Artykuł metodologiczny

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65735

⸱

6 października 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Duesseldorf, 2Department of Neurology, Institute of Translational Neurology, University Hospital Muenster

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Streszczenie

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest najczęstszym mysim modelem stwardnienia rozsianego (SM) i jest często wykorzystywane do dalszego wyjaśnienia wciąż nieznanej etiologii SM w celu opracowania nowych strategii leczenia. Model EAE glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych 35-55 (MOG35-55) odtwarza samoograniczający się monofazowy przebieg choroby z rosnącym paraliżem w ciągu 10 dni po szczepieniu. Myszy są codziennie badane przy użyciu systemu punktacji klinicznej. Stwardnienie rozsiane jest napędzane przez różne patomechanizmy o określonym wzorcu czasowym, dlatego badanie roli typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) podczas progresji choroby jest bardzo interesujące. Unikalną cechą tego protokołu jest jednoczesna izolacja wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN (mikroglej, oligodendrocyty, astrocyty i neurony) mających zastosowanie u dorosłych EAE i zdrowych myszy. Po dysocjacji mózgu i rdzenia kręgowego od dorosłych myszy następuje sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS) w celu wyizolowania mikrogleju, oligodendrocytów, astrocytów i neuronów. Cytometria przepływowa została wykorzystana do przeprowadzenia analiz jakościowych oczyszczonych zawiesin jednokomórkowych, potwierdzających żywotność po izolacji komórek i wskazujących na czystość każdego typu komórek na poziomie około 90%. Podsumowując, protokół ten oferuje precyzyjny i kompleksowy sposób analizy złożonych sieci komórkowych u zdrowych myszy i myszy EAE. Co więcej, wymaganą liczbę myszy można znacznie zmniejszyć, ponieważ wszystkie cztery typy komórek są izolowane od tych samych myszy.

Wprowadzenie

Stwardnienie rozsiane (SM) jest przewlekłą autoimmunologiczną chorobą zapalną ośrodkowego układu nerwowego (OUN) charakteryzującą się demielinizacją, uszkodzeniem aksonów, glejozą i neurodegeneracją. Pomimo licznych podejść badawczych w tej dziedzinie, patofizjologia stwardnienia rozsianego nadal nie jest w pełni poznana1,2,3,4. Najpowszechniejszym modelem zwierzęcym do badania stwardnienia rozsianego jest eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) wywołane peptydem glikoproteiny oligodendrocytów mieliny 35-55 (MOG35-55), które ma wiele wspólnych cech klinicznych i patofizjologicznych5,6,7,8,9. Opiera się na odpowiedzi układu odpornościowego na antygeny specyficzne dla OUN, co prowadzi do stanu zapalnego, demielinizacji i zwyrodnienia neuroaksonów. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest odpowiednim modelem do badania szlaków neurozapalnych i kaskad sygnałowych występujących w stwardnieniu rozsianym.

Obecne opcje terapii stwardnienia rozsianego są tylko częściowo skuteczne i koncentrują się głównie na początkowej fazie zapalnej choroby. Jednak neurodegeneracyjny komponent SM wydaje się być głównym wyzwaniem dla długoterminowych podejść terapeutycznych. W związku z tym potrzebne są powtarzalne i precyzyjne protokoły izolacji komórek, aby kompleksowo zbadać mechanizmy molekularne i komórkowe w chorobach autoimmunologicznych. Nawet jeśli istnieją pewne protokoły izolacji jednego typu komórki10,11,12,13,14,15, istnieje niezaspokojona potrzeba jednoczesnej izolacji kilku populacji komórek rezydujących w OUN jednocześnie. Poprzednie protokoły izolacji komórek rezydujących w OUN nie zapewniały zachowania funkcjonalności i czystości komórek, co skutkowało współhodowlą z sąsiednimi komórkami16,17,18 lub nieprzydatność do złożonych analiz sieci wewnątrzkomórkowych ex vivo19,20,21,22.

Celem tego protokołu było ustanowienie powtarzalnej i wszechstronnej metody jednoczesnej izolacji czystych, żywotnych jednokomórkowych zawiesin wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN, stosowanych u dorosłych, zdrowych myszy i EAE. Różne typy komórek zostały wyizolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS)23. Separacja komórek może być osiągnięta albo przez selekcję pozytywną, tj. Znakowanie magnetyczne markerów powierzchniowych specyficznych dla typu komórki, albo przez selekcję negatywną poprzez biotynylację i zubożenie wszystkich niepożądanych komórek. Zastosowano cytometrię przepływową w celu zapewnienia czystości powyżej 90% i żywotności co najmniej 80% izolowanych zawiesin jednokomórkowych.

Podsumowując, głównym celem było ustanowienie protokołu do jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN jako wszechstronnego narzędzia do badania szlaków neurozapalnych, oferującego kompleksową i precyzyjną analizę złożonych sieci komórkowych i biochemicznych kaskad sygnalizacyjnych u zdrowych myszy i myszy EAE.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z EAE indukowano u samic myszy C57BL/6J w wieku 10-12 tygodni, a badania zostały zatwierdzone przez lokalne organy nadzorcze (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen). W każdym momencie trwania eksperymentów zapewniono zgodność z niemieckimi i unijnymi przepisami dotyczącymi ochrony zwierząt. Wszystkie myszy utrzymywano w klatkach z indywidualną wentylacją.

UWAGA: Poniższe objętości odczynników odnoszą się do jednego dorosłego mózgu i rdzenia kręgowego myszy, określanych dalej jako zawiesina komórek OUN, których masa wynosi około 20 mg do 500 mg. Jeśli planowana jest dysocjacja więcej niż jednej zawiesiny komórek OUN, wszystkie objętości odczynników i materiałów należy odpowiednio zwiększyć. Zaleca się przechowywanie soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (D-PBS; 1x) z dodatkiem wapnia i magnezu, uzupełnionej o 1 g/L glukozy i 36 mg/L pirogronianu sodu, w stałym chłodzeniu na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu. Jeśli planowana jest późniejsza hodowla komórek, wszystkie etapy należy przeprowadzić w warunkach sterylnych przy użyciu komór laminarnych. W przeciwnym razie żadna z poniższych sekcji protokołu nie musi być wykonywana w komorze laminarnej. Bufory należy przechowywać na lodzie. Przez cały eksperyment należy używać wyłącznie schłodzonych wcześniej roztworów i unikać mieszania w wortexie. Ogólny schemat postępowania przedstawiono na Rysunku 1.

Schemat izolacji komórek ośrodkowego układu nerwowego z wykorzystaniem przeciwciał anty-CD11b i anty-O4 do sortowania.
Rycina 1: Schemat jednoczesnej izolacji oligodendrocytów, mikrogleju, astrocytów i neuronów u myszy naiwnych oraz myszy z EAE. Pierwsze kroki procedury są takie same dla myszy naiwnych i myszy z EAE. W przypadku chęci pracy z replikatem EAE, wcześniej należy przeprowadzić indukcję EAE (1). W skrócie, protokół rozpoczyna się od wycięcia (2) i dysocjacji (3) mózgu i rdzenia kręgowego myszy, a następnie usunięcia debris (4) oraz erytrocytów (5). Następnie otrzymaną oczyszczoną zawiesinę komórek OUN dzieli się na dwie frakcje w celu jednoczesnej izolacji oligodendrocytów i mikrogleju za pomocą MACS (6). Mikroglej jest wykrywany za pomocą mikrokulek anty-CD11b, natomiast oligodendrocyty są izolowane przy użyciu mikrokulek anty-O4 (selekcja pozytywna). Z frakcji nieprzepuszczonej po izolacji oligodendrocytów (8), astrocyty są izolowane za pomocą mikrokulek anty-ACSA-2 (selekcja pozytywna), a neurony poprzez znakowanie biotyną i usunięcie wszystkich komórek nieneuronalnych (selekcja negatywna). U myszy z EAE izolacji komórek CD11b+ towarzyszy sortowanie komórek CD45intCD11bhigh metodą FACS w celu wyeliminowania innych komórek odpornościowych CD11b+, takich jak makrofagi, komórki dendrytyczne, monocyty, granulocyty i komórki natural killer, o których wiadomo, że uczestniczą w procesach neurozapalnych podczas przebiegu EAE (7)27, 28, 48. Po izolacji różnych typów komórek rezydujących w OUN można przeprowadzić analizy czystości (9). Skróty: Abs = przeciwciała; ACSA-2 = antygen powierzchniowy astrocytów 2; CD11b = kinaza zależna od cykliny 11B; CD45 = fosfataza białkowa tyrozynowa typu receptorowego C; CNS = ośrodkowy układ nerwowy; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia; MACS = magnetyczne sortowanie komórek; O4 = marker oligodendrocytów O4. Rycina została zmodyfikowana na podstawie49. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

