Artykuł metodologiczny

Wydajna i szybka metoda etykietowania i analizy kłębuszków mysich

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65973

⸱

9 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Transplant Engineering and Immunology, NHFPC, West China Hospital, Sichuan University, 2Core Facility of West China Hospital, Sichuan University, 3Regenerative Medicine Research Center, West China Hospital, Sichuan University

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia łatwy w użyciu, kompletny i prosty zestaw metod do oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych z mysich nerek oczyszczonych metodą CUBIC. Dane, takie jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych, można łatwo i niezawodnie uzyskać za pomocą dekstranu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-Dextran, mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych (LSFM) lub popularnej mikroskopii konfokalnej i oprogramowania, takiego jak Imaris.

Streszczenie

Kłębuszki nerkowe są podstawowymi jednostkami w nerkach; dlatego badanie kłębuszków nerkowych jest kluczowe dla zrozumienia funkcji nerek i patologii. Obrazowanie biologiczne dostarcza intuicyjnych informacji; Dlatego bardzo ważne jest oznaczanie i obserwowanie kłębuszków nerkowych. Jednak obecnie stosowane metody obserwacji kłębuszków nerkowych wymagają skomplikowanych operacji, a wyniki mogą spowodować utratę szczegółów etykiety lub informacji trójwymiarowych (3D). Przezroczysta, niezakłócona technologia obrazowania mózgu i analizy obliczeniowej (CUBIC) jest szeroko stosowana w badaniach nad nerkami, umożliwiając dokładniejsze wykrywanie i głębszą głębokość wykrywania. Odkryliśmy, że mysie kłębuszki nerkowe można szybko i skutecznie znakować przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej FITC-Dekstranu o średniej masie cząsteczkowej, a następnie metodą oczyszczania CUBIC. Oczyszczoną nerkę myszy można było zeskanować za pomocą mikroskopu świetlnego (lub mikroskopu konfokalnego po pokrojeniu), aby uzyskać trójwymiarowe stosy obrazów wszystkich kłębuszków nerkowych w całej nerce. Przetworzone za pomocą odpowiedniego oprogramowania, sygnały kłębuszków nerkowych mogą być łatwo digitalizowane i dalej analizowane w celu zmierzenia liczby, objętości i częstotliwości kłębuszków nerkowych.

Wprowadzenie

Liczba i objętość kłębuszków nerkowych są bardzo ważne dla diagnozowania i leczenia różnych chorób nerek1,2,3,4,5. Złotym standardem szacowania liczby kłębuszków nerkowych jest fizyczna kombinacja dyssektora/frakcjonatora. Jednak ta metoda wymaga specjalnych odczynników i sprzętu, co czyni ją powolną i kosztowną6,7,8,9. Biopsja dostarcza wielu informacji, ale oczywiście ta metoda jest odpowiednia tylko do przybliżonych szacunków10,11. Technologie obrazowania medycznego, w tym rezonans magnetyczny (MRI), tomografia komputerowa (CT) i promieniowanie rentgenowskie, są również szeroko stosowane w wykrywaniu kłębuszków nerkowych12,13,14,15, ale takie technologie wymagają nieporęcznych instrumentów. Nowe metody, takie jak spektrometr mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI) obrazowania spektrometru mas 16 lub metoda grubego i cienkiego przekroju17, były również stosowane w detekcji kłębuszków nerkowych, choć nadal są żmudne i pracochłonne.

Dzięki technologiom przezroczystości możliwe jest obserwowanie głębszych głębokości i uzyskiwanie bogatszych i bardziej kompletnych informacji z grubych tkanek lub nawet całych narządów18,19,20,21,22,23. Dlatego technologie przezroczystości są szeroko stosowane w badaniach nad nerkami24. W grę wchodzi również obserwacja i wykrywanie kłębuszków nerkowych w oczyszczonych nerkach. Jednak te opublikowane artykuły albo tylko krótko odnosiły się do wykrywania kłębuszków nerkowych25, albo wykorzystywały trudne do osiągnięcia metody znakowania, takie jak transgenic animals26, self-made dyes13, lub inkubacja przeciwciał o wysokim stężeniu27 do oznaczania kłębuszków nerkowych. Ponadto, mimo że w badaniach analizowano kłębuszki nerkowe w oczyszczonych nerkach, analizy zawsze były ograniczone13 lub opierały się na algorytmach analizy ustalonych przez samych autorów26.

