Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie modeli uszkodzeń siatkówki w kijankach Xenopus

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65771

⸱

13 października 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Paris-Saclay Institute of Neuroscience, CNRS, Université Paris-Saclay

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy kilka protokołów do wywoływania uszkodzeń siatkówki lub degeneracji siatkówki u kijanek Xenopus laevis. Modele te dają możliwość badania mechanizmów regeneracji siatkówki.

Streszczenie

Choroby neurodegeneracyjne siatkówki są główną przyczyną ślepoty. Spośród wielu badanych strategii terapeutycznych, stymulacja samonaprawy okazała się ostatnio szczególnie atrakcyjna. Komórkowym źródłem zainteresowania naprawą siatkówki jest komórka glejowa Müllera, która kryje w sobie potencjał komórek macierzystych i niezwykłą zdolność regeneracyjną u anamniotów. Potencjał ten jest jednak bardzo ograniczony u ssaków. Badanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw regeneracji siatkówki w modelach zwierzęcych o zdolnościach regeneracyjnych powinno dostarczyć informacji na temat tego, w jaki sposób odblokować utajoną zdolność komórek Müllera ssaków do regeneracji siatkówki. Jest to kluczowy krok w rozwoju strategii terapeutycznych w medycynie regeneracyjnej. W tym celu opracowaliśmy kilka paradygmatów uszkodzenia siatkówki w Xenopus: mechaniczne uszkodzenie siatkówki, transgeniczną linię pozwalającą na warunkową ablację fotoreceptorów za pośrednictwem nitroreduktazy, model barwnikowego zwyrodnienia siatkówki oparty na nokaucie rodopsyny za pośrednictwem CRISPR/Cas9 oraz model cytotoksyczny napędzany przez wewnątrzgałkowe wstrzyknięcia CoCl2. Podkreślając ich zalety i wady, opisujemy tutaj tę serię protokołów, które generują różne stany zwyrodnieniowe i pozwalają na badanie regeneracji siatkówki u Xenopus.

Wprowadzenie

Miliony ludzi na całym świecie cierpią na różne choroby zwyrodnieniowe siatkówki prowadzące do ślepoty, takie jak barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, retinopatia cukrzycowa czy zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). Do tej pory schorzenia te pozostają w dużej mierze nieuleczalne. Obecnie oceniane podejścia terapeutyczne obejmują terapię genową, przeszczepy komórek lub tkanek, leczenie neuroprotekcyjne, optogenetykę i urządzenia protetyczne. Inna pojawiająca się strategia opiera się na samoregeneracji poprzez aktywację komórek endogennych o potencjale komórek macierzystych. Komórki glejowe Müllera, główny typ komórek glejowych siatkówki, należą do komórkowych źródeł zainteresowania w tym kontekście. Po urazie mogą się deróżnicować, namnażać i generować neurony1,2,3. Chociaż proces ten jest bardzo skuteczny u danio pręgowanego lub ksenopusa, jest w dużej mierze nieefektywny u ssaków.

Niemniej jednak wykazano, że odpowiednie leczenie białkami mitogennymi lub nadekspresją różnych czynników może wywołać ponowne wejście w cykl komórkowy komórek glejowych Müllera u ssaków, a w niektórych przypadkach wywołać ich późniejsze zaangażowanie w neurogenezę1,2,3,4,5. Jest to jednak w dużej mierze niewystarczające w przypadku leczenia. W związku z tym poszerzenie naszej wiedzy na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw regeneracji jest niezbędne do zidentyfikowania cząsteczek zdolnych do skutecznego przekształcania właściwości komórek macierzystych Müllera w nowe komórkowe strategie terapeutyczne.

W tym celu opracowaliśmy kilka paradygmatów uszkodzeń w Xenopus, które wywołują degenerację komórek siatkówki. W tym miejscu przedstawiamy (1) mechaniczne uszkodzenie siatkówki, które nie jest specyficzne dla typu komórki, (2) warunkowy i odwracalny model ablacji komórek przy użyciu systemu NTR-MTZ, który celuje w komórki pręcikowe, (3) nokaut rodopsyny za pośrednictwem CRISPR/Cas9, model barwnikowego zwyrodnienia siatkówki, który wyzwala postępującą degenerację komórek pręcikowych, oraz (4) CoCl2-indukowany model cytotoksyczny, który w zależności od dawki może być ukierunkowany na czopki lub prowadzić do szerszego zwyrodnienia komórek siatkówki. Podkreślamy specyfikę, zalety i wady każdego paradygmatu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opieka nad zwierzętami i eksperymenty były prowadzone zgodnie z wytycznymi instytucji, na podstawie licencji instytucjonalnej A91272108. Protokoły badań zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami CEEA #59 i otrzymały autoryzację od Direction Départementale de la Protection des Populations pod numerem referencyjnym APAFIS #32589-2021072719047904 v4 i APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące wszystkich materiałów, przyrządów i odczynników używanych w tych protokołach.

1. Mechaniczne uszkodzenie siatkówki

UWAGA: Opisany tutaj protokół paradygmatu urazów polega na mechanicznym nakłuciu kijanki siatkówki od stadium 45. W związku z tym nie jest ukierunkowany na żaden konkretny typ komórek siatkówki, ale uszkadza całą grubość siatkówki w miejscu nakłucia.

