Artykuł metodologiczny

Jednoczesna izolacja głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od dorosłych myszy z autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia

DOI:

10.3791/65735

⸱

6 października 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Medical Faculty, Heinrich Heine University Duesseldorf, 2Department of Neurology, Institute of Translational Neurology, University Hospital Muenster

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory, protokoły jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym od tej samej myszy są niezaspokojonym wymaganiem. Protokół przedstawia procedurę mającą zastosowanie u myszy z nieleczonym i eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia w celu zbadania złożonych sieci komórkowych podczas zapalenia nerwów i jednoczesnego zmniejszenia wymaganej liczby myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) jest najczęstszym mysim modelem stwardnienia rozsianego (SM) i jest często wykorzystywane do dalszego wyjaśnienia wciąż nieznanej etiologii SM w celu opracowania nowych strategii leczenia. Model EAE glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych 35-55 (MOG35-55) odtwarza samoograniczający się monofazowy przebieg choroby z rosnącym paraliżem w ciągu 10 dni po szczepieniu. Myszy są codziennie badane przy użyciu systemu punktacji klinicznej. Stwardnienie rozsiane jest napędzane przez różne patomechanizmy o określonym wzorcu czasowym, dlatego badanie roli typów komórek rezydujących w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) podczas progresji choroby jest bardzo interesujące. Unikalną cechą tego protokołu jest jednoczesna izolacja wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN (mikroglej, oligodendrocyty, astrocyty i neurony) mających zastosowanie u dorosłych EAE i zdrowych myszy. Po dysocjacji mózgu i rdzenia kręgowego od dorosłych myszy następuje sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS) w celu wyizolowania mikrogleju, oligodendrocytów, astrocytów i neuronów. Cytometria przepływowa została wykorzystana do przeprowadzenia analiz jakościowych oczyszczonych zawiesin jednokomórkowych, potwierdzających żywotność po izolacji komórek i wskazujących na czystość każdego typu komórek na poziomie około 90%. Podsumowując, protokół ten oferuje precyzyjny i kompleksowy sposób analizy złożonych sieci komórkowych u zdrowych myszy i myszy EAE. Co więcej, wymaganą liczbę myszy można znacznie zmniejszyć, ponieważ wszystkie cztery typy komórek są izolowane od tych samych myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stwardnienie rozsiane (SM) jest przewlekłą autoimmunologiczną chorobą zapalną ośrodkowego układu nerwowego (OUN) charakteryzującą się demielinizacją, uszkodzeniem aksonów, glejozą i neurodegeneracją. Pomimo licznych podejść badawczych w tej dziedzinie, patofizjologia stwardnienia rozsianego nadal nie jest w pełni poznana1,2,3,4. Najpowszechniejszym modelem zwierzęcym do badania stwardnienia rozsianego jest eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE) wywołane peptydem glikoproteiny oligodendrocytów mieliny 35-55 (MOG35-55), które ma wiele wspólnych cech klinicznych i patofizjologicznych5,6,7,8,9. Opiera się na odpowiedzi układu odpornościowego na antygeny specyficzne dla OUN, co prowadzi do stanu zapalnego, demielinizacji i zwyrodnienia neuroaksonów. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest odpowiednim modelem do badania szlaków neurozapalnych i kaskad sygnałowych występujących w stwardnieniu rozsianym.

Obecne opcje terapii stwardnienia rozsianego są tylko częściowo skuteczne i koncentrują się głównie na początkowej fazie zapalnej choroby. Jednak neurodegeneracyjny komponent SM wydaje się być głównym wyzwaniem dla długoterminowych podejść terapeutycznych. W związku z tym potrzebne są powtarzalne i precyzyjne protokoły izolacji komórek, aby kompleksowo zbadać mechanizmy molekularne i komórkowe w chorobach autoimmunologicznych. Nawet jeśli istnieją pewne protokoły izolacji jednego typu komórki10,11,12,13,14,15, istnieje niezaspokojona potrzeba jednoczesnej izolacji kilku populacji komórek rezydujących w OUN jednocześnie. Poprzednie protokoły izolacji komórek rezydujących w OUN nie zapewniały zachowania funkcjonalności i czystości komórek, co skutkowało współhodowlą z sąsiednimi komórkami16,17,18 lub nieprzydatność do złożonych analiz sieci wewnątrzkomórkowych ex vivo19,20,21,22.

Celem tego protokołu było ustanowienie powtarzalnej i wszechstronnej metody jednoczesnej izolacji czystych, żywotnych jednokomórkowych zawiesin wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN, stosowanych u dorosłych, zdrowych myszy i EAE. Różne typy komórek zostały wyizolowane za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS)23. Separacja komórek może być osiągnięta albo przez selekcję pozytywną, tj. Znakowanie magnetyczne markerów powierzchniowych specyficznych dla typu komórki, albo przez selekcję negatywną poprzez biotynylację i zubożenie wszystkich niepożądanych komórek. Zastosowano cytometrię przepływową w celu zapewnienia czystości powyżej 90% i żywotności co najmniej 80% izolowanych zawiesin jednokomórkowych.

Podsumowując, głównym celem było ustanowienie protokołu do jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN jako wszechstronnego narzędzia do badania szlaków neurozapalnych, oferującego kompleksową i precyzyjną analizę złożonych sieci komórkowych i biochemicznych kaskad sygnalizacyjnych u zdrowych myszy i myszy EAE.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty EAE zostały przeprowadzone na samicach myszy C57BL/6J w wieku 10-12 tygodni i zatwierdzone przez lokalne władze (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen). Zapewniono również zgodność z niemieckim i unijnym prawem o ochronie zwierząt na każdym etapie eksperymentów. Wszystkie myszy były trzymane w indywidualnie wentylowanych klatkach, w pomieszczeniach dla zwierząt.

UWAGA: Następujące objętości odczynników odnoszą się do jednego dorosłego mysiego mózgu i rdzenia kręgowego, które w dalszej części nazwane są zawiesiną komórek OUN i ważą około 20 mg do 500 mg. Jeśli planowana jest dysocjacja więcej niż jednej zawiesiny komórek OUN, wszystkie objętości odczynników i materiały muszą być odpowiednio przeskalowane. Zaleca się przechowywanie soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (D-PBS; 1x) z wapniem i magnezem, uzupełnionej 1 g/l glukozy i 36 mg/l pirogronianu sodu) w sposób ciągły na lodzie podczas całego eksperymentu. Jeśli hodowla komórek jest planowana później, wszystkie czynności należy wykonać w sterylnych warunkach przy użyciu kapturów. W przeciwnym razie żadna z poniższych sekcji protokołu nie musi być wykonywana pod maską. Przechowuj na lodzie. Używaj tylko wstępnie schłodzonych roztworów i unikaj wirowania przez cały eksperyment. Zobacz Rysunek 1, aby zapoznać się z ogólnym przepływem pracy.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Procedura jednoczesnej izolacji oligodendrocytów, mikrogleju, astrocytów i neuronów u myszy naiwnych i EAE. Pierwsze kroki przepływu pracy są takie same zarówno dla myszy naiwnych, jak i myszy EAE. Jeśli pożądana jest praca z repliką EAE, należy wcześniej przeprowadzić indukcję EAE (1). Krótko mówiąc, protokół rozpoczyna się od rozbioru (2) i dysocjacji (3) mysiego mózgu i rdzenia kręgowego, a następnie usunięcia szczątków (4) i czerwonych krwinek (5). Następnie powstałą oczyszczoną zawiesinę komórek OUN dzieli się na dwie frakcje w celu jednoczesnej izolacji oligodendrocytów i mikrogleju za pomocą MACS (6). Mikroglej wykrywa się za pomocą mikrokulek anty-CD11b, podczas gdy oligodendrocyty izoluje się za pomocą mikrokulek anty-O4 (selekcje pozytywne). Z ujemnego przepływu oligodendrocytów (8) astrocyty są izolowane za pomocą mikrokulek anty-ACSA-2 (selekcja pozytywna) i neurony przez znakowanie biotyną i zubożenie wszystkich komórek nieneuronalnych (selekcja negatywna). U myszy EAE po izolacji komórek CD11b + następuje aktywowane fluorescencją sortowanie komórek CD45wkomórkach o wysokiej zawartości CD11b w celu wyeliminowania innych komórek odpornościowych CD11b +, takich jak makrofagi, komórki dendrytyczne, monocyty, granulocyty i komórki NK o wiadomo, że uczestniczą w procesach zapalenia nerwów podczas kursu EAE (7)27, 28, 48. Po wyizolowaniu różnych typów komórek rezydujących w OUN można przeprowadzić analizy czystości (9). Skróty: Abs = przeciwciała; ACSA-2 = antygen powierzchniowy komórek astrocytów-2; CD11b = kinaza zależna od cykliny 11B; CD45 = receptorowa fosfataza białkowa tyrozynowa C; OUN = ośrodkowy układ nerwowy; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego; MACS = sortowanie komórek aktywowane magnetycznie; O4 = marker oligodendrocytów O4. Ten rysunek został zmodyfikowany z49. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Indukcja aktywnego EAE

