Artykuł metodologiczny

Modelowanie stwardnienia rozsianego u obu płci: eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia wywołane MOG35-55

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65778

⸱

13 października 2023

 ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”, University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino, 4Koelliker Hospital

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia jest jednym z najczęściej stosowanych mysich modeli stwardnienia rozsianego. W obecnym protokole myszy C57BL/6J obu płci są immunizowane peptydem glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych, co skutkuje głównie wznoszącym się niedowładem ogona i kończyn. W tym miejscu omówiono protokół indukcji i oceny EAE.

Streszczenie

Stwardnienie rozsiane (SM) jest przewlekłą autoimmunologiczną chorobą zapalną atakującą ośrodkowy układ nerwowy (OUN). Charakteryzuje się różnym rozpowszechnieniem u obu płci, dotykając więcej kobiet niż mężczyzn, oraz różnymi wynikami, wykazując bardziej agresywne formy u mężczyzn niż u kobiet. Ponadto stwardnienie rozsiane jest wysoce niejednorodne pod względem aspektów klinicznych, cech radiologicznych i patologicznych. Dlatego konieczne jest wykorzystanie eksperymentalnych modeli zwierzęcych, które pozwalają na zbadanie jak największej liczby aspektów patologii. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) stanowi jeden z najczęściej stosowanych modeli stwardnienia rozsianego u myszy, modelujący różne cechy choroby, od aktywacji układu odpornościowego po uszkodzenie OUN. W tym miejscu opisujemy protokół indukcji EAE zarówno u samców, jak i samic myszy C57BL / 6J za pomocą immunizacji peptydu glikoproteinowego oligodendrocytów mielinowych 35-55 (MOG35-55), co prowadzi do rozwoju przewlekłej postaci choroby. Przedstawiamy również ocenę dziennego wyniku klinicznego i sprawności motorycznej tych myszy przez 28 dni po szczepieniu (28 dpi). Na koniec ilustrujemy podstawową analizę histologiczną na poziomie OUN, koncentrując się na rdzeniu kręgowym jako głównym miejscu uszkodzenia wywołanego chorobą.

Wprowadzenie

Stwardnienie rozsiane (SM) jest przewlekłą autoimmunologiczną chorobą zapalną atakującą ośrodkowy układ nerwowy (OUN). Wskazuje na obecność okołonaczyniowego nacieku komórek zapalnych, demielinizacji, utraty aksonów i glejozy1. Jego etiologia pozostaje nieznana, a aspekty kliniczne, cechy radiologiczne i patologiczne sugerują niezwykłą heterogeniczność choroby2.

Ze względu na jego nieznaną etiologię i złożoność, obecnie żaden model zwierzęcy nie podsumowuje wszystkich klinicznych i radiologicznych cech wyświetlanych u człowieka MS3,4. Jednak różne modele zwierzęce są wykorzystywane do badania różnych aspektów MS3,4. W tych modelach inicjacja choroby jest zazwyczaj bardzo sztuczna, a ramy czasowe wystąpienia objawów klinicznych są różne u ludzi i myszy. Na przykład u ludzi procesy patofizjologiczne leżące u podstaw choroby pozostają niewykryte przez wiele lat przed wystąpieniem objawów klinicznych. I odwrotnie, eksperymentatorzy mogą wykryć objawy w modelach zwierzęcych w ciągu kilku tygodni lub nawet dni po indukcji SM4.

Trzy podstawowe modele zwierzęce wytwarzają cechy demielinizacji, które są charakterystyczne dla SM: te, które są wywołane przez wirusa (np. wirus mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera), te, które są indukowane przez czynniki toksyczne (np. kupryzone, lizolecytyna) oraz różne warianty eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE)5. Każdy model pomaga badać pewne specyficzne aspekty choroby, ale żaden nie replikuje wszystkich cech MS6. Dlatego tak ważne jest, aby wybrać właściwy model, biorąc pod uwagę konkretne potrzeby eksperymentalne i pytania naukowe, którymi należy się zająć.

