Method Article

Wydajna i szybka metoda etykietowania i analizy kłębuszków mysich

DOI:

10.3791/65973

⸱

February 9th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Transplant Engineering and Immunology, NHFPC, West China Hospital, Sichuan University, 2Core Facility of West China Hospital, Sichuan University, 3Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia łatwy w użyciu, kompletny i prosty zestaw metod do oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych z mysich nerek oczyszczonych metodą CUBIC. Dane, takie jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych, można łatwo i niezawodnie uzyskać za pomocą dekstranu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-Dextran, mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (LSFM) lub popularnej mikroskopii konfokalnej i oprogramowania, takiego jak Imaris.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kłębuszki nerkowe są podstawowymi jednostkami w nerkach; dlatego badanie kłębuszków nerkowych jest kluczowe dla zrozumienia funkcji nerek i patologii. Obrazowanie biologiczne dostarcza intuicyjnych informacji; Dlatego bardzo ważne jest oznaczanie i obserwowanie kłębuszków nerkowych. Jednak obecnie stosowane metody obserwacji kłębuszków nerkowych wymagają skomplikowanych operacji, a wyniki mogą spowodować utratę szczegółów etykiety lub informacji trójwymiarowych (3D). Przezroczysta, niezakłócona technologia obrazowania mózgu i analizy obliczeniowej (CUBIC) jest szeroko stosowana w badaniach nad nerkami, umożliwiając dokładniejsze wykrywanie i głębszą głębokość wykrywania. Odkryliśmy, że mysie kłębuszki nerkowe można szybko i skutecznie znakować przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej FITC-Dekstranu o średniej masie cząsteczkowej, a następnie metodą oczyszczania CUBIC. Oczyszczoną nerkę myszy można było zeskanować za pomocą mikroskopu świetlnego (lub mikroskopu konfokalnego po pokrojeniu), aby uzyskać trójwymiarowe stosy obrazów wszystkich kłębuszków nerkowych w całej nerce. Przetworzone za pomocą odpowiedniego oprogramowania, sygnały kłębuszków nerkowych mogą być łatwo digitalizowane i dalej analizowane w celu zmierzenia liczby, objętości i częstotliwości kłębuszków nerkowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczba i objętość kłębuszków nerkowych są bardzo ważne dla diagnozowania i leczenia różnych chorób nerek1,2,3,4,5. Złotym standardem szacowania liczby kłębuszków nerkowych jest fizyczna kombinacja dyssektora/frakcjonatora. Jednak ta metoda wymaga specjalnych odczynników i sprzętu, co czyni ją powolną i kosztowną6,7,8,9. Biopsja dostarcza wielu informacji, ale oczywiście ta metoda jest odpowiednia tylko do przybliżonych szacunków10,11. Technologie obrazowania medycznego, w tym rezonans magnetyczny (MRI), tomografia komputerowa (CT) i promieniowanie rentgenowskie, są również szeroko stosowane w wykrywaniu kłębuszków nerkowych12,13,14,15, ale takie technologie wymagają nieporęcznych instrumentów. Nowe metody, takie jak spektrometr mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI) obrazowania spektrometru mas 16 lub metoda grubego i cienkiego przekroju17, były również stosowane w detekcji kłębuszków nerkowych, choć nadal są żmudne i pracochłonne.

Dzięki technologiom przezroczystości możliwe jest obserwowanie głębszych głębokości i uzyskiwanie bogatszych i bardziej kompletnych informacji z grubych tkanek lub nawet całych narządów18,19,20,21,22,23. Dlatego technologie przezroczystości są szeroko stosowane w badaniach nad nerkami24. W grę wchodzi również obserwacja i wykrywanie kłębuszków nerkowych w oczyszczonych nerkach. Jednak te opublikowane artykuły albo tylko krótko odnosiły się do wykrywania kłębuszków nerkowych25, albo wykorzystywały trudne do osiągnięcia metody znakowania, takie jak transgenic animals26, self-made dyes13, lub inkubacja przeciwciał o wysokim stężeniu27 do oznaczania kłębuszków nerkowych. Ponadto, mimo że w badaniach analizowano kłębuszki nerkowe w oczyszczonych nerkach, analizy zawsze były ograniczone13 lub opierały się na algorytmach analizy ustalonych przez samych autorów26.

