Wstępne dochodzenie potwierdza, że krwotok podpajęczynówkowy (SAH) powoduje zanik perycytów mózgu. Ocena kurczliwości perycytów po SAH wymaga rozróżnienia między żywotnymi i nieżywotnymi perycytami mózgu. W związku z tym opracowano procedurę oznaczania żywotnych i nieżywotnych perycytów mózgu jednocześnie w wycinkach mózgu, ułatwiając obserwację przy użyciu mikroskopu konfokalnego o wysokiej rozdzielczości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie ważnych i nieistotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu po krwotoku podpajęczynówkowym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Perycyty są kluczowymi komórkami ściennymi znajdującymi się w mikrokrążeniu mózgowym, odgrywającymi kluczową rolę w aktywnym modulowaniu przepływu krwi w mózgu poprzez regulację kurczliwości. Konwencjonalnie ich kurczliwość mierzy się, obserwując przesunięcia morfologiczne i zmiany średnicy naczyń włosowatych w określonych okolicznościach. Jednak po utrwaleniu tkanki, ocena żywotności i wynikająca z tego kurczliwość perycytów w perycytach zobrazowanych mózgów staje się zagrożona. Podobnie, genetyczne znakowanie perycytów mózgu nie jest w stanie rozróżnić perycytów żywotnych i nieżywotnych, szczególnie w stanach neurologicznych, takich jak krwotok podpajęczynówkowy (SAH), gdzie nasze wstępne badanie potwierdza śmierć perycytów mózgu. W celu przezwyciężenia tych ograniczeń opracowano niezawodny protokół, umożliwiający jednoczesne znakowanie fluorescencyjne zarówno funkcjonalnych, jak i niefunkcjonalnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu. Ta metoda znakowania umożliwia wizualizację mikroskopu konfokalnego o wysokiej rozdzielczości, jednocześnie oznaczając mikrokrążenie wycinka mózgu. Ten innowacyjny protokół umożliwia ocenę kurczliwości okołocytów mózgu, jej wpływu na średnicę naczyń włosowatych i strukturę perycytów. Badanie kurczliwości perycytów mózgu w kontekście SAH pozwala na dogłębne zrozumienie jej wpływu na mikrokrążenie mózgowe.
Wprowadzenie
Perycyty mózgu, wyróżniające się smukłymi wypukłościami i wystającymi ciałami komórek, otaczają mikrokrążenie1,2. Podczas gdy zwiększenie przepływu krwi w mózgu jest głównie napędzane przez rozszerzenie naczyń włosowatych, mniejsze tętnice wykazują wolniejsze tempo rozszerzania 3. Kurczliwość perycytów wywiera wpływ na średnicę naczyń włosowatych i morfologię perycytów, wpływając na dynamikę naczyń krwionośnych4. Skurcz perycytów mózgu prowadzi do zwężenia naczyń włosowatych, a w scenariuszach patologicznych nadmierny skurcz może utrudniać przepływ erytrocytów5. Różne czynniki, w tym noradrenalina uwalniana z miejsca sinawy, mogą indukować skurcz perycytów mózgu w naczyniach włosowatych6. Pełniąc rolę regulacyjną w przepływie krwi w mózgu, perycyty wykazują syntezę 20-HOTE, służąc jako czujnik tlenu podczas hiperoksji7. Wywołany stresem oksydacyjno-azotatywnym skurcz perycytów mózgu szkodliwie wpływa na naczynia włosowate5. Pomimo badań zarówno in vivo, jak i ex vivo nad skurczem perycytów mózgu8, nadal istnieje ograniczona wiedza na temat obrazowania żywotnych i nieżywotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu.
Najważniejsze, obrazowanie perycytów mózgu po utrwaleniu tkanek pogarsza ich żywotność i późniejszą ocenę kurczliwości. Co więcej, w scenariuszach takich jak zaburzenia neurologiczne (np. krwotok podpajęczynówkowy - SAH), transgeniczne znakowanie perycytów mózgu nie rozróżnia żywotnych i nieżywotnych perycytów, co potwierdza nasze wstępne badanie śmierci perycytów mózgu wywołanej SAH9.
Aby sprostać tym wyzwaniom, zastosowaliśmy TO-PRO-3 do oznaczania żywych perycytów, podczas gdy martwe były barwione jodkiem propidyny (PI). Użyliśmy technologii obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości, aby zobrazować żywotne i nieżywotne perycyty mózgu w wycinkach mózgu, zachowując jednocześnie aktywność plasterków podczas obrazowania. Niniejszy artykuł ma na celu przedstawienie powtarzalnej metody obrazowania żywotnych i nieżywotnych perycytów mózgu w wycinkach mózgu, służąc jako cenne narzędzie do badania wpływu perycytów mózgu na mikrokrążenie mózgowe po SAH.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Kunming (kmmu20220945). Do badań wykorzystano szczury Sprague-Dawley (SD) obojga płci o wadze 300-350 g.
