Artykuł metodologiczny

Kriokonserwacja ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z komórek macierzystych w optymalnym stadium

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65888

⸱

3 listopada 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2National Clinical Research Center for Eye Diseases, 3Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, 4Shanghai Key Clinical Specialty, 5Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, 6Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, 7Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, 8Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie dostarcza szczegółowego protokołu do efektywnej kriokonserwacji komórek nabłonkowych barwnika siatkówki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych.

Streszczenie

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) są doskonałym źródłem komórek do terapii zastępczej u osób z chorobami zwyrodnieniowymi siatkówki; jednak badania nad stabilnym i bezpiecznym bankowaniem tych komórek terapeutycznych są rzadkie. Bardzo zmienna żywotność komórek i funkcjonalna regeneracja komórek RPE po kriokonserwacji to najczęściej spotykane problemy. W niniejszym protokole naszym celem było osiągnięcie najlepszego wskaźnika regeneracji komórek po rozmrożeniu poprzez wybór optymalnej fazy komórkowej do zamrożenia w oparciu o pierwotne warunki eksperymentalne. Komórki zamrożono w fazie wykładniczej określonej za pomocą testu znakowania 5-etynylo-2′-deoksyurydyny, co poprawiło żywotność komórek i szybkość regeneracji po rozmrożeniu. Stabilne i funkcjonalne komórki uzyskano wkrótce po rozmrożeniu, niezależnie od długiego procesu różnicowania. Opisane tutaj metody pozwalają na proste, wydajne i niedrogie przechowywanie i rozmrażanie komórek RPE pochodzących z hESC. Chociaż protokół ten koncentruje się na komórkach RPE, ta strategia zamrażania może być stosowana do wielu innych typów zróżnicowanych komórek.

Wprowadzenie

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) to pigmentowana monowarstwa komórek niezbędna do utrzymania prawidłowej funkcji siatkówki1. Dysfunkcja i śmierć RPE są ściśle związane z wieloma chorobami zwyrodnieniowymi siatkówki, w tym zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem, barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki i chorobą Stargardta2,3. Terapia zastępcza RPE jest jednym z najbardziej obiecujących schematów leczenia tych chorób4,5,6,7. Stabilne zaopatrzenie w komórki RPE dawcy ma zasadnicze znaczenie dla terapii komórkowej. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) pochodzące z komórek macierzystych są idealnym źródłem komórek do terapii komórkowej, ponieważ naśladują funkcję pierwotnych komórek RPE i mogą wytwarzać teoretycznie nieograniczoną podaż8. Proces różnicowania jest jednak pracochłonny, a okres trwałości uzyskanych komórek RPE jest stosunkowo krótki ze względu na późniejsze przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT). Dlatego kriokonserwacja komórek RPE pochodzących z hESC jest niezbędnym krokiem wymaganym do długoterminowego przechowywania i dystrybucji na żądanie9.

Uszkodzenia komórkowe wywołane krioprezerwacją mogą nieumyślnie zagrozić skuteczności terapeutycznej10,11. Dlatego ostatnie badania nad krioprezerwacją sugerują, że optymalne warunki przechowywania kriogenicznego powinny być określone podczas projektowania terapii komórkowych12. Skuteczna kriokonserwacja gwarantuje wydajną regenerację komórek, wysoką żywotność i przywrócenie funkcji komórek po cyklu zamrażania i rozmrażania. Jednak wcześniejsze badania nad krioprezerwacją przylegających monowarstw komórek ssaków wykazały bardzo zmienne (35%-95%) wskaźniki przeżywalności po rozmrożeniu13,14,15. Wiele czynników znacząco wpływa na wyniki kriokonserwacji, szczególnie w fazie zamrażania16,17. Ostatnie badania wykazały, że komórki RPE zamrożone w różnych punktach czasowych wykazywały różną regenerację po rozmrożeniu17. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą brakuje badań dotyczących określenia optymalnego okna czasowego zamrażania dla komórek macierzystych RPE. W różnych badaniach komórki zostały zamrożone na różnych etapach: niektóre komórki zostały zamrożone wkrótce po pasażowaniu lub przed konfluencją lub pigmentacją8,15,18, podczas gdy inne zostały zamrożone w innych punktach czasowych9,19,20,21. Ponadto nie ma jednoznacznych dowodów na to, czy faza lub etap komórek RPE używanych do kriokonserwacji wpływa na funkcję RPE po rozmrożeniu. W naszym poprzednim badaniu wykazaliśmy po raz pierwszy, że wykładnicza faza wzrostu komórek (P2D5) jest najlepszym etapem kriokonserwacji komórek RPE pochodzących z hESC pod względem żywotności komórek oraz odzyskiwania właściwości i funkcji komórkowych17.