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Do separacji komórek: Przygotować bufor PB i przechowywać go w temperaturze 2-8 °C przez maksymalnie 1 tydzień. Aby przygotować roztwór podstawowy, dodać 475 ml 1x PBS bez dodatków (pH 7,2) + 25 ml 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Użyć rozcieńczenia 1:20 przygotowanego w BSA.
    2. Do cytometrii przepływowej i sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS): Przygotować bufor FACS, PBS z 2% płodową surowicą cielęcą (FCS) i 2 mM EDTA i przechowywać w temperaturze 2-8 °C. Aby przygotować, dodaj 500 ml 1x PBS bez suplementów i 10 ml FCS + 2 ml EDTA (z 0,5 M EDTA)
    3. Wykonaj szczepienie zgodnie z protokołem Bittner et al. 5. Krótko mówiąc, indukuj EAE przez podskórne wstrzyknięcie emulsji zawierającej 200 μg peptydu MOG 35-55 i 200 μl kompletnego adiuwantu Freuda, w tym 200 μg Mycobacterium tuberculosis.
    4. Znieczulij mysz 2% izofluranem za pomocą komory anestezjologicznej z parownikiem izofluranowym. Użyj maści weterynaryjnej na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    5. Po 2 godzinach wstrzyknąć dootrzewnowo 100 ng toksyny krztuścowej (PTx) rozpuszczonej w 100 μL 1x PBS zgodnie z protokołem Huntemanna i wsp.24. Powtórzyć wstrzyknięcie PTx w 2 dniu po szczepieniu.
      UWAGA: Obserwuj każde zwierzę, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Myszy, które przeszły procedury wstrzyknięcia, nie są zwracane do towarzystwa innych myszy, dopóki w pełni nie wyzdrowieją. W przypadku Mycobacterium tuberculosis i PTx: Unikać wdychania, spożywania i kontaktu ze skórą i oczami. Mycobacterium tuberculosis jest aktywatorem wrodzonego układu odpornościowego. PTx ma wiele skutków biologicznych.
    6. Monitoruj postęp EAE codziennie, wykonywany przez dwóch zaślepionych badaczy, którzy monitorują wagę i badają myszy klinicznie.
    7. W tym celu należy zastosować następujący system punktacji: stopień 0 – brak objawów klinicznych EAE, stopień 1 – częściowy niedowład ogona, stopień 2 – całkowity niedowład ogona, stopień 3 – umiarkowane osłabienie kończyn tylnych, stopień 4 – całkowite osłabienie kończyn tylnych i atak ataksyjny, stopień 5 – łagodny niedowład kończyn, stopień 6 – niedowład kończyn, stopień 7 – paraplegia, stopień 8 – niedowład czterokończynowy, stopień 9 – porażenie czterokończynowe, i stopień 10 – śmierć.
    8. Zastosuj następujące kryteria wykluczenia do dalszego udziału w eksperymencie: wynik kliniczny > 7 lub utrata masy ciała przekraczająca 20% początkowej masy ciała.
    9. W celu przeprowadzenia sekcji mózgu i rdzenia kręgowego należy poddać eutanazji myszy EAE w 16 dniu po indukcji EAE reprezentującej maksimum choroby.

2. Przygotowanie tkanek OUN (Czas trwania: około 10 minut na mysz)

  1. Po poświęceniu myszy dwutlenkiem węgla, zacznij od perfuzji przezsercowej każdej myszy za pomocą 20 ml 1x PBS. Powtórzyć perfuzję ponownie z 20 ml 1x PBS.
  2. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i przymocuj kończyny za pomocą kaniuli. Nałóż 75% etanolu na przednią część ciała zwierzęcia. Dalsze środki sterylności nie są w tym momencie konieczne.
  3. Otwórz brzuch i klatkę piersiową, wykonując podłużny przekrój przez skórę i powięź za pomocą nożyczek.
  4. Przetnij żebra z boku i złóż klatkę piersiową, aby uzyskać swobodny dostęp do serca. Przymocuj klatkę piersiową złożoną do góry za pomocą kaniul.
  5. Otwórz prawe atrium za pomocą nożyczek. Nałóż 20 ml 1x PBS do lewej komory za pomocą kaniuli, aby wypłukać krew przez nacięty prawy przedsionek.
  6. Odsłoń czaszkę, przecinając skórę na czubku mysiej głowy za pomocą odcinka podłużnego i przesuń skórę wokół głowy za pomocą kleszczy. Naciąć czaszkę za pomocą nożyczek wzdłuż szwu strzałkowego.
  7. Włóż końcówkę kleszczy wzdłuż linii nacięcia, aby otworzyć kalotę. Usuń pozostałe części kalotki za pomocą kleszczy, aby mózg był w pełni odsłonięty.
  8. Ostrożnie usuń mózg i umieść go w mysiej macierzy mózgowej. Pokrój mózg na plastry strzałkowe o grubości 1 mm za pomocą żyletki.
  9. Przeciąć kręgosłup nożyczkami tuż nad grzebieniem biodrowym, aby strzykawkę można było wprowadzić do kanału kręgowego.
    UWAGA: Najłatwiejszym sposobem usunięcia rdzenia kręgowego jest wypłukanie go z kanału kręgowego za pomocą PBS. W przeciwnym razie łuki kręgowe należy otworzyć pojedynczo nożyczkami, a następnie można usunąć rdzeń kręgowy.
  10. Wypłukać rdzeń kręgowy z kanału kręgowego od ogona do czaszki za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml z igłą 20G zawierającą 1x PBS. Przetnij rdzeń kręgowy na segmenty o długości 0,5 cm za pomocą skalpela.
  11. Każdą zawiesinę komórek ośrodkowego układu nerwowego składającą się z mózgu i odpowiadającego mu rdzenia kręgowego należy przechowywać na jednej oddzielnej szalce Petriego na mysz, wypełnionej około 3 ml zimnego D-PBS. Przechowuj naczynia na lodzie do czasu dalszej obróbki.

3. Dysocjacja tkanek OUN (Czas trwania: około 1-1,5 godziny w zależności od liczby zawiesin komórek OUN)

UWAGA: Tkanka nerwowa dorosłych myszy jest dysocjowana przez połączenie dysocjacji mechanicznej z enzymatyczną degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej. W ten sposób integralność strukturalna pozostaje, a zawiesina komórek może być wykorzystana do dalszych procedur izolacji komórek.

  1. Przygotować odpowiednią objętość mieszaniny enzymów 1 składającej się z 50 μl enzymu P i 1 900 μl buforu Z na zawiesinę komórek OUN. Oba odczynniki należą do zestawu do dysocjacji mózgu dla dorosłych.
  2. Przygotować odpowiednią objętość mieszaniny enzymów 2 składającej się z 10 μl enzymu A i 20 μl buforu Y na zawiesinę komórek OUN. Oba odczynniki należą do zestawu do dysocjacji mózgu dla dorosłych.
  3. Przenieś 1,950 μl mieszanki enzymów 1 do probówki C, a następnie dodaj fragmenty tkanki z jednej zawiesiny komórek OUN. Użyj jednej rurki C na mysz.
  4. Dodać 30 μl mieszanki enzymów 2 do każdej probówki C. Zamknij szczelnie rurki C i przymocuj je do góry nogami na tulei dysocjatora ogniw z grzałkami.
  5. Uruchom odpowiedni program o nazwie 37C_ABDK_01 (zajmuje to 30 minut). Obserwuj co najmniej pierwsze 5 minut programu, aby upewnić się, że wszystkie rurki obracają się z tą samą prędkością. Wystąpienie błędów podczas przebiegu jest możliwe. Następnie przejdź do kroku 6.
  6. W ciągu ostatnich 2 minut programu umieść jedno sitko o wielkości 70 μm na probówce o pojemności 50 ml na każdą zdysocjowaną zawiesinę komórek OUN. Wstępnie zwilż te sitka 2 ml D-PBS.
  7. Po zakończeniu programu podłącz probówki C od dysocjatora i umieść je w wirówce. Odwirować próbki w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 1 minutę w celu zebrania próbki na dnie probówki.
  8. Zawiesić ponownie próbkę i nałożyć ją na wstępnie zwilżone sitko. Dodaj 10 ml zimnego D-PBS do pustej probówki C i zamknij ją. Delikatnie wstrząsnąć i nałożyć zawiesinę na odpowiednie sitko.
  9. Wyrzucić sitka i zamknąć probówki o pojemności 50 ml. Zawiesinę komórek należy ponownie odwirować w temperaturze 300 x g i w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Następnie należy bardzo ostrożnie odessać cały supernatant.

