Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza multiomiczna TMEM200A jako biomarkera raka

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65795

⸱

15 września 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical University for Nationalities, 2Department of Pathophysiology, Youjiang Medical University for Nationalities

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentowany jest protokół, w którym wiele narzędzi bioinformatycznych jest połączonych w celu zbadania biologicznych funkcji TMEM200A w raku. Ponadto eksperymentalnie weryfikujemy również przewidywania bioinformatyczne.

Streszczenie

Wiadomo, że białko transbłonowe, TMEM200A, jest związane z ludzkimi nowotworami i infiltracją immunologiczną. W tym przypadku oceniliśmy funkcję TMEM200A w powszechnych nowotworach za pomocą analizy multiomicznej i zastosowaliśmy hodowle komórkowe komórek żołądka in vitro w celu weryfikacji wyników. Ekspresję TMEM200A w kilku typach nowotworów u ludzi oceniono przy użyciu danych sekwencyjnych RNA z bazy danych UCSC Xena. Analiza bioinformatyczna ujawniła potencjalną rolę TMEM200A jako biomarkera diagnostycznego i prognostycznego.

Wyhodowano kultury normalnych linii komórkowych żołądka i raka i TMEM200A zostały zburzone. Poziomy ekspresji TMEM200A mierzono za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym i western blot. Następnie przeprowadzono badania in vitro dotyczące utraty funkcji w celu określenia roli TMEM200A w złośliwym zachowaniu i tworzeniu nowotworów komórek raka żołądka (GC). Do oceny wpływu knockdownu na przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) i szlak sygnałowy PI3K/AKT w GC wykorzystano Western blot. Analiza bioinformatyczna wykazała, że TMEM200A wyrażało się na wysokim poziomie w GC.

Proliferacja komórek GC została zahamowana przez TMEM200A knockdown, który również zmniejszył ilość witaminyny, N-kadheryny i białek Snai oraz zahamował fosforylację AKT. Szlak sygnałowy PI3K/AKT wydaje się być również zaangażowany w regulację rozwoju GC za pośrednictwem TMEM200A. Przedstawione tutaj wyniki sugerują, że TMEM200A reguluje mikrośrodowisko guza poprzez wpływ na EMT. TMEM200A może również wpływać na EMT poprzez sygnalizację PI3K/AKT, wpływając w ten sposób na mikrośrodowisko guza. Dlatego w nowotworach świata, zwłaszcza GC, TMEM200A może być potencjalnym biomarkerem i onkogenem.

Wprowadzenie

Rak stał się uporczywym problemem zdrowia publicznego zagrażającym zdrowiu ludzkiemu na całym świecie1ze względu na jego wysokie wskaźniki zachorowalności i śmiertelności na całym świecie, stanowiąc duże obciążenie finansowe i medyczne dla społeczeństwa2. Znaczący postęp w terapii nowotworów został osiągnięty w ostatnich latach dzięki odkryciu markerów nowotworowych3, a naukowcy opracowali nowe metody diagnostyczne i nowe leki do leczenia raka. Jednak niektórzy pacjenci z rakiem nadal mają złe rokowania z powodu takich czynników, jak oporność na leki, skutki uboczne leków i wrażliwość chemiczna4. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania nowych biomarkerów do badań przesiewowych i leczenia nowotworów we wczesnym stadium5.

Białka błonowe to białka, które mogą wiązać się i integrować z komórkami i błonami organelli6. Można je podzielić na trzy kategorie w zależności od siły wiązania z błoną i ich lokalizacji: białka zakotwiczone w lipidach, białka integralne i białka błony obwodowej7,8. Białko transbłonowe (TMEM) jest integralnym białkiem błonowym, które składa się z co najmniej jednego segmentu transbłonowego9, który przechodzi całkowicie lub częściowo przez błonę biologiczną.

Chociaż mechanizmy działania białek należących do rodziny TMEM nie są dobrze poznane, wiadomo, że białka te są zaangażowane w kilka typów nowotworów10. Kilka białek TMEM jest związanych z fenotypami migrującymi, proliferacyjnymi i inwazyjnymi, a ich ekspresja jest często związana z rokowaniem pacjenta11. W związku z tym członkowie rodziny TMEM stali się celem badań. Kompleksowy przegląd istniejących doniesień na temat TMEM wykazał, że są one głównie związane z sygnalizacją między- i wewnątrzkomórkową12, chorobami związanymi z odpornością i nowotworzeniem 10. Wiele TMEM pełni również ważne funkcje fizjologiczne, na przykład kanały jonowe w błonie plazmatycznej, aktywację szlaków transdukcji sygnału, a także pośrednictwo chemotaksji komórek, adhezję, apoptozę i autofagię10. Dlatego postawiliśmy hipotezę, że białka TMEM mogą być ważnymi markerami prognostycznymi w wykrywaniu i leczeniu nowotworów.