1. Indukcja aktywnego EAE

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Do separacji komórek: Przygotować bufor PB i przechowywać go w temperaturze 2-8 °C przez maksymalnie 1 tydzień. Aby przygotować roztwór zapasowy, dodać 475 mL 1x PBS bez dodatków (pH 7.2) + 25 mL 0.5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Stosować rozcieńczenie 1:20 przygotowane w BSA.
    2. Do cytometrii przepływowej i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS): Przygotować bufor FACS, PBS z 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 2 mM EDTA, i przechowywać go w temperaturze 2-8 °C. W celu przygotowania dodać 500 mL 1x PBS bez dodatków oraz 10 mL FCS + 2 mL EDTA (z roztworu zapasowego 0.5 M EDTA).
    3. Przeprowadzić immunizację zgodnie z protokołem Bittnera i wsp. 5. W skrócie, indukować EAE poprzez podskórny wtrysk emulsji zawierającej 200 µg peptydu MOG35-55 i 200 µL kompletnego przymiotnika Freuda zawierającego 200 µg Mycobacterium tuberculosis.
    4. Zanestezjować mysz 2% izofluranem, używając komory anestezjologicznej z parowarzem do izofluranu. Na oczy zwierzęcia nałożyć maść weterynaryjną, aby zapobiec wysuszeniu podczas anestezji.
    5. Po 2 h wykonać wstrzyknięcie dosytronne 100 ng toksyny krztuśca (PTx) rozpuszczonej w 100 µL 1x PBS zgodnie z protokołem Huntemanna i wsp.24. Powtórzyć wtrysk PTx w 2. dniu po immunizacji.
      OSTRZEŻENIE: Obserwować każde zwierzę, aż odzyska ono wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję leżenia na brzuchu. Myszy, które przeszły procedury wtrysku, nie są zwracane do grupy pozostałych myszy, dopóki całkowicie nie powrócą do zdrowia. W przypadku Mycobacterium tuberculosis i PTx: Unikać wdychania, połknięcia oraz kontaktu ze skórą i oczami. Mycobacterium tuberculosis jest aktywatorem wrodzonego układu odpornościowego. PTx wykazuje wiele efektów biologicznych.
    6. Monitorować codziennie postęp EAE; badanie wykonują dwaj oślepieni badacze, którzy kontrolują masę ciała i badają myszy klinicznie.
    7. W tym celu zastosować następujący system oceny: stopień 0 – brak klinicznych objawów EAE, stopień 1 – częściowy niedowład ogona, stopień 2 – całkowity niedowład ogona, stopień 3 – umiarkowane osłabienie kończyn tylnych, stopień 4 – całkowite osłabienie kończyn tylnych i chód ataksyczny, stopień 5 – lekki niedowład kończyn tylnych (parapareza), stopień 6 – niedowład kończyn tylnych (parapareza), stopień 7 – porażenie kończyn tylnych (paraplegia), stopień 8 – niedowład czterokończynowy (tetrapareza), stopień 9 – porażenie czterokończynowe (quadriplegia), stopień 10 – śmierć.
    8. Przyjąć następujące kryteria wykluczenia z dalszego udziału w eksperymencie: wynik kliniczny > 7 lub utrata masy ciała przekraczająca 20% początkowej masy ciała.
    9. W celu wycięcia mózgu i rdzenia kręgowego, eutanazować myszy z EAE w 16. dniu po indukcji EAE, co odpowiada maksimum choroby.

2. Przygotowanie tkanki OUN (Czas trwania: około 10 min na mysz)

  1. Po uśmierceniu myszy dwutlenkiem węgla, rozpocznij transkardialną perfuzję każdej myszy 20 mL 1x PBS. Powtórz perfuzję ponownie, używając 20 mL 1x PBS.
  2. Ułóż mysz w pozycji grzbietowej i unieruchom kończyny za pomocą kaniul. Na przednią część ciała zwierzęcia nanieś 75% etanol. Na tym etapie dalsze środki sterylizacyjne nie są konieczne.
  3. Otwórz jamę brzuszną i klatkę piersiową, wykonując podłużne cięcie skóry i powięzi za pomocą nożyczek.
  4. Przetnij żebra bocznie i odchyl klatkę piersiową do góry, aby uzyskać swobodny dostęp do serca. Unieruchom odchyloną klatkę piersiową kaniulami.
  5. Otwórz prawy przedsionek za pomocą nożyczek. Wprowadź 20 mL 1x PBS do lewej komory za pomocą kaniuli, aby wypłukać krew przez nacięty prawy przedsionek.
  6. Odsłoń czaszkę, przecinając skórę na szczycie głowy myszy wzdłuż nacięcia podłużnego, a następnie odsuń skórę wokół głowy za pomocą pincety. Nacinij czaszkę nożyczkami wzdłuż szwu strzałkowego.
  7. Wsuń końcówkę pincety wzdłuż linii nacięcia, aby rozłupać kalotę. Usuń pozostałe części kaloty pincetą tak, aby mózg był w pełni odsłonięty.
  8. Ostrożnie wyjmij mózg i umieść go w matrycy do mózgu mysiego. Przetnij mózg na plastry strzałkowe o grubości 1 mm za pomocą żyletki.
  9. Przetnij kręgosłup nożyczkami tuż powyżej grzebienia biodrowego, aby możliwe było wprowadzenie strzykawki do kanału kręgowego.
    UWAGA: Najprostszym sposobem usunięcia rdzenia kręgowego jest jego wypłukanie z kanału kręgowego za pomocą PBS. W przeciwnym razie łuki kręgowe muszą zostać otwarte pojedynczo nożyczkami, a następnie można usunąć rdzeń kręgowy.
  10. Wypłucz rdzeń kręgowy z kanału kręgowego w kierunku od ogona do czaszki, używając strzykawki 20 mL z igłą 20G zawierającą 1x PBS. Przetnij rdzeń kręgowy na segmenty o długości 0,5 cm za pomocą skalpela.
  11. Każdą zawiesinę komórek OUN składającą się z mózgu i odpowiadającego mu rdzenia kręgowego przechowuj w oddzielnej płytce Petriego dla każdej myszy, wypełnionej około 3 mL zimnego D-PBS. Przechowuj płytki na lodzie do czasu dalszej obróbki.

3. Dysocjacja tkanki OUN (Czas trwania: około 1-1,5 h w zależności od liczby zawiesin komórek OUN)

UWAGA: Tkanka nerwowa dorosłych myszy jest dysocjowana poprzez połączenie dysocjacji mechanicznej z enzymatyczną degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej. Dzięki temu zachowana zostaje integralność strukturalna, a zawiesina komórkowa może być wykorzystana w dalszych procedurach izolacji komórek.

  1. Przygotować odpowiednią objętość mieszaniny enzymatycznej 1 składającej się z 50 µL enzymu P i 1 900 µL buforu Z na każdą zawiesinę komórek OUN. Oba odczynniki należą do zestawu do dysocjacji dorosłego mózgu.
  2. Przygotować odpowiednią objętość mieszaniny enzymatycznej 2 składającej się z 10 µL enzymu A i 20 µL buforu Y na każdą zawiesinę komórek OUN. Oba odczynniki należą do zestawu do dysocjacji dorosłego mózgu.
  3. Przenieść 1 950 µL mieszaniny enzymatycznej 1 do probówki C, a następnie dodać kawałki tkanki z jednej zawiesiny komórek OUN. Należy użyć jednej probówki C na jedną mysz.
  4. Dodać 30 µL mieszaniny enzymatycznej 2 do każdej probówki C. Szczelnie zamknąć probówki C i zamocować je do góry nogami w uchwycie dysocjatora komórek z grzałkami.
  5. Uruchomić odpowiedni program o nazwie 37C_ABDK_01 (czas trwania 30 min). Obserwować co najmniej pierwsze 5 min programu, aby upewnić się, że wszystkie probówki obracają się z tą samą prędkością. Podczas pracy możliwe jest wystąpienie błędów. Następnie przejść do kroku 6.
  6. W ciągu ostatnich 2 min programu umieścić jedno sitko 70 µm na probówce 50 mL dla każdej dysocjowanej zawiesiny komórek OUN. Sitka należy uprzednio zwilżyć 2 mL D-PBS.
  7. Po zakończeniu programu wyjąć probówki C z dysocjatora i umieścić je w wirówce. Wirować próbki przy 300 x g i 4 °C przez 1 min, aby zebrać próbkę na dnie probówki.
  8. Resuspendować próbkę i nanieść ją na uprzednio zwilżone sitko. Do pustej probówki C dodać 10 mL zimnego D-PBS i zamknąć ją. Delikatnie wstrząsnąć i nanieść zawiesinę na odpowiadające jej sitko.
  9. Usunąć sitka i zamknąć probówki 50 mL. Ponownie wirować zawiesinę komórkową przy 300 x g i 4 °C przez 10 min. Następnie bardzo ostrożnie odessać cały nadsącz.