  1. Przygotowanie środka znieczulającego dla kijanek
    1. Przygotować 10% roztwór podstawowy benzokainy. Aby uzyskać całkowitą objętość 10 ml, dodać 1 g benzokainy, 2 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) i 8 ml glikolu propylenowego. Roztwór podstawowy przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem folią aluminiową.
    2. Przygotować 0,005% roztwór benzokainy w momencie użycia, dodając 25 μl 10% roztworu podstawowego benzokainy do 50 ml wody z hodowli kijanek (przefiltrowanej i odchlorowanej wody z kranu). Dobrze wymieszaj.
      UWAGA: Stężenie benzokainy jest szczególnie niskie, ponieważ kijanki są bardzo wrażliwe na znieczulenie w porównaniu z dorosłymi.
  2. Przygotowanie szpilki
    1. Przymocuj sterylną szpilkę o średnicy 0,2 mm do wysterylizowanego uchwytu na szpilki (Rysunek 1A).
  3. Znieczulenie kijanką
    1. Użyj siatki zanurzeniowej, aby złapać kijanki w ich zbiornikach. Przenieś je do nowego zbiornika zawierającego 0,005% roztwór benzokainy. Poczekaj kilka minut, aż kijanki przestaną reagować na bodźce (stukanie w zbiornik lub bezpośredni kontakt).
      UWAGA: Kilka kijanek może być znieczulonych jednocześnie, ale czas spędzony w roztworze znieczulającym powinien być krótszy niż 30 minut.
  4. Nakłucie siatkówki
    1. Za pomocą łyżki złap jedną kijankę i ostrożnie połóż ją na małej szalce Petriego (55 mm średnicy) zawierającej mokrą chusteczkę. Umieść kijankę grzbietową stroną do góry na środku szalki Petriego.
    2. Pod mikroskopem stereoskopowym przebij siatkówkę, delikatnie wkładając szpilkę po grzbietowej stronie oka, aż przejdzie przez siatkówkę (Rysunek 1A). Jeśli potrzebnych jest kilka szturchnięć, powtórz tę procedurę w różnych miejscach. Po przebiciu prawego oka obróć szalkę Petriego o 180°, aby nakłuć lewe oko.
    3. Przenieś uszkodzoną kijankę do dużego zbiornika zawierającego 1 litr wody z hodowli, ostrożnie zanurzając szalkę Petriego. Monitoruj kijanki, aż zostaną w pełni obudzone.

2. Warunkowa ablacja komórek pręcikowych przy użyciu systemu NTR-MTZ

Protokół ma na celu wywołanie specyficznej ablacji komórek pręcikowych w transgenicznej linii Xenopus Tg(rho:GFP-NTR) class6, dostępnej w serwisie zootechnicznym TEFOR Paris-Saclay, w którym znajduje się francuskie centrum zasobów Xendopus. Ten system chemogenetyczny wykorzystuje zdolność enzymu nitroreduktazy (NTR) do przekształcania proleku metronidazolu (MTZ) w cytotoksyczny czynnik sieciujący DNA, aby swoistie ablować pręciki wykazujące ekspresję NTR (Figura 1B). Wcześniej opublikowano dwa szczegółowe protokoły tworzenia transgenicznych zwierząt Tg(rho:GFP-NTR) lub Tg(rho:NTR) i wywoływania degeneracji: 7,8. Tutaj po prostu szczegółowo opisujemy indukcję zwyrodnienia siatkówki i sposób monitorowania procesu zwyrodnienia in vivo.