Wcześniej pokazaliśmy wygodniejszy sposób oznaczania kłębuszków nerkowych u nerek myszy28. Korzystając z Imaris, odkryliśmy, że liczbę, częstotliwość i objętość kłębuszków nerkowych można szybko uzyskać. Dlatego tutaj przedstawiamy bardziej dostępny, kompleksowy i uproszczony zestaw metod oznaczania i analizowania kłębuszków nerkowych myszy.

Protokół

Dorosłe myszy C57BL/6 (w wieku 6 tygodni, 25-30 g) zostały użyte w tym badaniu. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt i etyki doświadczalnej. Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Biomedycznych Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Sichuan.

1. Znakowanie kłębuszków nerkowych i przygotowanie tkanek

  1. Etykietowanie kłębuszków nerkowych
    1. Rozpuścić FITC-dekstran (10 mg) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) w stosunku 1:1 (1 mg: 1 ml) w celu przygotowania roztworu sondy roboczej.
      UWAGA: Roztwór roboczy można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
    2. Umieść mysz C57 w stabilizatorze żył ogona myszy. Zwilż gazę gorącą wodą, owiń gazę wokół środkowej części ogona myszy i ogrzewaj ogon przez 1 minutę.
    3. Przetrzyj ogon myszy 75% etanolem, aż lewa i prawa żyła ogonowa będą widoczne.
    4. Za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml pobrać 100 μl roztworu z sondy roboczej i powoli wstrzyknąć roztwór do żyły ogonowej myszy.
    5. Po wstrzyknięciu należy pozostawić roztwór sondy na cyrkulację przez 30 minut. Pozwolić myszom swobodnie poruszać się w klatkach.
    6. Po osiągnięciu wystarczającego krążenia należy głęboko znieczulić myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (1%, 60-80 μg / kg).
  2. Pobieranie próbek i stabilizacja nerek
    1. Przymocuj znieczulone myszy do płytki anatomicznej w pozycji leżącej. Zabezpiecz ich łapy taśmą medyczną.
    2. Po przygotowaniu skóry należy poddać myszy eutanazji śmiertelną dawką pentobarbitalu sodu (1%, 10 mg/kg).
    3. Wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej, aby odsłonić jamę brzuszną.
    4. Odsłoń nerki i usuń je skalpelem i nożyczkami w okapie. Delikatnie usunąć otoczkę nerkową.
    5. Zebrać nerki i utrwalić je w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C przez noc.
    6. Przemyć próbki PBS trzy razy po 1 godzinie każda, wytrząsając w temperaturze pokojowej (RT).
    7. Przygotuj nerkę do mikroskopii.
      1. Pokrój nerkę do mikroskopii konfokalnej: Pokrój nerkę na plastry o grubości 1 mm za pomocą matrycy mózgowej (stal 1 mm, 40-75 g), aby ujednolicić grubość plastra. Przenieść plastry do 4% PFA i kontynuować utrwalanie w temperaturze 4 °C przez noc.
      2. Cała nerka do mikroskopii arkuszowej: Utrwalić nerki w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 48 godzin.