Dzięki procedurom immunizacji przeciwko antygenom pochodzącym z mieliny, EAE jest indukowane poprzez wywołanie autoimmunologicznej odpowiedzi na składniki OUN u podatnych myszy. Wzajemne oddziaływanie między szerokim zakresem mechanizmów immunopatologicznych i neuropatologicznych powoduje rozwój głównych cech patologicznych SM (tj. zapalenie, demielinizacja, utrata aksonów i glejoza) u immunizowanych myszy7,8. Myszy zaczynają wykazywać objawy kliniczne około drugiego tygodnia po szczepieniu i na ogół wykazują paraliż wstępujący od ogona do kończyny i kończyny przedniej. Wynik kliniczny (tj. kwantyfikacja akumulacji deficytów związanych z chorobą) jest zazwyczaj oceniany za pomocą 5-punktowej skali7.

Aktywna immunizacja białkiem lub peptydem lub pasywny transfer encefalitogennych limfocytów T może być użyty do wywołania EAE u myszy o różnym pochodzeniu genetycznym (np. SJL/J, C57BL/6 i myszy bez otyłości i cukrzycy (NOD)). Białko proteolipidowe mieliny (PLP), podstawowe białko mieliny (MBP) i glikoproteina oligodendrocytów mieliny (MOG) są przykładami białek własnego OUN, z których zwykle wytwarzane są immunogeny. W szczególności myszy SJL / J uodpornione immunodominującym epitopem PLP (PLP139−151) rozwijają przebieg choroby rzutowo-remisyjnej (RR), podczas gdy myszy C57BL / 6J immunizowane immunodominującym peptydem MOG35-55 wykazują EAE o charakterze przewlekłym1. Pomimo pewnych ograniczeń, takich jak dostarczanie bardzo mało informacji na temat progresji stwardnienia rozsianego, roli limfocytów B w chorobie, mechanizmów inside-out czy trudności w badaniu remielinizacji, modele EAE w ogromnym stopniu przyczyniły się do zrozumienia procesów autoimmunologicznych i neurozapalnych, zwiększając wiedzę w dziedzinie stwardnienia rozsianego, a tym samym umożliwiając opracowanie nowych podejść terapeutycznych dla tej choroby4, 6.

W niniejszej pracy skupiliśmy się na szczególnej formie aktywnego EAE, peptydzie glikoproteinowym oligodendrocytów mielinowych 35-55 (MOG35-55)9,10,11,12. EAE wywołane przez MOG35-55 modeluje przewlekłą postać stwardnienia rozsianego. Po szczepieniu myszy przechodzą fazę bezobjawową w ciągu pierwszego tygodnia po szczepieniu, następnie choroba zwykle pojawia się w drugim tygodniu po szczepieniu, natomiast między trzecim a czwartym tygodniem po szczepieniu choroba staje się przewlekła, bez możliwości pełnego wyleczenia ze skumulowanych deficytów7,8,13. Co ciekawe, w większości badań obecnych w literaturze14 nie obserwuje się różnic między mężczyznami i kobietami pod względem częstości występowania, początku choroby, przebiegu lub progresji, nawet jeśli w mniejszej liczbie badań porównuje się chorobę u mężczyzn i kobiet.

Natomiast u ludzi te parametry są silnie dymorficzne płciowo2. Stwardnienie rozsiane dotyka więcej kobiet niż mężczyzn; Jednak u mężczyzn na ogół rozwija się bardziej agresywna forma choroby2. Dowody te sugerują istotną, a także złożoną rolę hormonów gonad15; Niemniej jednak rola i mechanizm działania hormonów płciowych w patologii pozostają niejasne. Co więcej, dane z modeli zwierzęcych potwierdzają ideę, że zarówno estrogeny, jak i androgeny wywierają pozytywny wpływ na różne drogi patologii w sposób specyficzny dla płci16,17.

Niektóre badania sugerują również neuroprotekcyjne, promilenizujące i przeciwzapalne działanie progesteronu18 i, chociaż dowody u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym są rzadkie18, sterydy neuroaktywne (tj. steroidy de novo syntetyzowane przez układ nerwowy, takie jak pregnenolon, tetrahydroprogesteron i dihydroprogesteron) mogą również wpływać na przebieg patologiczny19. Podsumowując, dane te potwierdzają tezę, że hormony płciowe wytwarzane zarówno obwodowo, jak i wewnątrz OUN odgrywają ważną i specyficzną dla płci rolę w powstawaniu i postępie choroby. Dlatego w niniejszej pracy nalegamy na zebranie oddzielnych danych zarówno od samców, jak i samic.