Wcześniej pokazaliśmy wygodniejszy sposób oznaczania kłębuszków nerkowych u nerek myszy28. Korzystając z Imaris, odkryliśmy, że liczbę, częstotliwość i objętość kłębuszków nerkowych można szybko uzyskać. Dlatego tutaj przedstawiamy bardziej dostępny, kompleksowy i uproszczony zestaw metod oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych myszy.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dorosłe myszy C57BL/6 (w wieku 6 tygodni, 25-30 g) zostały użyte w tym badaniu. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt i etyki doświadczalnej. Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Biomedycznych Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Sichuan.

1. Znakowanie kłębuszków nerkowych i przygotowanie tkanek

  1. Etykietowanie kłębuszków nerkowych
    1. Rozpuścić FITC-dekstran (10 mg) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w stosunku 1:1 (1 mg: 1 ml) w celu przygotowania roztworu sondy roboczej.
      UWAGA: Roztwór roboczy można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
    2. Umieść mysz C57 w stabilizatorze żył ogona myszy. Zwilż gazę gorącą wodą, owiń gazę wokół środkowej części ogona myszy i ogrzewaj ogon przez 1 minutę.
    3. Przetrzyj ogon myszy 75% etanolem, aż lewa i prawa żyła ogonowa będą widoczne.
    4. Za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml pobrać 100 μl roztworu z sondy roboczej i powoli wstrzyknąć roztwór do żyły ogonowej myszy.
    5. Po wstrzyknięciu należy pozostawić roztwór sondy na cyrkulację przez 30 minut. Pozwolić myszom swobodnie poruszać się w klatkach.
    6. Po osiągnięciu wystarczającego krążenia należy głęboko znieczulić myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (1%, 60-80 μg / kg).
  2. Pobieranie próbek i stabilizacja nerek
    1. Przymocuj znieczulone myszy do płytki anatomicznej w pozycji leżącej. Zabezpiecz ich łapy taśmą medyczną.
    2. Po przygotowaniu skóry należy poddać myszy eutanazji śmiertelną dawką pentobarbitalu sodu (1%, 10 mg/kg).
    3. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej, aby odsłonić jamę brzuszną.
    4. Odsłoń nerki i usuń je skalpelem i nożyczkami w okapie. Delikatnie usunąć otoczkę nerkową.
    5. Zebrać nerki i utrwalić je w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C przez noc.
    6. Przemyć próbki PBS trzy razy po 1 godzinie każda, wytrząsając w temperaturze pokojowej (RT).
    7. Przygotuj nerkę do mikroskopii.
      1. Pokrój nerkę do mikroskopii konfokalnej: Pokrój nerkę na plastry o grubości 1 mm za pomocą matrycy mózgowej (stal 1 mm, 40-75 g), aby ujednolicić grubość plastra. Przenieść plastry do 4% PFA i kontynuować utrwalanie w temperaturze 4 °C przez noc.
      2. Cała nerka do mikroskopii arkuszowej: Utrwalić nerki w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 48 godzin.

2. Czyszczenie

  1. Przygotowanie odczynnika
    1. Przygotować odczynnik CUBIC-L, mieszając 10% (wag./wag.) N-butylodietanoloaminę, 10% (wag./wag.) Triton X-100 i 80%ddH2O.
    2. Przygotować odczynnik CUBIC-R, mieszając 45% (wag./wag.) antypiryny, 30% (wag./wt) nikotynamidu, 0,5% (obj./obj.) N-butylodietanoloaminy i 24.5%ddH2O. Upewnij się, że roztwór ma pH 9,6-9,8 i współczynnik załamania światła (RI) 1,522,
      UWAGA: CUBIC-L służy do delipidacji, a CUBIC-R służy do dopasowywania współczynnika załamania światła.
  2. Procedura rozliczeniowa
    1. Pobrać próbki nerek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie oczyścić je w CUBIC-L, wstrząsając z prędkością 60 obr./min w temperaturze 37 °C. Wymienną piankę CUBIC-L należy wymieniać co 4 godziny (w przypadku plastrów nerki) lub co 24 godziny (w przypadku całej nerki) aż do uzyskania zadowalającej przezroczystości optycznej.
      UWAGA: Ten proces trwa 1 dzień w przypadku plastrów nerki i 5 dni w przypadku całej nerki.
    2. Przemyć próbki trzykrotnie w PBS, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę każda.
    3. Nałożyć CUBIC-R na próbki, wstrząsając próbkami w temperaturze 37 °C, 60 obr./min przez 6 godzin.
    4. Oczyszczone próbki należy obserwować bezpośrednio lub przechowywać je w czarnych probówkach wypełnionych CUBIC-R w temperaturze pokojowej przez 1 tydzień.