2. Czyszczenie

  1. Przygotowanie odczynnika
    1. Przygotować odczynnik CUBIC-L, mieszając 10% (wag./wag.) N-butylodietanoloaminę, 10% (wag./wag.) Triton X-100 i 80%ddH2O.
    2. Przygotować odczynnik CUBIC-R, mieszając 45% (wag./wag.) antypiryny, 30% (wag./wt) nikotynamidu, 0,5% (obj./obj.) N-butylodietanoloaminy i 24.5%ddH2O. Upewnij się, że roztwór ma pH 9,6-9,8 i współczynnik załamania światła (RI) 1,522,
      UWAGA: CUBIC-L służy do delipidacji, a CUBIC-R służy do dopasowywania współczynnika załamania światła.
  2. Procedura rozliczeniowa
    1. Pobrać próbki nerek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie oczyścić je w CUBIC-L, wstrząsając z prędkością 60 obr./min w temperaturze 37 °C. Wymienną piankę CUBIC-L należy wymieniać co 4 godziny (w przypadku plastrów nerki) lub co 24 godziny (w przypadku całej nerki) aż do uzyskania zadowalającej przezroczystości optycznej.
      UWAGA: Ten proces trwa 1 dzień w przypadku plastrów nerki i 5 dni w przypadku całej nerki.
    2. Przemyć próbki trzykrotnie w PBS, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę każda.
    3. Nałożyć CUBIC-R na próbki, wstrząsając próbkami w temperaturze 37 °C, 60 obr./min przez 6 godzin.
    4. Oczyszczone próbki należy obserwować bezpośrednio lub przechowywać je w czarnych probówkach wypełnionych CUBIC-R w temperaturze pokojowej przez 1 tydzień.

3. Akwizycja obrazu

  1. Obrazowanie konfokalne
    UWAGA: Zobrazuj pokrojone próbki nerek za pomocą mikroskopii konfokalnej (soczewki: obiektyw Plan Apo λ 4×/0,2 N1 lub obiektyw Plan Apo VC 10×/0,45 DIC N1). Rejestruj duże obrazy (np. 6052 μm x 6052 μm dla wycinka nerki) za pomocą z-stacków.
    1. Włącz mikroskop konfokalny w następującej kolejności: moc lasera, przełącznik sterowania konfokalnego, komputer, mikroskop i sprzęt konfokalny. Po uruchomieniu autotestu włącz oprogramowanie konfokalne.
    2. Wybierz odpowiedni obiektyw. Usuń próbkę z odczynnika CUBIC-R, umieść ją w naczyniu konfokalnym i przykryj, aby zapobiec wyschnięciu odczynnika CUBIC-R.
    3. Przesuń próbkę na środek pola widzenia i dostosuj płaszczyznę ogniskowej, aż będzie ostra.
    4. Zastosuj rekonstrukcję 3D (krok 3.1.4.1) i rekonstrukcję dużego obrazu (kroki 3.1.4.2-3.1.4.3).
      1. Rekonstrukcja 3D (konfokalna): Przełącz płaszczyznę powiększenia w jednym kierunku, aż nie będzie widoczna fluorescencja; ta pozycja jest zdefiniowana jako góra. Następnie przełącz płaszczyznę powiększenia w przeciwnym kierunku, aż nie będzie widoczna fluorescencja; Ta pozycja jest zdefiniowana jako dół. Kliknij przycisk Uruchom w prawym dolnym rogu okna dialogowego, aby rozpocząć skanowanie.
      2. Rekonstrukcja dużego obrazu (konfokalna): Przesuń pole widzenia na środek próbki i ustaw bieżącą pozycję jako środek. Wybierz pole widzenia 2 x 2.
      3. W interfejsie wielofunkcyjnym ND wybierz stos Z, aby zrekonstruować duże obrazy i ustawić różne opcje w panelu. Następnie naciśnij przycisk Uruchom do n, aby rozpocząć skanowanie.
  2. Obrazowanie mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego (LSFM)
    UWAGA: Zobrazuj całe nerki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z arkuszem światła (soczewka: obiektyw EC Plan-Neofluar 5x/0.16 (Medium n = 1.529)).
    1. Dołączanie próbki (LSFM):
      1. Przykleić przezroczystą nerkę do łącznika mocującego próbkę i poczekać, aż nerka zostanie mocno przymocowana.
      2. Namocz nerkę w pojemniku na próbkę i wepchnij pojemnik na próbkę do systemu mikroskopu. Zamknij właz.
    2. Obserwuj i skanuj (LSFM):
      1. W interfejsie Locate (Zlokalizuj) przenieś próbkę do odpowiedniej pozycji obserwacji. Przełącz się na interfejs Akwizycja, ustaw ścieżkę optyczną, wybierz laser 488 nm, LBF 405/488/561/640, blok filtra optycznego SBS LP 490, wybierz Kamera 2 i zmień pseudokolor na zielony.
      2. Wypełnij wartość Przesunięcie Z w lewo/w prawo zarejestrowaną wcześniej w podmenu Kanał. Wybierz najmniejsze powiększenie (0,36) i dostosuj je, aby uzyskać maksymalną klarowność.
    3. Znajdź granicę X\Y i zakres Z całego narządu. Dostosuj intensywność lasera i czas ekspozycji (najlepiej krótszy niż 10 ms), a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć.
    4. Jeśli tkanka jest zbyt duża, połącz dwa lub więcej obrazów za pomocą zszywania obrazów. Otwórz przechwycony plik za pomocą oprogramowania mikroskopowego (tutaj ZEISS ZEN 3.7). Wybierz opcję Processing > Method (Metoda przetwarzania) > Stitching > method (Parametr metody> Apply (Zastosuj), aby zakończyć zszywanie obrazów.

