrod i nadajników.
  4. Ogol głowę zwierzęcia elektryczną maszynką do golenia. Wywołać znieczulenie u zwierzęcia mieszaniną ketaminy (45 mg/kg) i ksylazyny (7,5 mg/kg) podawanej dootrzewnowo (i.p.), następnie dodać znieczulenie izofluranem (1,4% w powietrzu; 1,2 ml/min) podawane przez maskę na twarz i przymocować głowę zwierzęcia do aparatu stereotaktycznego.
  5. Zapewnij odpowiednią głębokość znieczulenia, testując odruch wycofania pedału po uszczypnięciu opuszki stopy na tylnych łapach obu zwierząt i utrzymuj znieczulenie izofluranem do końca zabiegu. Regularnie sprawdzaj głębokość znieczulenia przez cały czas trwania zabiegu.
  6. Nałóż odpowiednią ilość maści do oczu na oczy obu zwierząt, aby zapobiec uszkodzeniu rogówki z powodu utraty odruchu mrugania spowodowanej znieczuleniem.
  7. Dokładnie oczyść skórę głowy zwierzęcia płynnym środkiem dezynfekującym i wykonaj podłużne cięcie o długości 2 cm za pomocą wysterylizowanego skalpela. Otwórz skórę głowy i przyłóż klipsy chirurgiczne do płatów skóry, aby utrzymać ją otwartą.
  8. Delikatnie odłącz okostną, aby odsłonić bregmę i obszar czaszki, przez który zostanie wprowadzona elektroda rejestrująca.

2. Chirurgiczne wszczepienie elektrod na uwięzi

UWAGA: Przed ustanowieniem procedury pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego w tym protokole (szczegóły w kroku 9), przeprowadzono wielokrotne pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą kaniuli prowadzącej u kilku swobodnie poruszających się szczurów nieznieczulonych. Wykorzystano kaniulowane zwierzęta, którym wszczepiono elektrody na uwięzi, w celu oceny wpływu implantów dwugłowych na długoterminowy zapis EEG w połączeniu z wielokrotnym pobieraniem próbek płynu mózgowo-rdzeniowego. W tych konkretnych eksperymentach szczurom wszczepiono atrapę kaniuli prowadzącej umieszczoną w cisterna magna, której końcówka została wprowadzona do niej stereotaktycznie na 7 mm, zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami22. Metody chirurgii podwójnej implantacji były podobne do tych stosowanych przez niektórych pracowników w przeszłości w przypadku kaniul prowadzących do mikrodializy i implantacji elektrod na uwięzi23,24.

  1. Użyj jednego ramienia ramy stereotaktycznej, zamontuj na nim uchwyt elektrody i umieść elektrodę pionowo w uchwycie. Przesuń końcówkę elektrody dokładnie nad bregmę. Zapisz współrzędne przednio-tylne i przyśrodkowo-boczne bregmy i przetłumacz je na żądane współrzędne.
  2. Opuść elektrodę, aż jej końcówka prawie dotknie czaszki. Zaznacz miejsce wiercenia i wywierć czaszkę w zaznaczonym miejscu. Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu i opon mózgowych.
  3. Wykonaj cztery lub więcej otworów na kotwiące i wkręć je w czaszkę. Zwróć uwagę na rozmiar elektrody podczas wykonywania otworów na kotwiące. Rozmiar elektrody nie powinien kolidować z umieszczonymi kotwiącymi.
  4. Powoli opuść ramię stereotaktyczne przenoszące elektrodę na osi grzbietowo-brzusznej, wejdź do tkanki mózgowej i zatrzymaj się w żądanej pozycji. Zamocuj przewód uziemiający elektrody wokół jednej ze wkręconych w czaszkę.
  5. Umieść cement metakrylowy na elektrodzie i zakrywające około połowy wysokości cokołu elektrody. Pozostaw górną połowę elektrody, która pasuje do końcówki drutu mocującego, odsłoniętą.
  6. Zwolnij elektrodę z uchwytu i podnieś ramię stereotaktyczne. Uwolnij zwierzę z aparatu stereotaktycznego i zapewnij mu opiekę pooperacyjną.
  7. Umieść zwierzę w oddzielnej klatce regeneracyjnej i obserwuj je co 10 minut, aż się obudzi i zacznie chodzić. Zwierzę należy zwrócić do jego standardowej klatki i do innej, nieznieczulonej grupy zwierząt dopiero po całkowitym wyzdrowieniu.

3. Chirurgiczne wszczepienie telemetrów

UWAGA: Używaj tylko sterylnych telemetrów. Jeśli telemetry są ponownie używane, wyczyść je i wysterylizuj przed zabiegiem zgodnie z instrukcjami producenta. W tym protokole wykorzystano telemetry Data Science International (DSI) do rejestracji EEG.