4. Usuwanie zanieczyszczeń (Czas trwania: Około 1,5-2 h w zależności od liczby zawiesin komórek OUN)

UWAGA: Dysocjacja tkanki często prowadzi do powstania mieliny i szczątków komórkowych, które mogą utrudniać dalsze analizy. Poprzez dodanie roztworu do usuwania zanieczyszczeń, szczątki te mogą zostać skutecznie usunięte z zawiesiny komórek OUN.

  1. Ostrożnie resuspenduj osad komórkowy w 3 100 µL D-PBS dla każdej zawiesiny komórek OUN. Nie używaj wortexa.
  2. W przypadku pracy z więcej niż jedną zawiesiną komórek OUN, połącz maksymalnie dwie zawiesiny pochodzące z jednego warunku lub grupy eksperymentalnej w jednej probówce 15 mL.
  3. Dodaj 900 µL roztworu do usuwania zanieczyszczeń z zestawu do dysocjacji mózgu dorosłego do jednej zawiesiny komórek OUN lub 1 800 µL roztworu do usuwania zanieczyszczeń do dwóch połączonych zawiesin komórek OUN.
  4. Odwróć probówkę i wymieszaj zawiesinę. Następnie bardzo delikatnie nałóż na nią 4 mL zimnego D-PBS. Powinien być widoczny wyraźny gradient (Rysunek 2A).
  5. Wiruj probówki przez 10 min przy 3000 x g i 4 °C z pełnym przyspieszeniem i bez hamowania.
  6. Jeśli rozdzielenie przebiegło zgodnie z planem, utworzą się trzy fazy (Rysunek 2C). Całkowicie odessij dwie górne fazy (Rysunek 2C-1,2) i je wylej. Ważne jest, aby nie pozostały żadne resztki mieliny (Rysunek 2E).
    UWAGA: Jeśli gradient nie zadziałał, a komórki są pilnie potrzebne, nie odsysaj dwóch górnych faz. Zamiast tego dopełnij probówkę 15 mL zimnym D-PBS do objętości 15 mL i odwróć ją kilka razy. Ponownie wiruj przy 1000 x g przez 10 min w 4 °C z pełnym przyspieszeniem i bez hamowania. Odessij nadnadkład i powtórz kroki 4.1-4.4.
  7. Dopełnij probówkę zimnym D-PBS do 14 mL i ją zamknij. Energicznie odwracaj probówkę na blacie roboczym, aż osad komórkowy oddzieli się od dna probówki. Nie używaj wortexa.
  8. Ponownie wiruj próbkę przy 1000 x g i 4 °C przez 10 min. Ustaw pełne przyspieszenie i pełne hamowanie. Ostrożnie i całkowicie odessij nadnadkład.

Centryfugowanie różnicowe; schemat izolacji mieliny; rozdział faz w probówkach do wirówki.
Rysunek 2: Prawidłowe i błędne praktyki podczas usuwania zanieczyszczeń. (A) Pozytywny przykład gradientu po nałożeniu 4 mL PBS. Górna faza składająca się z 4 mL PBS jest wyraźnie odróżnialna od dolnej fazy, która stanowi zawiesinę komórek OUN z roztworem do usuwania zanieczyszczeń. (B) Negatywny przykład gradientu po nałożeniu 4 mL PBS. Gradient nie wykazuje wyraźnego rozdziału między PBS a znajdującą się poniżej zawiesiną komórkową. Część PBS rozprzestrzeniła się w zawiesinie komórkowej. (C) Pozytywny przykład gradientu po wirowaniu. Można łatwo rozróżnić trzy oddzielne fazy. W górnej (1) lub dolnej fazie (3) gradientu nie widać pozostałości mieliny. Faza środkowa zawiera całą mielinę (2). Osad komórkowy jest widoczny na dnie probówki 15 mL. (D) Negatywny przykład gradientu po wirowaniu. Nie uzyskano dokładnego rozdziału trzech faz. W górnej (1) i dolnej fazie (3) gradientu widoczne są niektóre pozostałości mieliny. (E) Pozytywny przykład gradientu po odessaniu dwóch górnych faz. Powstała próbka zawiera jedynie osad komórkowy i przejrzysty nadsącz powyżej. Nie pozostały żadne resztki mieliny. (F) Negatywny przykład gradientu po odessaniu dwóch górnych faz. Próbka nadal zawiera niektóre pozostałości mieliny (czarna strzałka). Skróty: CNS = central nervous system (OUN – ośrodkowy układ nerwowy); PBS = phosphate-buffered saline (bufor fosforanowy) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Usuwanie erytrocytów (Czas trwania: Około 1 h w zależności od liczby zawiesin komórek OUN)

UWAGA: Ten etap zapobiega późniejszemu zanieczyszczeniu erytrocytami i zapewnia optymalną lizę czerwonych krwinek przy minimalnym wpływie na pozostałe typy komórek izolowanych z tkanki OUN. Poniższe objętości są wskazane dla zawiesin komórkowych otrzymanych z 100 mg do 1 g tkanki neuronalnej, co odpowiada dwóm mózgom i rdzeniom kręgowym dorosłych myszy. W przypadku pracy z więcej niż dwiema zawiesinami komórek OUN, należy proporcjonalnie zwiększyć ilość wszystkich odczynników i objętości całkowite.

  1. Zacznij od przygotowania roztworu do usuwania erytrocytów (RBCRS): na dwie połączone zawiesiny komórek OUN. Rozcieńcz 100 µL roztworu zapasowego do usuwania erytrocytów (10x) z zestawu do dysocjacji mózgu dorosłych w 900 µL ddH2O, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:10.
  2. Przechowuj RBCRS w temperaturze 2-8 °C do momentu użycia. Niezużyte pozostałości utylizuj na koniec dnia.
  3. Resuspenduj pellet komórkowy z maksymalnie dwóch zawiesin komórek OUN w 1 mL RBCRS. Unikaj mieszania w wirówce typu vortex. Inkubuj roztwór przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  4. Dodaj 10 mL zimnego buforu PB do dwóch połączonych zawiesin komórkowych. Odwiruj próbkę przy 300 x g i 4 °C przez 10 min, a następnie całkowicie odessij supernatant.
  5. Resuspenduj każdy pellet komórkowy z jednej zawiesiny komórek OUN w 80 µL buforu PB, powoli pipetując go w górę i w dół. Odpowiednio, użyj 160 µL do resuspensji pelletów komórkowych pochodzących z dwóch zawiesin komórek OUN.
  6. Podczas pracy z kilkoma zawiesinami komórek OUN z tego samego warunku eksperymentalnego, połącz wszystkie te zawiesiny komórkowe.
  7. Wyznacz liczbę komórek, np. używając ulepszonej komory liczbowej. Zawiesiny komórkowe zazwyczaj rozcieńczano 1:50 w buforze PB, a następnie dodatkowo rozcieńczano 1:10 w 0,4% roztworze błękitu trypanu.