1. Indukowanie modelu SAH
- Znieczulij szczury za pomocą 2% izofluranu i 100% tlenu. Utrzymuj znieczulenie, podając ciągłe znieczulenie wziewne izofluranem (1%-3%). Zabezpiecz głowę szczura za pomocą aparatu stereotaktycznego (patrz Tabela Materiałów).
- Utwórz model SAH, wykonując poniższe czynności.
- Wprowadzić igłę do mikroiniekcji do spłuczki nadsiodłowej. Następnie wstrzyknąć autologiczną krew z tętnicy ogonowej szczura (bez antykoagulantu) do spłuczki nadsiodłowej za pomocą pompy strzykawkowej (patrz Tabela materiałów).
- Wszczepić igłę do mikroiniekcji do prawej bocznej komory mózgu, korzystając z podanych współrzędnych: bregma, −0,8 mm; boczna, 1,4 mm; głębokość, 4 mm9. W przypadku grup SAH wstrzyknij 0,2 ml krwi z tętnicy ogonowej szczura. W przypadku grup pozorowanych podawaj tę samą objętość izotonicznego soli fizjologicznej (Rysunek 1A).
2. Przygotowanie i stabilizacja wycinka mózgu
- Głęboko znieczulić szczury za pomocą 2% inhalacji izofluranu. Po ścięciu głowy należy pobrać całe mózgi i zanurzyć je w lodowatym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF).
UWAGA: Stosować świeżo przygotowane roztwory ACSF o następującym składzie: 134 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1,1 mM NaH2PO4, 1,5 mMMgSO4, 2,5 mM CaCl2 i 10,11 mM D-Glucose (patrz tabela materiałów). Utrzymuj pH między 7,3 a 7,4. - Użyj wibratomu (patrz Tabela materiałów), aby przygotować ostre plastry mózgu o grubości 200 μm od szczurów SD w lodowatym ACSF, który jest napowietrzany 5% CO2 i 95% O2 (Rysunek 2).
- Umieść ostre plastry mózgu o grubości 200 μm w komorze do przechowywania na nylonowej siatce zanurzonej w ACSF. Zrównoważyć roztwór ACSF z 95%O2 i 5% CO2 , utrzymując zakres temperatur 35-37 °C. Pozwól plasterkom mózgu ustabilizować się przez 2 godziny, dając im czas na dostosowanie się (Rysunek 3).
3. Oznaczanie perycytów w ostrych wycinkach mózgu za pomocą TO-PRO-3
UWAGA: Perycyty z ostrych wycinków mózgu zostały fluorescencyjnie oznaczone za pomocą znacznika TO-PRO-310.
- Dodać barwnik fluorescencyjny TO-PRO-3 do ACSF, uzyskując końcowe stężenie 1 μM. Inkubować ostre plastry mózgu w temperaturze pokojowej w ciemnym otoczeniu z ACSF zawierającym TO-PRO-3 przez 20 min.
UWAGA: Pamiętaj, aby nosić rękawice lateksowe podczas obchodzenia się z TO-PRO-3 w celu ochrony. - Przenieść sitko z siatki nylonowej, przenoszące plastry mózgu, z komory załadowczej do 6-dołkowej komory płukania płytek (patrz tabela materiałów). Pozostaw plastry mózgu w komorze płukania na 10 minut (Rysunek 4D).
UWAGA: Ten etap płukania kończy proces barwienia, zmniejsza etykietowanie tła i zapobiega niespecyficznemu barwieniu. - Płukać preparaty łącznie przez 15 minut roztworem ACSF, który jest zrównoważony mieszaniną 5% CO2 i 95% O2 . Ten etap płukania zatrzymuje wchłanianie barwnika i minimalizuje etykietowanie tła (Rysunek 4C).
4. Barwienie nieistotnych perycytów mikrokrążenia mózgowego w ostrych wycinkach mózgu
- Inkubować wycinki mózgu wstępnie załadowane TO-PRO-3 w temperaturze 37 °C z izolektyną B4 sprzężoną z Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/ml, patrz tabela materiałów) przez 30 minut w ciemnym otoczeniu. Po inkubacji płucz plastry mózgu przez 15 minut w ACSF (Rysunek 4E).
- Inkubować wycinki mózgu w ACSF zagazowane 5% CO2 i 95%O2 jak zwykle. Dodać jodek propydyny (PI) o stężeniu 37 μM do obu roztworów w temperaturze 37 °C. To oznaczy nieistotne perycyty mózgu. Inkubuj preparaty w tym roztworze ACSF przez 60 minut w ciemności (Rysunek 4F).
- Następnie płucz preparaty przez 15 minut roztworami ACSF, aby zatrzymać wchłanianie barwnika i zminimalizować etykietowanie tła.