  1. Przygotowanie roztworu metronidazolu
    1. Przygotować 10 mM roztwór MTZ w momencie użycia, rozpuszczając 1,67 g proszku MTZ w ciemnej butelce w 1 litrze wody do hodowli kijanek zawierającej 0,1% DMSO, używając mieszadła magnetycznego i mieszadła magnetycznego.
      UWAGA: MTZ jest wrażliwy na światło. Całkowite rozpuszczenie może potrwać do 10 minut.
  2. Generowanie transgenicznych kijanek poprzez naturalne krzyżowanie z linii Tg(rho:GFP-NTR)
    UWAGA: Ponieważ transgeniczne samce reprezentują cenny gatunek, wolimy generować zarodki poprzez naturalne krycie, aby nie składać samca w ofierze i używać go wielokrotnie.
    1. Podawanie hormonów
      1. Wstrzyknąć 600 j.m. ludzkiego hormonu gonadotropiny kosmówkowej (hCG) za pomocą igieł 25G do grzbietowego worka limfatycznego samic Xenopus laevis typu dzikiego. Wstrzyknąć transgenicznym mężczyznom 100-200 j.m. hCG do grzbietowego worka limfatycznego. Do monitorowania na żywo zwyrodnienia pręcików (krok 2.4) należy używać albino Xenopus zamiast pigmentowanych, aby lepiej uwidocznić zmiany fluorescencji w całym oku wygenerowanych transgenicznych kijanek.
        UWAGA: Samice Xenopus mogą być zaszczepione 50 j.m. hCG na 1 do 7 dni przed planowaną owulacją, ale jest to opcjonalne.
    2. Gody i zbieranie jaj
      1. Natychmiast po wstrzyknięciu hCG umieścić w zbiorniku jednego transgenicznego samca Tg(rho:GFP-NTR) wraz z jedną samicą, której wstrzyknięto hCG, w temperaturze 20 °C do następnego dnia. Użyj dużej objętości (co najmniej 10 l) i dodaj małe przedmioty, do których jaja będą przylegać, aby jaja nie zostały uszkodzone przez ruchy dorosłych. Następnego dnia, gdy żaby nie są już w ampleksusie, wyjmij dorosłe osobniki ze zbiornika i zbierz zarodki.
    3. Hodowla zarodków i kijanek
      1. Stadium zarodków i kijanek zgodnie z normalną tabelą rozwoju Xenopus 9.
      2. Hoduj zarodki w zbiorniku wypełnionym wodą do hodowli kijanek. Od etapu 45 nakarm kijanki sproszkowanym pokarmem do smażenia i natlenić wodę bełkotką. W razie potrzeby dodawaj wodę codziennie, aby skompensować parowanie i wymieniaj wodę w całym zbiorniku co tydzień.
        UWAGA: Alternatywnie możliwa jest również wymiana 50% wolumenu dwa razy w tygodniu. Szczegółowy protokół można znaleźć w10.
    4. Sortowanie zarodków transgenicznych
      1. Od etapu 37/38 sortuj i wybieraj transgeniczne zarodki pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym, bezpośrednio wizualizując GFP (Rysunek 1C).
  3. Zabieg na kijankę MTZ
    1. Przenieść transgeniczne kijanki Tg(rho:GFP-NTR) do zbiornika zawierającego 10 mM roztworu MTZ i hodować je w temperaturze 20 °C w ciemności przez 1 tydzień. Jako grupę kontrolną należy używać transgenicznego rodzeństwa hodowanego w wodzie do hodowli kijanek zawierającej 0,1% DMSO.
    2. Zmieniaj MTZ i roztwór kontrolny co drugi dzień w okresie leczenia. Karm kijanki jak zwykle podczas zabiegu MTZ.
    3. W celu indywidualnego monitorowania fluorescencji (krok 2.4) umieść każdą kijankę w małym pojemniku z 30 ml MTZ lub roztworem kontrolnym, począwszy od kroku 2.3.1.
      UWAGA: Zabieg MTZ można wykonać w dowolnym momencie, począwszy od 45 etapu.
  4. Monitorowanie na żywo zwyrodnienia pręta
    UWAGA: Postępującą degenerację prętów można monitorować w czasie rzeczywistym. W związku z tym należy wykonać kroki 2.4.1. zgodnie z pkt 2.4.4. przed leczeniem MTZ, a następnie regularnie po zabiegu.
    1. Wykonaj kroki 1.1 i 1.3, aby przygotować odpowiednio znieczulenie i znieczulenie kijanką.
    2. Łyżką złap jedną kijankę i ostrożnie połóż ją na mokrej chusteczce na małej szalce Petriego (55 mm średnicy). Obserwuj fluorescencję GFP pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym (długość fali wzbudzenia = 488 nm i długość fali emisji = 509 nm) i wykonaj zdjęcia oka. Zmniejszona intensywność fluorescencji odzwierciedla degradację pręcików.
      UWAGA: Aby dokonać porównań ilościowych, należy zachować te same ustawienia dla obrazowania wszystkich kijanek.
    3. Przenieś obrazowaną kijankę do dużego zbiornika zawierającego 1 litr wody do hodowli, ostrożnie zanurzając szalkę Petriego. Monitoruj kijanki, aż zostaną w pełni obudzone.
    4. Porównaj intensywność fluorescencji między oczami kijanki leczonymi MTZ i kontrolnymi, aby monitorować i oceniać skuteczność procesu zwyrodnienia.

3. Zwyrodnienie komórek pręcikowych przez nokaut rodopsyny za pośrednictwem CRISPR/Cas9

UWAGA: Ten protokół został stworzony do generowania modelu barwnikowego zwyrodnienia siatkówki u Xenopus laevis poprzez indukowanie specyficznej degeneracji komórek pręcikowych za pomocą nokautu rodopsyny za pośrednictwem CRISPR/Cas9. % wstawienia-usunięcia (indels) w F0 jest podany w11 i wynosi ~75%. Taki nokaut rodopsyny za pośrednictwem CRISPR/Cas9 można również przeprowadzić u kijanek Xenopus tropicalis 11.