6. Protokół z użyciem kulek magnetycznych u myszy naiwnych i myszy z EAE (Czas trwania: Około 1 h)

  1. Oznakuj magnetycznie różne typy komórek OUN za pomocą MicroBeads specyficznych dla ich antygenów powierzchniowych. Następnie umieść zawiesinę komórkową w kolumnie i oddziel magnetycznie komórki oznakowane, zatrzymane w kolumnie, od komórek nieoznakowanych, które przepłyną przez nią.
  2. Po wyjęciu kolumny z pola magnetycznego, wypłucz magnetycznie znakowane komórki z kolumny do probówki jako frakcję komórek wyselekcjonowanych pozytywnie.
    UWAGA: Objętości dla procesu znakowania magnetycznego zostały obliczone dla maksymalnie 1 x 107 całkowita liczba komórek. W przypadku uzyskania większej liczby komórek należy odpowiednio zwiększyć objętość wszystkich odczynników i objętości całkowite. Zaleca się szybką pracę i stosowanie wyłącznie schłodzonych wcześniej roztworów, aby zapobiec blokowaniu przeciwciał na powierzchni komórek oraz nieswoistemu znakowaniu komórek, a także w celu zapewnienia wysokiej żywotności wyizolowanych populacji komórek. Ważne jest również, aby etapy płukania przeprowadzać natychmiast po opróżnieniu zbiornika kolumny, dodając bufor PB, tak aby kolumny nie wyschły.
  3. Podziel oczyszczoną, nierozcieńczoną zawiesinę komórek OUN na dwie frakcje w celu przeprowadzenia następujących izolacji mikrogleju i oligodendrocytów. Stosunek obu frakcji zależy od pożądanej liczby komórek każdego z typów.
    UWAGA: Dalsze szczegóły (czas inkubacji, szczegółowe kroki protokołu, objętości, odczynniki oraz metoda liczenia komórek) zostały wskazane w Tabela 1.

Tabela 1: Schemat jednoczesnego znakowania magnetycznego i izolacji oligodendrocytów oraz mikrogleju z myszy naiwnych i z EAE. Oba typy komórek są izolowane poprzez selekcję pozytywną. Kroki wymienione w tym samym wierszu są oznaczone jako czynności wykonywane jednocześnie. Skróty: CD11b = kinaza zależna od cykliny 11B; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia; FcR = białko podobne do receptora Fc; O4 = marker oligodendrocytów O4. Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.

7. Poprawka do protokołu: dodatkowa sortownia w celu izolacji mikrogleju u myszy z EAE (Czas trwania: około 1,5-2 h)

UWAGA: Podczas pracy z myszami z EAE konieczne jest uzupełnienie protokołu izolacji komórek w systemie MACS o metodę FACS, aby usunąć z frakcji komórek CD11b+ inne populacje komórek CD11b+ niż mikroglej (np. monocyty, makrofagi, komórki natural killer, granulocyty lub komórki dendrytyczne). W przeciwnym razie ten krok można pominąć.

  1. Przygotować mieszaninę barwiącą (master mix) zawierającą 1x PBS z dodatkiem CD11b FITC (klon M1/70, 1:50) i CD45 APC/Cy7 (klon 30-F11, 1:200). Użyć 100 µL mieszaniny barwiącej na 5 x 106 komórek. Wszystkie przeciwciała należy wymieszać w wirówce typu vortex przed użyciem.
  2. Odwirować zawiesinę komórek mikrogleju przy 300 x g i 4 °C przez 10 min, a następnie ostrożnie odessać nadsącz.
  3. Resuspendować osad komórkowy w 100 µL przygotowanej mieszaniny barwiącej na 5 x 106 komórek. Inkubować przez 15 min w ciemności w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Zatrzymać reakcję, dodając 500 µL PBS, a następnie ponownie odwirować próbkę przy 300 x g i 4 °C przez 10 min.
  5. Ostrożnie odessać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 1x PBS z dodatkiem 10 µg/mL DNAse, aby uzyskać końcowe stężenie 1 x 107 komórek na mL. Przechowywać komórki w 4 °C do rozpoczęcia sortowania.
  6. Bezpośrednio przed rozpoczęciem sortowania nanieść zawiesinę komórkową na sito 100 µm umieszczone w nowej probówce do FACS.
  7. Ustawić szybkość przepływu na 1000 zdarzeń na sekundę i użyć dyszy 100 µm. Wyselekcjonować pożądaną populację komórek CD45intCD11bhigh do nowej probówki 15 mL z 1x PBS w temperaturze pokojowej (RT).

8. Przygotowanie frakcji ujemnej (flow-through) oligodendrocytów w celu izolacji neuronów i astrocytów (Czas trwania: Około 1 h)

UWAGA: Negatywna frakcja przepływowa oligodendrocytów z kroku 6 jest zbierana do dalszej izolacji neuronów i astrocytów. W tym celu zawiesinę komórkową dzieli się na dwie części. Dzięki wcześniejszej izolacji oligodendrocytów z zawiesiny komórkowej OUN zminimalizowano zanieczyszczenie komórkami O4+, które w przeciwnym razie byłoby obserwowane.

  1. Odwiruj ujemną frakcję przepływową oligodendrocytów przy 300 x g i 4 °C przez 10 min, a następnie ostrożnie odessij supernatant.
  2. Resuspenduj osad komórkowy w 80 µL buforu PB na każdą połączoną zawiesinę komórek OUN wcześniej wykorzystaną do izolacji dodatniej frakcji oligodendrocytów.
  3. Policz komórki. Przeprowadź zliczanie komórek uznanych za O4-, korzystając z ulepszonej komory liczbowej po rozcieńczeniu zawiesiny komórkowej 1:50 w buforze PB, a następnie dodatkowym rozcieńczeniu 1:10 w 0,4% błękicie trypanowym.
  4. Podziel oczyszczoną, nierozcieńczoną zawiesinę komórkową na dwie frakcje w celu jednoczesnej izolacji neuronów i astrocytów. Stosunek obu frakcji zależy od pożądanej ilości każdego typu komórek.
    UWAGA: Dalsze szczegóły (czas inkubacji, szczegółowe kroki protokołu, objętości, odczynniki i metoda zliczania komórek) podano w Tabeli 2.

Tabela 2: Schemat jednoczesnego znakowania magnetycznego i izolacji neuronów oraz astrocytów od myszy naiwnych oraz myszy z EAE. Oba typy komórek są izolowane z frakcji przepływowej negatywnej dla oligodendrocytów. Astrocyty są oddzielane poprzez selekcję pozytywną przy użyciu mikrokulek anty-ACSA-2, natomiast neurony są oczyszczane poprzez biotinylację i usunięcie wszystkich komórek nieneuronalnych w ramach selekcji negatywnej. Kroki wymienione w tym samym wierszu powinny być wykonywane jednocześnie. Skróty: Anti-ACSA-2 = antygen powierzchniowy astrocytów-2; EAE = eksperymentalne autoimmunizacyjne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego; FcR = białko podobne do receptora Fc; MACS = magnetyczna separacja komórek. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

9. Analizy czystości wyizolowanych typów komórek rezydujących w OUN (Czas trwania: Około 2 h)

UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie cytometrii przepływowej wszystkich czterech izolowanych populacji komórek obecnych w OUN w celu pomiaru i porównania ich czystości oraz żywotności. W związku z tym konieczne jest barwienie wszystkich typów komórek przeciwciałem znakowanym fluorochromem. Barwienie komórek żywych/martwych wykonuje się przy użyciu utrwalanego barwnika żywotności (1:10 000).