4. Usuwanie zanieczyszczeń (Czas trwania: około 1,5-2 godziny w zależności od liczby zawiesin komórek OUN)

UWAGA: Dysocjacja tkanek często prowadzi do powstawania mieliny i resztek komórek, które mogą utrudnić dalszą analizę. Dodając roztwór do usuwania zanieczyszczeń, zanieczyszczenia te można skutecznie usunąć z zawiesiny komórek OUN.

  1. Ostrożnie zawiesić osad komórkowy za pomocą 3 100 μl D-PBS na każdą zawiesinę komórek OUN. Nie wirować.
  2. W przypadku pracy z więcej niż jedną zawiesiną komórek OUN, należy zebrać maksymalnie dwie zawiesiny komórek OUN pochodzące z jednego stanu lub grupy eksperymentalnej w jednej probówce o pojemności 15 ml.
  3. Dodać 900 μl roztworu do usuwania zanieczyszczeń z zestawu do dysocjacji mózgu dorosłego do jednej zawiesiny komórek OUN lub 1 800 μl roztworu do usuwania zanieczyszczeń do dwóch połączonych zawiesin komórek OUN.
  4. Odwrócić rurkę i wymieszać zawiesinę. Następnie bardzo delikatnie pokryj go 4 ml zimnego D-PBS. Powinien być widoczny wyraźny gradient (Rysunek 2A).
  5. Wirować probówki przez 10 minut przy 3000 x g i 4 °C przy pełnym przyspieszeniu i bez hamowania.
  6. Jeśli separacja następuje zgodnie z przeznaczeniem, powstają trzy fazy (Rysunek 2C). Całkowicie odessaj dwie górne fazy (Rysunek 2C-1,2) i odrzuć je. Ważne jest, aby nie pozostały żadne pozostałości mieliny (Rysunek 2E).
    UWAGA: Jeśli gradient nie zadziałał, a ogniwa są pilnie potrzebne, nie odsysaj dwóch górnych faz. Zamiast tego napełnij probówkę o pojemności 15 ml zimnym D-PBS do 15 ml i kilkakrotnie odwróć. Ponownie odwirować przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy pełnym przyspieszeniu i bez hamowania. Odessać supernatant i powtórzyć kroki 4.1-4.4.
  7. Napełnij probówkę zimnym D-PBS do 14 ml i zamknij ją. Mocno odwróć rurkę na stole roboczym, aż granulka ogniw oderwie się od dna rury. Nie wirować.
  8. Ponownie odwirować próbkę w temperaturze 1000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Ustawić pełne przyspieszenie i pełne hamowanie. Odessać supernatant ostrożnie i całkowicie.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Co robić, a czego nie robić podczas usuwania gruzu. (A) Dodatni przykład gradientu po nałożeniu 4 ml PBS. Górna faza składająca się z 4 ml PBS jest wyraźnie odróżnialna od dolnej fazy składającej się z zawiesiny komórek OUN z roztworem do usuwania zanieczyszczeń. (B) Ujemny przykład gradientu po nałożeniu na 4 ml PBS. W gradiencie brakuje wyraźnej separacji między PBS a zawiesiną komórek poniżej. Pewna ilość PBS jest dyfundowana do zawiesiny komórkowej. (C) Pozytywny przykład gradientu po odwirowaniu. Można łatwo rozróżnić trzy oddzielne fazy. W górnej (1) lub dolnej fazie (3) gradientu nie są widoczne żadne reszty mieliny. Środkowa faza zawiera całą mielinę (2). Osad komórkowy jest widoczny na dnie probówki o pojemności 15 ml. (D) Ujemny przykład gradientu po odwirowaniu. Nie jest możliwe dokładne rozdzielenie tych trzech faz. Niektóre reszty mieliny są widoczne w górnej (1) i dolnej fazie (3) gradientu. (E) Dodatni przykład dla gradientu po zasysaniu dwóch górnych faz. Otrzymana próbka zawiera tylko osad komórkowy i klarowny supernatant znajdujący się powyżej. Nie pozostają żadne pozostałości mieliny. (F) Negatywny przykład dla gradientu po zasysaniu dwóch górnych faz. Próbka nadal zawiera pewne pozostałości mieliny (strzałka). Skróty: OUN = ośrodkowy układ nerwowy; PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Usuwanie czerwonych krwinek (Czas trwania: około 1 godziny w zależności od liczby zawiesin komórek OUN)

UWAGA: Ten krok zapobiega późniejszemu zakażeniu przez czerwone krwinki i zapewnia optymalną lizę erytrocytów przy minimalnym wpływie na inne typy komórek izolowane z tkanki OUN. Następujące objętości są wskazane dla zawiesin komórkowych pochodzących z tkanki neuronalnej o stężeniu od 100 mg do 1 g odpowiadającej dwóm dorosłym mózgom myszy i rdzeniowi kręgowemu. Jeśli pracujesz z więcej niż dwiema zawiesinami komórek OUN, odpowiednio skaluj w górę wszystkie odczynniki i całkowite objętości.

  1. Rozpocząć od przygotowania roztworu do usuwania krwinek czerwonych (RBCRS): na dwie zbiorcze zawiesiny komórek OUN. Rozcieńczyć 100 μl roztworu podstawowego do usuwania krwinek czerwonych (10x) z zestawu do dysocjacji mózgu dorosłego w 900 μl ddH2O, aby osiągnąć końcowe rozcieńczenie 1:10.
  2. Przechowuj RBCRS w temperaturze 2-8 °C do czasu użycia. Wyrzuć niewykorzystane resztki pod koniec dnia.
  3. Zawiesić osad komórkowy z maksymalnie dwóch zawiesin komórek OUN w 1 ml RBCRS. Unikaj wirowania. Inkubować roztwór przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Dodaj 10 ml zimnego buforu PB do dwóch zbiorczych zawiesin komórkowych. Odwirować próbkę w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut, a następnie całkowicie odessać supernatant.
  5. Zawiesić każdą osadkę komórkową z jednej zawiesiny komórek OUN w 80 μl buforu PB, pipetując powoli w górę iw dół. W związku z tym użyj 160 μl do ponownego zawieszenia osadów komórkowych pochodzących z dwóch zawiesin komórek OUN.
  6. Podczas pracy z kilkoma zawiesinami komórek OUN z tego samego warunku eksperymentalnego, połącz wszystkie te zawiesiny komórek.
  7. Określ liczbę komórek, np. za pomocą ulepszonej komory liczącej. Zawiesiny komórek zwykle rozcieńczano w stosunku 1:50 w buforze PB, a następnie rozcieńczano w stosunku 1:10 w 0,4% roztworze błękitu trypanowego.