  1. Przygotowanie roztworów i odczynników
    1. Porządkowanie crRNA i tracrRNA
      1. Kup syntetyczne RNA CRISPR (crRNA) ukierunkowane na gen rodopsyny (rho) i standardowe transaktywujące crRNA (tracrRNA). crRNA składa się z regionu specyficznego dla celu rho (GCUCUGCUAAGUAAUACUGA) i innego (GUUUUAGAGCUAUGCU), który hybrydyzuje z tracrRNA.
    2. crRNA:duplex tracrRNA (dupleks rho gRNA)
      1. Ponownie zawiesić crRNA i tracrRNA przy 100 μM w buforze dupleksowym bez nukleazy.
      2. Przygotować duplex gRNA, mieszając 3 μl 100 μM rho crRNA, 3 μl 100 μM tracrRNA i 94 μl buforu dupleksowego. Końcowe stężenia to 36 ng/μL rho crRNA i 67 ng/μL tracrRNA.
      3. Oligonukleotydę wyżarzać, ogrzewając ją w temperaturze 95 °C przez 5 minut i powoli schłodzić do temperatury pokojowej. Przygotować porcje i przechowywać je w temperaturze -20 °C.
    3. Kompleks rybonukleoproteinowy CRISPR-Cas9 (tj. gRNA duplex/białko Cas9)
      1. W momencie użycia przygotuj mieszaninę dupleksu rho gRNA i białka Cas9. W przypadku 20 μl dodaj 10 μl roztworu dupleksu rho gRNA, 2 μl białka Cas9 (zapas w stężeniu 5 mg/ml), 2 μl dekstranu fluoresceiny lizyny (zapas w stężeniu 10 mg/ml) i 6 μl wody wolnej od RNaz.
      2. Aby utworzyć kompleks rybonukleoproteinowy, inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C i pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
      3. Na 20 μl roztworu kontrolnego wymieszać 2 μl białka Cas9, 2 μl dekstranu lizyny fluoresceiny i 16 μl wody wolnej od RNaz.
    4. Przygotowanie rozwiązań MBS 10x, 1x i 0,1x
      1. Przygotować zmodyfikowany roztwór podstawowy soli Bartha (10x MBS), dodając 11,92 g HEPES, 51,43 g chlorku sodu (NaCl), 0,75 g chlorku potasu (KCl), 2,1 g wodorowęglanu sodu (NaHCO3) i 2,46 g siedmiowodnego siarczanu magnezu (MgSO4,7 H2O) w 800 ml wody typu II. Dostosuj pH do 7,8 za pomocą 30% wodorotlenku sodu (NaOH). Dodawać wodę typu II, aż objętość wyniesie 1 l i sterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      2. Przygotować 1 l roztworu 1x MBS, rozcieńczając 100 ml 10 x roztworu soli MBS i 7 ml 0,1 M dwuwodnego chlorku wapnia (CaCl2, 2H2O) w wodzie typu II. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      3. Przygotować roztwór 0,1x MBS, rozcieńczając 1x roztwór MBS w wodzie typu II. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    5. Roztwór benzokainy dla dorosłych
      1. Przygotować 0,05% roztwór benzokainy, dodając 5 ml 10% roztworu podstawowego benzokainy (patrz krok 1.1.1.) do 1 litra wody do hodowli kijanek. Dobrze wymieszaj.
        UWAGA: Roztwór należy przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem folią aluminiową. Doprowadź roztwór do temperatury pokojowej przed użyciem u zwierząt.
    6. Roztwór L-cysteiny
      1. Przygotować roztwór do deżelacji w momencie użycia, dodając 2 g monohydratu chlorowodorku L-cysteiny do 100 ml 0,1 x roztworu MBS. Dostosuj pH do 7,8 z 30% NaOH.
    7. Roztwór polisacharozy
      1. Przygotuj gęsty roztwór polisacharozy, dodając 3 g polisacharozy do 100 ml 0,1 x roztworu MBS. Roztwór należy przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze 4 °C.
  2. Zapłodnienie in vitro i dejellying
    UWAGA: Więcej szczegółów na temat zapłodnienia in vitro Xenopus można znaleźć w szczegółowym dedykowanym protokole w12.
    1. Podawanie hormonów samicom Xenopus laevis w celu wywołania owulacji
      1. Na około 15 godzin przed pobraniem komórek jajowych należy wstrzyknąć 600 j.m. hCG do grzbietowego worka limfatycznego samicy i przechowywać przez noc w temperaturze 18 °C.