  1. Panel czystości – protokół barwienia zewnątrzkomórkowego
    1. Użyć 1 x 105 komórki rozpuszczone w 50 µL PBS na jedno barwienie.
    2. Przygotować główną mieszaninę barwiącą rozpuszczoną w PBS z 2% FCS/2 mM EDTA, składającą się z następujących przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z fluorochromami, skierowanych przeciwko specyficznych dla typów komórek markerom powierzchniowym: CD11b FITC (klon 1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotyna-PE (klon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (klon REA-969, 1:200)33,34,35, O4 APC (klon REA-576, 1:400) oraz CD45 BV510 (klon 30-F11, 1:150)36,37Dodaj 1 µg przeciwciał anty-CD16/32 na 1 x 106 komórki w celu zablokowania receptora Fc38,39Wszystkie przeciwciała należy wymieszać w wstrząsarzu typu vortex przed użyciem.
    3. Odwiruj zawiesinę komórkową przez 5 min przy 540 x g. g i 4 °C i ostrożnie odessać supernatant.
    4. Resuspendować osad komórkowy w 100 µL odpowiedniej mieszanki master mix, a następnie inkubować próbkę przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
    5. Przemyć komórki za pomocą 500 µL 1x PBS z dodatkiem 2% FCS/2 mM EDTA i odwirować próbkę przez 5 min przy 540 x g i 4 °C.
    6. Odssać supernatant i resuspendować osad komórkowy w 70 µL 1x PBS z dodatkiem 2% FCS/2 mM EDTA.
    7. Wymieszaj próbkę w wstrząsarzu wirowym (vortex), aby całkowicie rozbić pellet komórkowy. Następnie próbka jest gotowa do analizy metodą cytometrii przepływowej.
  2. Panel czystości – protokół barwienia wewnątrzkomórkowego z wykorzystaniem NeuN
    1. Użyć 1 x 105 komórki z każdej populacji komórkowej do barwienia wewnątrzkomórkowego NeuN, który jest specyficznym dla neuronów markerem jądrowym 40,41Jest to dodatkowy sposób barwienia żywych neuronów.
    2. Przenieś 1 x 105 komórki każdej populacji komórkowej do probówki do FACS. Do każdej probówki dodać 1 ml PBS z 2% FCS/2 mM EDTA. Odwirować probówki przy 540 x g i 4 °C przez 5 min.
    3. W międzyczasie przygotować master mix rozpuszczony w PBS z dodatkiem 2% FCS/2 mM EDTA, składający się z następujących koniugowanych z fluorochromami przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko markerom powierzchniowym specyficznymi dla danego typu komórek: CD11b FITC (klon M1/70, 1:100)25,26,27,28, biotyna-PE (klon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (klon REA-969, 1:200)33,34,35oraz CD45 BV510 (klon 30-F11, 1:150)36,37.
    4. Odssać supernatant i resuspendować komórki w 100 µL do przygotowanej mieszaniny master mix i inkubować próbkę przez 10 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
    5. Przemyć komórki za pomocą 100 µL buforu PBS z dodatkiem 2% FCS/2 mM EDTA, a następnie ponownie odwiruj je przy 540 x g i 4 °C przez 5 min.
    6. W międzyczasie należy przygotować 200 µL roztworu do fiksacji/permeabilizacji: dodać 50 µL skoncentrowanego roztworu roboczego do fiksacji i permeabilizacji do 150 µL roztworu rozcieńczającego do fiksacji/permeabilizacji, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:4.
    7. Odessać nadsącz i resuspender komórki w 100 µL roztworu do fiksacji/permeabilizacji (1x). Inkubować próbkę przez 30 min w temperaturze 4 °C.
    8. W międzyczasie przygotować 1 ml buforu do permeabilizacji/płukania 1x, dodając 100 µL roztworu zapasu buforu do permeabilizacji do 900 µL z ddH2O2Aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1:10.
    9. Przemyć komórki jednokrotnie za pomocą 100 µL buforu do permeabilizacji/płukania 1x i odwirować próbkę przy 540 x g i 4 °C przez 5 min.
    10. W międzyczasie należy przygotować inny master mix w 1x buforze do permeabilizacji/płukania, składający się wyłącznie z NeuN (NeuN AF647, klon EPR12763, 1:200) oraz 1 µg anty-CD16/32 na 106 komórki w celu zablokowania receptora Fc.
    11. Odssać nadsącz. Ponownie zawiesić utrwalone i permeabilizowane komórki w 50 µL drugiego master mixu i inkubować przez 30 min w temperaturze 4 °C.
    12. Przemyć próbkę za pomocą 100 µL buforu do permeabilizacji/płukania 1x i odwirować przy 540 x g i 4 °C przez 5 min.
    13. Odlej nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w 70 µL buforu PBS z dodatkiem 2% FCS/2 mM EDTA. Następnie próbka jest gotowa do analizy cytometrycznej.
    14. Po skonfigurowaniu panelu w cytometrze przepływowym należy przeprowadzić akwizycję komórek w celu analizy czystości, korzystając z oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.

10. Analiza statystyczna

  1. Przeprowadź analizy statystyczne i przygotuj wykresy za pomocą programu do analizy graficznej. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM.

Wyniki

Obecny protokół umożliwia jednoczesną izolację wszystkich głównych komórek zamieszkujących OUN, tj. mikrogleju, oligodendrocytów, astrocytów i neuronów z jednej pojedynczej replikacji OUN. Jest to istotne dla zmniejszenia liczby myszy potrzebnych do tego rodzaju eksperymentów oraz dla zapewnienia porównywalności analiz molekularnych i biochemicznych na poziomie komórkowym. Jeśli poszczególne typy komórek są izolowane z różnych replikacji OUN, interakcje komórkowe nie mogą być wiernie odwzorowane, a potencjalne odchylenia techniczne podczas procesów izolacji mogłyby zaburzyć dalsze analizy. Ponadto wyniki molekularne i biochemiczne z każdego typu komórek nie byłyby ze sobą porównywalne, ponieważ nie pochodziłyby z tego samego kontekstu EAE. W celu umożliwienia jednoczesnej izolacji wyżej wymienionych typów komórek zaadaptowano istniejący protokół MACS z wykorzystaniem komercyjnego systemu/zestawu.

Izolację mikrogleju przeprowadzono przy użyciu mikrokulek anty-CD11b, oligodendrocytów izolowano za pomocą mikrokulek anty-O4 (Tabela 1), a do izolacji astrocytów wykorzystano mikrokulki anty-ACSA-2 (Tabela 2). Z kolei izolacja neuronów stanowi selekcję negatywną i została przeprowadzona poprzez biotinylację oraz znakowanie magnetyczne wszystkich komórek nieneuronalnych (Tabela 2). Wszystkie komórki nieneuronalne (np. oligodendrocyty, mikroglej, astrocyty, komórki śródbłonka i fibroblasty), z wyjątkiem komórek krwi, mogą zostać znakowane magnetycznie przy użyciu przeciwciała sprzężonego z biotyną, skierowanego specyficznie przeciwko antygenowi powierzchniowemu ekspresjonowanemu na tych komórkach nieneuronalnych (Tabela 2). Poprzez usunięcie tych magnetycznie znakowanych komórek nieneuronalnych można uzyskać wysokiej czystości i żywotne populacje komórek neuronalnych30,42,43.

Zaprojektowano dwa nowe panele do cytometrii przepływowej w celu analizy czystości otrzymanych zawiesin pojedynczych komórek. Wykorzystano w nich swoiste dla typów komórek markery powierzchniowe i jądrowe w połączeniu z dyskryminacją komórek żywych i martwych.

Przeanalizowano uzyskaną liczbę komórek na mysz i typ komórki (Rysunek 3A), co pozwoliło uzyskać średnią wynoszącą 8. 4 x 105 ± 3 x 104 mikrogleju, 3.23 x 106 ± 1 x 105 oligodendrocytów, 8.6 x 105 ± 2 x 104 astrocytów oraz 4.5 x 105 ± 1 x 104 neuronów na mysz naiwną.

W ramach celu polegającego na zbadaniu modeli chorobowych neurostanu zapalnego, protokół zastosowano również w mysim modelu EAE. Myszy uśpiono w 16. dniu po indukcji EAE, co odpowiadało szczytowi choroby. W tym ustawieniu EAE wyizolowano około 2,9 x 106 ± 6,7 x 105 oligodendrocytów, 5,2 x 105 ± 9 x 104 astrocytów oraz 4,4 x 105 ± 4 x 104 neuronów. Wydajność uzyskania mikrogleju spadła do około 1,7 x 105 ± 4 x 104 komórek mikrogleju na mysz z EAE ze względu na dodatkowe sortowanie komórek po etapach MACS (Rycina 3A).

Po izolacji, charakterystyka fenotypowa różnych populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej wykazała, że możliwe jest uzyskanie żywych zawiesin pojedynczych komórek o czystości około 90% dla wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN (Rysunek 3B). Mikroglej wyznaczano (gate) jako CD45intCD11bhigh zgodnie z definicjami zawartymi w literaturze44,45,46,47.

W modelu EAE mikroglej musiał zostać wyselekcjonowany ze wszystkich komórek CD11b+, aby odróżnić go od innych immunologicznych komórek CD11b+, takich jak monocyty, neutrofile, komórki natural killer, granulocyty i makrofagi, które migrują do OUN podczas neurostanu zapalnego27,28,48. W związku z tym mikroglej wyselekcjonowano jako komórki CD45intCD11high z zawiesiny komórek CD11b+. Cała strategia sortowania mikrogleju przedstawiona jest na Rysunku 4. U myszy naiwnych populacja mikrogleju stanowiła 91,16% wszystkich żywych pojedynczych komórek (96% całkowitej populacji CD11b+) (Rysunek 4A). U myszy z EAE populacja mikrogleju stanowiła 46,85% wszystkich żywych pojedynczych komórek (55% całkowitej populacji CD11b+) (Rysunek 4B). Pomimo że zarówno procedury MACS, jak i FACS wywierają stres mechaniczny na pojedyncze komórki, 75,41% ± 8,63% wyselekcjonowanego, oczyszczonego mikrogleju było żywotne (Rysunek 3B).