4. Przetwarzanie danych i kwantyfikacja

UWAGA: Przetwarzaj stosy obrazów za pomocą oprogramowania Imaris (analiza obrazu), używając funkcji Powierzchnia do oznaczania kłębuszków nerkowych i przeprowadzania analizy.

  1. Liczba kłębuszków nerkowych
    1. Importuj duże obrazy (mikroskopia konfokalna) lub obrazy zszyte (mikroskopia arkuszowa) do oprogramowania do analizy obrazu.
    2. Otwórz pliki w oprogramowaniu do analizy obrazu. Kliknij przycisk Powierzchnia, aby utworzyć nową powierzchnię. Postępuj zgodnie z instrukcjami w lewej dolnej części ekranu.
      1. Kliknij przycisk Dalej (przycisk strzałki w prawo) bez zaznaczania czegokolwiek.
      2. Zaznacz pole przed opcją Wygładzanie i wprowadź odpowiednią liczbę (np. 14.5), aby sterować szczegółami powierzchni. Wybierz opcję Odejmowanie tła w obszarze Thresholding (Określanie progów) i wypełnij pole przybliżoną średnią średnicą kłębuszków nerkowych. Kliknij przycisk Dalej.
      3. W razie potrzeby dostosuj i kliknij przycisk Dalej. Wybierz odpowiedni zakres i kliknij przycisk Dalej, aby utworzyć powierzchnię.
    3. Kliknij przycisk Filtruj, a następnie przycisk Dodaj, aby dodać Kulistość w celu odfiltrowania obiektów niesferycznych. Kliknij przycisk Duplikuj, aby skopiować tę nową powierzchnię.
    4. Kliknij przycisk Statystyki, a następnie kliknij przycisk Ogólny; oprogramowanie przedstawi liczbę kłębuszków nerkowych jako całkowitą liczbę powierzchni.
  2. Objętość kłębuszków nerkowych
    1. Utwórz powierzchnię kłębuszków nerkowych jak powyżej.
    2. Po zakończeniu tworzenia powierzchni kliknij przycisk Zaznaczenie, aby wybrać obiekty docelowe i przedstawić objętość każdego obiektu. Kliknij przycisk Zapisz i wyeksportuj statystyki do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.
  3. Objętość plastra lub całej nerki
    1. Importuj duże obrazy (mikroskopia konfokalna) lub obrazy zszyte (mikroskopia arkuszowa) do oprogramowania do analizy obrazu.
    2. Otwórz pliki w oprogramowaniu do analizy obrazu. Kliknij przycisk Powierzchnia, aby utworzyć nową powierzchnię. Postępuj zgodnie z instrukcjami w lewej dolnej części ekranu.
      1. Kliknij przycisk Dalej (przycisk strzałki w prawo) bez zaznaczania.
      2. Zaznacz pole przed opcją Wygładzanie i wprowadź odpowiednią liczbę (np. 50), aby sterować szczegółami powierzchni. Wybierz opcję Absolute Intensity (Intensywność bezwzględna) w obszarze Thresholding (Określanie progowe). Kliknij przycisk Dalej.
      3. Dopasuj powierzchnię, aż pokryje całą tkankę, a następnie kliknij przycisk Dalej. Kliknij przycisk Dalej, aby utworzyć powierzchnię.
    3. Kliknij przycisk Zaznaczenie, aby wybrać powierzchnię całej tkanki i przedstawić objętość tkanki. Kliknij przycisk Zapisz, aby wyeksportować statystyki do arkusza kalkulacyjnego.