    2. Rozwarstwienie jądra
      1. Poddaj samca Xenopus eutanazji śmiertelną dawką 0,05% roztworu benzokainy przez 10-15 minut. Jako uzupełniającą metodę eutanazji należy odciąć kręgosłup bezpośrednio za czaszką ostrymi i mocnymi nożycami. Otwórz jamę brzuszną nożyczkami preparacyjnymi, wytnij jądra i odetnij przyczepiony tłuszcz i naczynia włosowate. Umieść każde jądro natychmiast na lodzie w 1 ml 1x MBS.
    3. Przygotowanie nasienia
      1. Rozdrobnić jedno jądro za pomocą tłuczka do probówek do mikrowirówek i rozcieńczyć zawiesinę w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml 1x MBS. Dodać 10 μg/ml gentamycyny do drugiej probówki z jądrem i utrzymywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów z nawożeniem.
    4. Zapłodnienie in vitro
      1. Delikatnie masuj plecy samicy, której wstrzyknięto hormon i zbierz oocyty na szalce Petriego (średnica 100 mm). Rozprowadź kilka kropli roztworu plemnika do oocytów. Odczekaj 5 minut i przykryj je 0,1x MBS. Odczekaj 10 minut przed przystąpieniem do dejellyingu.
    5. Zapłodnione jaja dejellying
      1. Zastąp 0,1x roztwór MBS roztworem dejellingu, aby usunąć galaretowatą powłokę z zapłodnionych jaj (~5 min). Dokładnie wypłucz zarodki 5-6 razy 0,1x MBS i przenieś je na nową 100-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną 0,1x MBS.
  3. Przygotowanie systemu mikroiniekcji
    1. Naostrz szklane kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet13.
    2. Napełnij zaostrzoną kapilarnę 2-10 μl kompleksu rybonukleoproteinowego CRISPR-Cas9 lub roztworem kontrolnym za pomocą końcówki mikroładowarki i umieść kapilarnę w manipulatorze mikroiniektorów.
    3. Przy największym powiększeniu mikroskopu stereoskopowego odłamać końcówkę kapilary drobnymi kleszkami i dostosować czas wstrzykiwania (~400 ms), aby uzyskać objętość wyrzutową 10 nL na impuls. Ustaw ciśnienie wyrzutu na około 40 PSI.
  4. Mikroiniekcja zarodka w stadium jednokomórkowym kompleksem rybonukleoproteinowym CRISPR-Cas9
    1. Umieść zarodki w stadium jednokomórkowym na siatce (1 mm tkanka nylonowa) przyklejonej do 100-milimetrowej szalki Petriego wypełnionej 3% roztworem polisacharozy (Ryc. 1D).
    2. Za pomocą mikroiniektora i pod mikroskopem stereoskopowym wstrzyknąć 10 nL kompleksu rybonukleoproteinowego CRISPR-Cas9 (co odpowiada 500 pg dupleksu gRNA + 5 ng białka Cas9 na zarodek) lub roztworu kontrolnego na poziomie bieguna zwierzęcego, w obszarze kory mózgowej, tuż pod błoną cytoplazmatyczną.
      UWAGA: Zawarty w roztworze dekstran lizyny fluoresceinowej umożliwia późniejsze sortowanie wstrzykniętych zarodków.
    3. Przenieść wstrzyknięte zarodki na nową szalkę Petriego o średnicy 100 mm zawierającą czysty roztwór polisacharozy i umieścić je w temperaturze 21 °C.
    4. Pierwszego dnia należy regularnie sortować dobrze rozwinięte zarodki i zastąpić roztwór polisacharozy roztworem 0,1 x MBS po około 5 godzinach od mikroiniekcji.
    5. Odczekaj 24 godziny po wstrzyknięciu, aby posortować i wybrać dobrze wstrzyknięte zarodki rho crispant pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym, wizualizując fluoresceinę dekstran lizyny (Rysunek 1E).
      UWAGA: Im wcześniejsza mikroiniekcja po zapłodnieniu, tym skuteczniejszy nokaut.
  5. Hodowla zarodków i kijanek
    1. Hoduj zarodki rho crispant w 0,1x MBS na szalkach Petriego do etapu 37/38. Codziennie usuwaj martwe zarodki i zmieniaj roztwór 0,1x MBS. Od etapu 37/38 hoduj zarodki w zbiorniku wypełnionym wodą do hodowli kijanek, a od etapu 45 postępuj jak w kroku 2.2.3.