TMEM200A ekspresja jest znacznie podwyższona w raku żołądka (GC). Wyższa ekspresja TMEM200A13, która ma osiem eksonów i pełną długość 77,536 kb na chromosomie 6q23.1, wiąże się ze złym rokowaniem w zakresie całkowitego przeżycia (OS) w przypadkach GC. Jednak zmiany w jego ekspresji rzadko były zgłaszane w badaniach onkologicznych. W tym artykule porównano i przeanalizowano przydatność TMEM200A jako celu terapeutycznego i markera diagnostycznego nowotworu w różnych badaniach nad rakiem przy użyciu różnych publicznie dostępnych zestawów danych. Oceniliśmy skuteczność TMEM200A jako biomarkera diagnostycznego i prognostycznego całego nowotworu, a także jego poziomy ekspresji w różnych typach nowotworów u ludzi, korzystając z danych sekwencyjnych RNA z baz danych UCSC Xena i TCGA, a także za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i western blot.

Wpływ poziomów ekspresji TMEM200A na tempo mutacji, procesy regulacyjne, diagnozę i prognozowanie nowotworów, infiltrację immunologiczną i immunoterapię był dalej badany przy użyciu kombinacji narzędzi obliczeniowych i stron internetowych z zestawami danych. Do zbadania mutacji w TMEM200A wykorzystano CBioPortal oraz bazy danych COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells). Wykorzystano strony internetowe Sangerbox i TISIDB, aby zrozumieć, w jaki sposób TMEM200A wpływa na infiltrację immunologiczną. Do zbadania funkcji TMEM200A wykorzystano narzędzie online Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) oraz bazę danych CancerSEA. Wreszcie, aby ocenić wpływ TMEM200A na złośliwe zachowanie i funkcję rozwoju guza komórek GC, przeprowadzono eksperyment utraty funkcji w teście in vitro. Dodatkowo przeprowadzono western blot, aby ocenić, jak TMEM200A knockdown wpływa na szlak sygnałowy PI3K/AKT i przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) w GC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Baza danych Atlasu Genomu Raka (TCGA)

UWAGA: Baza danych Cancer Genome Atlas (TCGA) zawiera dane sekwencjonowania genów w różnych tkankach nowotworowych14. Dane sekwencyjne RNA w TCGA do badania formatów TMEM200A transkryptów na część na milion (TPM) zostały wyodrębnione ze strony internetowej UCSC Xena 15 (https://xenabrowser. net/datapages/) i log2 przekształconych w celu porównania wyrażeń między próbkami.

  1. Przejdź do interfejsu strony internetowej UCSC Xena.
  2. Kliknij kartę Uruchom Xena.
  3. Kliknij zakładkę ZBIORY DANYCH u góry ekranu.
  4. Spośród 129 kohort i 1,571 zestawów danych na tej stronie kliknij zakładkę, aby wyświetlić łącznie 33 nowotwory, takie jak ostra białaczka szpikowa GDC TCGA (LAML), GDC TCGA rak kory nadnerczy (ACC), RAK DRÓG ŻÓŁCIOWYCH GDC TCGA (CHOL) i inne.
  5. Z menu ekspresji genów RNAseq wybierz i kliknij zakładkę HTSeq - FPKM GDC Hub.
    UWAGA: HTSeq - FPKM GDC Hub reprezentuje dane, które zostały poprawione za zgodą.
  6. W menu pobierania kliknij odpowiedni link.
    UWAGA: Powyższą metodą pobrano dane RNA-Seq dla 33 różnych typów raka.
  7. Rozpakuj archiwum zip z danymi sekwencyjnymi RNA dla 33 różnych typów raka w jednym pliku w folderze na pulpicie komputera.
  8. Ujednolic rozpakowane pliki txt w tym samym folderze i umieść skrypty Perla w tym folderze.
  9. Otwórz oprogramowanie Perl, skopiuj i wklej ścieżkę folderu do programu Perl, w którym znajduje się kursor myszy, naciśnij Enter, wprowadź nazwę kodu Perla i nazwę genu (TMEM200A), a następnie naciśnij Enter, aby uzyskać nowy plik txt (singleGeneExp.txt).
    UWAGA: Ten nowy plik txt (singleGeneExp.txt) zawiera ekspresję genów TMEM200A w 33 nowotworach u różnych pacjentów.
  10. Otwórz kod R (diffR) i skopiuj i wklej ścieżkę, w której znajduje się plik singleGeneExp.txt, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie R.
  11. Otwórz oprogramowanie R, uruchom zmodyfikowany kod R (diffR) i narysuj obraz za pomocą pakietu "ggpubr".

2. Baza danych TIMER2.0

  1. Przejdź do interfejsu bazy danych TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) 16.
  2. Kliknij kartę Eksploracja raka.
  3. Wprowadź identyfikator genu (TMEM200A) w polu wyszukiwania i kliknij kartę Prześlij, aby uzyskać obrazy ekspresji różnicowej TMEM200A w różnych typach nowotworów.

3. Atlas białek ludzkich (HPA)

  1. Przejdź do interfejsu internetowego atlasu białek ludzkich (HPA) (www.proteinatlas.org) 17.
  2. Wpisz ID (TMEM200A) w polu wyszukiwania i kliknij przycisk Szukaj. Wybierz podatlas TKANKI.
  3. Najedź kursorem na stronę i przewiń w dół, aby znaleźć kartę Przegląd ekspresji białka.
    UWAGA: Sekcja Przegląd ekspresji białek pokazuje poziomy ekspresji białek TMEM200A w 45 narządach w ludzkim ciele.