Astrocyty i neurony izolowane bezpośrednio z początkowej zawiesiny komórek OUN wykazywały istotne zanieczyszczenie oligodendrocytami, co doprowadziło do założenia, że jednoczesna izolacja neuronów i astrocytów z frakcji ujemnej (flow-through) oligodendrocytów może zapobiec temu zanieczyszczeniu. Analizy cytometryczne potwierdziły, że astrocyty izolowane z frakcji ujemnej oligodendrocytów charakteryzowały się czystością na poziomie 89,23% ± 2,78% i przeżywalnością wynoszącą 80,56% ± 1,41%. Podobnie, czystość neuronów izolowanych z frakcji komórek O4- wynosiła 81,25% ± 3,31%, a przeżywalność 83,90% ± 2,61% (Rycina 3B). Wyniki te potwierdzają również, że jednoczesna izolacja tych dwóch typów komórek dopiero po uprzedniej izolacji oligodendrocytów nie wpływa na liczbę żywych, funkcjonalnych komórek.

Wyniki dotyczące żywotności i czystości wyizolowanych zawiesin pojedynczych komórek były bardzo zbliżone u myszy z EAE w porównaniu do wyników uzyskanych u myszy naiwnych, co potwierdza, że protokół ten jest odpowiedni zarówno dla myszy zdrowych, jak i w kontekście EAE (Ryc. 3B).

Wykres analizy fenotypu komórek; warunki naiwne vs. EAE; mikroglej, oligodendrocyte, astrocyty, neurony.
Rysunek 3: Wydajność uzyskiwania komórek i walidacja za pomocą cytometrii przepływowej izolowanych komórek rezydentnych w OUN. (A) Wydajność uzyskiwania komórek na mysz i typ komórek po izolacji komórek rezydentnych w OUN u myszy naiwnych i z EAE. Wykresy słupkowe wizualizują ilość uzyskanych komórek na mysz i typ komórek po zastosowaniu przedstawionego protokołu. W celu uzyskania wyników dla myszy naiwnych przetworzono pięć powtórzeń biologicznych, a w przypadku myszy z EAE przeanalizowano cztery powtórzenia biologiczne. Przedstawiono odpowiednie średnie ± SEM. (B) Odpowiadające analizy czystości i żywotności oczyszczonych frakcji komórkowych. Wykresy słupkowe wskazują żywotność i czystość otrzymanych zawiesin pojedynczych komórek na podstawie ekspresji markerów specyficznych dla danego typu komórek. NeuN wykorzystano jako specyficzny dla typu komórek marker jądrowy dla neuronów. Dla każdego typu komórki, zarówno dla myszy zdrowych, jak i z EAE, pozyskano i porównano pięć powtórzeń biologicznych. Wskazano odpowiednie średnie ± SEM. Skróty: Anti-ACSA-2 = antygen powierzchniowy astrocyta 2; CD11b = kinaza zależna od cykliny 11B; CD45 = receptorowa fosfataza tyrozynowa C; CNS = ośrodkowy układ nerwowy; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia; MACS = magnetyczne sortowanie komórek; NeuN = białko wiążące RNA homolog 3 fox-1; O4 = marker oligodendrocytów O4; SEM = standardowy błąd średniej. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie literatury49. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki cytometrii przepływowej, wykresy kropkowe przedstawiają sortowanie komórek, analizę bramkowania, SSC-A/FSC-A, markery CD45/CD11b.
Rycina 4: Strategia bramkowania dla sortowania mikrogleju po izolacji komórek CD11b+. (A) Strategia bramkowania u myszy naiwnych oraz (B) myszy z EAE. Górny rząd każdego panelu przedstawia wykresy kropkowe przed sortowaniem, a dolny rząd po sortowaniu. Po wyselekcjonowaniu żywych komórek (SSC-A / FSC-A) oraz pojedynczych komórek (FCS-H / FSC-W), populację komórek CD45intCD11b+ posortowano jako populację mikrogleju. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Do tej pory metody mapowania komórek rezydujących w OUN ex vivo poprzez połączenie spektrometrii mas i sekwencjonowania RNA oferują bardzo precyzyjne profilowanie komórkowe w zdrowiu i chorobie, ale wymagają ambitnej wiedzy technicznej i doświadczenia w tej dziedzinie50,51. Ponadto nie pozwalają na analizy funkcjonalne i są bardzo drogie. Poza tym mikroprzepływowe systemy typu brain-on-a-chip zapewniają szybkie i niedrogie badania przesiewowe pod kątem mechanizmów chorobowych oraz testowanie nowych podejść terapeutycznych z ograniczeniem wzrostu i migracji komórek 52,53,54,55. Organoidy OUN mogą również stanowić równoważną alternatywę w przyszłości do badania modelowania komórkowego, połączeń międzykomórkowych i interakcji podczas przebiegu choroby 56,57,58,59. Jednak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i magnetycznie jest obecnie najskuteczniejszą metodą generowania czystych i żywotnych zawiesin jednokomórkowych ex vivo 35,60,61. Nawet jeśli inne ustalone protokoły produkcyjne dotyczące izolacji typów komórek rezydujących w OUN są podobne w odniesieniu do poszczególnych etapów izolacji magnetycznej i wcześniejszej dysocjacji komórek, przewiduje się je przeprowadzić dla każdego typu komórek osobno. W przeciwieństwie do tego, obecny protokół integruje różne metody izolacji dla każdego typu komórek rezydujących w OUN w logicznym kontekście, tak aby można je było wykonywać jednocześnie i z jednej zawiesiny komórek OUN (Tabela 1, Tabela 2). W ten sposób umożliwia analizy multiomiczne z pojedynczej zawiesiny komórek OUN, a ostatecznie eksplorację złożonych sieci neuronowych. Nawet jeśli nie jest konieczne zebranie kilku tkanek od wielu zwierząt w celu wykonania tego protokołu, to połączenie zapewnia odpowiednią liczbę izolowanych komórek do dalszej analizy. Wykorzystanie różnych myszy do izolacji pojedynczych typów komórek wykluczyłoby możliwość analizy potencjalnych interakcji komórkowych. Poza tym połączenie indywidualnych metod izolacji dla różnych typów komórek OUN, z których wszystkie są zgodne z wcześniejszą dysocjacją OUN, pozwala zaoszczędzić koszty materiałowe dzięki zastosowaniu jednej zdysocjowanej zawiesiny komórek OUN dla wszystkich kolejnych etapów izolacji magnetycznej. Dodatkowo zminimalizowane jest potencjalne odchylenie techniczne spowodowane użyciem różnych myszy.

Jednym z ograniczeń protokołu może być prawie wyłączne użycie samic myszy C57BL/6J. Protokół szczepień EAE został zaprojektowany i ustalony dla samic myszy, więc ten protokół izolacji komórek został wdrożony również u samic myszy C57BL / 6J. Niemniej jednak naiwne samce myszy zostały również wykorzystane podczas opracowywania tego protokołu, nie rozpoznając żadnego wpływu na wynikową liczbę komórek lub czystość. Kolejne ograniczenie wpływa na magnetyczną izolację komórek neuronów, ponieważ nie ma specyficznych mikrokulek do izolacji neuronów pod względem selekcji pozytywnej. Założono, że czystą zawiesinę jednokomórkową można uzyskać poprzez znakowanie biotyną i zubożenie wszystkich komórek nieneuronalnych (tab. 2). Założenie to zostało zweryfikowane poprzez zastosowanie NeuN jako specyficznego markera jądrowego dla neuronów, zintegrowanego ze wspomnianym panelem czystości cytometrii przepływowej. Kolejne ograniczenie dotyczy izolacji mikrogleju u myszy EAE. W tym przypadku wynikowa wydajność komórek jest zmniejszona w porównaniu z innymi typami komórek ze względu na dodatkowy etap sortowania po protokole MACS. Co więcej, można argumentować, że sortowanie zwiększa naprężenia mechaniczne mikrogleju w porównaniu z innymi populacjami komórek. Indywidualne strategie sortowania mogą prowadzić do różnej wydajności komórek. Jeśli liczba izolowanych komórek jest mniejsza niż oczekiwana lub pożądana, zaleca się dostosowanie konfiguracji bramkowania i/lub poprawę dyskryminacji żywych/martwych.

Krytycznym krokiem w protokole jest usuwanie gruzu. Gradient musi być nakładany bardzo powoli i delikatnie, aby utworzyć trzy pożądane oddzielne fazy (rysunek 2A). Tylko wtedy, gdy mielina i inne pozostałości w dwóch górnych fazach zostaną całkowicie usunięte (ryc. 2E), można wytworzyć czyste zawiesiny jednokomórkowe i zmniejszyć dalsze zanieczyszczenie. Jeśli powstałe zawiesiny komórkowe nie mają czystości, jest to prawdopodobnie ta sekcja protokołu, która powinna zostać poprawiona w pierwszej kolejności, obok zapewnienia prawidłowego użycia wszystkich mikrokulek.