6. Protokół z koralikami magnetycznymi u myszy naiwnych i EAE (Czas trwania: około 1 h)

  1. Oznacz magnetycznie różne typy komórek OUN za pomocą mikrokulek specyficznych dla ich antygenu powierzchniowego. Następnie umieść zawiesinę komórek w kolumnie i magnetycznie oddziel oznakowane komórki zatrzymane w kolumnie i nieoznakowane komórki, które przez nią przechodzą.
  2. Po usunięciu kolumny z pola magnetycznego należy wypłukać znakowane magnetycznie komórki z kolumny do probówki jako pozytywnie wybraną frakcję komórki.
    UWAGA: Objętości dla procesu etykietowania magnetycznego są obliczane dla maksymalnie 1 x 107 wszystkich komórek. Jeśli uzyskano więcej komórek, odpowiednio przeskaluj wszystkie odczynniki i całkowite objętości. Zaleca się szybką pracę i stosowanie wyłącznie wstępnie schłodzonych roztworów, aby zapobiec zamykaniu przeciwciał na powierzchni komórki i niespecyficznemu znakowaniu komórek, a także zapewnić wysoką żywotność izolowanych populacji komórek. Ważne jest również, aby wykonać etapy mycia, gdy tylko zbiornik kolumny zostanie opróżniony, dodając bufor PB, aby kolumny nie wyschły.
  3. Podzielić oczyszczoną, nierozcieńczoną zawiesinę komórek OUN na dwie frakcje w celu uzyskania następujących izolacji mikrogleju i oligodendrocytów. Stosunek obu frakcji zależy od pożądanej liczby komórek każdego typu komórek.
    UWAGA: Dalsze szczegóły (czas trwania inkubacji, szczegółowe etapy protokołu, objętości, odczynniki i metoda zliczania komórek) są wskazane w Tabeli 1.

Tabela 1: Przebieg pracy dla jednoczesnego znakowania magnetycznego i izolacji oligodendrocytów i mikrogleju od myszy naiwnych i EAE. Oba typy komórek są izolowane poprzez selekcję pozytywną. Kroki, które są wymienione w tym samym wierszu, są oznaczone jako wykonane jednocześnie. Skróty: CD11b = kinaza zależna od cykliny 11B; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego; FcR = białko podobne do receptora Fc; O4 = marker oligodendrocytów O4. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

7. Poprawka do protokołu: dodatkowe sortowanie w celu izolacji mikrogleju u myszy EAE (Czas trwania: około 1,5-2 h)

UWAGA: Podczas pracy z myszami EAE, konieczne jest uzupełnienie protokołu izolacji komórek opartego na MACS przez FACS w celu usunięcia populacji komórek CD11b+ innych niż mikroglej (np. monocytów, makrofagów, komórek NK lub komórek dendrytycznych) z frakcji komórek CD11b+. W przeciwnym razie ten krok można zignorować.

  1. Przygotować wzorcową mieszankę barwiącą zawierającą 1x PBS uzupełnioną przez CD11b FITC (klon M1/70, 1:50) i CD45 APC/Cy7 (klon 30-F11, 1:200). Użyć 100 μl głównej mieszanki barwiącej na 5 x 106 komórek. Sproszkować wszystkie przeciwciała przed użyciem.
  2. Odwirować zawiesinę komórek mikrogleju w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut i ostrożnie odessać supernatant.
  3. Zawiesić osad komórkowy ze 100 μl przygotowanej mieszanki wzorcowej barwienia na 5 x 106 komórek. Inkubować przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Zatrzymać reakcję przez dodanie 500 μl PBS i ponownie odwirować próbkę w temperaturze 300 x g i 4 °C przez 10 minut.
  5. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1x PBS uzupełnionym 10 μg/ml DNAzy, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 x10,7 komórek na ml. Przechowywać komórki w temperaturze 4 °C do momentu rozpoczęcia sortowania.
  6. Zawiesinę komórek należy nanieść na sitko o średnicy 100 μm umieszczone na nowej probówce FACS bezpośrednio przed rozpoczęciem sortowania.
  7. Ustaw natężenie przepływu na 1000 zdarzeń na sekundę i użyj dyszy 100 μm. Posortuj pożądaną populację komórek CD45wCD11b do nowej probówki o pojemności 15 ml przygotowanej z 1x PBS w RT.

8. Przygotowanie ujemnego przepływu oligodendrocytów do izolacji neuronów i astrocytów (Czas trwania: około 1 h)

UWAGA: Ujemny przepływ oligodendrocytów z kroku 6 jest zbierany w celu dalszej izolacji neuronów i astrocytów. W tym celu zawiesinę komórek dzieli się na dwie części. Ze względu na wcześniejszą izolację oligodendrocytów z zawiesiny komórek OUN, zanieczyszczenie komórkami O4 + jest zminimalizowane, niż można by zaobserwować w przeciwnym razie.

  1. Odwirować ujemny przepływ oligodendrocytów w temperaturze 300 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut i ostrożnie odessać supernatant.
  2. Zawiesić osad komórkowy w 80 μl buforu PB na zbiorczą zawiesinę komórek OUN poprzednio używaną do izolacji frakcji dodatniej oligodendrocytów.
  3. Policz komórki. Przeprowadzić liczenie komórek, co do których zakłada się, że są O4- przy użyciu ulepszonej komory zliczającej po rozcieńczeniu zawiesiny komórek w stosunku 1:50 w buforze PB, a następnie dalszym rozcieńczeniu w stosunku 1:10 w 0,4% błękitu trypanowego.
  4. Podziel oczyszczoną, nierozcieńczoną zawiesinę komórkową na dwie frakcje, aby następnie jednocześnie wyizolować neurony i astrocyty. Stosunek obu frakcji zależy od preferowanej ilości każdego typu komórki.
    UWAGA: Dalsze szczegóły (czas trwania inkubacji, szczegółowe kroki protokołu, objętości, odczynniki i metoda zliczania komórek) są wskazane w Tabeli 2.

Tabela 2: Przepływ pracy dla jednoczesnego znakowania magnetycznego i izolacji neuronów i astrocytów od myszy naiwnych i EAE. Oba typy komórek są izolowane z ujemnego przepływu oligodendrocytów. Astrocyty są rozdzielane jako selekcja pozytywna za pomocą mikrokulek anty-ACSA-2, podczas gdy neurony są oczyszczane przez biotynylację i zubożenie wszystkich komórek nieneuronalnych jako selekcja negatywna. Kroki, które są wymienione w tym samym wierszu, są wskazane do wykonania od razu. Skróty: Anty-ACSA-2 = antygen powierzchniowy komórek astrocytów-2; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego; FcR = białko podobne do receptora Fc; MACS = sortowanie komórek aktywowane magnetycznie. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

9. Analizy czystości izolowanych typów komórek rezydujących w OUN (Czas trwania: około 2 h)

UWAGA: Zaleca się wykonanie cytometrii przepływowej wszystkich czterech izolowanych populacji komórek rezydujących w OUN w celu zmierzenia i porównania ich czystości i żywotności. Dlatego konieczne jest wybarwienie wszystkich typów komórek przeciwciałem znakowanym fluoroforem. Barwienie żywych/martwych komórek odbywa się za pomocą utrwalanego barwnika żywotności (1:10 000).