4. Zwyrodnienie komórek siatkówki przez cytotoksyczne wstrzyknięcia CoCl 2 do gałki ocznej

UWAGA: Ten protokół został ustanowiony w celu wywołania degeneracji komórek siatkówki poprzez dogałkowe wstrzyknięcia chlorku kobaltu (CoCl2) u kijanek Xenopus laevis. W zależności od dawki może wywołać zwyrodnienie specyficzne dla stożka lub szersze zwyrodnienie14. Protokół ten stosujemy u kijanek Xenopus laevis w wieku od 48 lat. Może być również stosowany w kijankach Xenopus tropicalis.

  1. Przygotowanie buforu i odczynników
    1. Przygotować 0,005% roztwór benzokainy w momencie użycia, jak w kroku 1.1.
    2. Przygotować 100 mM roztworu podstawowego CoCl2, dodając 118,5 mg do 5 ml 0,1 x MBS (patrz krok 3.1.4 w celu przygotowania 0,1 x MBS). Roztwór podstawowy należy przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem folią aluminiową.
      UWAGA: CoCl2 jest klasyfikowany jako związek toksyczny dla życia ludzi i zwierząt. Dokładnie postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi obchodzenia się, przechowywania i utylizacji odpadów zawartymi w karcie charakterystyki.
    3. W przypadku zwyrodnienia specyficznego dla stożka należy przygotować 10 mM roztwór CoCl2 w momencie użycia z 100 mM roztworu podstawowego rozcieńczonego w 0,1 x MBS. W przypadku szerszego zwyrodnienia komórek siatkówki przygotuj roztwór 25 mM CoCl2.
  2. Przygotowanie układu wtryskowego
    1. Naostrz szklane kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet 13.
    2. Napełnij zaostrzoną kapilarnę 2-10 μl 10 lub 25 mM roztworu CoCl2 lub roztworu kontrolnego (0,1 x MBS) za pomocą końcówki mikroładowarki i umieść kapilar w obsłudze mikrowtryskiwacza.
    3. Przy największym powiększeniu mikroskopu stereoskopowego odłamać końcówkę kapilary drobnymi kleszkami i dostosować czas wstrzyknięcia (około 100 ms), aby uzyskać objętość wyrzutową 15-40 nL na impuls. Ustaw ciśnienie wyrzutu na ~40 PSI.
      UWAGA: Wielkość kropli powinna być dostosowana do stadium rozwoju kijanek i wielkości ich oka. Na przykład na etapach 48-49 wielkość kropli wynosi ~15-20 nL, podczas gdy na etapach 52-56 wynosi 30-40 nL. Wizualnie rozmiar kropli jest nieco większy niż rozmiar soczewki.
  3. CoCl2 wstrzyknięcia do gałki ocznej
    1. Użyj siatki zanurzeniowej, aby złapać kijanki w ich zbiornikach. Przenieś je do 50 ml 0,005% roztworu benzokainy. Odczekaj kilka minut, aż kijanki przestaną reagować na bodźce.
      UWAGA: Kilka kijanek może być znieczulonych w tym samym czasie, ale czas spędzony w znieczuleniu powinien być krótszy niż 30 minut.
    2. Za pomocą łyżki złap jedną kijankę i ostrożnie umieść ją na małej szalce Petriego (55 mm średnicy) zawierającej mokrą chusteczkę. Umieść kijankę grzbietową stroną do góry na środku szalki Petriego (Rysunek 1F,G).
    3. Użyć mikrowstrzykiwacza pod mikroskopem stereoskopowym, aby wstrzyknąć dogałkowo roztwór CoCl2. Delikatnie włóż naczynek do oka nad soczewką. Gdy końcówka kapilary znajdzie się wewnątrz oka, wysuń dwie krople na oko. Po wstrzyknięciu do prawego oka należy ręcznie obrócić szalkę Petriego o 180°, aby wykonać wstrzyknięcie do lewego oka.
      UWAGA: Należy upewnić się, że wstrzyknięcie zostało wykonane wewnątrz oka, tak aby po każdym wytrysku roztworu musiał być widoczny niewielki obrzęk oka. Kijanka powinna jak najmniej przebywać poza wodą. Wstrzyknięcie do obu oczu powinno trwać krócej niż 1 minutę.
    4. Przenieś wstrzykniętą kijankę do dużego zbiornika zawierającego 1 litr wody hodowlanej, zanurzając ją ostrożnie na szalce Petriego (Rysunek 1H). Monitoruj kijanki, aż zostaną w pełni obudzone.