4. Platforma metylacji DNA HumanMethylation450 Illumina Infinium

UWAGA: Do zbierania danych na temat metylacji użyto platformy metylacji DNA HumanMethylation450 Illumina Infinium. Mogliśmy ocenić poziomy metylacji DNA TMEM200A za pomocą bazy danych SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/18.

  1. Przejdź do interfejsu strony internetowej SMART.
  2. Wprowadź identyfikator genu (TMEM200A) w polu wyszukiwania, aby uzyskać rozkład TMEM200A w chromosomach i poziom metylacji TMEM200A w różnych typach nowotworów złośliwych.
  3. Przewiń stronę w dół do menu Kliknij, aby sprawdzić zagregowaną metylację CpG i kliknij przycisk Wykres. U dołu strony znajdź i kliknij przycisk Pobierz rysunek. Pobierz rysunek.

5. Baza danych UALCAN

  1. Przejdź do strony internetowej UALCAN interface.
    UWAGA: Wykresy pudełkowe poziomów metylacji promotora TMEM200A w różnych nowotworach złośliwych zostały wygenerowane za pomocą bazy danych UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19
  2. U góry strony kliknij przycisk TCGA.
  3. Wprowadź TMEM200A w polu wprowadzania identyfikatora genu na ekranie. W menu zestawu danych TCGA przewiń w dół i wybierz typ nowotworu, który ma zostać poddany zapytaniu.
  4. Po kliknięciu przycisku Eksploruj, kliknij jego analizę podgrupy Metylacja w menu Linki do analizy, aby uzyskać wyniki metylacji tego nowotworu.
    UWAGA: Tą metodą uzyskaliśmy wyniki metylacji dla 22 nowotworów w bazie danych UALCAN.

6. Baza danych Katalogu Mutacji Somatycznych w Komórkach Nowotworowych (COSMIC)

  1. Przejdź do strony internetowej Katalogu Mutacji Somatycznych w Komórkach Nowotworowych (COSMIC) interface.
    UWAGA: Dane dotyczące mutacji kodujących, niekodujących mutacji genomowych i genów fuzyjnych w ludzkim genomie są dostępne w bazie danych Katalogu Mutacji Somatycznych w Komórkach Nowotworowych (COSMIC) class20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/), która jest również używana do określania częstości występowania różnych mutacji TMEM200A w różnych nowotworach.
  2. Wprowadź identyfikator genu (TMEM200A) w polu wyszukiwania i kliknij przycisk SZUKAJ, aby przejść do nowego ekranu.
  3. W menu Geny znajdź i kliknij link, w którym pojawia się nazwa identyfikatora genu TMEM200A.
  4. Znajdź kolumnę grupowania Dystrybucja mutacji na nowej stronie, aby uzyskać status mutacji TMEM200A w guzie.

7. CBioPortal

  1. Przejdź do strony internetowej CBioPortal interface.
    UWAGA: Dane genomiczne dotyczące nowotworów można znaleźć, pobrać, przeanalizować i zwizualizować za pomocą bazy danych cBioPortal (www.cioportal.org). Mutacje somatyczne, zmiany liczby kopii DNA (CNA), ekspresja mRNA i mikroRNA (miRNA), metylacja DNA, obfitość białek i obfitość fosfoprotein to tylko niektóre z typów danych genomowych, które są integrowane przez cBioPortal21. Za pomocą cBioPortal można prowadzić szeroki zakres badań; Główny nacisk kładziony jest jednak na różne analizy związane z mutacjami i ich wizualizacją.
  2. Wybierz zestaw danych Pan-Cancer analysis of whole genomes (Analiza całego genomu) z podsekcji PanCancer Studies (Badania nad rakiem przeciwnowotworowym) w sekcji Select Studies for Visualization & Analysis (Wybrane badania do wizualizacji i analizy). Następnie kliknij przycisk Zapytanie według genu.
  3. Wprowadź identyfikator genu docelowego (TMEM200A) w polu zapytania Wprowadź geny. Kliknij przycisk Prześlij zapytanie.
  4. Kliknij przycisk Szczegóły typu raka u góry strony, aby uzyskać mutacje TMEM200A w różnych typach nowotworów.

8. Narzędzie Sangerbox 3.0

  1. Przejdź do interfejsu narzędzia Sangerbox 3.0.
    UWAGA: Korelacja ekspresji TMEM200A z komórkami naciekającymi układ odpornościowy, środkami immunosupresyjnymi, czynnikami immunostymulującymi i cząsteczkami MHC (główny kompleks zgodności tkankowej) we wszystkich nowotworach została przeanalizowana przez infiltrację immunologiczną CIBERSORT przy użyciu danych o nacieku immunologicznym pan-raka w narzędziu Sangerbox 3.0 tool22 (http://vip.sangerbox.com/).
  2. Na pasku narzędzi po lewej stronie wybierz i kliknij zakładkę Analiza immunokomórkowa (CIBERSORT) z menu Analiza Pan-Rakowa.
  3. Wprowadź identyfikator genu docelowego (TMEM200A) w polu zapytania Wprowadź geny. Kliknij przycisk Prześlij.