3. Akwizycja obrazu

  1. Obrazowanie konfokalne
    UWAGA: Zobrazuj pokrojone próbki nerek za pomocą mikroskopii konfokalnej (soczewki: obiektyw Plan Apo λ 4×/0,2 N1 lub obiektyw Plan Apo VC 10×/0,45 DIC N1). Rejestruj duże obrazy (np. 6052 μm x 6052 μm dla wycinka nerki) za pomocą z-stacków.
    1. Włącz mikroskop konfokalny w następującej kolejności: moc lasera, przełącznik sterowania konfokalnego, komputer, mikroskop i sprzęt konfokalny. Po uruchomieniu autotestu włącz oprogramowanie konfokalne.
    2. Wybierz odpowiedni obiektyw. Usuń próbkę z odczynnika CUBIC-R, umieść ją w naczyniu konfokalnym i przykryj, aby zapobiec wyschnięciu odczynnika CUBIC-R.
    3. Przesuń próbkę na środek pola widzenia i dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aż będzie ostra.
    4. Zastosuj rekonstrukcję 3D (krok 3.1.4.1) i rekonstrukcję dużego obrazu (kroki 3.1.4.2-3.1.4.3).
      1. Rekonstrukcja 3D (konfokalna): Przełącz płaszczyznę powiększenia w jednym kierunku, aż nie będzie widoczna fluorescencja; ta pozycja jest zdefiniowana jako góra. Następnie przełącz płaszczyznę powiększenia w przeciwnym kierunku, aż nie będzie widoczna fluorescencja; Ta pozycja jest zdefiniowana jako dół. Kliknij przycisk Uruchom w prawym dolnym rogu okna dialogowego, aby rozpocząć skanowanie.
      2. Rekonstrukcja dużego obrazu (konfokalna): Przesuń pole widzenia na środek próbki i ustaw bieżącą pozycję jako środek. Wybierz pole widzenia 2 x 2.
      3. W interfejsie wielofunkcyjnym ND wybierz stos Z, aby zrekonstruować duże obrazy i ustawić różne opcje w panelu. Następnie naciśnij przycisk Uruchom do n, aby rozpocząć skanowanie.
  2. Obrazowanie mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego (LSFM)
    UWAGA: Zobrazuj całe nerki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z arkuszem światła (soczewka: obiektyw EC Plan-Neofluar 5x/0.16 (Medium n = 1.529)).
    1. Dołączanie próbki (LSFM):
      1. Przykleić przezroczystą nerkę do łącznika mocującego próbkę i poczekać, aż nerka zostanie mocno przymocowana.
      2. Namocz nerkę w pojemniku na próbkę i wepchnij pojemnik na próbkę do systemu mikroskopu. Zamknij właz.
    2. Obserwuj i skanuj (LSFM):
      1. W interfejsie Locate (Zlokalizuj) przenieś próbkę do odpowiedniej pozycji obserwacji. Przełącz się na interfejs Akwizycja, ustaw ścieżkę optyczną, wybierz laser 488 nm, LBF 405/488/561/640, blok filtra optycznego SBS LP 490, wybierz Kamera 2 i zmień pseudokolor na zielony.
      2. Wypełnij wartość Przesunięcie Z w lewo/w prawo zarejestrowaną wcześniej w podmenu Kanał. Wybierz najmniejsze powiększenie (0,36) i dostosuj je, aby uzyskać maksymalną klarowność.
    3. Znajdź granicę X\Y i zakres Z całego narządu. Dostosuj intensywność lasera i czas ekspozycji (najlepiej krótszy niż 10 ms), a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć.
    4. Jeśli tkanka jest zbyt duża, połącz dwa lub więcej obrazów za pomocą zszywania obrazów. Otwórz przechwycony plik za pomocą oprogramowania mikroskopowego (tutaj ZEISS ZEN 3.7). Wybierz opcję Processing > Method (Metoda przetwarzania) > Stitching > method (Parametr metody> Apply (Zastosuj), aby zakończyć zszywanie obrazów.