Z punktu widzenia histopatologicznego, istota biała rdzenia kręgowego służy jako główne miejsce uszkodzenia OUN w tym modelu, który charakteryzuje się wieloogniskowymi, zlewającymi się regionami jednojądrzastego nacieku zapalnego i demielinizacji8. Tak więc, opisując ten protokół indukcji EAE indukowanego przez MOG35-55 u myszy C57BL / 6J, weźmiemy pod uwagę wynik choroby u obu płci i przedstawimy pewne histopatologiczne spostrzeżenia dotyczące rdzenia kręgowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opieka nad zwierzętami w niniejszej pracy została przeprowadzona zgodnie z Dyrektywą Rady Unii Europejskiej z dnia 22września 2010 r. (2010/63/UE); wszystkie procedury przedstawione w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (407/2018-PR) oraz przez Komitet Etyczny Uniwersytetu w Turynie (Projekt nr 360384). Sugerujemy dostosowanie projektu eksperymentalnego do wytycznych ARRIVE pierwotnie opublikowanych przez Kilkenny et al. w 201020. Przed rozpoczęciem upewnij się, że dostępne są niezbędne materiały (patrz Tabela materiałów). Wysterylizuj wszystkie szkło i przybory używane do przygotowania emulsji MOG35-55 w autoklawie. Podsumowanie procedur eksperymentalnych jest przedstawione w Rysunek 1.

1. Przygotowanie emulsji MOG35-55

UWAGA: Do przygotowania emulsji wymagane są MOG35-55, niekompletny adiuwant Freuda (IFA), Mycobacterium Tuberculosis szczep H37Ra (MT) oraz roztwór fizjologiczny (patrz Tabela Materiałów).

UWAGA: Zabity termicznie MT może stymulować wrodzoną odpowiedź immunologiczną. Należy unikać wdychania, połykania i kontaktu ze skórą i oczami przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej i ważenia MT w zakrytej wadze precyzyjnej pod maską.

rozwiązaniekompozycjaNotatki
2 mg/ml roztworu peptydu MOG35-55 Liofilizowany peptyd MOG35-55 rozcieńczony w roztworze fizjologicznym o stężeniu 2 mg/ml Już rozcieńczony roztwór zachować w temperaturze -80 °C.
5 μg/ml roztworu PT Liofilizowany PT rozcieńczony w roztworze fizjologicznym o stężeniu 5 μg/ml. Już rozcieńczony roztwór zachować w temperaturze -80 °C.
emulsjaCałkowita objętość emulsji potrzebna do uodpornienia każdej myszy wynosi 300 μl podzielona w następujący sposób: Aby uniknąć zmian lub zanieczyszczenia, należy przygotować emulsję w dniu szczepienia.
200 μg/mysz MOG35-55 , tj. 100 μl roztworu MOG35-55 2 mg/ml.
50 μl roztworu fizjologicznego
150 μL IFA
4 mg/ml MT, tj. 1,2 mg/mysz
Roztwór fizjologicznyChlorek sodu 0,9% rozcieńczony w wodzie destylowanej.

Tabela 1: Skład roztworów stosowanych w procedurze szczepień.

  1. Przygotować roztwór w szklanej zlewce, dodając najpierw składnik płynny, a na końcu MT.
    UWAGA: Całkowita objętość emulsji potrzebna do uodpornienia każdej myszy wynosi 300 μl, podzielona zgodnie z tabelą 1. Emulsja jest bardzo lepka i gęsta, więc podczas procedury przygotowania i wstrzykiwania może dojść do pewnych strat, zwłaszcza podczas przygotowywania roztworu dla kilku myszy. Sugerujemy obliczenie końcowej objętości potrzebnej emulsji poprzez przeszacowanie liczby myszy do uodpornienia o co najmniej 1,5-2-krotnie.
  2. Umieścić zlewkę w lodzie i użyć szklanej strzykawki z igłą 18 G, aby rozpocząć emulgowanie roztworu.
    UWAGA: Emulsję można również przygotować przy użyciu innych strategii, na przykład łącząc dwie szklane strzykawki bez powietrza z trójdrożnym kranem i mieszając roztwór, popychając tłoki w przód i w tył21,22.
  3. Roztwór należy emulgować przez co najmniej 15 minut; zazwyczaj wystarczy 30 minut emulgowania. Aby sprawdzić jakość emulsji, dodaj kroplę emulsji do przezroczystego pojemnika wypełnionego wodą: jeśli kropla zachowa swoją strukturę i pozostanie nienaruszona, emulsja jest gotowa
    4. .
  4. Umieścić emulsję bezpośrednio w strzykawkach o pojemności 1 ml, które będą używane do immunizacji i przechowywać je w temperaturze +4 °C do momentu użycia, aby zachować gęstość emulsji i uniknąć zmian lub zanieczyszczeń.