5. Barwienie w celu oceny uszkodzenia siatkówki lub zwyrodnienia siatkówki

  1. Utrwalenie kijanki i odwodnienie
    1. Przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu (PFA), rozcieńczając 100 ml 32% roztworu PFA w 700 ml 1x PBS. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą NaOH. Podwielokrotnić ten roztwór podstawowy i przechowywać go przez kilka miesięcy w temperaturze -20 °C.
    2. Kijanki należy poddać eutanazji w 0,01% benzokainie i przenieść do fiolki zawierającej 4% PFA na 2 godziny w temperaturze pokojowej z mieszaniem lub przez noc w temperaturze 4 °C. Płukać 3 x 5 min w 1x PBS.
    3. Stopniowo odwadniaj kijanki poprzez kolejne 30-minutowe inkubacje w 70% i 95% etanolu (rozcieńczonym w wodzie typu II), a następnie trzy kolejne 1-godzinne inkubacje w 100% etanolu. Na tym etapie przechowuj główki kijanek w temperaturze -20 °C lub bezpośrednio przenieś je na noc do 100% butanolu w celu podjęcia dalszych kroków.
  2. Cięcie parafiny
    1. Zastąp 100% butanolu stopioną parafiną na 2 godziny w temperaturze 62 °C. Zastąp parafinę na 2 x 2 godziny dodatkowej inkubacji w temperaturze 62 °C.
    2. Przenieś główki kijanek w jednorazowych formach do zatapiania parafiny i ustaw je tak, aby ich oczy były dobrze wyrównane, a następnie pozwól parafinie stwardnieć. Przechowuj bloki w temperaturze pokojowej.
    3. Przytnij nadmiar parafiny i zamontuj blok z osadzonymi kijankami na wsporniku mikrotomu.
    4. Przeciąć blok za pomocą mikrotomu o odpowiedniej grubości (10-12 μm). Przenieś wstążki z odcinkami na szkiełku uprzednio pokrytym 3% albuminą glicerynową (rozcieńczoną w wodzie).
    5. Umieścić szkiełko na szkiełku podstawowym podgrzewanym w temperaturze 42 °C na kilka minut, a następnie usunąć nadmiar albuminy gliceryny. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc w piekarniku w temperaturze 37 °C.
    6. Odwoskuj poprzez zanurzenie szkiełek na 2 x 15 min w słoiku Coplin wypełnionym 100% ksylenem. Ponownie uwodnić sekcje za pomocą stopniowanej serii etanolu: 100% dwukrotnie, 70%, 50% (rozcieńczone w wodzie typu II), ~5 min każda, a następnie 2 x 5 min w wodzie.
  3. Znakowanie immunofluorescencyjne
    1. Przygotować 100 mM roztworu podstawowego cytrynianu sodu (CiNa), dodając 29,4 g dwuwodnej soli trisodowej cytrynianu sodu (C, 6, H, 5, Na, 3,O7, 2H2O) do 1 l wody typu II; dostosować pH do 6 za pomocą kwasu solnego (HCl). Sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy. Przygotować roztwór demaskujący w momencie użycia, dodając 25 ml 100 mM roztworu podstawowego CiNa do 225 ml wody typu II. Dodaj 125 μl Tween-20 i dobrze wymieszaj (końcowe stężenie to 10 mM CiNa, 0,05% Tween-20).
    2. Przygotować roztwór podstawowy Hoechsta o stężeniu 10 mg/ml, dodając 100 mg bisBenzimide H 33258 do 10 ml wody typu I. Roztwór podstawowy należy przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem folią aluminiową. Przygotować roztwór Hoechsta o stężeniu 7,5 μg/ml, dodając 300 μl roztworu podstawowego Hoechst do 400 ml 1x PBS.
      UWAGA: Roztwór ten może być używany do 10 razy i przechowywany przez około 6 miesięcy w temperaturze 4 °C, chroniony przed światłem folią aluminiową.
    3. Po odparafinowaniu skrawków należy przeprowadzić pobranie antygenu, gotując skrawki w roztworze demaskującym przez 9 minut. Pozostaw roztwór do ostygnięcia przez 20 minut.
    4. Spłucz raz w wodzie typu II i raz w 1x PBS. Umieść szkiełka płasko w wilgotnej komorze i dodaj 400-600 μl roztworu blokującego na szkiełko (rozcieńczalnik przeciwciał + 0,2% Triton X100) przez 30 minut.
    5. Zastąp roztwór blokujący 200 μl na szkiełko przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym. Użyj szkiełka nakrywkowego, aby rozprowadzić roztwór na sekcjach, unikając tworzenia się pęcherzyków. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.
    6. Przenieś szkiełka do słoika Coplin i płucz przez 3 x 10 minut w 1x PBS uzupełnionym 0,1 % Triton X100. Ułożyć szkiełka płasko, dodać 400 μl na szkiełko przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w roztworze blokującym i pozostawić na 2 godziny w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
    7. Przenieś szkiełka do słoika Coplin i płucz przez 3 x 5 minut 1x PBS uzupełnionym 0,1% Triton X100.
    8. Przeciwbarwić jądra komórkowe roztworem Hoechst przez 10 minut i płukać 3 x 5 minut 1x PBS.
    9. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach w wodnym podłożu montażowym specjalnie zaprojektowanym w celu zachowania fluorescencji. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przechowuj je w temperaturze 4 °C.
    10. Zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
  4. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu oceny uszkodzenia siatkówki
    UWAGA: Zamiast znakować określony typ komórek za pomocą barwienia immunologicznego, ogólną histologię siatkówki można ocenić za pomocą zabarwienia H&E.
    1. Po odparafinowaniu skrawków należy wykonać znakowanie kwasami nukleinowymi, zanurzając szkiełka w roztworze hematoksyliny na 2 min. Dobrze spłukać wodą z kranu.
    2. Wykonaj znakowanie cytoplazmy, zanurzając szkiełka w 1% roztworze eozyny na 1 minutę. Szybko spłucz wodą.
      UWAGA: Eozyna jest bardzo dobrze rozpuszczalna; Jeśli szkiełka pozostaną zbyt długo w wodzie, cały barwnik zniknie.
    3. Płukać 2 x 5 min w 100% etanolu i 2 x 5 min w ksylenie.
    4. Pod maską umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach w 4-5 kroplach podłoża montażowego. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia pod maską i zobrazuj następnego dnia pod mikroskopem.
  5. Wykrywanie komórek apoptotycznych
    1. Po odparafinowaniu skrawków (patrz sekcja 5.2.6) postępuj zgodnie z protokołem producenta zestawu, aby wykryć apoptotyczną fragmentację DNA.
    2. Barwienie jąder należy przeprowadzić przez zanurzenie szkiełek w roztworze Hoechsta (patrz sekcja 5.3.8) i zamocować za pomocą wodnego podłoża montażowego specjalnie zaprojektowanego w celu zachowania fluorescencji. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 1 godzinę w temperaturze pokojowej i przechowuj je w temperaturze 4 °C.
    3. Zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mechaniczne uszkodzenie siatkówki
Przekroje siatkówki kijanek poddanych mechanicznemu uszkodzeniu opisanemu w sekcji 1 protokołu wykazują, że zmiana w siatkówce obejmuje wszystkie warstwy tkanki, pozostając ograniczoną do miejsca nakłucia (Rycina 2A,B).