  1. Panel czystości - protokół barwienia zewnątrzkomórkowego
    1. Użyj 1 x 105 komórek rozpuszczonych w 50 μl PBS na barwienie.
    2. Przygotować główną mieszankę barwienia rozpuszczoną w PBS z 2% FCS/2 mM EDTA, składającą się z następujących przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z fluorochromem skierowanych do markerów powierzchniowych specyficznych dla typu komórki: CD11b FITC (klon 1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotin-PE (klon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (klon REA-969, 1:200)33,34,35, O4 APC (klon REA-576, 1:400), oraz CD45 BV510 (klon 30-F11, 1:150)36,37. Dodaj 1 μg anty-CD16/32 na 1 x 106 komórek, aby zablokować receptor Fc38,39. Wiruj wszystkie przeciwciała przed użyciem.
    3. Odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut w temperaturze 540 x g i temperaturze 4 °C i ostrożnie odessać supernatant.
    4. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl odpowiedniej mieszanki wzorcowej i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    5. Przemyć komórki 500 μl 1x PBS z 2% FCS/2 mM EDTA i odwirować próbkę przez 5 minut w temperaturze 540 x g i 4 °C.
    6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 70 μl 1x PBS z 2% FCS/2 mM EDTA.
    7. Odwiruj próbkę, aby całkowicie zdysocjować osad komórkowy. Następnie próbka jest gotowa do analizy metodą cytometrii przepływowej.
  2. Panel czystości - protokół barwienia wewnątrzkomórkowego za pomocą NeuN
    1. Użyj 1 x 105 komórek z każdej populacji komórek do wewnątrzkomórkowego barwienia NeuN, który jest specyficznym dla neuronu markerem jądrowym 40,41. Jest to dodatkowy sposób na barwienie żywotnych neuronów.
    2. Przenieś 1 x 105 komórek z każdej populacji komórek do probówki FACS. Dodać 1 ml PBS z 2% FCS/2 mM EDTA na probówkę. Odwirować probówki w temperaturze 540 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.
    3. W międzyczasie należy przygotować mieszankę główną rozpuszczoną w PBS z 2% FCS/2 mM EDTA, składającą się z następujących przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z fluorochromem skierowanych do markerów powierzchniowych specyficznych dla typu komórki: CD11b FITC (klon M1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotin-PE (klon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (klon REA-969, 1:200)33,34,35 i CD45 BV510 (klon 30-F11, 1:150)36,37.
    4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl przygotowanej mieszanki wzorcowej i inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    5. Przemyć komórki 100 μl PBS z 2% FCS/2 mM EDTA i ponownie odwirować je w temperaturze 540 x g i 4 °C przez 5 minut.
    6. W międzyczasie należy przygotować 200 μl roztworu do utrwalania/przepuszczalności: dodać 50 μl skoncentrowanego koncentratu do utrwalania/przepuszczalności do 150 μl rozcieńczalnika do utrwalania/przepuszczalności, aby osiągnąć końcowe rozcieńczenie 1:4.
    7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl 1x roztworu utrwalającego/przepuszczalnego. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    8. W międzyczasie przygotować 1 ml 1x buforu do przemywania przez dodanie 100 μl buforu do permeabilizacji do 900 μl ddH2O, aby osiągnąć końcowe rozcieńczenie 1:10.
    9. Przepłukać komórki 1x 100 μL 1x buforu do przepuszczania/przemywania i odwirować próbkę w temperaturze 540 x g i 4 °C przez 5 minut.
    10. W międzyczasie przygotuj kolejną mieszankę wzorcową w 1x buforze do permeabilizacji/płukania składającym się tylko z NeuN (NeuN AF647, klon EPR12763, 1:200) i 1 μg anty-CD16/32 na 106 komórek w celu zablokowania receptora Fc.
    11. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić utrwalone i przepuszczalne komórki w 50 μl drugiej mieszanki wzorcowej i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    12. Przemyć próbkę 100 μl 1x buforu do przepuszczania/przemywania i odwirować w temperaturze 540 x g i 4 °C przez 5 minut.
    13. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 70 μl PBS z 2% FCS/2 mM EDTA. Następnie próbka jest gotowa do analizy metodą cytometrii przepływowej.
    14. Po skonfigurowaniu panelu na cytometrze przepływowym należy pobrać komórki do analizy czystości za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.

10. Analiza statystyczna

  1. Wykonuj analizy statystyczne i projektuj wykresy za pomocą programu do analizy graficznej. Dane prezentowane są jako średnia ± SEM.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół oferuje możliwość jednoczesnego izolowania wszystkich głównych komórek rezydujących w OUN, tj. mikrogleju, oligodendrocytów, astrocytów i neuronów z jednej repliki OUN. Jest to ważne dla zmniejszenia liczby myszy potrzebnych do tego rodzaju eksperymentów oraz dla zapewnienia porównywalności analiz molekularnych i biochemicznych na poziomie komórkowym. Jeśli poszczególne typy komórek są izolowane z różnych kontrprób OUN, interakcje komórkowe nie mogą być wiernie odwzorowane, a potencjalne odchylenia techniczne podczas procesów izolacji mogą wpływać na dalsze analizy. Ponadto wyniki molekularne i biochemiczne dotyczące każdego typu komórek nie byłyby ze sobą porównywalne, ponieważ nie pochodzą z tego samego kontekstu EAE. Istniejący wcześniej protokół MACS wykorzystujący komercyjny system/zestaw został dostosowany, aby umożliwić jednoczesną izolację wyżej wymienionych typów komórek.

Izolacja mikrogleju została przeprowadzona za pomocą mikrokulek anty-CD11b, oligodendrocyty zostały wyizolowane za pomocą mikrokulek anty-O4 (Tabela 1), a mikrokulki anty-ACSA-2 zostały użyte do izolacji astrocytów (Tabela 2). W przeciwieństwie do tego, izolacja neuronów reprezentuje selekcję negatywną i została osiągnięta przez biotynylację i znakowanie magnetyczne wszystkich komórek nieneuronalnych (Tabela 2). Wszystkie komórki nieneuronalne (np. oligodendrocyty, mikroglej, astrocyty, komórki śródbłonka i fibroblasty) z wyjątkiem komórek krwi mogą być znakowane magnetycznie za pomocą przeciwciała sprzężonego z biotyną, specyficznie skierowanego przeciwko antygenowi powierzchniowemu ulegającemu ekspresji na tych komórkach nieneuronalnych (Tabela 2). Poprzez wyczerpanie tych magnetycznie znakowanych komórek nieneuronalnych można wygenerować wysoce czyste i żywotne populacje komórek neuronalnych30,42,43.

Zaprojektowano dwa nowe panele cytometrii przepływowej do analizy czystości generowanych zawiesin jednokomórkowych. W tym przypadku wykorzystano specyficzne dla typu komórki markery powierzchniowe i jądrowe w połączeniu z dyskryminacją żywych i martwych komórek.

Wynikowe wyniki komórek na mysz i typ komórki (Rysunek 3A) zostały przeanalizowane i uzyskały średnią 8. 4 x 105 ± 3 x 104 mikroglej, 3,23 x 106 ± 1 x 105 oligodendrocytów, 8,6 x 105 ± 2 x 104 astrocytów i 4,5 x 105 ± 1 x 104 neuronów na naiwną mysz.

W kontekście celu zbadania modeli chorób zapalenia nerwów, protokół został również zastosowany do mysiego modelu EAE. Myszy zostały poddane eutanazji w 16 dniu po indukcji EAE, co stanowiło maksimum choroby. W tym ustawieniu EAE wyizolowano około 2,9 x 106 ± 6,7 x 105 oligodendrocytów, 5,2 x 105 ± 9 x 104 astrocyty i 4,4 x 105 ± 4 x 104 neurony. Wydajność komórek mikrogleju została zmniejszona do około 1,7 x 105 ± 4 x 104 mikrogleju na mysz EAE z powodu dodatkowego sortowania komórek po krokach MACS (Figura 3A).

Po izolacji, fenotypowe charakterystyki różnych populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej dowiodły, że możliwe jest uzyskanie żywotnych zawiesin jednokomórkowych o czystości około 90% dla wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN (Rysunek 3B). Mikroglej został ogrodzony jako CD45intCD11bhigh, zgodnie z definicją w literaturze44,45,46,47.

W EAE, mikroglej musiał zostać posortowany ze wszystkich komórek CD11b+, aby odróżnić je od innych komórek odpornościowych CD11b+, takich jak monocyty, neutrofile, komórki NK, granulocyty i makrofagi, które migrują do OUN podczas zapalenia nerwów27,28,48. W związku z tym mikroglej posortowano jako CD45wkomórkach o wysokiej zawartości CD11 z zawiesiny komórek CD11b +. Cała strategia sortowania mikrogleju jest przedstawiona na Rysunek 4. U myszy wcześniej nieleczonych populacja mikrogleju stanowiła 91,16% wszystkich żywych pojedynczych komórek (96% całej populacji CD11b+) (Figura 4A). U myszy EAE populacja mikrogleju stanowiła 46,85% wszystkich żywych pojedynczych komórek (55% całej populacji CD11b+) (Figura 4B). Chociaż zarówno procedury MACS, jak i FACS stosują naprężenia mechaniczne do pojedynczych komórek, 75,41% ± 8,63% posortowanych oczyszczonych mikrogleju było żywotnych (Rysunek 3B).

Astrocyty i neurony, które zostały bezpośrednio wyizolowane z początkowej zawiesiny komórek OUN, wykazały istotne zanieczyszczenie oligodendrocytami, co doprowadziło do założenia, że jednoczesna izolacja neuronów i astrocytów od negatywnego przepływu oligodendrocytów może zapobiec temu zakażeniu. Analizy cytometrii przepływowej potwierdziły, że astrocyty wyizolowane z ujemnego przepływu oligodendrocytów miały czystość 89,23% ± 2,78% i wykazywały żywotność 80,56% ± 1,41%. Podobnie jak w tych wynikach, czystość neuronów wyizolowanych z frakcji komórek O4 wynosiła 81,25% ± 3,31%, a żywotność wynosiła 83,90% ± 2,61% (Rysunek 3B). Wyniki te potwierdzają również, że jednoczesna izolacja tych dwóch typów komórek dopiero po izolacji oligodendrocytów nie ma wpływu na liczbę żywotnych komórek funkcjonalnych.