Uzyskanie wysokiego poziomu czystości i żywotności może być wyzwaniem w tego typu eksperymencie. Oto kilka zaleceń dotyczących rozwiązywania problemów:

-Praca w sterylnych warunkach jest obowiązkowa, aby zapobiec zanieczyszczeniu różnych mikrokulek i umożliwić wielokrotne użycie, zwłaszcza do późniejszej uprawy.
-Zdecydowanie zaleca się oznakowanie każdej tuby, aby zapobiec pomieszaniom.
-Unikać stosowania niechłodzonych odczynników/. Przechowuj wszystkie zawiesiny komórek na lodzie podczas całego eksperymentu, aby zapewnić wysoką żywotność.
-Utrzymuj czas między różnymi krokami pracy tak krótki, jak to możliwe. W protokole nie ma określonej części, w której zaleca się wstrzymanie eksperymentu.
-Bardzo istotne jest przestrzeganie określonych okresów inkubacji.

Podsumowując, ten obecny protokół jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN z jednej repliki OUN oferuje możliwość analizy złożonych sieci neuronalnych i szlaków neurozapalnych ex vivo z jednej zawiesiny komórek OUN. W ten sposób komórki rezydujące w OUN mogą być badane na różnych etapach przebiegu choroby, np. podczas zapalenia nerwów, neurodegeneracji i/lub remisji w EAE. Co więcej, interakcje komórka-komórka i szlaki biochemiczne mogą być badane na poziomie indywidualnym, a zmienność w grupach eksperymentalnych może zostać zmniejszona. Istnieje również możliwość hodowli frakcji wyizolowanych komórek OUN w monokulturach w celu dalszych testów funkcjonalnych i walidacji. Podsumowując, protokół ten oferuje znaczące postępy, które mogą mieć wpływ na podejścia do badań przedklinicznych i klinicznych.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Figurki zostały stworzone przy użyciu Adobe Illustrator (wersja 2023) i Servier Medical Art (https://smart.servier.com). Antonię Henes wspierała fundacja Jürgen Manchot Stiftung.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
70 μ m sitka komórkoweCorning, MA, USA352350Dysocjacja tkanek OUN
ACSA-2 Przeciwciało, anty-mysie, PE-Vio 615 (klon REA-969)Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-116-244Cytometria przepływowa, przechowywać w 4 & stopni; C
Zestaw do dysocjacji mózgu dla dorosłych, mysz i szczurMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-107-677Dysocjacja tkanek, zawiera zanieczyszczenia i roztwory do usuwania czerwonych krwinek; przygotować podwielokrotności enzymu A i P po przybyciu i przechowywać je w temperaturze -20 stopni; C; Przechowuj pozostały zestaw w temperaturze 4 & stopni; C
Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, myszMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-097-678MACS astrocytów, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Przeciwciało anty-mysie CD16/32 BioLegend, Londyn, Wielka Brytania101301Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Mikrokulki anty-O4, człowiek, mysz, szczurMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-094-543MACS oligodendrocytów, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
AstroMACS Bufor separacyjnyMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-091-221MACS astrocytów, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Przeciwciało biotyny, PE (klon Bio3-18E7)Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-113-853Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
BRAND Komora licząca NeubauerThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10195580Liczenie komórek 
Przeciwciało anty-mysie CD45 Brilliant Violet 510 (klon 30-F11)BioLegend, Londyn, Wielka Brytania103137Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
CD11b MicroBead, człowiek, myszMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-049-601MACS mikrogleju, przechowywać pod 4 stopniami; C
DNAse I, rekombinowany, wolny od rnazyMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy4716728001Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze -20° C
D-PBS z wapniem, magnezem, glukozą, pirogronatemThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA14287080Bufor do przechowywania, w temperaturze 4 stopni; C
D-PBS, bez wapnia, bez magnezuThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA14190250Bufor do przechowywania, w temperaturze 4 stopni; C
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA65-0865-14Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
eBioscience Foxp3/Zestaw do barwienia czynnikiem transkrypcyjnymThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA00-5523-00Cytometria przepływowa, przechowywać w 4° C
Falcon (15 ml)Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA11507411Rurka komórkowa
Falcon (50 mL)Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA10788561 Rurka komórkowa 
Sokół  Probówki z polistyrenu o okrągłym dnie z zatrzaskiem z sitkiem do komórek, 5 mlThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA08-771-23Cytometria przepływowa
Odczynnik blokujący FcR, mysz Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-092-575MACS oligodendrocytów, przechowywać w temperaturze 4 & deg; C
Samica myszy C57BL/6JCharles River Laboratories, Sulzfeld, NiemcyAktywna indukcja EAE 
Surowica cielęca płodu (FCS)Merck KGaA, Darmstadt, NiemcyF2442-50MLCytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze od -5 do -20 stopni; C
FITC Szczur Anty-CD 11b  (klon M1/70)BD Biosciences, San Jose, CA, USA553310Cytometria przepływowa, przechowywać w 4 & stopni; C
Freund' s Kompletny adiuwantMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyAR001Aktywna indukcja EAE, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
GentleMACS C TubesMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-093-237Dysocjacja tkanek CNS
GentleMACS Octo Disocjator z grzałkamiMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-096-427Dysocjacja tkanek OUN
Graphpad Prism 8.4.3Graphpad firmy DotmaticsAnaliza graficzna
IsofluraneAbbVie, Północne Chicago, IL, USAAktywna indukcja EAE, przechowywać w 4 & stopni; C
Oprogramowanie do analizy Kaluza V2.1.1Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USAAnaliza cytometrii przepływowej
LS KolumnyMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-042-401MACS
MACS BSA Roztwór podstawowyMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-091-376PB-buffer
MACS MultiStandMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-042-303MACS 
MOG35– 55 peptydCharité, Berlin, Niemcy; alternatywy: Genosphere Biotechnologies (Paryż, Francja) lub sb-Peptide (Saint Egrè ve, Francja)Aktywna indukcja EAE, przechowywać w temperaturze -20 ° C
Mycobacterium tuberculosis szczep H37 Ra Becton, Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USAAktywna indukcja EAE, sklep pod kątem 4 & stopni; C
Zestaw do izolacji neuronów, mysz Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-115-390MACS neuronów, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; Przeciwciało C
O4, anty-ludzkie/mysie/szczurze, APC, (klon REA-576)Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-119-897Cytometria przepływowa, przechowywać w 4 & stopni; C
Toksyna krztuścowa w gliceroluHooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USABT-0105Aktywna indukcja EAE; przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
pluriSitko Mini 100 μ m pluriSelect Life Science UG, Lipsk, Saksonia, Niemcy43-10100-40Separator cytometrii przepływowej
QuadroMACS Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-090-976
Rekombinowane przeciwciało anty-NeuN MACS Alexa Fluor 647 (klon EPR12763)Abcam, Cambridge, Wielka BrytaniaEPR12763Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze -20 ° C
Matryce mózgowe ze stali nierdzewnej, 1 mmTed Pella, Redding, CA, USA15067Sekcja tkanek CNS
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15250061Liczenie komórek 
UltraPure 0,5  M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15575020Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze pokojowej