  1. Włącz nadajnik telemetryczny za pomocą magnesu i przetestuj sygnał za pomocą radia o częstotliwości AM. Przed zabiegiem sprawdź, czy jest silny i wyraźny sygnał. W razie potrzeby wyrzuć źle działające telemetry.
  2. Przygotuj przewody telemetryczne, skracając je do optymalnych długości dla dorosłych szczurów. Zdejmij powłokę silikonową na dwóch przewodach (ujemnym i dodatnim), odsłaniając około 5 mm spiralnego stalowego przewodu. Utwórz pętelkowy uchwyt o długości około 2 mm i szerokości 1 mm na końcu przewodów.
  3. Ogol bok zwierzęcia pod i za lewym ramieniem. Zdezynfekuj obszar zabiegu środkiem dezynfekującym na bazie stabilizowanych nadtlenków i czwartorzędowej aktywności amoniowej. Pozwól płynowi dezynfekującemu działać przez 15 minut.
  4. Wykonaj około 2 cm boczne nacięcie tuż za ramieniem zwierzęcia i wykonaj podskórną kieszeń o powierzchni około 5cm3 na umieszczenie nadajnika. Umieść nadajnik równolegle do długiej osi ciała, z przewodami skierowanymi w kierunku rostralnym.
  5. Przymocuj nadajnik do wewnętrznej ściany kieszonki podskórnej za pomocą bawełnianego szwu 3-0. Za pomocą nożyczek o końcach utwórz podskórny tunel (o długości około 2,5 cm) przez bok i szyję zwierzęcia, łącząc w ten sposób kieszeń nadajnika z nacięciem linii środkowej wykonanym na skórze głowy zwierzęcia w kroku 1.6.
  6. Weź oba przewody telemetryczne z kleszczami i przeciągnij je przez tunel tak, aby wystawały z ujścia nacięcia skóry głowy. Trzymaj przewody z nacięcia skóry głowy za pomocą klipsów do ran.
  7. Użyj ramki stereotaktycznej, aby zindywidualizować żądane współrzędne dla dodatniego (czerwonego) przewodu i wywierć otwór w czaszce na dodatnią końcówkę przewodu (podobnie jak w kroku 2.1.). Zrób jeszcze jeden otwór do zakotwiczenia w górę do mównicy i wkręć ją w czaszkę.
  8. Włóż końcówkę dodatniego ołowiu pod jarmułkę i oponę twardą i połóż ją na powierzchni mózgu. Podłącz zapętloną końcówkę ujemnego (białego) przewodu do. Umieść niewielką ilość cementu metakrylowego wokół dodatniego wylotu ołowiu i ujemnego ołowiu, aby unieruchomić je na czaszce.
  9. Przymocuj przewody do wewnętrznej ściany skóry czaszki za pomocą bawełnianego szwu 3-0. Upewnij się, że stałe przewody i szew mocujący nie będą kolidować z miejscem wycofania płynu mózgowo-rdzeniowego (tj. depresyjną powierzchnią o wyglądzie rombu między wypukłością potyliczną a grzbietem atlasu).
  10. Zamknij nacięcie skóry głowy i nacięcie boczne za pomocą bawełnianego szwu 3-0. Nałóż środki dezynfekujące na rany. Dopiero po ich wyschnięciu nałóż krem z antybiotykiem na zszyte rany.

4. Opieka pooperacyjna

  1. Monitoruj zwierzęta przez około 1 godzinę po operacji, aż do pozycji pionowej i poruszania się po klatce. Trzymaj je na podkładce rozgrzewającej, aby zapobiec hipotermii. Podawaj zwierzętom antybiotyk ogólnoustrojowy, aby zapobiec infekcji i ogólnoustrojowy lek przeciwbólowy, aby zapobiec bólowi pooperacyjnemu przez 2-3 dni.
  2. Pozwól szczurom dojść do siebie przez co najmniej 7 dni po zabiegach chirurgicznych. Monitoruj zwierzęta co najmniej raz dziennie przez 3 dni pod kątem oznak bólu lub niepokoju.

5. Stan indukcji padaczkowej u szczurów

UWAGA: Szczegółowy protokół indukcji stanu padaczkowego (SE) potrzebnego do odtworzenia padaczki mezjalnego płata skroniowego (mTLE) u szczurów, znajduje się w Guarino et al.25.