Wyniki dotyczące żywotności i czystości izolowanych zawiesin jednokomórkowych były bardzo podobne u myszy EAE w porównaniu do tych otrzymanych u myszy naiwnych, co potwierdza, że ten protokół jest odpowiedni dla zdrowych myszy, jak również w kontekście EAE (Rysunek 3B).

figure-results-1
Rysunek 3: Wydajność komórek i walidacja na podstawie cytometrii przepływowej izolowanych komórek rezydujących w OUN. (A) Wydajność komórek na mysz i typ komórki po wyizolowaniu komórek rezydujących w OUN u myszy naiwnych i EAE. Wykresy słupkowe wizualizują ilość plonów komórek na mysz i typ komórki po wdrożeniu przedstawionego protokołu. Pięć powtórzeń biologicznych przetworzono w celu uzyskania wyników u myszy naiwnych, a cztery powtórzenia biologiczne przeanalizowano u myszy EAE. Przedstawione są odpowiednie środki ± SEM. (B) Odpowiednie analizy czystości i żywotności oczyszczonych frakcji komórkowych. Wykresy słupkowe wskazują żywotność i czystość powstałych zawiesin jednokomórkowych w oparciu o ich ekspresję markerów specyficznych dla typu komórki. NeuN został wykorzystany jako specyficzny dla typu komórki marker jądrowy dla neuronów. Pozyskano pięć powtórzeń biologicznych i porównano je dla każdego typu komórek zarówno u myszy zdrowych, jak i myszy z EAE. Wskazane są odpowiednie środki ± SEM. Skróty: Anty-ACSA-2 = antygen powierzchniowy komórek astrocytów-2; CD11b = kinaza zależna od cykliny 11B; CD45 = receptorowa fosfataza białkowa tyrozynowa C; OUN = ośrodkowy układ nerwowy; EAE = eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego; MACS = sortowanie komórek aktywowane magnetycznie; NeuN = białko wiążące RNA fox-1 homolog 3; O4 = marker oligodendrocytów O4; SEM = błąd standardowy średniej. Ten rysunek został zmodyfikowany z49. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 4: Strategia bramkowania dla sortowania komórek mikrogleju po izolacji komórek CD11b+. (A) Strategia bramkowania u myszy naiwnych i (B) EAE. Górny wiersz każdego panelu pokazuje wykresy kropkowe przed sortowaniem, a dolny wiersz po sortowaniu. Po selekcji żywych (SSC-A / FSC-A) i pojedynczych komórek (FCS-H / FSC-W) populację komórek CD45intCD11b+ posortowano jako populację mikrogleju. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory metody mapowania komórek rezydujących w OUN ex vivo poprzez połączenie spektrometrii mas i sekwencjonowania RNA oferują bardzo precyzyjne profilowanie komórkowe w zdrowiu i chorobie, ale wymagają ambitnej wiedzy technicznej i doświadczenia w tej dziedzinie50,51. Ponadto nie pozwalają na analizy funkcjonalne i są bardzo drogie. Poza tym mikroprzepływowe systemy typu brain-on-a-chip zapewniają szybkie i niedrogie badania przesiewowe pod kątem mechanizmów chorobowych oraz testowanie nowych podejść terapeutycznych z ograniczeniem wzrostu i migracji komórek 52,53,54,55. Organoidy OUN mogą również stanowić równoważną alternatywę w przyszłości do badania modelowania komórkowego, połączeń międzykomórkowych i interakcji podczas przebiegu choroby 56,57,58,59. Jednak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i magnetycznie jest obecnie najskuteczniejszą metodą generowania czystych i żywotnych zawiesin jednokomórkowych ex vivo 35,60,61. Nawet jeśli inne ustalone protokoły produkcyjne dotyczące izolacji typów komórek rezydujących w OUN są podobne w odniesieniu do poszczególnych etapów izolacji magnetycznej i wcześniejszej dysocjacji komórek, przewiduje się je przeprowadzić dla każdego typu komórek osobno. W przeciwieństwie do tego, obecny protokół integruje różne metody izolacji dla każdego typu komórek rezydujących w OUN w logicznym kontekście, tak aby można je było wykonywać jednocześnie i z jednej zawiesiny komórek OUN (Tabela 1, Tabela 2). W ten sposób umożliwia analizy multiomiczne z pojedynczej zawiesiny komórek OUN, a ostatecznie eksplorację złożonych sieci neuronowych. Nawet jeśli nie jest konieczne zebranie kilku tkanek od wielu zwierząt w celu wykonania tego protokołu, to połączenie zapewnia odpowiednią liczbę izolowanych komórek do dalszej analizy. Wykorzystanie różnych myszy do izolacji pojedynczych typów komórek wykluczyłoby możliwość analizy potencjalnych interakcji komórkowych. Poza tym połączenie indywidualnych metod izolacji dla różnych typów komórek OUN, z których wszystkie są zgodne z wcześniejszą dysocjacją OUN, pozwala zaoszczędzić koszty materiałowe dzięki zastosowaniu jednej zdysocjowanej zawiesiny komórek OUN dla wszystkich kolejnych etapów izolacji magnetycznej. Dodatkowo zminimalizowane jest potencjalne odchylenie techniczne spowodowane użyciem różnych myszy.

Jednym z ograniczeń protokołu może być prawie wyłączne użycie samic myszy C57BL/6J. Protokół szczepień EAE został zaprojektowany i ustalony dla samic myszy, więc ten protokół izolacji komórek został wdrożony również u samic myszy C57BL / 6J. Niemniej jednak naiwne samce myszy zostały również wykorzystane podczas opracowywania tego protokołu, nie rozpoznając żadnego wpływu na wynikową liczbę komórek lub czystość. Kolejne ograniczenie wpływa na magnetyczną izolację komórek neuronów, ponieważ nie ma specyficznych mikrokulek do izolacji neuronów pod względem selekcji pozytywnej. Założono, że czystą zawiesinę jednokomórkową można uzyskać poprzez znakowanie biotyną i zubożenie wszystkich komórek nieneuronalnych (tab. 2). Założenie to zostało zweryfikowane poprzez zastosowanie NeuN jako specyficznego markera jądrowego dla neuronów, zintegrowanego ze wspomnianym panelem czystości cytometrii przepływowej. Kolejne ograniczenie dotyczy izolacji mikrogleju u myszy EAE. W tym przypadku wynikowa wydajność komórek jest zmniejszona w porównaniu z innymi typami komórek ze względu na dodatkowy etap sortowania po protokole MACS. Co więcej, można argumentować, że sortowanie zwiększa naprężenia mechaniczne mikrogleju w porównaniu z innymi populacjami komórek. Indywidualne strategie sortowania mogą prowadzić do różnej wydajności komórek. Jeśli liczba izolowanych komórek jest mniejsza niż oczekiwana lub pożądana, zaleca się dostosowanie konfiguracji bramkowania i/lub poprawę dyskryminacji żywych/martwych.

Krytycznym krokiem w protokole jest usuwanie gruzu. Gradient musi być nakładany bardzo powoli i delikatnie, aby utworzyć trzy pożądane oddzielne fazy (rysunek 2A). Tylko wtedy, gdy mielina i inne pozostałości w dwóch górnych fazach zostaną całkowicie usunięte (ryc. 2E), można wytworzyć czyste zawiesiny jednokomórkowe i zmniejszyć dalsze zanieczyszczenie. Jeśli powstałe zawiesiny komórkowe nie mają czystości, jest to prawdopodobnie ta sekcja protokołu, która powinna zostać poprawiona w pierwszej kolejności, obok zapewnienia prawidłowego użycia wszystkich mikrokulek.

Uzyskanie wysokiego poziomu czystości i żywotności może być wyzwaniem w tego typu eksperymencie. Oto kilka zaleceń dotyczących rozwiązywania problemów:

-Praca w sterylnych warunkach jest obowiązkowa, aby zapobiec zanieczyszczeniu różnych mikrokulek i umożliwić wielokrotne użycie, zwłaszcza do późniejszej uprawy.
-Zdecydowanie zaleca się oznakowanie każdej tuby, aby zapobiec pomieszaniom.
-Unikać stosowania niechłodzonych odczynników/. Przechowuj wszystkie zawiesiny komórek na lodzie podczas całego eksperymentu, aby zapewnić wysoką żywotność.
-Utrzymuj czas między różnymi krokami pracy tak krótki, jak to możliwe. W protokole nie ma określonej części, w której zaleca się wstrzymanie eksperymentu.
-Bardzo istotne jest przestrzeganie określonych okresów inkubacji.