Metoda tutaj ustanowiona ma na celu kriokonserwację RPE pochodzącego z hESC na optymalnym etapie, aby osiągnąć najlepszą konserwację pod względem żywotności i funkcji komórki po rozmrożeniu. Korzystając z testu znakowania 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) w celu wykrycia wykładniczej fazy syntezy DNA przed krioprezerwacją, rozmrożone komórki RPE wykazywały >80% żywotność i szybkość przyłączania, ekspresję genu specyficzną dla RPE, spolaryzowaną morfologię komórek, wydzielanie czynnika pochodzącego z nabłonka barwnikowego, odpowiednią odporność przeznabłonkową i zdolność fagocytarną8,17,22. Chociaż protokół ten koncentruje się na komórkach RPE pochodzących z hESC i nie wszystkie komórki terapeutyczne są jednakowo krioprezerwowane, strategia zamrażania w fazie wykładniczej może być stosowana do wielu innych komórek terapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Dysocjacja komórek

  1. Utrzymuj komórki RPE zgodnie z wcześniejszym opisem17,22.
    UWAGA: Wszystkie komórki są hodowane w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez cały czas trwania protokołów.
  2. Przygotować wymaganą ilość PBS i pożywki hodowlanej w łaźni wodnej o temperaturze 37 ° C i umieścić odczynnik do dysocjacji komórek w temperaturze pokojowej.
  3. Wyrzucić roztwór hodowlany i umyć płytki dwukrotnie 1 ml podgrzanego PBS na studzienkę.
  4. Dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek do płytek 6-dołkowych i trawić komórki w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Po inkubacji obserwuj pod mikroskopem komórki, które kurczą się i błyszczą na krawędziach, aby potwierdzić zakończenie trawienia.
    UWAGA: Dysocjacja na bazie trypsyny nie jest zalecana, ponieważ daje niską żywotność komórek.
  5. Delikatnie pipetować w górę i w dół 10 razy pipetą o pojemności 1 ml w celu dysocjacji komórek i rozcieńczyć zawiesinę komórek podgrzaną pożywką hodowlaną (bez Y-27632) w stosunku 1:10. Następnie odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 3 minuty w temperaturze 250 × g.
  6. Szybko wylej supernatant po odwirowaniu, delikatnie zawieś ponownie osad komórkowy w 2 ml pożywki hodowlanej i ponownie zawieś komórki 10-15x za pomocą pipety.
  7. Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka do komórek 40 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową i obliczyć liczbę komórek.
    UWAGA: Zawiesina jednokomórkowa jest niezbędna do dokładnego zliczania komórek i jednolitej gęstości wysiewu komórek po rozmrożeniu.

2. Określenie optymalnego stadium komórki do kriokonserwacji

UWAGA: Ponieważ stan komórki różni się między metodami różnicowania a liniami komórkowymi, faza wykładnicza komórek RPE hodowanych w różnych laboratoriach powinna być określona przed zamrożeniem.

