Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych ram do dokumentowania fizycznego wpływu cytoszkieletu na kształt jądra i wewnętrzne organelle pozbawione błony w układzie oocytów myszy. Struktura może być dostosowana do użycia w innych typach komórek i kontekstach.

Streszczenie

Głównym wyzwaniem w zrozumieniu przyczyn kobiecej niepłodności jest wyjaśnienie mechanizmów rządzących rozwojem żeńskich komórek rozrodczych, zwanych oocytami. Ich rozwój charakteryzuje się wzrostem komórek i późniejszymi podziałami, dwiema krytycznymi fazami, które przygotowują oocyt do fuzji z plemnikiem w celu zainicjowania embriogenezy. Podczas wzrostu oocyty reorganizują swoją cytoplazmę, aby umieścić jądro w środku komórki, co jest zdarzeniem predyktorującym pomyślny rozwój oocytów u myszy i ludzi, a tym samym ich potencjał embriogenny. W oocytach myszy wykazano, że ta reorganizacja cytoplazmatyczna jest napędzana przez cytoszkielet, którego aktywność generuje siły mechaniczne, które poruszają, zmieniają położenie i penetrują jądro. W związku z tym ta transmisja siły cytoplazmatycznej do nukleoplazmatycznej dostraja dynamikę organelli przetwarzających jądrowe RNA, znanych jako kondensaty biomolekularne. Protokół ten zapewnia ramy eksperymentalne do dokumentowania, z wysoką rozdzielczością czasową, wpływu cytoszkieletu na jądro w różnych skalach przestrzennych w oocytach myszy. Szczegółowo opisano w nim etapy i narzędzia do obrazowania i analizy obrazu niezbędne do oceny i) aktywności cytoszkieletu w cytoplazmie oocytów, ii) mieszania jądra oocytu przez cytoszkielet oraz iii) jego wpływu na dynamikę kondensatu biomolekularnego w nukleoplazmie oocytu. Poza biologią oocytów, opracowane tutaj metody można zaadaptować do stosowania w komórkach somatycznych, aby w podobny sposób zająć się dostrajaniem dynamiki jądrowej w różnych skalach za pomocą cytoszkieletu.

Wprowadzenie

Pozycjonowanie jądrowe jest niezbędne dla wielu funkcji komórkowych i rozwojowych^1,2,3,4,5. Samice komórek rozrodczych ssaków zwane oocytami przebudowują swoją cytoplazmę, aby umieścić jądro w środku komórki, pomimo przejścia asymetrycznego podziału wielkości, który opiera się na późniejszym przesunięciu chromosomu poza centrum⁶ (Rysunek 1). To wyśrodkowanie jądra przewiduje pomyślny rozwój oocytów u myszy i ludzi^{7, 8}, a tym samym ich potencjał embriogenny (Rysunek 1).

Przebudowa cytoplazmatyczna w oocytach myszy jest napędzana głównie przez cytoszkielet aktomiozyny⁹ (Rysunek 2). Jego aktywność generuje siły mechaniczne, które poruszają, przemieszczają i przenikają do jądra¹⁰ (Rysunek 2). W związku z tym ta transmisja siły cytoplazmatycznej do nukleoplazmy dostraja dynamikę organelli przetwarzających RNA przekaźnika jądrowego zwanych plamkami jądrowymi¹¹, jeden z kilku bezbłonowych organelli w jądrze znanych jako kondensaty biomolekularne^{12,13,14,15,16} (Rysunek 2).