9. Baza danych TISIDB

  1. Przejdź do strony internetowej TISIDB interface.
    UWAGA: Baza danych TISIDB23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) została wykorzystana do zbadania korelacji ekspresji TMEM200A z komórkami naciekającymi immunologicznie, środkami immunosupresyjnymi, czynnikami immunostymulującymi i cząsteczkami MHC w różnych nowotworach.
  2. Wprowadź docelowy symbol genu (TMEM200A) w polu zapytania Wprowadź geny. Kliknij przycisk Prześlij.
  3. Kliknij sekcje Limfocyty, Immunomodulatory, Chemokiny i Podtypy u góry strony. Pobierz odpowiednie obrazy na dole strony.

10. Baza danych TIDE

  1. Przejdź do interfejsu strony internetowej TIDE.
    UWAGA: Baza danych TIDE (http://tide.dfci.harvard.edu/) została wykorzystana do oceny potencjału TMEM200A jako biomarkera do przewidywania odpowiedzi na terapię blokującą immunologiczne punkty kontrolne guza.
  2. Wprowadź adres e-mail na ekranie początkowym, aby zarejestrować konto i zalogować się.
  3. Znajdź podsekcję Ocena biomarkerów u góry strony i kliknij na nią.
  4. Wprowadź identyfikator genu docelowego (TMEM200A) w polu zapytania Wprowadź geny u dołu strony. Następnie kliknij przycisk Prześlij.
  5. Na stronie przeciągnij myszą, aby przesunąć stronę w dół i znaleźć wyniki analizy.

11. Baza danych CancerSEA

  1. Przejdź do strony internetowej CancerSEA interface.
    UWAGA: Korzystając z danych sekwencjonowania pojedynczych komórek, zbadano zależności między ekspresją TMEM200A a stanem funkcjonalnym różnych komórek nowotworowych. Dokonano tego przy użyciu bazy danych CancerSEA24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
  2. U góry strony znajdź i kliknij kartę Szukaj.
  3. Wprowadź identyfikator genu docelowego (TMEM200A) w polu zapytania Wprowadź geny. Kliknij przycisk Prześlij.

12. Narzędzie sieciowe TISCH (Tumor Immune Single-cell Center)

  1. Przejdź do interfejsu internetowego narzędzia sieciowego centrum jednokomórkowego układu odpornościowego na nowotwory (TISCH).
    UWAGA: Korelacja między poziomami ekspresji komórek TMEM200A a komórkami nowotworowymi została również pokazana za pomocą narzędzia sieciowego tumor immune single-cell center (TISCH) network25.
  2. Wprowadź identyfikator genu docelowego (TMEM200A) w polu zapytania Wprowadź geny. Kliknij przycisk Eksploruj.
  3. W menu Typ raka na tej stronie wybierz i kliknij zestaw danych Wszystkie nowotwory. Następnie przewiń stronę w dół i kliknij przycisk Szukaj.

13. GeneMANIA

  1. Przejdź do strony GeneMANIA interface.
    UWAGA: Korelacja między TMEM200A a jego funkcjonalnie istotnymi genami została przewidziana przy użyciu strategii integracji dla sieci wieloasocjacyjnej genów Website GeneMANIA (www.genemania.org)26 do konstruowania sieci interakcji gen-gen (GGI).
  2. W polu wyszukiwania w lewym górnym rogu strony wprowadź identyfikator genu (TMEM200A) i kliknij Narzędzia wyszukiwania.
    UWAGA: Narzędzie internetowe GeneMANIA zostało użyte do znalezienia 20 genów związanych z TMEM200A.

14. Funkcjonalna analiza wzbogacenia

  1. Zapisz identyfikatory symboli genów, które mają być analizowane w celu wzbogacenia w formacie pliku txt.
  2. Otwórz kod R (symbolidR) i skopiuj i wklej ścieżkę, w której znajduje się powyższy plik txt, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie R.
  3. Otwórz oprogramowanie języka R i uruchom zmodyfikowany kod języka R (symbolidR). Przekonwertuj identyfikatory symboli tych genów na entrezID za pomocą polecenia "org. Hs.eg.db". Pobierz plik id.txt.
  4. Otwórz kod R (GOR i KEGGR), a następnie skopiuj i wklej ścieżkę, w której znajduje się plik id.txt, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie R.
  5. Otwórz oprogramowanie R i uruchom zmodyfikowany kod R (GOR i KEGGR). Aby postępować zgodnie z tym protokołem, przeanalizuj te geny pod kątem wzbogacenia GO i KEGG za pomocą pakietów "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db" i "enrichplot" i wykreślić wyniki wzbogacania przy użyciu pakietu "gglot2".

15. Analiza różnic w aktywności genów

UWAGA: TMEM200A punktacja w każdej próbce raka została obliczona za pomocą ssGSEA (analiza wzbogacenia zestawu genów pojedynczej próby)27, a analiza różnicowa aktywności genu TMEM200A w tkankach nowotworowych i zdrowych została przeprowadzona dla różnych nowotworów.