  1. Rozmrozić jedną fiolkę roztworu matrycy błony podstawnej na lodzie w temperaturze 4 °C przez noc. Rozcieńczyć matrycę w 12 ml zimnego DMEM/F-12 i dobrze wymieszać. Dodać jedno szkiełko nakrywkowe do dołka i pokryć każde zagłębienie 24-dołkowej płytki 0,25 ml rozcieńczonego roztworu. Przed użyciem inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C i zasysać roztwór powlekający tuż przed posiewem komórek.
    UWAGA: Instrukcje dotyczące podwielokrotnej objętości są specyficzne dla partii w oparciu o stężenie białka i znajdują się w karcie specyfikacji produktu.
  2. Wysiewać pojedyncze komórki RPE z kroku 1.7 na szkiełkach nakrywkowych pokrytych matrycą błony podstawnej o gęstości 105/cm2 w 1 ml pożywki hodowlanej. Odświeżaj pożywkę co 2-3 dni.
  3. We wskazanych punktach czasowych (1, 3, 5, 7 i 11 dni po pasażu) inkubować komórki RPE z 10 μM EdU w pożywce przez 24 godziny. Utrwalić, przeniknąć i wybarwić komórki koktajlem reakcyjnym zgodnie z opisem w instrukcji, aby wykryć włączony EdU.
  4. Uchwyć obrazy z pięciu losowych pól pod mikroskopem fluorescencyjnym i oblicz procent komórek EdU-dodatnich. Wykreślić odpowiednie krzywe proporcji w czasie dodatnim EdU, aby wygenerować krzywą wzrostu. Następnie określ okno zamrażania lub fazę wykładniczą dla każdej linii komórkowej zgodnie z krzywą wzrostu.
    UWAGA: Przywrócona sześciokątna morfologia komórek wskazuje, że komórki wychodzą z fazy wykładniczej.

3. Kriokonserwacja

  1. Postępując zgodnie z krokami 1.1-1.7, z wyjątkiem tego, że czas trawienia skraca się do 5 minut, odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy masie 250 × g.
  2. Odrzucić supernatant przez szybkie zalanie po odwirowaniu i delikatnie zawiesić osad komórkowy w pożywce do kriokonserwacji do gęstości 2 × 106 komórek/ml i przenieść 1 ml zawiesiny komórek do fiolek kriogenicznych o pojemności 1,2 ml.
  3. Natychmiast umieścić fiolki kriogeniczne w pojemniku do zamrażania, zamrozić w temperaturze -80 °C przez noc, aby osiągnąć szybkość chłodzenia -1 °C/min, a następnie przenieść fiolki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

4. Rozmrażanie

  1. Ogrzać pożywkę hodowlaną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i napełnić 10 ml podgrzanej pożywki do probówki o pojemności 15 ml.
  2. Szybko rozmrozić fiolki kriogeniczne pobrane bezpośrednio z magazynu ciekłego azotu za pomocą automatycznego systemu rozmrażania.
  3. Wlej 0,5-1 ml podgrzanej pożywki hodowlanej do fiolki kriogenicznej, aby upewnić się, że zamrożone komórki stopniowo przystosowują się do nowego środowiska. Następnie przenieść 1,5-2 ml zawiesiny komórek do 10 ml pożywki hodowlanej w probówce o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy 250 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  4. Odrzucić supernatant przez szybkie zalanie po odwirowaniu, ponownie zawiesić osad w 2 ml podgrzanej pożywki hodowlanej i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru w celu określenia wskaźników odzysku i przeżycia przy użyciu standardowego wykluczenia błękitu trypanowego (0,4% barwienie błękitem trypanowym).
  5. Hodować komórki na powierzchniach pokrytych matrycą błony podstawnej w gęstości10-5 żywotnych komórek/cm2 w pożywce hodowlanej uzupełnionej Y-27632 (końcowe stężenie: 10 μM). Usuń Y-27632 po 24 godzinach.
  6. Aby określić szybkość przyczepiania, ponownie oddysocjuj komórki i policz liczbę komórek 24 godziny po rozmrożeniu.