  1. Po tygodniu rekonwalescencji pooperacyjnej należy losowo przydzielić zwierzęta do grup: (i) zwierzęta kontrolne otrzymujące nośnik oraz (ii) zwierzęta z padaczką, które otrzymają pilokarpinę. W grupie chorych na padaczkę należy stosować proporcjonalnie większą liczbę zwierząt, ponieważ nie wszystkie szczury, którym podawano pilokarpinę, przeżyją lub rozwiną SE.
  2. Dzień przed indukcją SE należy podać zwierzętom pojedynczą dawkę 127 mg/kg chlorku litu rozpuszczonego w 0,9% roztworze soli fizjologicznej (3M) w objętości 1 ml/kg przez zgłębnik żołądkowy. Podać zwierzęciu lit, który zwiększa skuteczność pilokarpiny26, około 14 godzin przed indukcją SE w celu zmniejszenia zmienności w czasie do wystąpienia SE.
  3. Około 14 godzin po podaniu litu należy podać szczurom pojedyncze wstrzyknięcie skopolaminy metylowej (1 mg/kg mc. podskórnie).
  4. Dokładnie 30 minut po podaniu skopolaminy metylowej, należy podać szczurom pojedyncze wstrzyknięcie pilokarpiny (50 mg/kg mc., i.p.) w celu wywołania SE. Podać skopolaminę metylową i nośnik (0,9% roztwór NaCl) do kontroli szczurów.
    1. Wstrzyknięcie pilokarpiny wywołuje typowe zachowanie u zwierząt: wczesne napady częściowe (ruchy wibrysów i głową w ciągu 5 minut po podaniu pilokarpiny) przekształcające się w nawracające drgawki uogólnione (SE) w ciągu 25-30 minut. W przypadku szczurów, u których SE nie rozwinie się w ciągu 30 minut, należy podać dodatkową dawkę pilokarpiny (25 mg/kg mc., i.p.), a jeśli nadal nie rozwinie się SE, wykluczyć je z badania (osoby niereagujące na SE).
  5. Obserwuj i oceniaj zachowanie napadowe u szczurów co 5 minut, zaczynając bezpośrednio po wstrzyknięciu pilokarpiny. Użyj skali Racine'a do punktacji27.
  6. Przerwij SE 2 godziny po wystąpieniu przez podanie dożylnie koktajlu leków: diazepamu (10 mg/kg), fenobarbitalu (25 mg/kg) i skopolaminy (1 mg/kg).
  7. Podaj szczurom ten koktajl ponownie po 4 godzinach. Na koniec, po kolejnych 4 godzinach, należy podać szczurom i.p. ostatnią mieszankę leków (diazepam 10 mg/kg plus skopolamina 1 mg/kg) w celu całkowitego zatrzymania napadu.
  8. Wstrzyknij zwierzętom sól fizjologiczną (1 ml 0,9% roztworu NaCl, pH dostosowane do 7,0) i karm je 10% roztworem sacharozy przez 2-3 dni po SE, aby sprzyjać regeneracji po utracie masy ciała, która następuje po SE.
  9. Zwierzęta, które przeżyły po SE, przydziela się losowo do różnych grup doświadczalnych zgodnie z wymaganiami konkretnego protokołu doświadczalnego. Do dalszych eksperymentów na szczurach z padaczką należy stosować następujące kryteria włączenia/wykluczenia: rozwój konwulsyjnego SE w ciągu 1 godziny po podaniu pilokarpiny, przyrost masy ciała w pierwszym tygodniu po SE oraz prawidłowe ustawienie elektrody w obszarze mózgu będącym przedmiotem zainteresowania dla rejestracji EEG25.

6. Wideo-EEG na uwięzi u szczurów z padaczką i analizy aktywności napadowej

UWAGA: Ta sekcja opisuje eksperymentalną procedurę rejestrowania sygnałów EEG u szczurów trzymanych w jednym pomieszczeniu, swobodnie poruszających się w standardowych warunkach. Klatka nie powinna zawierać przedmiotów, w których zwierzę lub nagrywający mogą utknąć. W zależności od pytania naukowego, którym należy się zająć, można przeanalizować kilka parametrów. W przypadku badań nad padaczką ślady EEG są badane w celu rozpoznania napadów elektrycznych i ruchowych. Najczęstszymi parametrami używanymi do identyfikacji napadu są amplituda, częstotliwość i czas trwania napadowej aktywności elektrycznej.

  1. Umieść zwierzę w czystej klatce w pomieszczeniu do nagrywania, aby umożliwić przyzwyczajenie się i zmniejszyć stres wywołany nowym środowiskiem. Umieść klatkę zwierzęcia w klatce Faradaya, aby uniknąć zanieczyszczenia sygnału EGG polem elektromagnetycznym otoczenia.
  2. Podłącz jeden koniec nagrywającego do urządzenia nagrywającego. Użyj woltomierza, aby zmierzyć potencjał elektryczny i rozróżnić elektrody masowe i referencyjne.
  3. Podłącz drugi koniec nagrywającego do elektrody zamocowanej na głowie szczura. W tym celu należy przytrzymać cementową osłonę na głowie zwierzęcia podczas wkładania wtyczki do złącza elektrody i unikać wywierania nacisku na głowę szczura.
  4. Zrównoważ ciężar nagrywającego, aby umożliwić swobodne poruszanie się zwierzęcia, jednocześnie zapobiegając ryzyku skręcenia. Aby to zrobić, użyj ramienia równoważącego lub komutatorów. Nawet jeśli nagrywający jest z przeciwwagą, umieść karmę w klatce, a nie w uchwycie do karmienia, w którym zwierzęta muszą się podnieść, aby dotrzeć do jedzenia.
  5. Przed rozpoczęciem rejestracji należy sprawdzić wszystkie ustawienia używane do pozyskiwania i przetwarzania danych z EEG.
    UWAGA: Protokół ten nie zawiera wprowadzenia do aparatury wymaganej do wykonania zapisu EEG, jednak należy zastosować odpowiednie filtrowanie i częstotliwość próbkowania, aby uniknąć artefaktów i szumów w sygnałach EEG.
    1. W przypadku rutynowego eksperymentu ustaw częstotliwość próbkowania na 500 Hz, a wzmocnienie wzmocnienia na 5000x. Przefiltruj sygnał za pomocą filtra 0,005 Hz oprócz filtra wycinającego, aby odrzucić otaczającą aktywność elektryczną w paśmie 50 Hz (specyficznym dla krajów europejskich).
  6. Rozpocznij zarówno zapisy wideo, jak i EEG i upewnij się, że ślady są zgodne z oczekiwanym sygnałem EEG, sprawdzając moc w określonych pasmach częstotliwości w czasie. Należy zanotować okres wyjściowy przed rozpoczęciem interwencji na zwierzętach.
  7. Okresowo sprawdzaj zwierzęta i ślady EEG. Nierzadko zdarza się, że nagrywający odczepia się od złącza elektrody w głowie szczura. Jeśli tak się stanie, ponownie podłącz elektrodę w głowie szczura do nagrywającego i sprawdź, czy sygnał EEG jest czysty
    8. .
  8. Analizuj sygnał EEG ręcznie lub automatycznie za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania. W przypadku analizy ręcznej przeprowadź badanie przesiewowe przez zapis EEG, aby zidentyfikować czynności podobne do napadów. Jeśli ma być używane oprogramowanie, skonfiguruj kluczowe parametry zdarzenia napadowego, takie jak amplituda, częstotliwość i czas trwania aktywności elektrycznej.
    UWAGA: Pojedynczy napad może charakteryzować się aktywnością elektryczną o amplitudzie 3 razy wyższej niż wartość wyjściowa, częstotliwości równej lub wyższej niż 5 Hz i czasie trwania co najmniej 5 s22.
  9. Niezależnie od zastosowanej metody, należy potwierdzić potencjalne napady drgawkowe, sprawdzając zsynchronizowany zapis wideo zebrany jednocześnie z EEG.