  1. Na podstawie danych sekwencyjnych RNA 33 typów nowotworów pobranych w kroku 1.7 rozpakuj wszystkie pobrane pliki i umieść je w ujednoliconym folderze.
  2. Umieść plik merge.txt w powyższym folderze.
    UWAGA: Dane w pliku merge.txt z BioWolf (www.biowolf.cn) zawierają ekspresję genów dla wszystkich pacjentów we wszystkich nowotworach w bazie danych The Cancer Genome Atlas (TCGA).
  3. Otwórz kod R (ssGSEAR) i skopiuj i wklej ścieżkę, w której znajduje się powyższy folder, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie R.
  4. Weź wiersz, w którym geneName znajduje się w kodzie R (ssGSEAR) i wprowadź identyfikator genu (TMEM200A).
  5. Otwórz oprogramowanie R i uruchom zmodyfikowany kod R (ssGSEAR). Pobierz plik z oceną aktywności genów: scores.txt.
    UWAGA: Za pomocą algorytmu ssGSEA najpierw konstruujemy plik zestawu genów na podstawie współczynników korelacji między genami zgodnie z danymi dostarczonymi w pliku merge.txt i identyfikujemy geny o wyższej korelacji z genem docelowym (TMEM200A) z pliku. Następnie geny o wyższej korelacji są unifikowane jako aktywne geny TMEM200A, a na końcu otrzymujemy punktację aktywnych genów w każdej próbce.
  6. Otwórz kod języka R (scoreDiffR) i skopiuj i wklej ścieżkę, w której znajduje się plik scores.txt, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie języka R.
  7. Otwórz oprogramowanie R, uruchom zmodyfikowany kod R (scoreDiffR) i narysuj obraz za pomocą pakietów "plyr", "reshape2" i "ggpubr".

16. Korelacja kliniczno-patologiczna i analiza prognoz przeżycia

  1. Przejdź do interfejsu strony internetowej UCSC Xena.
  2. Kliknij kartę Launch Xena (Uruchom Xenę).
  3. Kliknij zakładkę ZBIORY DANYCH u góry ekranu.
  4. Najedź kursorem na stronę i przewiń w dół, aby znaleźć zakładkę TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  5. Spośród 129 kohort i 1 571 zestawów danych na tej stronie kliknij kartę TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  6. Z menu fenotypu wybierz i kliknij zakładkę Wyselekcjonowane dane kliniczne.
  7. W menu pobierania kliknij odpowiedni link.
    UWAGA: Pobierz dane kliniczne dla 33 nowotworów z bazy danych TCGA pod powyższym linkiem.
  8. Rozpakuj pobrany plik z danymi klinicznymi i otwórz rozpakowany plik w formacie pliku xls.
  9. Uporządkuj i zachowaj potrzebne dane kliniczne (stadium, wiek, stadium patologiczne i status pacjenta) w pliku, usuń pozostałe niepotrzebne dane kliniczne i zapisz cały plik jako plik w formacie txt po zmianie jego nazwy na kliniczny.
  10. Na podstawie singleGeneExp.txt uzyskanych w kroku 1.9 umieść ten plik w tym samym folderze, co zorganizowany plik clinical.txt.
  11. Rozpakuj pobrane dane kliniczne i umieść pliki singleGeneExp.txt i clinical.txt w tym samym folderze, co rozpakowane pliki kliniczne.
  12. Otwórz kod R (clinicalDiffR) i skopiuj i wklej ścieżkę, w której znajduje się powyższy folder, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie R.
  13. Otwórz oprogramowanie R, uruchom zmodyfikowany kod R (clinicalDiffR) i narysuj obrazek za pomocą pakietu "ggpubr".
  14. Przejdź do interfejsu strony internetowej UCSC Xena.
  15. Kliknij kartę Launch Xena (Uruchom Xenę).
  16. Kliknij zakładkę ZBIORY DANYCH u góry ekranu.
  17. Spośród 129 kohort i 1,571 zestawów danych na tej stronie kliknij zakładkę, aby wyświetlić łącznie 33 nowotwory, takie jak ostra białaczka szpikowa GDC TCGA (LAML), GDC TCGA rak kory nadnerczy (ACC), RAK DRÓG ŻÓŁCIOWYCH GDC TCGA (CHOL) i inne.
  18. Z menu fenotypu wybierz i kliknij zakładkę danych dotyczących przeżycia.
  19. W menu pobierania kliknij odpowiedni link.
  20. Rozpakuj archiwum zip z danymi dotyczącymi przeżycia dla 33 różnych typów raka w jednym pliku w folderze na pulpicie komputera.
  21. Umieść rozpakowane dane dotyczące przetrwania w tym samym folderze, co plik singleGeneExp.txt uzyskany w kroku 1.9.
  22. Otwórz kod R (preOSR) i skopiuj i wklej ścieżkę, w której znajduje się powyższy folder, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie R.
  23. Otwórz oprogramowanie języka R i uruchom zmodyfikowany kod języka R (preOSR). Oblicz za pomocą pakietu "limma", aby uzyskać plik danych o przeżyciu TMEM200A w pan-raku: expTime.txt.
  24. Otwórz kod języka R (OSR), a następnie skopiuj i wklej ścieżkę, w której znajduje się plik expTime.txt, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie języka R.
  25. Otwórz oprogramowanie języka R i uruchom zmodyfikowany kod języka R (OSR). Wykonaj analizę KM przy użyciu pakietów "przeżycia" i "survminer" na podstawie danych w pliku expTime.txt i wykreśl krzywe przeżycia dla TMEM200A w obrębie nowotworu.