2. Selekcja zwierząt i immunizacja

  1. Selekcja zwierząt
    1. Wybierz dorosłe myszy C57BL/6J obu płci w wieku 8-10 tygodni o optymalnej masie ciała ~20 g. Pamiętaj, aby wybrać myszy dopasowane pod względem wieku i płci do różnych grup eksperymentalnych, ponieważ podatność na choroby może się różnić w zależności od wieku i płci.
      UWAGA: Myszy powinny mieć porównywalną masę ciała w dniu szczepienia, ponieważ obecna procedura jest zoptymalizowana dla określonego zakresu masy ciała (17-25 g).
    2. Trzymanie zwierząt tej samej płci w grupach (n = 4-5 / klatka), aby uniknąć izolacji społecznej w standardowych warunkach, w polipropylenowych klatkach na myszy o wymiarach 45 cm x 25 cm x 15 cm w temperaturze 22 ± 2 °C, w cyklu światła/ciemności o godzinie 12:12 (światła włączone o 08:00). Zapewnij jedzenie i wodę ad libitum.
      UWAGA: Ostatecznie, aby jeszcze bardziej ograniczyć potencjalną zmienność przebiegu choroby u uodpornionych zwierząt, sugerujemy również utworzenie odpowiednio licznych grup doświadczalnych. Istnieją również badania8,23, które opisują czas szczepienia jako warunek, który determinuje zmienność wyniku EAE. Dlatego sugerujemy wykonanie szczepienia mniej więcej o tej samej godzinie u wszystkich zwierząt, najlepiej w godzinach świetlnych dziennego cyklu światło/ciemność23. Aby ograniczyć stres, zaleca się manipulowanie zwierzętami przed dniem szczepienia i znakowanie ich w celu łatwej identyfikacji do codziennej oceny, na przykład obcinanie uszu lub znacznik
      3. .
  2. Procedura szczepień ochronnych
    UWAGA: Upewnij się, że procedura jest wykonywana przez doświadczonego badacza, aby zminimalizować stres u zwierząt i zoptymalizować immunizację. Przed rozpoczęciem szczepienia należy wybrać metodę znieczulenia zgodnie z wytycznymi instytucjonalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami i etyki. W naszym laboratorium stosuje się znieczulenie krótkie izofluranem.
    1. Znieczulij mysz: 4% izofluranu do indukcji znieczulenia i 1,5-2% izofluranu do utrzymania znieczulenia. Poczekaj, aż znieczulenie będzie skuteczne i użyj szczypania tylnego i przedniego palca stopy, aby ocenić poziom znieczulenia. Aby zapobiec wysuszeniu oczu, gdy mysz jest pod narkozą, użyj zatwierdzonej przez weterynarza maści do oczu.
    2. PT wstrzyknięcie dożylne w boczną żyłę ogonową: delikatnie zatkaj ogon myszy roztworem etanolu, który działa jako środek rozszerzający naczynia krwionośne, aby wyświetlić żyły. Skoncentruj się na jednej z dwóch żył bocznych ogona i za pomocą strzykawki o pojemności 0,5 ml wyposażonej w igłę 30 G wstrzyknij 500 ng PT (tj. 100 μl PT rozcieńczonego w roztworze fizjologicznym o stężeniu 5 μg/ml).
    3. Iniekcja podskórna emulsji MOG35-55: za pomocą strzykawki 1 ml z igłą 26 G należy wykonać trzy iniekcje podskórne wcześniej przygotowanej emulsji: dwie pod rostralną część boków i jedną u nasady ogona. Objętość emulsji wstrzykiwanej w każde miejsce wynosi 100 μl, co daje całkowitą objętość 300 μl emulsji wstrzykiwanej do każdej myszy.
      UWAGA: Dzień szczepienia jest rejestrowany jako dzień 0 po szczepieniu (dpi); 48 godzin później (tj. w temperaturze 2 dpi) konieczne jest wykonanie kolejnego dożylnego wstrzyknięcia PT równego poprzednio wykonanemu. Możliwe jest wykonanie iniekcji bez znieczulenia, przy użyciu przytrzymywacza dla myszy. Opisana tutaj procedura ma na celu wywołanie i utrzymanie znieczulenia myszy podczas procedury immunizacji, aby uniknąć możliwego dyskomfortu i ruchów zwierząt lub ryzyka zarówno dla myszy, jak i badaczy. W związku z tym nie ma zabiegów chirurgicznych. Jednak, aby zoptymalizować procesy eksperymentalne, ważne jest utrzymanie odpowiednich warunków sterylnych podczas tych etapów i monitorowanie stanu myszy po tych procedurach.
    4. Aby sprawdzić, czy mysz wyzdrowiała po wstrzyknięciach, po zabiegach umieść ją w czystej klatce i poczekaj, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać leżącą mostek. Gdy mysz w pełni wyzdrowieje, wróć do klatki domowej z innymi zwierzętami.