4. Przetwarzanie danych i kwantyfikacja

UWAGA: Przetwarzaj stosy obrazów za pomocą oprogramowania Imaris (analiza obrazu), używając funkcji Powierzchnia do oznaczania kłębuszków nerkowych i przeprowadzania analizy.

  1. Liczba kłębuszków nerkowych
    1. Importuj duże obrazy (mikroskopia konfokalna) lub obrazy zszyte (mikroskopia arkuszowa) do oprogramowania do analizy obrazu.
    2. Otwórz pliki w oprogramowaniu do analizy obrazu. Kliknij przycisk Powierzchnia, aby utworzyć nową powierzchnię. Postępuj zgodnie z instrukcjami w lewej dolnej części ekranu.
      1. Kliknij przycisk Dalej (przycisk strzałki w prawo) bez zaznaczania czegokolwiek.
      2. Zaznacz pole przed opcją Wygładzanie i wprowadź odpowiednią liczbę (np. 14.5), aby sterować szczegółami powierzchni. Wybierz opcję Odejmowanie tła w obszarze Thresholding (Określanie progów) i wypełnij pole przybliżoną średnią średnicą kłębuszków nerkowych. Kliknij przycisk Dalej.
      3. W razie potrzeby dostosuj i kliknij przycisk Dalej. Wybierz odpowiedni zakres i kliknij przycisk Dalej, aby utworzyć powierzchnię.
    3. Kliknij przycisk Filtruj, a następnie przycisk Dodaj, aby dodać Kulistość w celu odfiltrowania obiektów niesferycznych. Kliknij przycisk Duplikuj, aby skopiować tę nową powierzchnię.
    4. Kliknij przycisk Statystyki, a następnie kliknij przycisk Ogólny; oprogramowanie przedstawi liczbę kłębuszków nerkowych jako całkowitą liczbę powierzchni.
  2. Objętość kłębuszków nerkowych
    1. Utwórz powierzchnię kłębuszków nerkowych jak powyżej.
    2. Po zakończeniu tworzenia powierzchni kliknij przycisk Zaznaczenie, aby wybrać obiekty docelowe i przedstawić objętość każdego obiektu. Kliknij przycisk Zapisz i wyeksportuj statystyki do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.
  3. Objętość plastra lub całej nerki
    1. Importuj duże obrazy (mikroskopia konfokalna) lub obrazy zszyte (mikroskopia arkuszowa) do oprogramowania do analizy obrazu.
    2. Otwórz pliki w oprogramowaniu do analizy obrazu. Kliknij przycisk Powierzchnia, aby utworzyć nową powierzchnię. Postępuj zgodnie z instrukcjami w lewej dolnej części ekranu.
      1. Kliknij przycisk Dalej (przycisk strzałki w prawo) bez zaznaczania.
      2. Zaznacz pole przed opcją Wygładzanie i wprowadź odpowiednią liczbę (np. 50), aby sterować szczegółami powierzchni. Wybierz opcję Absolute Intensity (Intensywność bezwzględna) w obszarze Thresholding (Określanie progowe). Kliknij przycisk Dalej.
      3. Dopasuj powierzchnię, aż pokryje całą tkankę, a następnie kliknij przycisk Dalej. Kliknij przycisk Dalej, aby utworzyć powierzchnię.
    3. Kliknij przycisk Zaznaczenie, aby wybrać powierzchnię całej tkanki i przedstawić objętość tkanki. Kliknij przycisk Zapisz, aby wyeksportować statystyki do arkusza kalkulacyjnego.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie dostarcza prostej i efektywnej metody oznaczania i analizy kłębuszków nerkowych u myszy.