7. Telemetria video-EEG u szczurów padaczkowych i analiza aktywności napadowej

UWAGA: Ta sekcja opisuje eksperymentalną procedurę rejestrowania sygnałów radiotelemetrycznych EEG u jednoosobowych, swobodnie poruszających się szczurów w standardowych warunkach. Protokół oparty jest na komercyjnie dostępnym systemie telemetrycznym. Jednak kilka systemów telemetrycznych różni się nieznacznie pod względem specyfikacji funkcjonalnych i technicznych. System należy dobrać w zależności od wymagań laboratorium i celów badawczych.

  1. Umieść klatkę domową dla zwierząt nad odbiornikiem sygnału. Podłącz odbiornik sygnału do systemu akwizycji danych, a ten z komputerem z oprogramowaniem do akwizycji.
  2. Włącz implant telemetrii o częstotliwości radiowej, umieszczając magnes w pobliżu telemetru umieszczonego w boku szczura. Przetestuj sygnał za pomocą urządzenia radiowego. Użyj uniwersalnego urządzenia radiowego, aby przetestować telemetry i usłyszysz wyraźny sygnał dźwiękowy wskazujący, że telemetr jest aktywowany, podczas gdy skwierczący dźwięk oznacza nieaktywny telemetr.
    UWAGA: Przed określeniem czasu trwania nagrań należy wziąć pod uwagę żywotność baterii nadajnika częstotliwości radiowej.
  3. Skonfiguruj oprogramowanie do akwizycji i zsynchronizuj sygnał telemetryczny i system wideo, aby jednocześnie pobierać dane EEG i wideo. Przypisz jeden odbiornik sygnału do każdego wszczepionego nadajnika i ustaw wartości kalibracji nadajnika. Ustaw częstotliwość próbkowania na 1000 Hz, wykrywanie szumów w zakresie od -500 mV do +500 mV, a interwał integracji na 100 ms. Nie używaj filtrów dolno- i górnoprzepustowych.
  4. Uruchom telemetrię i nagrania wideo. Wykonaj długoterminową rejestrację linii bazowej przed uzyskaniem aktywności podobnej do padaczkowej. Przeanalizuj sygnał EEG zgodnie z opisem w krokach 6.8 i 6.9.

8. Procedura pobierania krwi z żyły ogonowej

UWAGA. Próżniowy system pobierania krwi składa się z igły motylkowej (23 G x 3/4 x 12 (0,8 mm x 19 mm x 305 mm). Technika pobierania krwi może być bez problemu wykonana przez jednego operatora, a zabieg trwa około 5 minut.