Podsumowując, ten obecny protokół jednoczesnej izolacji wszystkich głównych typów komórek rezydujących w OUN z jednej repliki OUN oferuje możliwość analizy złożonych sieci neuronalnych i szlaków neurozapalnych ex vivo z jednej zawiesiny komórek OUN. W ten sposób komórki rezydujące w OUN mogą być badane na różnych etapach przebiegu choroby, np. podczas zapalenia nerwów, neurodegeneracji i/lub remisji w EAE. Co więcej, interakcje komórka-komórka i szlaki biochemiczne mogą być badane na poziomie indywidualnym, a zmienność w grupach eksperymentalnych może zostać zmniejszona. Istnieje również możliwość hodowli frakcji wyizolowanych komórek OUN w monokulturach w celu dalszych testów funkcjonalnych i walidacji. Podsumowując, protokół ten oferuje znaczące postępy, które mogą mieć wpływ na podejścia do badań przedklinicznych i klinicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figurki zostały stworzone przy użyciu Adobe Illustrator (wersja 2023) i Servier Medical Art (https://smart.servier.com). Antonię Henes wspierała fundacja Jürgen Manchot Stiftung.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
70 μ m sitka komórkoweCorning, MA, USA352350Dysocjacja tkanek OUN
ACSA-2 Przeciwciało, anty-mysie, PE-Vio 615 (klon REA-969)Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-116-244Cytometria przepływowa, przechowywać w 4 & stopni; C
Zestaw do dysocjacji mózgu dla dorosłych, mysz i szczurMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-107-677Dysocjacja tkanek, zawiera zanieczyszczenia i roztwory do usuwania czerwonych krwinek; przygotować podwielokrotności enzymu A i P po przybyciu i przechowywać je w temperaturze -20 stopni; C; Przechowuj pozostały zestaw w temperaturze 4 & stopni; C
Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, myszMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-097-678MACS astrocytów, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Przeciwciało anty-mysie CD16/32 BioLegend, Londyn, Wielka Brytania101301Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Mikrokulki anty-O4, człowiek, mysz, szczurMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-094-543MACS oligodendrocytów, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
AstroMACS Bufor separacyjnyMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-091-221MACS astrocytów, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
Przeciwciało biotyny, PE (klon Bio3-18E7)Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-113-853Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
BRAND Komora licząca NeubauerThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA10195580Liczenie komórek 
Przeciwciało anty-mysie CD45 Brilliant Violet 510 (klon 30-F11)BioLegend, Londyn, Wielka Brytania103137Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
CD11b MicroBead, człowiek, myszMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-049-601MACS mikrogleju, przechowywać pod 4 stopniami; C
DNAse I, rekombinowany, wolny od rnazyMerck KGaA, Darmstadt, Niemcy4716728001Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze -20° C
D-PBS z wapniem, magnezem, glukozą, pirogronatemThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA14287080Bufor do przechowywania, w temperaturze 4 stopni; C
D-PBS, bez wapnia, bez magnezuThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA14190250Bufor do przechowywania, w temperaturze 4 stopni; C
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA65-0865-14Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C
eBioscience Foxp3/Zestaw do barwienia czynnikiem transkrypcyjnymThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA00-5523-00Cytometria przepływowa, przechowywać w 4° C
Falcon (15 ml)Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA11507411Rurka komórkowa
Falcon (50 mL)Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA10788561 Rurka komórkowa 
Sokół  Probówki z polistyrenu o okrągłym dnie z zatrzaskiem z sitkiem do komórek, 5 mlThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA08-771-23Cytometria przepływowa
Odczynnik blokujący FcR, mysz Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-092-575MACS oligodendrocytów, przechowywać w temperaturze 4 & deg; C
Samica myszy C57BL/6JCharles River Laboratories, Sulzfeld, NiemcyAktywna indukcja EAE 
Surowica cielęca płodu (FCS)Merck KGaA, Darmstadt, NiemcyF2442-50MLCytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze od -5 do -20 stopni; C
FITC Szczur Anty-CD 11b  (klon M1/70)BD Biosciences, San Jose, CA, USA553310Cytometria przepływowa, przechowywać w 4 & stopni; C
Freund' s Kompletny adiuwantMerck KGaA, Darmstadt, NiemcyAR001Aktywna indukcja EAE, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
GentleMACS C TubesMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-093-237Dysocjacja tkanek CNS
GentleMACS Octo Disocjator z grzałkamiMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-096-427Dysocjacja tkanek OUN
Graphpad Prism 8.4.3Graphpad firmy DotmaticsAnaliza graficzna
IsofluraneAbbVie, Północne Chicago, IL, USAAktywna indukcja EAE, przechowywać w 4 & stopni; C
Oprogramowanie do analizy Kaluza V2.1.1Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USAAnaliza cytometrii przepływowej
LS KolumnyMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-042-401MACS
MACS BSA Roztwór podstawowyMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-091-376PB-buffer
MACS MultiStandMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-042-303MACS 
MOG35– 55 peptydCharité, Berlin, Niemcy; alternatywy: Genosphere Biotechnologies (Paryż, Francja) lub sb-Peptide (Saint Egrè ve, Francja)Aktywna indukcja EAE, przechowywać w temperaturze -20 ° C
Mycobacterium tuberculosis szczep H37 Ra Becton, Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, USAAktywna indukcja EAE, sklep pod kątem 4 & stopni; C
Zestaw do izolacji neuronów, mysz Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-115-390MACS neuronów, przechowywać w temperaturze 4 & stopni; Przeciwciało C
O4, anty-ludzkie/mysie/szczurze, APC, (klon REA-576)Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-119-897Cytometria przepływowa, przechowywać w 4 & stopni; C
Toksyna krztuścowa w gliceroluHooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USABT-0105Aktywna indukcja EAE; przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
pluriSitko Mini 100 μ m pluriSelect Life Science UG, Lipsk, Saksonia, Niemcy43-10100-40Separator cytometrii przepływowej
QuadroMACS Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Niemcy130-090-976
Rekombinowane przeciwciało anty-NeuN MACS Alexa Fluor 647 (klon EPR12763)Abcam, Cambridge, Wielka BrytaniaEPR12763Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze -20 ° C
Matryce mózgowe ze stali nierdzewnej, 1 mmTed Pella, Redding, CA, USA15067Sekcja tkanek CNS
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15250061Liczenie komórek 
UltraPure 0,5  M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15575020Cytometria przepływowa, przechowywać w temperaturze pokojowej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trapp, B. D., Nave, K. A. Multiple Sclerosis: An Immune or Neurodegenerative Disorder. Annu Rev Neurosci. 31 (1), 247-269 (2008).
  2. Stys, P. K., Zamponi, G. W., van Minnen, J., Geurts, J. J. Will the real multiple sclerosis please stand up. Nat Rev Neurosci. 13 (7), 507-514 (2012).
  3. Korn, T. Pathophysiology of multiple sclerosis. J Neurol. 255 (Suppl 6), 2-6 (2008).
  4. Ward, M., Goldman, M. D. Epidemiology and Pathophysiology of Multiple Sclerosis. CONTINUUM. 28 (4), 988-1005 (2022).
  5. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG35-55) Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 Mice. J Vis Exp. (86), 51275(2014).
  6. Bittner, S., et al. The TASK1 channel inhibitor A293 shows efficacy in a mouse model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 238 (2), 149-155 (2012).
  7. Göbel, K., et al. Plasma kallikrein modulates immune cell trafficking during neuroinflammation via PAR2 and bradykinin release. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (1), 271-276 (2019).
  8. Ballerini, C. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Methods Mol Biol. 2285, 375-384 (2021).