Wyniki

Niniejsze badanie przedstawia prostą i wydajną metodę znakowania oraz analizy kłębuszków nerkowych u myszy.

Kłębuszki nerkowe (naczynia krwionośne) można skutecznie oznakować za pomocą wstrzykniętego do naczyń FITC-Dextranu. Po procesie utrwalania i udrożnienia (clearingu) nerka stała się przezroczysta (Rysunek 1A), a kłębuszki można było wyraźnie zaobserwować przy użyciu mikroskopii arkusza światła (Rysunek 1B) lub mikroskopii konfokalnej (Rysunek 1C). Mikroskopia konfokalna charakteryzuje się ograniczoną głębokością skanowania, dlatego nerki należy pociąć na plastry o grubości około 1 mm. W przypadku zastosowania mikroskopu arkusza światła, całą nerkę można skanować bezpośrednio.

Dzięki wyraźnym sygnałom możliwe było łatwe przeliczenie liczby kłębuszków. W rzeczywistości znakowanie było tak skuteczne, że kłębuszki można było policzyć gołym okiem. Można było również bezpośrednio zmierzyć objętość kłębuszków. Oczywiście oprogramowanie takie jak Imaris znacznie przyspieszyło ten proces. Korzystając z funkcji Surface, można było zaznaczyć wszystkie kłębuszki w przekroju nerki (Rysunek 2), w całej nerce (Rysunek 3) lub w wycinku (Rysunek 4), a następnie bezpośrednio uzyskać ich liczbę oraz objętość (Rysunek 2C, Rysunek 3C, Rysunek 4C). Można było również zmierzyć objętość zaznaczonego obszaru (Rysunek 2B, Rysunek 3B, Rysunek 4B), co pozwoliło na obliczenie stosunku objętości kłębuszków oraz ich częstotliwości występowania w określonym regionie lub w całej nerce (Rysunek 2D, Rysunek 3D, Rysunek 4D). W celu przeprowadzenia obliczeń w konkretnych obszarach można było zaznaczyć wybrany fragment nerki. Przedstawiono wycinek przypominający biopsję. Liczbę, objętość i częstotliwość występowania kłębuszków w wycinku również można było łatwo uzyskać (Rysunek 4).

Jak pokazano na rycinach, wyniki przedstawione w niniejszym badaniu to (N = liczba, F = częstotliwość, V = objętość, V(a) = objętość średnia, V(t) = objętość całkowita):

Nkłębuszków w plastrze= 1128, Nkłębuszków w całej nerce= 14006, Fkłębuszkowa w plastrze= 65 na mm3, Fkłębuszkowa w całej nerce= 105 na mm3, Vcałkowita kłębuszków w plastrze/Vplastra = 2,24%, Vcałkowita kłębuszków w całej nerce/Vnerki = 5,54%, V(a)kłębuszków w plastrze= 373654 µm3, V(a)kłębuszków w całej nerce = 521627 µm3, V(t)kłębuszków w plastrze= 421481724 µm3, V(t)kłębuszków w całej nerce = 7305386256 µm3 (Rycina 2D, Rycina 3D).

Nkłębuszków w pasku = 63, Fkłębuszków w pasku = 72 na mm3, Vcałkowita objętość kłębuszków w pasku/Vpasek = 2.23%, V(a)kłębuszków w pasku = 307698 µm3, V(t)kłębuszków w pasku = 19384977 µm3 (Rycina 4D).