  1. Na krótko przed pobraniem należy pokryć igłę motylkową i jej rurkę 1%K2EDTA w wodzie destylowanej, tj. pobrać i usunąć roztwórK2EDTA z systemu za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Przeciąć rurkę tuż za igłą, aby zbierać krew kropla po kropli, bez aspiracji (Rysunek 1A).
  2. Umieść szczura w komorze indukcyjnej i znieczul go izofluranem (1,4% w powietrzu; 1,2 ml/min). Przełącz się na ramkę stereotaktyczną i utrzymuj znieczulenie przez maskę na twarz. Umieść poduszkę grzewczą pod zwierzęciem, utrzymując część jego ogona w bezpośrednim kontakcie z podkładką.
  3. Delikatnie przesuń grzbiet zwierzęcia na bok, tak aby boczna żyła ogonowa pozostała na górze.
  4. Zanurz ogon w ciepłej wodzie (42 °C) na 2 minuty, aby rozszerzyć żyłę boczną. Przetrzyj ogon 70% etanolem, aby żyła była bardziej widoczna. Umieść ciepłe światło na ogonie za pomocą zwykłej żarówki.
  5. Wprowadzić igłę motylkową 21G do bocznej żyły ogonowej o głębokości 5 mm i kącie 20°. Zbierz krew do probówki próżniowej o pojemności 500 μl, która zawiera 5 mg K2EDTA jako antykoagulant (Rysunek 1B, C).
  6. Wyjąć igłę i zatrzymać przepływ krwi, wywierając nacisk na miejsce nakłucia. Przywróć szczura do jego domowej klatki.
  7. Delikatnie odwróć probówkę 10x, aby wymieszać antykoagulant z krwią. Wykonaj otwory o głębokości około 1,5 cm w lodzie, aby pomieścić rurki do zbierania. Delikatnie i pionowo umieść próbkę na lodzie.
  8. Odwirować próbkę krwi w wirówce z chłodzeniem (4 °C) o temperaturze 1300 x g przez 10 minut w celu oddzielenia osocza. Wykonaj tę procedurę maksymalnie w ciągu 1 godziny.
  9. Weź około 200 μl osocza, omijając warstwę czerwonych i białych krwinek. Pobrane osocze umieścić w sterylnej mikroprobówce o pojemności 0,2 ml. W razie potrzeby przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 godziny po odwirowaniu.
  10. Odłożyć 5 μl próbki do kontroli jakości. Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
    UWAGA: Nie używaj próżni, nawet jeśli jest to zalecane przez niektórych badaczy28 lub wydoić ogon podczas procedur opisanych w kroku 8.5, aby uzyskać więcej krwi, ponieważ obniża to jakość próbki do następnych analiz ilościowych sncRNA (szczegółowe informacje można znaleźć w Reprezentatywnych wynikach). Należy pamiętać, że u szczura maksymalna ilość krwi, którą można pobrać jednorazowo, wynosi <10% całkowitej objętości krwi (tj. około 1,6-1,9 ml u szczura o wadze 250-300 g) i <15% całkowitej objętości krwi (około 2,64 ml) w ciągu 1 miesiąca29. W tym protokole wykorzystuje się maksymalnie 500 μl krwi jednorazowo do pięciu razy w jednym zwierzęciu30,31.

9. Procedura pobierania płynu CSF

UWAGA. Technika może być bez problemu wykonana przez jednego operatora, a zabieg trwa około 2-4 minut. Materiały używane do zbierania płynu mózgowo-rdzeniowego to niedrogie, jednorazowe próżniowe igły motylkowe i rurki ekstrakcyjne. W tym protokole w celu wytworzenia próżni użyto zestawu infuzyjnego ze skrzydłami motyla połączonego ze sterylną strzykawką (Rysunek 2A).

  1. Przygotuj igłę motylkową 23G, przecinając jej plastikową osłonę tak, aby koniec nieosłoniętej igły był odsłonięty na 7 mm, aby zapobiec jej wniknięciu na głębokość większą niż 7 mm w cisterna magna podczas wyjmowania (Rysunek 2B).
  2. Podłączyć igłę motylkową wyposażoną w rurkę polimerową do strzykawki o pojemności 1 ml.
  3. Umieść szczura w komorze indukcyjnej i znieczul go izofluranem (1,4% w powietrzu; 1,2 ml/min). Przełącz przepływ izofluranu na ramkę stereotaktyczną i utrzymuj znieczulenie dostarczane przez maskę na twarz. Usuń futro z tylnej głowy i szyi szczura za pomocą brzytwy.
  4. Przymocuj głowę szczura za pomocą prętów do uszu. Opuść głowę zwierzęcia w dół o około 45° w pionie, przesuwając się w dół listwy nosowej ramy stereotaktycznej (Rysunek 2C). Sprawdź tylną głowę zwierzęcia i znajdź lekko wklęsłą powierzchnię o wyglądzie rombu, między wypukłością potyliczną a grzbietem atlasu.
  5. Przetrzyj tę powierzchnię 70% etanolem, aby była bardziej widoczna i zdezynfekuj ją.
  6. Włóż igłę motylkową pionowo w środek wklęsłej powierzchni w kształcie rombu do cisterna magna w celu pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego, aż ruch zostanie zablokowany przez przycięcie na wymiar plastikowej osłony tulei igły (Rysunek 2D). Delikatnie odciągnąć tłok strzykawki o pojemności 1 ml, aby płyn mózgowo-rdzeniowy powoli przepływał przez igłę.
  7. Zbierz około 100 μl płynu mózgowo-rdzeniowego do rurki polimerowej ( Rysunek 2D). Unikać przedostania się do krwi lub innych widocznych zanieczyszczeń. Ściśnij rurkę polimerową bardzo blisko igły motylkowej i odetnij rurkę w tym miejscu.
  8. Pobrać przezroczystą (niezanieczyszczoną) próbkę do strzykawki. Wyrzuć zanieczyszczoną próbkę, jeśli widoczne zanieczyszczenie dostanie się do rurki zbiorczej.
  9. Wylej próbkę do sterylnej mikroprobówki o pojemności 0,2 ml i przechowuj na lodzie do 1 godziny.
  10. Zdezynfekować miejsce pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego na głowie zwierzęcia. Wyjmij szczura ze stereotaktycznej klatki i włóż go z powrotem do klatki.
  11. Odłożyć 2 μl próbki do kontroli jakości. Pozostałą część próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.
    UWAGA: U szczurów, jeśli wielokrotne pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego jest wykonywane, zalecana objętość do pobrania przy każdym pobraniu wynosi 100 μL32. W tym protokole jednorazowo wykonano maksymalnie 100 μl płynu mózgowo-rdzeniowego przy 5-krotnym maksymalnym odstawieniu w ciągu 15 dni u jednego zwierzęcia.