3. Kontynuacja EAE

  1. Masa ciała i przyjmowane pokarmy
    1. Codziennie monitoruj masę ciała (BW) zwierząt za pomocą elektronicznej wagi precyzyjnej, ponieważ spadek masy ciała jest wskaźnikiem postępu choroby.
      UWAGA: Spadek ten nie powinien przekraczać określonego procentu, zgodnie z wytycznymi komitetu instytucjonalnego i etycznego dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Zazwyczaj, jeśli zwierzę straci więcej niż 20% początkowej masy ciała (tj. masy zarejestrowanej przy 0 dpi), powinno zostać uśmiercone w ramach zastosowania humanitarnego punktu końcowego. Metody eutanazji obejmują głębokie nieodwracalne znieczulenie do inhalacji (np. 5% izofluranu), a następnie ścięcie głowy.
    2. Monitoruj spożycie pokarmu (FI) - pokarm zjedzony przez zwierzę w ciągu dnia (g∙dzień-1∙zwierzę-1), ważąc ilość pokarmu w określonym pojemniku co najmniej raz w tygodniu i dzieląc ilość zjedzonego pokarmu w ciągu minionych dni między dwa kolejne pomiary i liczbę zwierząt obecnych w klatce.
      UWAGA: Pomiar ten pozwala na oszacowanie średniego spożycia pokarmu. Ze względu na pojawienie się i nagromadzenie klinicznych objawów chorobowych, które obejmują paraliż kończyn, sugerujemy umieszczenie trochę podlanego pokarmu na podłodze klatki, gdy zwierzęta nie są w stanie stabilnie stać na tylnych kończynach i sięgać do pojemnika na karmę lub butelki z wodą. Aby jak najdokładniej ocenić spożycie pokarmu w okresie obserwacji, zmierzyliśmy również suchą masę tego pokarmu przed zmoczeniem go dla myszy.
  2. Ocena cykliczności rujowej podczas EAE
    1. Sprawdź cykl rujowy przez co najmniej dwa cykle, oceniając rozmazy cytologii pochwy zgodnie z opisem McLean i wsp.24. Sklasyfikuj fazę cyklu rujowego na podstawie obecności trzech pierwotnych typów komórek - jądrzastych komórek nabłonkowych, zrogowaciałych komórek nabłonka płaskonabłonkowego i leukocytów - w próbkach rozmazu z pochwy w następujący sposób:
      1. Klasyfikować jako ruję na podstawie prawie wyłącznej obecności skupisk okrągłych, dobrze uformowanych jądrzastych komórek nabłonkowych.
      2. Klasyfikować jako ruję na podstawie dominującej obecności gęsto upakowanych skupisk zrogowaciałych komórek nabłonka płaskiego.
      3. Klasyfikować jako metestrus na podstawie dominującej obecności małych ciemno zabarwionych leukocytów i niewielkiej obecności zrogowaciałych komórek nabłonka płaskiego.
      4. Klasyfikować jako diestrus na podstawie wysoce dominującej obecności małych, ciemno zabarwionych leukocytów i rzadkich zrogowaciałych komórek nabłonka płaskiego wraz z możliwym pojawieniem się jądrzastych komórek nabłonka.
        UWAGA: Podczas oceny choroby u obu płci ważne jest, aby sprawdzić zmienność u samic ze względu na cykl rujowy. Sugerujemy skupienie się na ocenie cyklu rujowego, zwłaszcza między pierwszym a drugim tygodniem po szczepieniu (tj. podczas ostrej fazy EAE). Wcześniej wykazano, że procedura immunizacji powoduje najbardziej wyraźne zmiany w cyklu rujowym w tej fazie25. Ponadto należy wziąć pod uwagę, że wykonanie rozmazu, gdy zwierzę osiągnie wysoki wynik kliniczny (zwłaszcza >3), jest trudne ze względu na niedowład tylny i brak napięcia kończyn tylnych.
  3. Wynik kliniczny
    1. Niech zaślepiony badacz codziennie ocenia wynik kliniczny zwierząt. Każdemu zwierzęciu przypisz ocenę w skali od 0 do 5 (patrz Tabela 2), aby ocenić przebieg choroby26 zgodnie z opisem Racke7.
      UWAGA: Podobnie jak w przypadku spadku masy ciała, humanitarny punkt końcowy jest również niezbędny do zwiększenia wyników klinicznych, zgodnie z wytycznymi komitetu instytucjonalnego i etycznego dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Ogólnie rzecz biorąc, jeśli zwierzę nie jest już w stanie samodzielnie się wyżywić (dzieje się tak zwykle, gdy zwierzę osiąga co najmniej 4 punkty, zgodnie z używaną przez nas skalą), powinno zostać uśmiercone w ramach zastosowania humanitarnego punktu końcowego.
  4. Ocena sprawności silnika za pomocą testu rotaroda
    UWAGA: Ocena progresji EAE jest zwykle przeprowadzana poprzez codzienne przypisywanie wyniku klinicznego, co jest wykonywane przez w pełni przeszkolonego, zaślepionego badacza. Przydatne może być jednak uzupełnienie go bardziej ilościową i obiektywną oceną postępu choroby. W poprzednim badaniu26, test rotarod został użyty do zmierzenia sprawności motorycznej zaszczepionych zwierząt. Jak opisali van den Berg et al.27, aby uzyskać bardziej ilościową i precyzyjną ocenę kliniczną przebiegu choroby, ocena sprawności motorycznej za pomocą testu Rotarod może wesprzeć ocenę wyniku klinicznego. Szczegółowy opis można znaleźć w van den Berg et al.27.
    1. Pozwól myszom codziennie przechodzić sesje rotarodowe, zaczynając od 1 dpi aż do złożenia ofiary (tj. 28 dpi). Każda sesja składa się z pojedynczej 300 s sesji, podczas której prędkość pręta musi być zwiększana liniowo od 4 do 40 obr./min.
    2. Zarejestruj wynik zwierzęcia. Gdy mysz nie jest w stanie utrzymać równowagi i spada z urządzenia, upada na ziemię i uruchamia czujnik, a czas (y) jest rejestrowany. W związku z tym wydajność jest oceniana jako opóźnienie do spadku (s).