Kłębuszki (naczynia krwionośne) mogą być dobrze oznaczone przez donaczyniowo wstrzykiwany FITC-Dextran. Po procesie oczyszczania nerka stała się przezroczysta (Ryc. 1A), a kłębuszki nerkowe można było wyraźnie zaobserwować za pomocą mikroskopii z jasnym arkuszem (Ryc. 1B) lub mikroskopii konfokalnej ( Ryc.). Mikroskopia konfokalna ma ograniczoną głębokość skanowania, dlatego nerki należy pokroić w plastry o grubości około 1 mm. Jeśli używany jest mikroskop z arkuszami świetlnymi, cała nerka może być skanowana bezpośrednio.

Dzięki wyraźnym sygnałom, łatwo było policzyć liczbę kłębuszków nerkowych. W rzeczywistości etykietowanie było tak skuteczne, że kłębuszki można było policzyć gołym okiem. Objętość kłębuszków nerkowych można również zmierzyć bezpośrednio. Oczywiście oprogramowanie takie jak Imaris znacznie przyspieszyło ten proces. Korzystając z funkcji Powierzchnia, można wybrać wszystkie kłębuszki nerkowe w wycinku nerki (Rysunek 2), w całej nerce (Rysunek 3) lub w pasku (Rysunek 4), a liczbę i objętość kłębuszków można uzyskać bezpośrednio (Rysunek 2C, Rysunek 3C, Rysunek 4C). Można również zmierzyć objętość wybranego obszaru (Rysunek 2B, Rysunek 3B, Rysunek 4B), dzięki czemu można obliczyć stosunek objętości i częstość występowania kłębuszków nerkowych w określonym regionie lub w całej nerce (Rysunek 2D, Rysunek 3D, Rysunek 4D). Można wybrać obszar nerki do wykonania obliczeń w określonych regionach. Zaprezentowaliśmy pasek podobny do biopsji. Liczbę, objętość i częstość występowania kłębuszków nerkowych w pasie można również łatwo uzyskać (Ryc. 4).

Jak pokazano na rysunkach, wyniki przedstawione w tym badaniu to (N = liczba, F = częstotliwość, V = objętość, V(a) = średnia objętość, V(t) = całkowita objętość):

Nkłębuszków w plasterku = 1128, Nkłębuszków w całej nerce = 14006,Kłębuszków F w plasterku = 65 na mm3,Kłębuszków F w całej nerce = 105 na mm3, V kłębuszkiogółem w plastrze/V plasterek = 2,24%, Vkłębuszki całkowite w całej nerce/Vnerka = 5,54%, V(a)kłębuszki w plasterku = 373654 μm3, V(a)kłębuszki w całej nerce = 521627 μm3, V(t)kłębuszki w plasterku = 421481724 μm3, V(t)kłębuszki w całej nerce = 7305386256 μm3 (Rysunek 2D, Rysunek 3D).

Nkłębuszków w pasie = 63, Fglomeruli w pasie = 72 na mm3, Vcałkowite kłębuszki w pasie/V paski = 2,23%, V(a)kłębuszki w pasie = 307698 μm3, V(t)kłębuszki w pasie = 19384977 μm3 (Rysunek 4D).