Równowaga dynamiczna; analiza obrazu ziaren; mikroskopia fluorescencyjna; porównanie przed i po opracowaniu.
Rycina 1: Przezroczystość tkanki nerkowej i kłębki szczeczkowe znakowane FITC-dekstraną. (A) Nerka przed i po opracowaniu w celu uzyskania przezroczystości. (B) Obraz całej nerki zeskanowany za pomocą LSFM. (C) Obraz przekroju nerki zeskanowany mikroskopem konfokalnym (lewo: 4x, prawo: 10x). pasek skali = 300 µm (4x, konfokalny); pasek skali = 100 µm (10x, konfokalny); pasek skali = 700 µm (5x, powiększenie 0,36, LSFM). Kłębki szczeczkowe zostały znakowane FITC-dekstraną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza komórek 3D, ilościowe wyodrębnianie danych w mikroskopii, pomiar objętości, schemat.
Rysunek 2: Funkcja Surface zastosowana do skanu konfokalnego przekroju nerki. (A) Utworzono powierzchnię (Surface) przekroju oraz wszystkich kłębuszków. Kolor różowy = kłębuszki, niebieski = obszar poza powierzchnią przekroju nerki, zielony = oryginalne znakowanie naczyń (kłębuszki i niektóre duże naczynia). Pasek skali = 300 µm. (B) Po wybraniu powierzchni przekroju (lewa strona) lub kłębuszków (prawa strona) (wybrane obiekty zmieniają kolor na żółty), dane mogą zostać pobrane bezpośrednio (przerywana ramka zaznacza miejsce wyświetlania danych). (C) Bezpośrednio można uzyskać liczbę, objętość każdego pojedynczego kłębuszka oraz całkowitą objętość kłębuszków, a także objętość przekroju. (D) Wyeksportowane dane mogą zostać poddane dalszej analizie, co pozwala na wykonanie obliczeń, takich jak średnia objętość kłębuszków oraz stosunek objętości kłębuszków do wybranego obszaru. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat analizy objętości nerek; wizualizacja 3D, wykres danych, wyniki obliczeń objętości kłębuszków.
Rycina 3: Funkcja Surface zastosowana do całego skanowanego LSFM nerek. (A) Utworzono powierzchnię (Surface) całej nerki oraz wszystkich kłębuszków. Kolor różowy = kłębuszki, niebieski = zewnętrzna powierzchnia całej nerki, zielony = oryginalne oznaczenie naczyń (kłębuszki i niektóre duże naczynia). Pasek skali = 1000 µm. (B) Po wybraniu powierzchni nerki (lewo) lub kłębuszków (prawo) (wybrane obiekty zmieniają kolor na żółty), dane można uzyskać bezpośrednio (przerywana ramka zaznacza miejsce wyświetlania danych). (C) Można bezpośrednio uzyskać numer i objętość każdego pojedynczego kłębuszka, liczbę kłębuszków, a także objętość nerki. (D) Wyeksportowane dane mogą zostać poddane dalszej analizie w celu wykonania obliczeń, takich jak średnia objętość kłębuszków oraz stosunek objętości kłębuszków do objętości całej nerki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza objętości kłębuszków; modelowanie 3D i metryki danych; schemat przedstawia obliczenia objętości.
Rysunek 4: Funkcja Surface zastosowana do wybranego paska nerki. (A) Utworzono powierzchnię (Surface) paska oraz wszystkich kłębuszków. Kolor różowy = kłębuszki, niebieski = zewnętrzna powierzchnia paska nerki, zielony = oryginalne etykiety naczyń (kłębuszki i niektóre duże naczynia). Pasek skali = 150 µm. (B) Po wybraniu powierzchni paska (lewa strona) lub kłębuszków (prawa strona) (wybrane obiekty zmieniają kolor na żółty), dane można uzyskać bezpośrednio (przerywana ramka zaznacza miejsce wyświetlania danych). (C) Można bezpośrednio uzyskać liczbę, objętość każdego pojedynczego kłębuszka oraz całkowitą objętość kłębuszków, a także objętość paska. (D) Wyeksportowane dane mogą zostać poddane dalszej analizie w celu wykonania obliczeń, takich jak średnia objętość kłębuszków oraz stosunek objętości kłębuszków do wybranego obszaru. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Technologie oczyszczania tkanek można podzielić na 3 lub 4 grupy 29,30,31. Oczyszczanie tkanek na bazie rozpuszczalników organicznych (np. DISCO i PEGASOS), oczyszczanie tkanek na bazie wody (np. CUBIC) i oczyszczanie tkanek zatapiające hydrożel (np. CLARITY) zostały zastosowane w oczyszczaniu nerek 25,26,28,32. CUBIC, jak wykazaliśmy, działa najlepiej, gdy kłębuszki nerkowe (naczynia) są oznaczone FITC-Dextran. Ponadto CUBIC ma stosunkowo wygodniejszy proces obsługi i wymaga nie więcej niż zwykłe soczewki mikroskopowe27, ponieważ przetwarzane próbki nie muszą być moczone w odczynnikach organicznych33. Różne metody rozliczania i etykietowania statków mają jednak swoje zalety i wady; Naukowcy mogą być zmuszeni do eksperymentowania z różnymi podejściami, aby spełnić swoje specyficzne potrzeby.