  9. Birmpili, D., Charmarke Askar, I., Bigaut, K., Bagnard, D. The Translatability of Multiple Sclerosis Animal Models for Biomarkers Discovery and Their Clinical Use. Int J Mol Sci. 23 (19), 11532(2022).
  10. Tsatas, O., Ghasemlou, N. Isolation and RNA purification of macrophages/microglia from the adult mouse spinal cord. J Immunol Methods. 477, 112678(2020).
  11. Calvo, B., Rubio, F., Fernández, M., Tranque, P. Dissociation of neonatal and adult mice brain for simultaneous analysis of microglia, astrocytes and infiltrating lymphocytes by flow cytometry. IBRO Rep. 8, 36-47 (2020).
  12. Diaz-Amarilla, P., et al. Isolation and characterization of neurotoxic astrocytes derived from adult triple transgenic Alzheimer's disease mice. Neurochem Int. 159, 105403(2022).
  13. Galatro, T. F., Vainchtein, I. D., Brouwer, N., Boddeke, E. W. G. M., Eggen, B. J. L. Isolation of Microglia and Immune Infiltrates from Mouse and Primate Central Nervous System. Methods Mol Biol. 1559, 333-342 (2017).
  14. Altendorfer, B., et al. Transcriptomic Profiling Identifies CD8+ T Cells in the Brain of Aged and Alzheimer's Disease Transgenic Mice as Tissue-Resident Memory T Cells. J Immunol. 209 (7), 1272-1285 (2022).
  15. Lanfranco, M. F., Sepulveda, J., Kopetsky, G., Rebeck, G. W. Expression and secretion of apoE isoforms in astrocytes and microglia during inflammation. Glia. 69 (6), 1478-1493 (2021).
  16. Swire, M., Ffrench-Constant, C. Oligodendrocyte-Neuron Myelinating Coculture. Methods Mol Biol. 1936, 111-128 (2019).
  17. Park, J., Koito, H., Li, J., Han, A. Microfluidic compartmentalized co-culture platform for CNS axon myelination research. Biomed Microdevices. 11 (6), 1145-1153 (2009).
  18. Facci, L., Barbierato, M., Skaper, S. D. Astrocyte/Microglia Cocultures as a Model to Study Neuroinflammation. Methods Mol Biol. 1727, 127-137 (2018).
  19. Speicher, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G., Pawlowski, M. Generating microglia from human pluripotent stem cells: novel in vitro models for the study of neurodegeneration. Mol Neurodegener. 14 (1), 46(2019).
  20. Homayouni Moghadam, F., et al. Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells. J Vis Exp. (141), 58874(2018).
  21. Santos, R., et al. Differentiation of Inflammation-Responsive Astrocytes from Glial Progenitors Generated from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1757-1769 (2017).
  22. Tcw, J., et al. An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  23. Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
  24. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443(2022).
  25. Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J Vis Exp. (124), 55781(2017).
  26. Sarkar, S., et al. Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility. J Vis Exp. (122), 55364(2017).
  27. Rodríguez Murúa, S., Farez, M. F., Quintana, F. J. The Immune Response in Multiple Sclerosis. Annu Rev Pathol. 17, 121-139 (2021).
  28. Engelhardt, B., Ransohoff, R. M. Capture, crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers. Trends Immunol. 33 (12), 579-589 (2012).
  29. Elia, G. Biotinylation reagents for the study of cell surface proteins. Proteomics. 8 (19), 4012-4024 (2008).
  30. Berl, S., et al. Enrichment and isolation of neurons from adult mouse brain for ex vivo analysis. J Neurosci Methods. 283, 15-22 (2017).
  31. Turvy, D. N., Blum, J. S. Biotin Labeling and Quantitation of Cell-Surface Proteins. Curr Protoc Immunol. 18 (7), (2001).
  32. Mao, S. Y. Biotinylation of Antibodies. Methods Mol Biol. 115, 39-41 (1999).
  33. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  34. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
  35. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834(2020).
  36. Donovan, J. A., Koretzky, G. A. CD45 and the immune response. J Am Soc Nephrol. 4 (4), 976-985 (1993).
  37. Hathcock, K. S., Hirano, H., Hodes, R. J. CD45 expression by murine B cells and T cells: Alteration of CD45 isoforms in subpopulations of activated B cells. Immunol Res. 12 (1), 21-36 (1993).
  38. Balogh, P., Tew, J. G., Szakal, A. K. Simultaneous blockade of Fc? receptors and indirect labeling of mouse lymphocytes by the selective detection of allotype-restricted epitopes on the kappa chain of rat monoclonal antibodies. Cytometry. 47 (2), 107-110 (2002).
  39. Becerril-García, M. A., et al. Langerhans Cells From Mice at Birth Express Endocytic- and Pattern Recognition-Receptors, Migrate to Draining Lymph Nodes Ferrying Antigen and Activate Neonatal T Cells in vivo. Front Immunol. 11, 744(2020).
  40. Dent, M. A., Segura-Anaya, E., Alva-Medina, J., Aranda-Anzaldo, A. NeuN/Fox-3 is an intrinsic component of the neuronal nuclear matrix. FEBS Lett. 584 (13), 2767-2771 (2010).
  41. Duan, W., et al. Novel Insights into NeuN: from Neuronal Marker to Splicing Regulator. Mol Neurobiol. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  42. Monteiro, R., Sivasubramanian, M. K., Balasubramanian, P., Subramanian, M. Obesity-Induced Sympathoexcitation is Associated with Glial Senescence in the Brainstem. FASEB J. 34 (S1), 1-1 (2020).
  43. Li, S., Chang, L., Teissie, J. Electroporation protocols: mircroorganism, mammalian system, and nanodevice. , Humana Press, New York. (2020).
  44. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of Microglia. Physiol Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
  45. Haage, V., et al. Comprehensive gene expression meta-analysis identifies signature genes that distinguish microglia from peripheral monocytes/macrophages in health and glioma. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 20(2019).
  46. Kosior, N., Petkau, T. L., Connolly, C., Lu, G., Leavitt, B. R. Isolating cells from adult murine brain for validation of cell-type specific cre-mediated deletion. J Neurosci Methods. 328, 108422(2019).
  47. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of General and Discriminating Markers of Differential Microglia Phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).
  48. Man, S., Ubogu, E. E., Ransohoff, R. M. Inflammatory Cell Migration into the Central Nervous System: A Few New Twists on an Old Tale. Brain Pathol. 17 (2), 243-250 (2007).
  49. Schroeter, C. B., et al. One Brain-All Cells: A Comprehensive Protocol to Isolate All Principal CNS-Resident Cell Types from Brain and Spinal Cord of Adult Healthy and EAE Mice. Cells. 10 (3), 651(2021).
  50. Sankowski, R., et al. Mapping microglia states in the human brain through the integration of high-dimensional techniques. Nate Neurosci. 22 (12), 2098-2110 (2019).
  51. Brennan, F. H., et al. Microglia coordinate cellular interactions during spinal cord repair in mice. Nat Commun. 13 (1), 4096(2022).
  52. Enright, H. A., et al. Functional and transcriptional characterization of complex neuronal co-cultures. Sci Rep. 10 (1), 11007(2020).
  53. Mofazzal Jahromi, M. A., et al. Microfluidic Brain-on-a-Chip: Perspectives for Mimicking Neural System Disorders. Mol Neurobiol. 56 (12), 8489-8512 (2019).
  54. Chin, E., Goh, E. Blood-brain barrier on a chip. Methods Cell Biol. 146, 159-182 (2018).
  55. Miccoli, B., Braeken, D., Li, Y. E. Brain-on-a-chip Devices for Drug Screening and Disease Modeling Applications. Curr Pharm Des. 24 (45), 5419-5436 (2019).
  56. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  57. Pellegrini, L., et al. Human CNS barrier-forming organoids with cerebrospinal fluid production. Science. 369 (6500), eaaz5626(2020).
  58. Chhibber, T., et al. CNS organoids: an innovative tool for neurological disease modeling and drug neurotoxicity screening. Drug Discov Today. 25 (2), 456-465 (2020).
  59. Tang, X. Y., et al. Human organoids in basic research and clinical applications. Signal Transduct TargetTher. 7 (1), 168(2022).
  60. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227(2019).
  61. Doughty, D., et al. Development of a novel purification protocol to isolate and identify brain microglia. Exp Biol Med. 247 (16), 1433-1446 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie m zgu i rdzeniaizolacja kom rek OUNmagnetyczna separacja kom rekcytometria przep ywowaizolacja mikroglejuizolacja oligodendrocyt wizolacja astrocyt wizolacja neuron wdysocjacja m zgudysocjacja rdzenia kr gowego

Powiązane artykuły