10. Analiza spektrofotometryczna jakości próbki

UWAGA: Po prawidłowym pobraniu próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i osocza, próbki są gotowe do analiz spektrofotometrem i nie wymagają specjalnego traktowania. Zmierzyć absorbancję hemoglobiny za pomocą spektrofotometrii UV przy 414 nm, aby ocenić ryzyko hemolizy w próbkach. W próbkach pobranych od szczurów należy przyjąć wartość odcięcia absorbancji wynoszącą 0,25. Wybór tego limitu może zależeć od późniejszej analizy qPCR i jej specyficznych wymagań dotyczących kwantyfikacji sncRNA.

  1. Włączyć spektrofotometr UV. Wybierz metodę pomiaru absorbancji przy pojedynczej długości fali 414 nm dla PLAZMY lub płynu mózgowo-rdzeniowego. Kliknij Dalej.
  2. Opłucz kuwetę o średnicy 1 mm oczyszczoną wodą. Umieść 5 μl 70% etanolu na miejscu pomiarowym kuwety. Osusz ręcznikiem papierowym i przetrzyj niestrzępiącą się bibułą. Sprawdź, czy jest idealnie przezroczysty.
  3. Wlej 1,5 μl oczyszczonej wody do kuwety 1 mm i zamknij ją. Włóż kuwetę do komory pomiarowej spektrofotometru i zmierz absorbancję ślepej próbki, klikając przycisk Ślepa. Sprawdzić, czy wartość absorbancji przy 414 nm wynosi 0,000.
  4. Osusz kuwetę ręcznikiem papierowym i wyczyść ją niestrzępiącą się bibułą. Sprawdź, czy jest idealnie przezroczysty.
  5. Umieścić 1,5 μl próbki w kuwecie o średnicy 1 mm i zamknąć ją. Włóż kuwetę do komory pomiarowej spektrofotometru. Zmierz próbkę, klikając przycisk Próbka. Sprawdzić absorbancję próbki przy długości fali 414 nm i opatrzyć ją adnotacjami.
  6. Kontynuuj ilościowe określanie absorbancji hemoglobiny we wszystkich dostępnych próbkach. Zmierz ślepą próbkę przed jakąkolwiek próbką osocza lub płynu mózgowo-rdzeniowego, klikając alternatywnie przyciski Ślepa próba i Próbka.
  7. Zachować próbki o długości fali A414 nm < 0,25 w temperaturze -80 °C i odrzucić próbki, jeżeli A414 nm > 0,25.
  8. Przepłucz kolejno kuwetę o średnicy 1 mm oczyszczoną wodą i 70% etanolem. Wysuszyć kuwetę.
  9. Zamknij pustą kuwetę w komorze pomiarowej, aby zapobiec jej pyleniu. Wyłączyć spektrofotometr.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki różnych procedur pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) i krwi przeprowadzonych u 9 szczurów kontrolnych i 18 szczurów z chroniczną epilepsją, wszystkim zaimplantowanych elektrodami 1 miesiąc po SE, przedstawiono w formie wskaźnika sukcesu. Po implantacji wszystkie szczury były monitorowane za pomocą wideo-EEG przez 1 miesiąc, podczas którego CSF oraz krew pobierano 5 razy co 3 dni w ciągu dwóch ostatnich tygodni eksperymentu (tj. w dniach 52, 55, 58, 61 i 64 po SE; dpSE). Dane z wielokrotnych pobrań od różnyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niniejsza praca ilustruje łatwą do opanowania technikę płynu mózgowo-rdzeniowego i pobierania krwi u szczurów, która może być przydatna nie tylko w badaniach na modelach padaczki, ale także innych schorzeń lub chorób neurologicznych, takich jak Alzheimer, Parkinson czy stwardnienie rozsiane. W badaniach nad padaczką obie procedury pobierania próbek w połączeniu z wideo-EEG są idealne, gdy poszukuje się korelacji między poziomami różnych rozpuszczalnych cząsteczek a aktywnością napadową. Z tego konkretnego powodu zastosow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało wsparte grantem z Programu Prac Unii Europejskiej Horyzont 2020 (zaproszenie H2020-FETOPEN-2018-2020) na podstawie umowy o grant 964712 (PRIME; dla M. Simonato).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do pobierania krwi BD Vacutainer Safety-LokBD Italy SpA, Mediolan, Włochy367246 Materiałowe
probówki do pobierania krwi (Microtainer K2E)BD Italy SpA, Mediolan, Włochy365975Materiał
Zestaw do naparu ze skrzydłami motyla 23G x 3/4'' 0,6 x 19 mmNipro, Osaka, Japonia PSY-23-ET-ICUWirówka materiałowa
chłodzeniem ALC PK 130RDJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, Anglia112000033
Materiał Szew bawełniany 3-0Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA7343HMateriał
Diazepam 5 mg / 2 ml, SolupamDechra Veterinary Products, Turyn, Włochy105183014 (AIC)Rozwiązanie
Cyfrowy 8-kanałowy rejestrator mediów wideo system telemetrii EEG DataSciences International (DSI), St Paul, MN, USAPNM-VIDEO-008Sprzęt
Cyfrowy system nadzoru wideo z przewodem EEGEZVIZ Network, Hangzhou, CinaEZVIZ (V5.3.2)Sprzęt
Środek dezynfekujący na bazie stabilizowanych nadtlenków i czwartorzędowej aktywności amoniowejLaboratoire Garcin-Bactinyl, FrancjaLB 920111Solution
Atrapa kaniuli prowadzącej 8 mmAgn Tho's, Lindigö, SzwecjaCXD-8Materiał
Elektroda 3-kanałowa dwuskrętnaInvivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USAMS333/3-B/SPCMateriał
Uchwyt elektrody do chirurgii stereotxicAgn Tho's, Lindigö, Szwecja1776-P1Sprzęt
Eppendorf BioSpectrometer basicEppendorf AG, Hamburg, Niemcy6137Sprzęt