Wcześniejsze badania wykazały, że kłębuszki nerkowe mogą być oznaczone w oczyszczonych nerkach, gdy naczynia krwionośne w nerkach były oznaczonejako 13,25,26,28. Dokładne wyjaśnienie tego zjawiska wymaga dalszych badań, ale można wywnioskować, że dobra metoda znakowania układu naczyniowego skutecznie oznacza również kłębuszki nerkowe. Na podstawie wyników eksperymentalnych zalecamy donaczyniowe wstrzyknięcie FITC-Dekstranu o średniej masie cząsteczkowej (np. 150 kDa). Ponieważ jednak etykietowanie opiera się na krążeniu krwi, ta metoda może nie oznaczyć kłębuszków nerkowych, gdy brakuje im krążenia.

LSFM umożliwia obserwację tkanek na dużą skalę, dzięki czemu jest bardziej odpowiedni do wykrywania całych kłębuszków nerkowych. Jednak mikroskopy z arkuszami świetlnymi mogą nie być dostępne w każdym laboratorium. Dlatego zapewniamy alternatywny zestaw protokołów przy użyciu zwykłych mikroskopów konfokalnych. Chociaż nerka musi zostać podzielona na wiele sekcji, możliwe jest uzyskanie danych, takich jak liczba i objętość kłębuszków nerkowych w całej nerce. Poza tym mikroskopia konfokalna zapewnia mniejszą ilość danych, co jest bardziej przyjazne dla przetwarzania danych.

Imaris zapewnia bezpośredni wyrzut danych. Należy jednak zadbać o to, aby sygnał analogowy był jak najbardziej zbliżony do oryginału. Ponadto oprogramowanie może zająć dużo czasu na przetwarzanie dużych plików, co może być frustrujące. Tak długo, jak kłębuszki nerkowe mogą być wyraźnie oznaczone i zwizualizowane, istnieje więcej niż jedno unikalne rozwiązanie do analizy danych. Naukowcy z różnych laboratoriów mogli pracować z własnym, znanym im oprogramowaniem i językami programowania.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82204951) oraz Sichuan Science and Technology Program (2020JDRC0102).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% PFABiosharp7007171800Fixation reaagen
502 Klej Deli7146Do mocowania nerki do adaptera mocującego próbkę 
AntypirynaAladynA110660Odczynnik czyszczący
Brain MatrixRWD Life Science1mm 40-75Krojenie tkanek
Mikroskopia konfokalnaNikonA1plusAkwizycja obrazu
FITC-DekstranSigma-AldrichFD150SOdczynnik do znakowania
Mikroskopia fluorescencyjna arkusza świetlnego Arkusz ZeissLight 7 Akwizycja obrazu
MyszyEnsiweierAdult C57BL/6 myszy (6 tygodni, 25– 30 g) 
N-butylodietanoloaminaAladdinB299095Odczynnik czyszczący
NikotynamidAladdinN105042Odczynnik czyszczący
Pentobarbital NatriumsalzSigma-AldrichP3761
Stabilizator żył ogonowychJINUOTAIJNT-FS35Napraw mysz do wstrzykiwań vail
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Odczynnik czyszczący