Bibliografia

  1. Trapp, B. D., Nave, K. A. Multiple Sclerosis: An Immune or Neurodegenerative Disorder. Annu Rev Neurosci. 31 (1), 247-269 (2008).
  2. Stys, P. K., Zamponi, G. W., van Minnen, J., Geurts, J. J. Will the real multiple sclerosis please stand up. Nat Rev Neurosci. 13 (7), 507-514 (2012).
  3. Korn, T. Pathophysiology of multiple sclerosis. J Neurol. 255 (Suppl 6), 2-6 (2008).
  4. Ward, M., Goldman, M. D. Epidemiology and Pathophysiology of Multiple Sclerosis. CONTINUUM. 28 (4), 988-1005 (2022).
  5. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J Vis Exp. (86), 51275(2014).
  6. Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 238 (2), 149-155 (2012).
  7. Göbel, K., et al. Plasma kallikrein modulates immune cell trafficking during neuroinflammation via PAR2 and bradykinin release. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (1), 271-276 (2019).
  8. Ballerini, C. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Methods Mol Biol. 2285, 375-384 (2021).
  9. Birmpili, D., Charmarke Askar, I., Bigaut, K., Bagnard, D. The Translatability of Multiple Sclerosis Animal Models for Biomarkers Discovery and Their Clinical Use. Int J Mol Sci. 23 (19), 11532(2022).
  10. Tsatas, O., Ghasemlou, N. Isolation and RNA purification of macrophages/microglia from the adult mouse spinal cord. J Immunol Methods. 477, 112678(2020).
  11. Calvo, B., Rubio, F., Fernández, M., Tranque, P. Dissociation of neonatal and adult mice brain for simultaneous analysis of microglia, astrocytes and infiltrating lymphocytes by flow cytometry. IBRO Rep. 8, 36-47 (2020).
  12. Diaz-Amarilla, P., et al. Isolation and characterization of neurotoxic astrocytes derived from adult triple transgenic Alzheimer's disease mice. Neurochem Int. 159, 105403(2022).
  13. Galatro, T. F., Vainchtein, I. D., Brouwer, N., Boddeke, E. W. G. M., Eggen, B. J. L. Isolation of Microglia and Immune Infiltrates from Mouse and Primate Central Nervous System. Methods Mol Biol. 1559, 333-342 (2017).
  14. Altendorfer, B., et al. Transcriptomic Profiling Identifies CD8+ T Cells in the Brain of Aged and Alzheimer's Disease Transgenic Mice as Tissue-Resident Memory T Cells. J Immunol. 209 (7), 1272-1285 (2022).
  15. Lanfranco, M. F., Sepulveda, J., Kopetsky, G., Rebeck, G. W. Expression and secretion of apoE isoforms in astrocytes and microglia during inflammation. Glia. 69 (6), 1478-1493 (2021).
  16. Swire, M., Ffrench-Constant, C. Oligodendrocyte-Neuron Myelinating Coculture. Methods Mol Biol. 1936, 111-128 (2019).
  17. Park, J., Koito, H., Li, J., Han, A. Microfluidic compartmentalized co-culture platform for CNS axon myelination research. Biomed Microdevices. 11 (6), 1145-1153 (2009).
  18. Facci, L., Barbierato, M., Skaper, S. D. Astrocyte/Microglia Cocultures as a Model to Study Neuroinflammation. Methods Mol Biol. 1727, 127-137 (2018).
  19. Speicher, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G., Pawlowski, M. Generating microglia from human pluripotent stem cells: novel in vitro models for the study of neurodegeneration. Mol Neurodegener. 14 (1), 46(2019).
  20. Homayouni Moghadam, F., et al. Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells. J Vis Exp. (141), 58874(2018).
  21. Santos, R., et al. Differentiation of Inflammation-Responsive Astrocytes from Glial Progenitors Generated from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1757-1769 (2017).
  22. Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  23. Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
  24. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443(2022).
  25. Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J Vis Exp. (124), 55781(2017).
  26. Sarkar, S., et al. Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility. J Vis Exp. (122), 55364(2017).
  27. Rodríguez Murúa, S., Farez, M. F., Quintana, F. J. The Immune Response in Multiple Sclerosis. Annu Rev Pathol. 17, 121-139 (2021).
  28. Engelhardt, B., Ransohoff, R. M. Capture, crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends Immunol. 33 (12), 579-589 (2012).
  29. Elia, G. Biotinylation reagents for the study of cell surface proteins. Proteomics. 8 (19), 4012-4024 (2008).
  30. Berl, S., et al. Enrichment and isolation of neurons from adult mouse brain for ex vivo analysis. J Neurosci Methods. 283, 15-22 (2017).
  31. Turvy, D. N., Blum, J. S. Biotin Labeling and Quantitation of Cell-Surface Proteins. Curr Protoc Immunol. 18 (7), (2001).
  32. Mao, S. Y. Biotinylation of Antibodies. Methods Mol Biol. 115, 39-41 (1999).
  33. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  34. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
  35. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834(2020).
  36. Donovan, J. A., Koretzky, G. A. CD45 and the immune response. J Am Soc Nephrol. 4 (4), 976-985 (1993).
  37. Hathcock, K. S., Hirano, H., Hodes, R. J. CD45 expression by murine B cells and T cells: Alteration of CD45 isoforms in subpopulations of activated B cells. Immunol Res. 12 (1), 21-36 (1993).
  38. Balogh, P., Tew, J. G., Szakal, A. K. Simultaneous blockade of Fc? receptors and indirect labeling of mouse lymphocytes by the selective detection of allotype-restricted epitopes on the kappa chain of rat monoclonal antibodies. Cytometry. 47 (2), 107-110 (2002).
  39. Becerril-García, M. A., et al. Langerhans Cells From Mice at Birth Express Endocytic- and Pattern Recognition-Receptors, Migrate to Draining Lymph Nodes Ferrying Antigen and Activate Neonatal T Cells in vivo. Front Immunol. 11, 744(2020).
  40. Dent, M. A., Segura-Anaya, E., Alva-Medina, J., Aranda-Anzaldo, A. NeuN/Fox-3 is an intrinsic component of the neuronal nuclear matrix. FEBS Lett. 584 (13), 2767-2771 (2010).
  41. Duan, W., et al. Novel Insights into NeuN: from Neuronal Marker to Splicing Regulator. Mol Neurobiol. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  42. Monteiro, R., Sivasubramanian, M. K., Balasubramanian, P., Subramanian, M. Obesity-Induced Sympathoexcitation is Associated with Glial Senescence in the Brainstem. FASEB J. 34 (S1), 1-1 (2020).
  43. Li, S., Chang, L., Teissie, J. Electroporation protocols: mircroorganism, mammalian system, and nanodevice. , Humana Press, New York. (2020).
  44. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of Microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  45. Haage, V., et al. Comprehensive gene expression meta-analysis identifies signature genes that distinguish microglia from peripheral monocytes/macrophages in health and glioma. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 20(2019).
  46. Kosior, N., Petkau, T. L., Connolly, C., Lu, G., Leavitt, B. R. Isolating cells from adult murine brain for validation of cell-type specific cre-mediated deletion. J Neurosci Methods. 328, 108422(2019).
  47. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of General and Discriminating Markers of Differential Microglia Phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).
  48. Man, S., Ubogu, E. E., Ransohoff, R. M. Inflammatory Cell Migration into the Central Nervous System: A Few New Twists on an Old Tale. Brain Pathol. 17 (2), 243-250 (2007).
  49. Schroeter, C. B., et al. One Brain-All Cells: A Comprehensive Protocol to Isolate All Principal CNS-Resident Cell Types from Brain and Spinal Cord of Adult Healthy and EAE Mice. Cells. 10 (3), 651(2021).
  50. Sankowski, R., et al. Mapping microglia states in the human brain through the integration of high-dimensional techniques. Nate Neurosci. 22 (12), 2098-2110 (2019).
  51. Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096(2022).
  52. Enright, H. A., et al. Functional and transcriptional characterization of complex neuronal co-cultures. Sci Rep. 10 (1), 11007(2020).
  53. Mofazzal Jahromi, M. A., et al. Microfluidic Brain-on-a-Chip: Perspectives for Mimicking Neural System Disorders. Mol Neurobiol. 56 (12), 8489-8512 (2019).
  54. Chin, E., Goh, E. Blood-brain barrier on a chip. Methods Cell Biol. 146, 159-182 (2018).
  55. Miccoli, B., Braeken, D., Li, Y. E. Brain-on-a-chip Devices for Drug Screening and Disease Modeling Applications. Curr Pharm Des. 24 (45), 5419-5436 (2019).
  56. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  57. Pellegrini, L., et al. Human CNS barrier-forming organoids with cerebrospinal fluid production. Science. 369 (6500), eaaz5626(2020).
  58. Chhibber, T., et al. CNS organoids: an innovative tool for neurological disease modeling and drug neurotoxicity screening. Drug Discov Today. 25 (2), 456-465 (2020).
  59. Tang, X. Y., et al. Human organoids in basic research and clinical applications. Signal Transduct TargetTher. 7 (1), 168(2022).
  60. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227(2019).
  61. Doughty, D., et al. Development of a novel purification protocol to isolate and identify brain microglia. Exp Biol Med. 247 (16), 1433-1446 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie m zgu i rdzeniaizolacja kom rek OUNmagnetyczna separacja kom rekcytometria przep ywowaizolacja mikroglejuizolacja oligodendrocyt wizolacja astrocyt wizolacja neuron wdysocjacja m zgudysocjacja rdzenia kr gowego
Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.