Eppendorf PCR Tubes 0,2 ml		Eppendorf Srl, Mediolan, Włochy30124332Materiał
Eppendorf μ Kuweta G1.0Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy6138Sprzęt
Igła do karmienia elastyczna 17G dlaszczurów Agn Tho's, Lindigö Szwecja7206Materiał
Aparatura do technologii trawyGrass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, Kalifornia, USAM665G08Sprzęt (wzmacniacz AS40, skrzynka główna, połączeniowe, telefaktor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFloZoetis, Rzym, Włochy103287025 (AIC)Solution
Ketamine (Imalgene)Merial, Tuluza, Francja221300288 ( AIC)Roztwór
chlorku litu Sigma-Aldrich, Mediolan, WłochyL9650Materiał
Kaniula mikroiniekcyjna 31G 9 mmAgn Tho's, Lindigö SzwecjaCXMI-9
Materiał MP150 modułowa akwizycja danych i  System analizy Biopac, Goleta, Kalifornia, USAMP150WSWEquipment
Maść okulistyczna weterynaryjna, Hylo nightUrsapharm, Mediolan, Włochy941791927 (AIC)Materiał
Chlorowodorek pilokarpinySigma-Aldrich, Mediolan, WłochyP6503Materiał
Rurka PTFE zezłączem Agn Tho's, Lindigö, SzwecjaJT-10Materiał
Sól fizjologiczna0,9% NaCl, pH dostosowany do 7.0Roztwór
Trójwodny bromowodorek skopolaminySigma-Aldrich, Mediolan, WłochyS2250Materiał
Skopolamina azotan metyluSigma-Aldrich, Mediolan, WłochyS1876Materiał
Srebrny  Sulfadiazyna 1% śmietana Sofar, Trezzano Rosa, Mediolan, Włochy025561010 (AIC)Materiał
Cement metakrylowy simplex rapid dental   Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, Wielka BrytaniaACR811Materiał
Aparat stereotaktycznyDavid Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USAModel 963Sprzęt
Roztwór sacharozy10% sacharozy w wodzie destylowanejDomowy roztwór
Strzykawka 1 ml Biosigma, Cona, Venezia, Włochy20,71,26,03,00,350Telemetry materiałowe
Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USACTA-F40Telemetria materiałowa
Analizator śladów EEGData Sciences International (DSI), St Paul, MN, USANeuroScore v3-0Sprzęt
System telemetrycznyData Sciences International (DSI), St Paul, MN, USASprzęt plus oprogramowanie Ponemah rdzeń 6.51Sprzęt
Chlorowodorek ksylazynySigma-Aldrich, Mediolan, WłochyX1251Materiał
z