ocenaObjaw klinicznyOpis
0ZdrowyNie zaobserwowano objawów klinicznych. Zwierzę wykazuje normalny ton i poruszanie ogonem. Chodzi bez potykania się.
0,5Bramka z uszkodzonym skutkiemZwierzę potyka się podczas spaceru po grillu.
1Kulejący ogonGdy zwierzę jest podnoszone za podstawę ogona, ogon opada (zwiotczały ogon).
1,5Bezwładny ogon i osłabiona bramaZwierzę ma zwiotczały ogon i potyka się podczas spaceru po grillu.
cyfra arabskaAtaksjaZwierzę ma trudności ze wstaniem po przewróceniu na grzbiet.
Rozdział 2.5Ataksja i niedowład kończyn tylnychZwierzę nie może wstać na nogach, gdy zostanie obrócone na plecy, i traci ton jednej ze swoich tylnych kończyn.
3Paraliż kończyn tylnychZwierzę traci ton obu tylnych kończyn.
3,5Paraliż kończyn tylnych i/lub niedowład kończyn przednichZwierzę traci ton zarówno tylnych, jak i częściowo przednich. W rzeczywistości pokazuje utratę siły w uścisku kończyn przednich.
4niedowład tetraZwierzę całkowicie traci tonację swoich kończyn.
Rozdział 4.5Niedowład tetra i obniżona temperatura ciałaZwierzę całkowicie traci napięcie kończyn i wykazuje spadek temperatury ciała (jest mu zimno).
5Umierający lub martwyZwierzę jest martwe (nie reaguje na żaden bodziec) lub nie żyje.

Tabela 2: System punktacji klinicznej używany do oceny progresji EAE.

4. Ocena objawów histopatologicznych wywołanych EAE na poziomie rdzenia kręgowego

UWAGA: Tutaj krótko opisujemy procedurę uśmiercania zwierząt i pobierania rdzenia kręgowego w celu przeprowadzenia analizy histopatologicznej; szczegółowy opis znajdziesz w tych odnośnikach10,26,28,29.