Bibliografia

  1. Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
  2. Bertram, J. F., Douglas-Denton, R. N., Diouf, B., Hughson, M. D., Hoy, W. E. Human nephron number: implications for health and disease. Pediatric Nephrology. 26 (9), 1529-1533 (2011).
  3. Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
  4. Rasch, R. Prevention of diabetic glomerulopathy in streptozotocin diabetic rats by insulin treatment. Kidney size and glomerular volume. Diabetologia. 16 (2), 125-128 (1979).
  5. Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2011).
  6. Bertram, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29, 575-580 (2014).
  7. Bertram, J. F., Soosaipillai, M. C., Ricardo, S. D., Ryan, G. B. Total numbers of glomeruli and individual glomerular cell types in the normal rat kidney. Cell and Tissue Research. 270 (1), 37-45 (1992).
  8. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  9. Bertram, J. F. Analyzing renal glomeruli with the new stereology. International Review of Cytology. 161, 111-172 (1995).
  10. Lødrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
  11. Lane, P. H., Steffes, M. W., Mauer, S. M. Estimation of glomerular volume: a comparison of four methods. Kidney International. 41 (4), 1085-1089 (1992).
  12. Baldelomar, E. J., Charlton, J. R., deRonde, K. A., Bennett, K. M. In vivo measurements of kidney glomerular number and size in healthy and Os(/+) mice using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 317 (4), F865-F873 (2019).
  13. Huang, J., et al. A cationic near infrared fluorescent agent and ethyl-cinnamate tissue clearing protocol for vascular staining and imaging. Scientific Reports. 9 (1), 521(2019).
  14. Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
  15. Basgen, J. M., Steffes, M. W., Stillman, A. E., Mauer, S. M. Estimating glomerular number in situ using magnetic resonance imaging and biopsy. Kidney International. 45 (6), 1668-1672 (1994).
  16. Prentice, B. M., Caprioli, R. M., Vuiblet, V. Label-free molecular imaging of the kidney. Kidney International. 92 (3), 580-598 (2017).
  17. Sanden, S. K., Wiggins, J. E., Goyal, M., Riggs, L. K., Wiggins, R. C. Evaluation of a thick and thin section method for estimation of podocyte number, glomerular volume, and glomerular volume per podocyte in rat kidney with Wilms' tumor-1 protein used as a podocyte nuclear marker. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (10), 2484-2493 (2003).
  18. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  20. Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127(2016).
  21. Ren, Z., et al. CUBIC-plus: An optimized method for rapid tissue clearing and decolorization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 568, 116-123 (2021).
  22. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  23. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  24. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  25. Zhu, J., et al. Optimal combinations of fluorescent vessel labeling and tissue clearing methods for three-dimensional visualization of vasculature. Neurophotonics. 9 (4), 045008(2022).
  26. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  27. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  28. Bai, L., et al. A simple and effective vascular network labeling method for transparent tissues of mice. Journal of Biophotonics. 16 (7), e202300042(2023).
  29. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  30. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. J. I. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. Iscience. 238 (2), 489-507 (2021).
  31. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
  32. Du, H., Hou, P., Zhang, W., Li, Q. Advances in CLARITY-based tissue clearing and imaging. Experimental and Therapeutic. 16 (3), 1567-1576 (2018).
  33. Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 89, e51382(2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

znakowanie kłębków nerkowychobrazowanie nerekprzejrzyszczanie tkanek metodą CUBICznakowanie FITC-dekstranemmikroskopia arkusza światłamikroskopia konfokalnaobrazowanie trójwymiaroweoprogramowanie do analizy obrazukwantyfikacja kłębków nerkowych
Wydajna i szybka metoda etykietowania i analizy kłębuszków mysich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.