17. Jednowymiarowe i wielowymiarowe analizy regresji Coxa z budową działki leśnej

  1. Otwórz kod R (COXR) i skopiuj i wklej ścieżkę, w której otrzymaliśmy plik expTime.txt od 16.23 znajduje się do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie R.
  2. Otwórz oprogramowanie R i uruchom zmodyfikowany kod R (COXR). Na podstawie danych w pliku expTime.txt wykonaj jednowymiarowe analizy regresji COX przy użyciu pakietów "przeżycie", "survminer" i "forestplot", aby wykreślić jednowymiarowy wykres leśny TMEM200A w różnych nowotworach.
  3. Umieść plik expTime.txt z kroku 16.23 i clinical.txt z kroku 16.10 w tym samym folderze.
  4. Otwórz kod R (multicoxR) i skopiuj i wklej ścieżkę, w której znajduje się folder zawierający plik expTime.txt z kroku 16.23 i plik clinical.txt z kroku 16.10 do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie R.
  5. Otwórz oprogramowanie języka R i uruchom zmodyfikowany kod języka R (multicoxR). Wykonaj wielowymiarową analizę regresji COX przy użyciu pakietów "przeżycie" i "survminer", aby wykreślić wielowymiarowy wykres lasu TMEM200A w różnych nowotworach na podstawie danych w plikach expTime.txt i clinical.txt.

18. Model prognostyczny raka żołądka oparty na TMEM200A ekspresji i cechach klinicznych

  1. Umieść plik clinical.txt z kroku 16.10 i plik expTime.txt z kroku 16.23 w tym samym folderze.
  2. Otwórz kod R (NomoR) i skopiuj i wklej ścieżkę, w której znajduje się powyższy plik txt, do wiersza, w którym znajduje się setwd w kodzie R.
  3. Otwórz oprogramowanie R i uruchom zmodyfikowany kod R (NomoR). Użyj pakietów oprogramowania "przeżycie", "regplot" i "rms", aby uzyskać dane dotyczące ekspresji TMEM200A w GC i dane kliniczne, aby skonstruować model prognostyczny do przewidywania przeżycia pacjenta.

19. Hodowla komórkowa i transfekcja siRNA TMEM200A

UWAGA: Ludzkie komórki STAD HGC-27, komórki SGC-7901 i ludzkie komórki GES-1 nabłonka błony śluzowej żołądka zostały uzyskane komercyjnie (zobacz Tabelę Materiałów), ożywione, zaszczepione w Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complete medium (zawierające 10% noworodkowej płodowej surowicy bydlęcej i 1% mieszaniny penicyliny) i hodowane w temperaturze 37 °C w 5% CO2 inkubator do hodowli komórkowych. Pożywkę hodowlaną zmieniano co 2-3 dni. Komórki w dobrych warunkach wzrostu inokulowano na płytkach sześciodołkowych zgodnie z (2-3) × 105 komórek na studzienkę.

  1. Najpierw weź trzy probówki do mikrowirówek i dodaj 8 μl odczynnika do transfekcji (patrzT able materiałów) i 200 μl podłoża podstawowego do każdej probówki. Następnie dodaj odpowiednio 4 μg SiRNA1, SiRNA2 i SiRNA3 do każdej probówki.
    UWAGA: Do TMEM200A knockdown, siRNA zostało zaprojektowane i zakupione (patrz Tabela Materiałów).
  2. Dokładnie wymieszaj mieszaninę w trzech probówkach mikrowirówkowych i dodaj do każdej z trzech studzienek płytki 6-dołkowej. Delikatnie potrząśnij płytką 6-dołkową, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę. Oznacz trzy studzienki, w których dodano mieszaninę, jako SiRNA-1, SiRNA-2 i SiRNA-3.
  3. Gdy komórki są inkubowane przez 4-6 godzin, zastąp połowę pożywki w trzech poddołkach na płytce 6-dołkowej.
    UWAGA: Wymieniając połowę kompletnej pożywki, należy odessać połowę oryginalnej kompletnej pożywki i uzupełnić połową świeżej pożywki kompletnej.
  4. Dwadzieścia cztery do 48 godzin później użyj TMEM200A komórek transfekowanych siRNA jako grupy eksperymentalnej i komórek nietransfekowanych jako negatywnej grupy kontrolnej. Przeprowadzić ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR, patrz punkt 20), aby ocenić wpływ transfekcji na komórki.

20. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym

  1. Odrzucić pożywkę do hodowli komórkowych w każdej podgrupie i delikatnie przemyć komórki dwukrotnie 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. Wyizoluj całkowite RNA za pomocą zestawu do izolacji RNA (patrz tabela materiałów).
  3. Oszacuj stężenie RNA i zsyntetyzuj cDNA z 1 μg RNA za pomocą zestawu do syntezy cDNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Wykonaj ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) na 10-krotnych rozcieńczeniach cDNA w 10 μl mieszaniny reakcyjnej, w tym specyficznych dla człowieka starterów do przodu i do tyłu dla GAPDH (do standaryzacji), TMEM200A (patrz Tabela materiałów) i qPCR Master Mix, przy użyciu systemu testów PCR w czasie rzeczywistym.
    UWAGA: Wykonaj każdy eksperyment w trzech egzemplarzach.
  5. Stosować następujące warunki reakcji qPCR: inicjalizacja, 95 °C przez 3 minuty, denaturacja, 95 °C przez 10 s, wyżarzanie, 60 °C przez 30 s; i przedłużanie, 80 °C przez 10 s; powtórzyć denaturację, wyżarzanie i wydłużenie 40x. Określić względną ekspresję każdego genu za pomocą techniki 2-ΔΔCt28.
  6. Powtórz doświadczenia co najmniej trzy razy, aby uzyskać biologiczne trialikaty.

21. Wykrywanie Western blot odpowiedniej ekspresji białka

  1. Odrzucić pożywkę do hodowli komórkowych w każdej podgrupie i delikatnie przemyć komórki 2 x 1 ml PBS.
  2. Schłodzić 6-dołkowe płytki zawierające komórki na lodzie i dodać 150 μl wstępnie schłodzonego buforu do lizy do testu radioimmunologicznego strącania (RIPA) (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% deoksycholanu sodu, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 i świeżo dodany koktajl inhibitorów proteazy). Pozwól lizie postępować na lodzie przez 10 minut.
  3. Za pomocą plastikowego skrobaka do komórek usuń przylegające komórki z naczynia i delikatnie przenieś roztwór komórek do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej.
  4. Odwirować lizat komórkowy przez 10 minut w temperaturze 1,5 × 104 g w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  5. Użyj zestawu do oznaczania białka BCA, aby określić zawartość białka zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Załaduj 30 g białka z każdej próbki na 10% żel do elektroforezy w żelu z dodecylosiarczanu sodu i dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i uruchom pod napięciem 80 V przez 0,5 godziny, a następnie 1,5 godziny przy 120 V.
  7. Przenieś białka z żelu na membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) o grubości 45 μm pod napięciem 300 mA przez 1-1,5 godziny.
  8. Po umieszczeniu membrany PVDF na wytrząsarce i wytrząsaniu jej przez 3 x 5 minut, dodaj sól fizjologiczną buforowaną Tris z Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl i 0,1% Tween 20) do odpowiedniego pojemnika stroną z białkiem (stroną żelową) skierowaną do góry.
  9. Umieścić membranę w buforze blokującym (patrz tabela materiałów) i inkubować ją przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej.
  10. Myć membranę TBST przez 3 x 10 min.
  11. Inkubować błonę z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko fosfo-AKT (p-AKT; 1:1,000), całkowitemu AKT 1:1,000, E-kadherynie (E-ca; 1:1,000), N-kadherynie (N-ca; 1:1,000), wimentynie 1:1,000, ślimakowi 1:1,000, TMEM200A 1:1,000, dehydrogenazie 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego (GAPDH; 1:1,000), przez noc w temperaturze 4 °C.
  12. Myć błonę przez 3 x 10 minut i inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym królika lub myszy (1:5 000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  13. Inkubować membranę PVDF z substratem ECL przez 30 s i wykryć sygnał za pomocą systemu obrazowania.

22. Test CCK-8

  1. Wysiewaj ludzkie komórki STAD HGC-27 w dobrych warunkach wzrostu na 96-dołkowych płytkach.
  2. Gdy gęstość komórek osiągnie 60-70%, transfekuj komórki TMEM200A siRNA (jak w kroku 19.3).
  3. Zasiać transfekowane komórki na 96-dołkowe płytki o gęstości komórek 5 × 10 3 / dołek (policzyć żywe komórki za pomocą licznika komórek), podzielić na grupy NC i TMEM200A siRNA (z trzema dołamkami replikowanymi w każdej grupie) i inkubować w temperaturze 37 °C.
  4. Dodać odczynnik CCK-8 po 0, 24, 48, 72 i 96 godzinach i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Zmierzyć absorbancję (450 nm) za pomocą wielofunkcyjnego etykieciarza enzymatycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ekspresja TMEM200A w różnych nowotworach
Jak pokazano na Rysunku 1, w pierwszej kolejności przeanalizowano różnice w poziomach ekspresji TMEM200A w różnych nowotworach przy użyciu różnych baz danych. Na podstawie samych danych TCGA stwierdzono, że ekspresja TMEM200A była podwyższona w cholangiocarcinoma (CHOL), rakach płaskonabłonkowych głowy i szyi (HNSC), jasnokomórkowym raku nerki (KIRC), brodawkowatym raku nerki (KIRP), ra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