5. Obrazowanie ważnych i nieistotnych perycytów mózgu w ostrych wycinkach mózgu
- Delikatnie przenieś wycinki mózgu do naczyń konfokalnych ze szklanym dnem (patrz Tabela materiałów) za pomocą plastikowych pipet Pasteura. Napełnij naczynia roztworem ACSF uprzednio zrównoważonym z 5% CO2 i 95%O2 . Użyj żelaznej siatki, aby zabezpieczyć plastry mózgu szczura na miejscu.
- Przenieś naczynia konfokalne ze szklanym dnem na stolik mikroskopu konfokalnego. Umieść ostry wycinek mózgu na dnie naczynia i wykonaj go > pomocą roztworu ACSF zrównoważonego mieszaniną 95%O2 i 5% CO2 podczas obrazowania w mikroskopii konfokalnej (Rysunek 5A i Rysunek 5Ab').
- Wizualizuj komórki ściany mikrokrążenia kory mózgowej za pomocą obiektywu 40x. Przechwytuj stosy obrazów za pomocą kompatybilnego oprogramowania (patrz Spis materiałów). Użyj odpowiednich filtrów dla IB4 (wzbudzenie/emisja 460 nm/520 nm), PI (wzbudzenie/emisja 545 nm/595 nm) i TO-PRO-3 (wzbudzenie/emisja 606 nm/666 nm) (Rysunek 5D).
UWAGA: Rób zdjęcia z następującymi szczegółami: 40× obiektyw DIC N1, 3 × 12 bitów: 512 × 512 pikseli (0,22 × 0,22 mm), kalibracja: 0,42 μm/px. - Zidentyfikuj mikrokrążenie mózgowe i perycyty na podstawie ich sieci i morfologii. Zlokalizuj określony region zawierający sieć mikrokrążenia mózgowego na każdym wycinku mózgu i uchwyć obrazy.
- Uważnie zanotuj lokalizację obrazowania, aby zapewnić spójność w kolejnych ujęciach (Rysunek 5B,C). Do dalszej obróbki i analizy należy użyć oprogramowania do analizy obrazu (ImageJ) i oprogramowania do edycji zdjęć (patrz Spis materiałów).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W normalnych warunkach fizjologicznych perycyty mózgowe zazwyczaj nie ulegają śmierci komórkowej. Rysunek 6 ilustruje to zjawisko, gdzie kolor żółty wskazuje obecność żywych perycytów mózgowych; perycyty mózgowe nie wykazują barwienia PI, co świadczy o ich żywotności. Aby sprawdzić, czy perycyty pozostają przytwierdzone do mikrokrążenia po śmierci komórkowej, zastosowano metody w szczurzym modelu SAH, a następnie przeprowadzono obrazowanie.
Opracowano metody obraz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowano techniki obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji ważnych perycytów mózgu, nieistotnych perycytów mózgu oraz mikrokrążenia w wycinkach mózgu. W ostrych wycinkach mózgu szczura proces ten obejmuje wstępne znakowanie perycytów za pomocą TO-PRO-311, a następnie komórek śródbłonka mikronaczyniowego za pomocą IB412; następnie identyfikacja martwych perycytów odbywa się za pomocą PI. Protokół ten jest prosty, powtarzalny i ma duże zastosowanie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Badanie było wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81960226,81760223); Fundacji Nauk Przyrodniczych Prowincji Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Płytka 6-dołkowa | ABC biochemia | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Folia | aluminiowa MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Oprogramowanie do obrazowania konfokalnego | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | |
| RT Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Zbiornik gazu (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | |
| RT Naczynia konfokalne ze szklanym dnem | Beyotime | FCFC020-10szt | RT |
| Glukoza | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Klej | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Maszyna do lodu | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Oprogramowanie do analizy obrazu | National Institutes of Health | Image J | |
| RT System znieczulenia wziewnego | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Izolektyna B 4- FITC | SIGMA | L2895– 2MG | Przechowuj porcje pod adresem – 20 &stopni; C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447– 40– 7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647– 14– 5 | RT |
| NaH2PO4· H2O | Sigma-Aldrich | 10049– 21– 5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pipeta Pasteura | NEST Biotechnology | 318314 | |
| RT Pompa perystaltyczna | Scientific Industries Inc | Model 203 | |
| RT Propidium (jodek) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Przechowuj porcje w – 20 &stopni; C |
| Aparat stereotaktyczny | SCIENCE | QA | RT |
| Pompa strzykawkowa | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Termostatyczna łaźnia wodna | OLABO | HH-2 | RT |
| Mikrotom wibracyjny | Leica | VT1200 | RT |
Bibliografia
- Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. Brain microvascular pericytes in health and disease. Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).
- Dore-Duffy, P., Cleary, K. Morphology and properties of pericytes. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).
- Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery. Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).
- Korte, N., et al. Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via α2 adrenergic receptors. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).
- Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Gong, Y., et al. Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats. Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).
- Mai-Morente, S. P., et al. Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3. Bio-protocol. 11 (22), e4222(2021).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Zhao, H., et al. Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).
- Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit. Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).
- Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain. Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