  1. Utrwalanie i pobieranie próbek tkanek
    UWAGA: Szczegółowy opis można znaleźć w następujących odnośnikach10,26.
    1. Składaj zwierzęta w ofierze w temperaturze 28 dpi podczas przewlekłej fazy choroby.
      1. Znieczulenie myszy głębokim nieodwracalnym znieczuleniem (dootrzewnowe wstrzyknięcie Zolazepamu i Tiletaminy 80 mg/kg / ksylazyna 10 mg/kg).
      2. Perfuzję przezsercową myszy należy przeprowadzić za pomocą roztworu soli fizjologicznej, a następnie 4% roztworu paraformaldehydu (PFA).
        UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas stosowania PFA: ponieważ jest toksyczny, unikaj wdychania, spożywania oraz kontaktu ze skórą i oczami przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej. Zważyć proszek, przygotować roztwór i przeprowadzić perfuzję pod maską.
    2. Usuń rdzeń kręgowy z kręgosłupa30.
    3. Przechowuj rdzeń kręgowy w 4% roztworze PFA przez 24 godziny.
    4. Wykonać kilka płukań w 0,01 M solankowym buforze fosforanowym (PBS).
    5. Osadź rdzeń kręgowy w blokach parafinowych30.
  2. Zabiegi histologiczne
    UWAGA: Szczegółowy opis można znaleźć w Montarolo et al.10.
    1. Za pomocą mikrotomu przeciąć poprzeczne odcinki rdzenia kręgowego o grubości 10 μm i zebrać je na szkiełkach pokrytych żelatyną. Ustaw płaszczyznę przekroju tak, aby odpowiadała rysunkom odpowiadającym przekrojom poprzecznym rdzenia kręgowego myszy atlas31.
    2. Wykonaj deparafinowanie sekcji32.
    3. Zabarwić sekcję za pomocą Hematoxyliny i Eosin32.
    4. Odwodnić sekcje32.
    5. Przykryj sekcje medium montażowym i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej pod okapem chemicznym.
      UWAGA: Barwienie Hematoksyliną-Eozyną pozwala na wykrycie obecności okołonaczyniowych nacieków zapalnych (PvIIs)26, co jest oceniane jako objaw choroby28.
  3. Analiza ilościowa odcinków rdzenia kręgowego
    1. Uzyskaj obrazy barwionych skrawków za pomocą mikroskopu optycznego podłączonego do kamery cyfrowej z obiektywem 20x29.
    2. Przeanalizuj uzyskany obraz, aby uzyskać liczbę PvII, wyrażoną jako liczba nacieków na mm2,
      UWAGA: Do analizy pozyskanych obrazów przydatne jest skorzystanie z oprogramowania do analizy obrazu. Wyniki neuropatologiczne przedstawione w tej pracy są określone ilościowo w 10 pełnych przekrojach rdzenia kręgowego na mysz (n = 8 / grupa) reprezentatywnych dla całych poziomów rdzenia kręgowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kontynuacja EAE po szczepieniu
Zostało to ocenione w sposób opisany poniżej.