Warunkowa ablacja komórek pręcikowych z wykorzystaniem systemu NTR-MTZ
Oczy znieczulonych kijanek transgenicznych Tg(rho:GFP-NTR) poddanych działa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zalety i wady różnych paradygmatów uszkodzenia siatkówki u kijanek Xenopus

Mechaniczne uszkodzenie siatkówki
U kijanek Xenopus rozwinęły się różne chirurgiczne urazy siatkówki nerwowej. Siatkówka nerwowa może być albo całkowicie usunięta15,16, albo tylko częściowo wycięta16,17. Przedstawiony tutaj uraz mechaniczny nie pol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty dla M.P. od Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) i UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) we współpracy z ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-propanodiol (propylè ne glikol)Sigma-Aldrich398039
Absolutny etanol ≥ 99,8%Chemikalia VWR20821-365
Przeciwciało przeciw rozszczepieniu kaspazy 3 (królik)Sygnalizacja komórkowa9661SRozcieńczenie 1/300
Przeciwciało anty-GFP (kurczak)AveslabsGFP-1020Rozcieńczenie 1/500
Przeciwciało anty-M-opsyny (królik)Sigma-AldrichAB5405Rozcieńczenie 1/500
Przeciwciało wtórne przeciwko myszy, Alexa Fluor 594 (koza)Invitrogen Thermo ScientificA11005Rozcieńczenie 1/1,000
Przeciwciało anty-Otx2 (królik)AbcamAb183951Rozcieńczenie 1/100
Przeciwciało wtórne przeciw królikowi, Alexa Fluor 488 (koza)Invitrogen Thermo ScientificA11008Rozcieńczenie 1/1,000
Przeciwciało wtórne anty-królika, Alexa Fluor 594 (koza)Invitrogen Thermo ScientificA11012Rozcieńczenie 1/1,000
Przeciwciało anty-Recoverin (królik)Sigma-AldrichAB5585Rozcieńczenie 1/500
Przeciwciało anty-rodopsyny (mysz)Sigma-AldrichMABN15Rozcieńczenie 1/1,000
Przeciwciało anty-S-Opsyny (królik)Sigma-AldrichAB5407Rozcieńczenie 1/500
Zestaw do wykrywania Apoptotis (ślepy zaułek fluorymetryczny system TUNEL)PromegaG3250
Benzokaina Sigma-AldrichE1501Roztwór podstawowy 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)Sigma-AldrichB2883Roztwór podstawowy 10 mg/ml
Butanol-1 ≥ 99,5%Chemikalia VWR20810.298
Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2, 2H2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.02382Użyj na 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)New England BiolabsM0646T
Clark Model szkła kapilarnego GC100TF-10Warner Instruments (Harvard Apparatus)30-0038
Chlorek kobaltu(II) sześciowodny (CoCl2, 6H2O)Sigma-AldrichC8661Roztwór podstawowy 100 mM
Szkiełko nakrywkowe 24 x 60 mmVWR631-1575
Dako REAL ab rozcieńczalnik AgilentS202230-2
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Elektroniczny mikrotom rotacyjnyThermo ScientificMicrom HM 340E 
Eozyna 1% wodnistaRAL Diagnostyka312740
Dekstran lizyny fluoresceiny   Invitrogen Thermo ScientificD1822
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowyOlympusSZX 200
GentamycinEuromedexEU0410-B
Albumina glicerynowa wg. MalloryDiapathE0012Stosować w stężeniu 3% w wodzie
Hematoksylina (Hemalun Mayera)RAL Diagnostics320550
Sól potasowaHEPESSigma-AldrichH0527
Ludzki hormon gonadotropiny kosmówkowejMSD Zdrowie zwierzątChorulon 1500
Kwas solny dymiący, 37% (HCl)Sigma-Aldrich (SAFC)1.00314
Monohydrat chlorowodorku L-cysteinySigma-AldrichC7880Stosować w stężeniu 2% w 0,1x MBS (pH 7,8 - 8,0)
Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4, 7H< sub>2O)Sigma-Aldrich (Supelco)1.05886
Metronidazol Sigma-Aldrich (Supelco)M3761Zastosowanie przy
końcówkach do mikroładowarekmM Ściągacz
(P-97 Flaming/Brown)Sutter Instrument Co.Model P-97Program: Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Medium montażowe do zachowania fluorescencji, FluorSave ReagentMillipore345789
Medium montażowe, EukittChem-LabCL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome bladeEpredia3053835
Igła Agani 25 G x 5/8''TerumoAN*2516R1
Niklowany uchwyt na szpilkiFine Science Tools26016-12
Nylonowa tkanka filtracyjna (tkanina do przesiewania) NITEX, otwór siatki 1,000 &mikro; mSefar06-1000/44
Histowax parafinowy bez DMSOHistolab00403
Roztwór paraformaldehydu (32%)Mikroskopia elektronowa NaukiEM-15714-S Stosowaćprzy 4% w 1x PBS pH 7,4
Jednorazowe formy do zatapiania Peel-A-WayEpredia2219
TłuczekVWR431-0094
szalka Petriego 100 mmCorning GosselinSB93-101
Szalka Petriego 55 mmCorning GosselinBP53-06
Bufor fosforanowy roztwór soli fizjologicznej (PBS) 10xEuromedexET330-A
System mikroiniekcji PicoSpritzerProdukty oprzyrządowania ParkerPicoSpritzer III
Kołki Fine Science Tools26002-20
Polisacharoza (Ficoll PM 400 )Sigma-AldrichF4375Stosować w stężeniu 3% w 0,1x MBS
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP3911
Sproszkowany pokarm do smażenia : sera Micron Naturesera45475 (00720)
Nożyczki do rozwarstwianiaFine Science Tools14090-09
Slide Superfrost   Szkło KNITTELVS11171076FKA 
Podgrzewacz do slajdówInstrumenty KunzHP-3
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS7653
Sól trisodowa cytrynianu sodu dwuwodna (C6H5Na3O7, 2H2O)VWR chemicals27833.294
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-Aldrich (Supelco)1.06329
Wodorotlenek sodu 30% roztwór wodny (NaOH)VWR chemicals28217-292
StereomikroskopZeissStemi 2000
Strzykawki jednorazowe Omnifix-F Solo 1mL B-BRAUN9161406V
transaktywujący crRNA (tracrRNA)Zintegrowane technologieDNA
Triton X-100Sigma-AldrichX-100
Tween-20Sigma-AldrichP9416
X-Cite 200DC Oświetlacz fluorescencyjnyX-Cite Ksylen 200DC
≥ 98.5% Chemikalia VWR28975-325
10 do mikropipet Eppendorf 5242956003 1072533

Bibliografia

  1. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  2. Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
  3. García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
  4. Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).
  5. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  6. Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
  7. Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
  8. Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
  9. Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
  10. McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
  11. Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807(2022).
  12. Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
  13. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
  14. Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
  15. Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
  16. Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
  17. Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).
  18. Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regeneracja siatk wkikom rki glejowe M lleramechaniczne uszkodzenie siatk wkiablacja fotoreceptor wknockout rodopsyny metod CRISPRwstrzykni cie chlorku kobaltufluorescencyjny stereomikroskopdegeneracja siatk wki
Generowanie modeli uszkodzeń siatkówki w kijankach Xenopus
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.