Bibliografia

  1. Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
  2. Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
  3. Dlugos, D., et al. Childhood Absence Epilepsy Study Team (2013). Pretreatment EEG in childhood absence epilepsy: associations with attention and treatment outcome. Neurology. 81 (2), 150-156 (2013).
  4. Lorenzo, N. Y., et al. Intractable frontal lobe epilepsy: pathological and MRI features. Epilepsy research. 20 (2), 171-178 (1995).
  5. van Dellen, E., et al. Epilepsy surgery outcome and functional network alterations in longitudinal MEG: a minimum spanning tree analysis. NeuroImage. 86, 354-363 (2014).
  6. Shah, A. K., Mittal, S. Invasive electroencephalography monitoring: Indications and presurgical planning. Annals of Indian Academy of Neurology. 17 (Suppl 1), S89-S94 (2014).
  7. Whiting, P., et al. A systematic review of the effectiveness and cost-effectiveness of neuroimaging assessments used to visualise the seizure focus in people with refractory epilepsy being considered for surgery. Health technology assessment. 10 (4), 1-iv (2006).
  8. Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of neuroscience methods. 212 (2), 195-202 (2013).
  9. Leach, J. P., Stephen, L. J., Salveta, C., Brodie, M. J. Which electroencephalography (EEG) for epilepsy? The relative usefulness of different EEG protocols in patients with possible epilepsy. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 77 (9), 1040-1042 (2006).
  10. Huppertz, H. J., et al. Localization of interictal delta and epileptiform EEG activity associated with focal epileptogenic brain lesions. NeuroImage. 13 (1), 15-28 (2001).
  11. Linder, C., et al. Comparison between dried blood spot and plasma sampling for therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs in children with epilepsy: A step towards home sampling. Clinical biochemistry. 50 (7-8), 418-424 (2017).
  12. Wegner, I., Wilhelm, A. J., Lambrechts, D. A., Sander, J. W., Lindhout, D. Effect of oral contraceptives on lamotrigine levels depends on comedication. Acta neurologica Scandinavica. 129 (6), 393-398 (2014).
  13. Palmio, J., et al. CSF and plasma adipokines after tonic-clonic seizures. Seizure. 39, 10-12 (2016).
  14. Hogg, M. C., et al. Elevation in plasma tRNA fragments precede seizures in human epilepsy. Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2946-2951 (2019).
  15. Ellul, M., Solomon, T. Acute encephalitis - diagnosis and management. Clinical medicine. 18 (2), 155-159 (2018).
  16. Diamond, M. L., et al. IL-1β associations with posttraumatic epilepsy development: a genetics and biomarker cohort study. Epilepsia. 55 (7), 1109-1119 (2014).
  17. Auvin, S., et al. Prospective clinical trials to investigate clinical and molecular biomarkers. Epilepsia. 58 (Suppl 3), 20-26 (2017).
  18. Weber, Y. G., Nies, A. T., Schwab, M., Lerche, H. Genetic biomarkers in epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 324-333 (2014).
  19. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528(2012).
  20. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880(2008).
  21. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  22. Westergren, I., Johansson, B. B. Changes in physiological parameters of rat cerebrospinal fluid during chronic sampling: evaluation of two sampling methods. Brain Research Bulletin. 27 (2), 283-286 (1991).
  23. Soukupová, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  24. Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58455(2018).
  25. Guarino, A., et al. Low-dose 7,8-Dihydroxyflavone Administration After Status Epilepticus Prevents Epilepsy Development. Neurotherapeutics. 19 (6), 1951-1965 (2022).
  26. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S. G., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  27. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  28. Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852(2017).
  29. Blood sampling: Rat. , https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-rat (2022).
  30. Powles-Glover, N., Kirk, S., Wilkinson, C., Robinson, S., Stewart, J. Assessment of toxicological effects of blood microsampling in the vehicle dosed adult rat. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 68 (3), 325-331 (2014).
  31. Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animal. 32 (4), 369-376 (1998).
  32. Wang, D., Zhao, Y., Yang, Y., Xie, H. Safety assessment of multiple repeated percutaneous punctures for the collection of cerebrospinal fluid in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (6), e10032(2021).
  33. Möller, C., et al. Impact of repeated kindled seizures on heart rate rhythms, heart rate variability, and locomotor activity in rats. Epilepsy & Behavior. 92, 36-44 (2019).
  34. Espinosa-Garcia, C., Zeleke, H., Rojas, A. Impact of Stress on Epilepsy: Focus on Neuroinflammation-A Mini Review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4061(2021).
  35. Cassar, S. C., et al. Comparing levels of biochemical markers in CSF from cannulated and non-cannulated rats. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 249-253 (2010).
  36. Huang, Y. L., Säljö, A., Suneson, A., Hansson, H. A. Comparison among different approaches for sampling cerebrospinal fluid in rats. Brain Research Bulletin. 41 (5), 273-279 (1996).
  37. Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
  38. Roncon, P., et al. MicroRNA profiles in hippocampal granule cells and plasma of rats with pilocarpine-induced epilepsy--comparison with human epileptic samples. Scientific Reports. 5, 14143(2015).
  39. van Vliet, E. A., et al. Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis: Focus on circulating microRNAs. Epilepsia. 58 (12), 2013-2024 (2017).
  40. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), e24145(2011).
  41. Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Frontiers in Veterinary Science. 10, 1185706(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pobieranie p ynu m zgowo rdzeniowegopobieranie krwirejestracja EEGpozyskiwanie osoczapunkcja cysterny wielkiejszczury z epilepsjodkrywanie biomarker wmonitorowanie wideo EEGbiomarkery osoczowe
Pobieranie próbek płynu mózgowo-rdzeniowego i krwi z żyły ogonowej bocznej u szczurów podczas zapisów EEG
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.