figure-results-1
Rysunek 1: Przezroczystość tkanki nerkowej i kłębuszki nerkowe znakowane FITC-dextran. (A) Nerka przed i po leczeniu przezroczystością. (B) Obraz całej nerki zeskanowanej za pomocą LSFM. (C) Obraz wycinka nerki zeskanowanego mikroskopem konfokalnym (po lewej: 4x, po prawej: 10x). podziałka = 300 μm (4x, konfokalna); podziałka = 100 μm (10x, konfokalny).; podziałka = 700 μm (5x, zoom 0,36, LSFM). Kłębuszki nerkowe zostały oznaczone FITC-Dextran. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Funkcja Powierzchnia zastosowana do konfokalnego skanowanego wycinka nerki. (A) Powierzchnia wycinka i wszystkie kłębuszki nerkowe są tworzone. Różowy = kłębuszki nerkowe, niebieski = na zewnątrz Powierzchnia wycinka nerki, zielony = oryginalna etykieta naczyń (kłębuszki nerkowe i niektóre duże naczynia). Podziałka liniowa = 300 μm. (B) Po wybraniu powierzchni wycinka (po lewej) lub kłębuszków nerkowych (po prawej) (wybrane obiekty zmienią kolor na żółty), dane można uzyskać bezpośrednio (kropkowane pole podświetla miejsce, w którym pokazują dane). (C) Liczbę, objętość każdego pojedynczego kłębuszka nerkowego oraz objętość całkowitych kłębuszków nerkowych można uzyskać bezpośrednio, jak również objętość wycinka. (D) Wyeksportowane dane mogą być dalej analizowane, aby można było opracować obliczenia, takie jak średnia objętość kłębuszków nerkowych i stosunek objętości kłębuszków nerkowych do wybranego obszaru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Funkcja Powierzchnia zastosowana do zeskanowanej LSFM całej nerki. (A) Powierzchnia całej nerki i wszystkie kłębuszki nerkowe są tworzone. Różowy = kłębuszki nerkowe, niebieski = na zewnątrz Powierzchnia całej nerki, zielony = oryginalna etykieta naczyń (kłębuszki nerkowe i niektóre duże naczynia). Pasek skali = 1000 μm. (B) Po wybraniu powierzchni nerki (po lewej) lub kłębuszków nerkowych (po prawej) (wybrane obiekty zmienią kolor na żółty), dane można uzyskać bezpośrednio (kropkowane pole podświetla miejsce, w którym pokazuje dane). (C) Liczbę, objętość każdego pojedynczego kłębuszka nerkowego i liczbę kłębuszków nerkowych można uzyskać bezpośrednio, jak również objętość nerki. (D) Wyeksportowane dane mogą być dalej analizowane, aby można było opracować obliczenia, takie jak średnia objętość kłębuszków nerkowych i stosunek objętości kłębuszków nerkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Funkcja Powierzchnia zastosowana do wybranego paska nerkowego. (A) Powierzchnia paska i wszystkie kłębuszki nerkowe są tworzone. Różowy = kłębuszki nerkowe, niebieski = na zewnątrz Powierzchnia paska nerkowego, zielony = oryginalna etykieta naczyń (kłębuszki nerkowe i niektóre duże naczynia). Podziałka liniowa = 150 μm. (B) Po wybraniu powierzchni paska (po lewej) lub kłębuszków nerkowych (po prawej) (wybrane obiekty zmienią kolor na żółty), dane można uzyskać bezpośrednio (kropkowane pole podświetla miejsce, w którym wyświetlane są dane). (C) Liczbę, objętość każdego pojedynczego kłębuszka nerkowego oraz objętość całkowitych kłębuszków nerkowych można uzyskać bezpośrednio, jak również objętość pasma. (D) Wyeksportowane dane mogą być dalej analizowane, aby można było opracować obliczenia, takie jak średnia objętość kłębuszków nerkowych i stosunek objętości kłębuszków nerkowych do wybranego obszaru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologie oczyszczania tkanek można podzielić na 3 lub 4 grupy 29,30,31. Oczyszczanie tkanek na bazie rozpuszczalników organicznych (np. DISCO i PEGASOS), oczyszczanie tkanek na bazie wody (np. CUBIC) i oczyszczanie tkanek zatapiające hydrożel (np. CLARITY) zostały zastosowane w oczyszczaniu nerek 25,26,28,32. CUBIC, jak wykazaliśmy, działa najlepiej, gdy kłębuszki nerkowe (naczynia) są oznaczone FITC-Dextran. Ponadto CUBIC ma stosunkowo wygodniejszy proces obsługi i wymaga nie więcej niż zwykłe soczewki mikroskopowe27, ponieważ przetwarzane próbki nie muszą być moczone w odczynnikach organicznych33. Różne metody rozliczania i etykietowania statków mają jednak swoje zalety i wady; Naukowcy mogą być zmuszeni do eksperymentowania z różnymi podejściami, aby spełnić swoje specyficzne potrzeby.