TMEM200A należy do rodziny TMEM, która jest niezbędna do namnażania się komórek rakowych38. Zmiennej ekspresji TMEM200A w różnych nowotworach złośliwych poświęcono mniej uwagi i brakuje dokładnych badań nad rakiem. Jednak dowody nadal się gromadzą, pokazując, że rodzina białek transbłonowych TMEM może być ważna w utrzymywaniu komórek rakowych w stanie złośliwym poprzez interakcje z kilkoma białkami, na przykład aktywacja kanałów Cl aktywowanych TMEM16A Ca2+ ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82160550).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało anty-AKTProteintech Group, Inc60203-2-Ig
Przeciwciało anty-E-kadherynyProteintech Group, Inc20874-1-AP
Przeciwciało anty-gliceraldehydowe dehydrogenazy 3-fosforanowej (GAPDH)Proteintech Group, Inc10494-1-AP
Przeciwciało anty-N-kadherynyProteintech Group, Inc22018-1-AP
Przeciwciało anty-P-AKTProteintech Group, Inc66444-1-Ig
Przeciwciało przeciw ślimakomProteintech Group, Inc13099-1-AP
Przeciwciało anty-wimentynoweProteintech Group, Inc10366-1-AP
Zestaw przygotowawczy AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., LtdUEL-UE-MN-MS-RNA-50G
Zestaw do oznaczania białek BCAOdczynnik Epizyme BiotechZJ101L
CCK-8MedChemExpressHY-K0301-500T
Płodowa surowica bydlęca (FBS)CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INCFBSSR-01021
GAPDH primerSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Starter do przodu (5'-3'): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Starter odwrotny (5'-3'): GTGTCCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus odczynnik do transfekcjiABklonalnyRM09014P
Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)Proteintech Group, IncSA00001-1
Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)Proteintech Group, IncSA00001-2
Ludzki nabłonek błony śluzowej żołądka komórki GES-1Guangzhou Cellcook Biotech Co., Ltd.
Ludzkie komórki STAD HGC-27Procell Life Science& Technology Co., Ltd
Ludzkie komórki STAD SGC-7901Procell Life Science& Technology Co., Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (Brak ROX)Mona (Suzhou) Biotechnology Co., LtdMQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix z dsDNase   Mona (Suzhou) Biotechnology Co., LtdMR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescencyjny ZestawEpizyme BiotechSQ201
PAGE Żel do szybkiego przygotowania Epizyme BiotechPG111
Penicylina-streptomycyna (Pen-Strep)Beijing Solarbio Science & Technology Co., LtdP1400-100
Membrana z polifluorku winylidenu (PVDF)Merck KGaAIPVH00010-1
Bezbiałkowy szybki bufor blokującyEpizyme BiotechPS108P
Roztwór do lizy RIPABeijing Solarbio Science & Technology Co., LtdR0010
RPMI 1640 kompletne mediumThermo Fisher ScientificC11875500BT
Mleko odtłuszczoneCampina:
TBSTBeijing Solarbio Science & Technology Co., LtdT1082
Bufor ładujący białkoEpizyme BiotechLT101S
TMEM200A plazmid knockdownMiaoLing Plasmid
TMEM200A primerSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Starter do przodu (5'-3'): AAGGCGTGTGGTGGGGGGG; Starter odwrotny (5'-3'): GATTTTGGTCTCTTTCACGGTT
em>TMEM200A SiRNA1MiaoLing PlasmidForward primer (5'-3'): ACAACTGATGATAAGACCAGAGAGAG; Starter odwrotny (5'-3'): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2MiaoLing PlasmidForward primer (5'-3'): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Starter odwrotny (5'-3'): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3MiaoLing PlasmidForward starter (5'-3'): ACAACCACAACATCTGCCCG; Odwrócony starter (5'-3'): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Białko transbłonowe 200APrzeciwciało Proteintech Group, Inc48081-1
Equipment
CO2 inkubator do hodowli komórkowychHaier GroupPYXE-80IR
Przyrząd do elektroforezyBio-RAD
Fluorescencyjny ilościowy instrument do PCRBio-RAD
Wielofunkcyjna etykieciarka enzymatycznaBerthold
roztwór buforowy Elk <

Bibliografia

  1. Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends--an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
  2. Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors - Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
  3. Harbeck, N., Gnant, M. Breast cancer. Lancet. 389 (10074), 1134-1150 (2017).
  4. Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
  5. Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
  6. Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
  7. Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345(2018).
  8. Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
  9. Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006(2017).
  10. Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
  11. Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086(2021).
  12. Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118(2022).
  13. Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
  14. Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
  15. Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
  16. Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
  17. Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321(2017).
  18. Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71(2019).
  19. Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
  20. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
  21. Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1(2013).
  22. Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36(2022).
  23. Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
  24. Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
  25. Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
  26. Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
  27. Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865(2022).
  28. Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
  29. Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  30. Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K. Genetics and epigenetics in asthma. Int J Mol Sci. 22 (5), 2412(2021).
  31. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Cancer metabolism: looking forward. Nat Rev Cancer. 21 (10), 669-680 (2021).
  32. Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543(2020).
  33. Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
  34. Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
  35. Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
  36. Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5(2007).
  37. Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893(2023).
  38. Stemmler, M. P. Cadherins in development and cancer. Mol Biosyst. 4 (8), 835-850 (2008).
  39. Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
  40. De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
  41. Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Biomarker TMEM200Aanaliza panrakowarak żołądkainfiltracja immunologicznaprzejście nabłonkowo-mezenchymalneszlak PI3K AKTilościowy RTPCRwestern blottingtest proliferacji komórek
Analiza multiomiczna TMEM200A jako biomarkera raka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.