5. Walidacja optymalnej fazy zamrażania

  1. Aby zweryfikować optymalną fazę zamrażania określoną w kroku 2.4, należy rozmrozić komórki RPE zamrożone w różnych punktach czasowych i hodować je przez 28 dni. Zbierz komórki do analizy qPCR i immunostainingu, aby ocenić ekspresję markerów RPE, jak opisano wcześniej17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tutaj, komórki RPE pochodzące z hESC w P1D35 zostały przepasane i zasiane w gęstości 105/cm2. W ciągu tygodnia od wysiewu charakterystyczna sześciokątna morfologia i pigmentacja zostały utracone w fazie lag (około 2 dni). Komórki RPE stopniowo ponownie przyjęły morfologię heksagonalną w fazie wykładniczej (około 5 dni, Rysunek 1A) i weszły w fazę spowolnienia (około 6 dni) z bardziej wielokątną morfologią. Jeśli hodowla komórkowa była kontynuowana przez kolejny tydzień, prolifera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym badaniu opisano skuteczny protokół zamrażania i rozmrażania komórek RPE pochodzących z hESC do celów badawczych i klinicznych. W przeciwieństwie do unieśmiertelnionej linii komórkowej RPE, ARPE-19, komórki RPE o prawidłowym charakterystycznym fenotypie i funkcji nabłonka, takie jak komórki RPE pochodzące z komórek macierzystych, są bardziej wrażliwe na krioprezerwację. Mniej niż 32% komórek pozostało po 24 godzinach od rozmrożenia, jeśli nie zostało odpowiednio zachowane17. Czas kriok...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81970816) dla Mei Jiang; Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (82201223) dla Xinyue Zhu; oraz Plan Działań na rzecz Innowacji Naukowych i Technologicznych Szanghajskiej Komisji Nauki i Technologii (2014090067000) dla Haiyun Liu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
40 μ m Sitko do komórekCorning431750
Zestaw do proliferacji komórek Click-iT EdU do obrazowania, Alexa Fluor 488 BarwnikThermo Fisher ScientificC10337
Pojemnik do zamrażaniaNalgene5100-0001
CryoStor CS10Biolife Solutions07930pożywka do krioprezerwacji #1
DPBS, bez wapnia, bez magnezuThermo Fisher Scientific
GenxinSelcellYB050050pożywka do krioprezerwacji #2
Ludzkie embrionalne komórki macierzystedostarczone przez Wicell, USALinia
Matrigel, Matrix z kwalifikacją hESC MatrixCorning354277matryca błony podstawnej
ThawSTAR CFT2 Zautomatyzowany system rozmrażania komórekBioLife SolutionsAST-601
Trypan Niebieski roztwór 0,4%SigmaT8154
TryPLE SelectThermo Fisher Naukowyodczynnik do dysocjacji komórek
12563029 XVIVO-10 podłożeLonzaBEBP04-743QPożywka hodowlana RPE
Y-27632SelleckS1049
14190144komórkowa H9

Bibliografia

  1. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846(2020).
  2. Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease. American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).
  3. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969(2021).
  4. Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration. Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).
  5. Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).
  6. Da Cruz,, L,, et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  7. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  8. Buchholz, D. E., et al. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).
  9. Li, Q. -Y., et al. Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases. Experimental Eye Research. 202, 108305(2021).
  10. Francois, M., et al. Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing. Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).
  11. Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties. Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).
  12. Ekpo, M. D., et al. Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper. Frontiers in Immunology. 13, 967731(2022).
  13. Bailey, T. L., et al. Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells. Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).
  14. Okumura, N., et al. Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells. PLoS One. 14 (6), e0218431(2019).
  15. Pennington, B. O., et al. Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo. Scientific Reports. 11 (1), 6286(2021).
  16. Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use. Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).
  17. Zhang, T., et al. Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 454(2022).
  18. Leach, L. L., et al. Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).
  19. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  20. Brandl, C., et al. In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC). Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).
  21. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 291(2017).
  22. Foltz, L. P., Clegg, D. O. Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274(2017).
  23. Marcantonini, G., et al. Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin. Molecules. 27 (10), 3254(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ludzkie embrionalne kom rki macierzystekriokonserwacja kom rekmro enie w fazie wyk adniczejterapia zast pcza kom rkamitest proliferacji EdUywotno kom rekwska nik odzyskania kom rekrozmra anie kom rekbankowanie kom rek

Powiązane artykuły