Wcześniejsze badania wykazały, że kłębuszki nerkowe mogą być oznaczone w oczyszczonych nerkach, gdy naczynia krwionośne w nerkach były oznaczonejako 13,25,26,28. Dokładne wyjaśnienie tego zjawiska wymaga dalszych badań, ale można wywnioskować, że dobra metoda znakowania układu naczyniowego skutecznie oznacza również kłębuszki nerkowe. Na podstawie wyników eksperymentalnych zalecamy donaczyniowe wstrzyknięcie FITC-Dekstranu o średniej masie cząsteczkowej (np. 150 kDa). Ponieważ jednak etykietowanie opiera się na krążeniu krwi, ta metoda może nie oznaczyć kłębuszków nerkowych, gdy brakuje im krążenia.

LSFM umożliwia obserwację tkanek na dużą skalę, dzięki czemu jest bardziej odpowiedni do wykrywania całych kłębuszków nerkowych. Jednak mikroskopy z arkuszami świetlnymi mogą nie być dostępne w każdym laboratorium. Dlatego zapewniamy alternatywny zestaw protokołów przy użyciu zwykłych mikroskopów konfokalnych. Chociaż nerka musi zostać podzielona na wiele sekcji, możliwe jest uzyskanie danych, takich jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych w całej nerce. Poza tym mikroskopia konfokalna zapewnia mniejszą ilość danych, co jest bardziej przyjazne dla przetwarzania danych.

Imaris zapewnia bezpośredni wyrzut danych. Należy jednak zadbać o to, aby sygnał analogowy był jak najbardziej zbliżony do oryginału. Ponadto oprogramowanie może zająć dużo czasu na przetwarzanie dużych plików, co może być frustrujące. Tak długo, jak kłębuszki nerkowe mogą być wyraźnie oznaczone i zwizualizowane, istnieje więcej niż jedno unikalne rozwiązanie do analizy danych. Naukowcy z różnych laboratoriów mogli pracować z własnym, znanym im oprogramowaniem i językami programowania.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82204951) oraz Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4% PFABiosharp7007171800Fixation reaagen
502 Klej Deli7146Do mocowania nerki do adaptera mocującego próbkę 
AntypirynaAladynA110660Odczynnik czyszczący
Brain MatrixRWD Life Science1mm 40-75Krojenie tkanek
Mikroskopia konfokalnaNikonA1plusAkwizycja obrazu
FITC-DekstranSigma-AldrichFD150SOdczynnik do znakowania
Mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego Arkusz ZeissLight 7 Akwizycja obrazu
MyszyEnsiweierAdult C57BL/6 myszy (6 tygodni, 25– 30 g) 
N-butylodietanoloaminaAladdinB299095Odczynnik czyszczący
NikotynamidAladdinN105042Odczynnik czyszczący
Pentobarbital NatriumsalzSigma-AldrichP3761
Stabilizator żył ogonowychJINUOTAIJNT-FS35Napraw mysz do wstrzykiwań vail
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Odczynnik czyszczący

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).">Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
  2. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).">Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  3. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).">Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
  4. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).">Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
  5. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).">Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
  6. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).">Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
  7. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).">Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
  8. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).">Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  9. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).">Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
  10. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).">Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
  11. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).">Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
  12. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).">Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
  13. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521(2019).">Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521(2019).
  14. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).">Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
  15. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).">Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
  16. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).">Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
  17. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).">Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
  18. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).">Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).">Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  20. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127(2016).">Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127(2016).
  21. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).">Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
  22. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).">Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  23. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).">Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  24. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).">Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  25. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008(2022).">Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008(2022).
  26. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).">Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  27. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).">Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  28. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042(2023).">Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042(2023).
  29. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).">Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  30. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).">Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
  31. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).">Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
  32. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).">Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
  33. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382(2014).">Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse GlomeruliGlomeruli LabelingKidney ImagingCUBIC Tissue ClearingFITC Dextran LabelingLight Sheet MicroscopyConfocal MicroscopyThree Dimensional ImagingImage Analysis SoftwareGlomeruli Quantification

Related Articles