Masa ciała i spożycie pokarmu
Dwukierunkowa analiza wariancji (ANOVA) (płeć i czas jako zmienne niezależne) wykazuje spadek masy ciała zwierząt EAE obu płci, zwłaszcza w drugim tygodniu po indukcji (F(1,57) = 4,952, p < 0,001; Rysunek 2A). Jednak dymorfizm płciowy w BW jest zawsze zachowany (Rysunek 2A). P...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisany przez nas protokół EAE indukowany przez MOG35-55 doprowadził do rozwoju przewlekłej postaci stwardnienia rozsianego u myszy C57BL / 6J 7,8,13. W tych reprezentatywnych wynikach wskazaliśmy, że u zwierząt obu płci, które poddano procedurze immunizacji, rozwinęła się przewlekła postać choroby (tj. nie wracają w pełni do zdrowia po wystąpieniu choroby, kumulują deficyty i utrzymują CS na poziomie co najmniej 1,5 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma żadnych konfliktów interesów, które mógłby zadeklarować w odniesieniu do badań, autorstwa i/lub publikacji tego artykułu.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca - MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 and 2023-2027 dla Departamentu Neuronauki Rity Levi Montalcini; Cavalieri-Ottolenghi Foundation, Orbassano, Włochy. BB był członkiem INFRA-P w regionie Piemontu (nr 378-35) (2022-2023) oraz PRIN w latach 2020 - 20203AMKTW. Dziękujemy Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) za wsparcie. Opłaty za publikację zostały wsparte darowizną rzeczową Distretto Rotaract 2031, a w szczególności Rotaract Club Torino Nord-Est. Dziękujemy Elaine Miller za korektę naszego manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
18 G x 1 & frac12; “ Igła 1,2 x 40 mm do szklanej strzykawki TerumoTER-HYP-18G-112-PIN
Aparat cyfrowy podłączony do mikroskopu optycznegocyfrowy NIKON DS-U1
Elektroniczna waga precyzyjnaMerckMod. Kern-440-47N, rozdzielczość 0,1 g
Eosin YSigma-AldrichHT110216
Szklana pipeta strzykawkowa " ultra asept" 10 mlSacco System 
Wyroby szklane (tj. becker do przygotowania emulsji)VWR213-1170, 213-1172
Hematoksylina (Mayer' s)Sigma-AldrichMHS32przed użyciem. 
Oprogramowanie do analizy obrazuFidżi
Niekompletne Freund' s adiuwant (IFA)Sigma-AldrichF5506Przechowywać w temperaturze +4 °C. 
IsofluraneWellona PharmaTen lek jest stosowany jako wziewny środek znieczulający.
Samce i samice myszy C57BL/6JJackson Laboratory, EnvigoWiek 8-10 tygodni, optymalna masa ciała ~20 g. 
MikrotomLeica HistoCore BIOCUT R
Medium montażowe Merck107961
Mouse RotarodUgo Basile #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), szczep H37Ra Difco Laboratories Inc. 231141Przechowywać w temperaturze +4 °C.
Peptyd glikoproteinowy oligodendrocytów mielinowych 35-55 (MOG35-55)EspikemEPK1Przechowywać w temperaturze -80 &; C rozcieńczony (2 mg/ml) w roztworze fizjologicznym; Przygotuj go w dniu szczepienia, aby w miarę możliwości uniknąć zmian lub zanieczyszczeń.
Mikroskop optycznyNIKON eclipse 90i
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich158127Sklep pod kątem +4 stopni; C po rozcieńczeniu (4%) w buforze fosforanowym.
Toksyna krztuścowa (PT)Duotech PT.181Przechowywać w temperaturze -80° C rozcieńczony (stężenie 5 &mikro; g/ml) w roztworze fizjologicznym 
Roztwór fizjologiczny (0,9% roztwór chlorku sodu)B. EurospitalA 032182038Przechowywać w temperaturze +4 ° C po otwarciu.
Bufor fosforanowo-solny (PBS)Thermo ScientificJ61196.
do akwizycji obrazu  Strzykawki NIS-Element AR 2.10
U-100 0,5 ml z 30 G x 5/16" (0,30 x 8 mm) w stałej igle  Strzykawki NiproSYMS-0,5U100-3008B-EC
U-100 1 ml z 26G x ½ ” (0,45 x 12,7 mm) w igle20,71,26,03,00,354
Maść weterynaryjna do oczuLacrilube, Lacrigel Europhta
XylazineRompunTa mieszanina leku jest stosowana jako środek znieczulający i uspokajający do wstrzykiwań. 
Zolazepam i TiletamineZoletil  100Ten lek jest stosowany jako środek znieczulający do wstrzykiwań, uspokajający, zwiotczający mięśnie i przeciwbólowy
Aparat L003465 Filtr Oprogramowanie AP

Bibliografia

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185(2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), Zurich, Switzerland. 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , Chapter 9, Unit 9.7 (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791(2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831(2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151(2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058(2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It's complicated. Front Immunol. 13, 1059833(2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412(2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778(2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389(2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4(2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida--a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C. Chapter 16 - Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. , Academic Press. 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084(2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50(2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund's adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924(2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis
Posted by JoVE Editors on 2/16/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. The Authors section was updated. An additional affiliation (School of Pharmacy, Pharmacology Unit, University of Camerino) was added for author Antonino Casile.

Tagi

Model stwardnienia rozsianegoimmunizacja MOG 35 55r nice mi dzy p ciami w stwardnieniu rozsianymmyszy C57BL 6Jocena wska nika klinicznegotest rotarodprocesy neurozapalnehistologia rdzenia kr gowegochoroba demielinizacyjna

Powiązane artykuły