Obrazowanie na żywo miało decydujące znaczenie w rozszyfrowaniu funkcjonalnych implikacji mieszania jądrowego. Filmy przedstawiające wielogodzinną migrację jądrową, a także filmy o wysokiej rozdzielczości czasowej siatki aktynowej i cytoplazmy masowej, w dużej mierze przyczyniły się do opracowania teoretycznego modelu pozycjonowania jądra atomowego, łączącego różne skale czasowe⁹. Również filmy o wysokiej rozdzielczości czasowej cytoplazmy, zarysu jądra i składników jądrowych, takich jak chromatyna i kondensaty jądrowe, podkreśliły rolę mieszania jądra za pomocą cytoszkieletu w przetwarzaniu RNA i ekspresji genów w oocytach myszy, łącząc różne skale czasoprzestrzenne w komórce^10,11. Podsumowując, takie podejście oparte na krzyżowaniu skal oparte na obrazowaniu w czasie rzeczywistym dostarczyło pierwszego uzasadnienia łączącego pobudzenie cytoszkieletu jądra z sukcesem rozwojowym oocytów.

Protokół dostarcza potok obrazowania i analizy obrazów używany do badania transmisji sił cytoplazmatycznych (generowanych głównie przez F-aktynę, a częściowo przez mikrotubule) do jądra i jego wewnętrznych składników w oocytach myszy. Wynikiem tych eksperymentów jest uchwycenie kontinuum sił w różnych skalach przestrzennych, od cytoszkieletu w cytoplazmie do wnętrza jądra za pomocą filmów o wysokiej rozdzielczości czasowej, jak pokazano w dwóch ostatnich badaniach^10,11, które ustaliły związek między aktywnymi ruchami cytoplazmatycznymi, fluktuacjami konturu jądrowego, a także ruchami i fluktuacjami powierzchni jednego typu jądrowych kondensatów biomolekularnych: plamki jądrowe. To samo podejście można zastosować do innych systemów modelowych, w których oczekuje się, że siły cytoplazmatyczne ulegną zmianie, na przykład w kontekście złośliwych komórek nowotworowych¹⁷.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Wspólnoty Europejskiej i zostały zatwierdzone przez francuskie Ministerstwo Rolnictwa (nr autoryzacji 75-1170) oraz przez Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; Umowa GMO o numerze DUO-5291). Myszy trzymano w pomieszczeniu dla zwierząt w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, w temperaturze otoczenia 22-24 °C i wilgotności 40%-50%. Używane tutaj myszy to samica OF1 (Oncins France 1, w wieku od 8 do 12 tygodni) i samica C57BL/6 (w wieku od 10 do 14 tygodni).

1. Pobieranie i przygotowanie oocytów

1. Zbierz oocyty od myszy w wieku od 8 do 14 tygodni zgodnie z opisem w¹⁸ i¹⁹.
   1. Krótko mówiąc, najpierw wyekstrahuj jajniki od myszy, jak w¹⁸ do wstępnie ogrzanego (37 °C) podłoża M2 + albuminy surowicy bydlęcej (BSA) uzupełnionego 1 μM Milrinone¹⁹, co zapobiega wznowieniu mejozy w oocytach.
   2. Nakłuć pęcherzyki jajnikowe igłami chirurgicznymi, aby uwolnić rosnące oocyty z pęcherzyków antralnych (koniec wzrostu oocytów²⁰).
   3. Zebrać oocyty o wielkości potrzebnej do eksperymentów (hodowla i/lub w pełni rozwinięte oocyty) za pomocą mikropipety przeznaczonej do pobierania oocytów, przed umyciem i przeniesieniem do naczyń ze świeżą pożywką pod olejem mineralnym.
2. Mechanicznie oddzielić oocyty od antralnych komórek pęcherzykowych poprzez pipetowanie w górę i w dół i pozostawić do ustabilizowania się na 1 godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przed przystąpieniem do kolejnych etapów doświadczalnych.
   UWAGA: Oocyty są utrzymywane w temperaturze 37 °C podczas wszystkich etapów doświadczalnych. Na potrzeby tego protokołu pobrano największe oocyty, czyli te w pełni rozwinięte.

2. Mikroiniekcja komórek jajowych

UWAGA: Aby uchwycić aktywność cytoszkieletu w cytoplazmie, stosuje się obrazowanie na żywo w jasnym polu. Mikroiniekcja markerów fluorescencyjnych nie jest zatem konieczna, a protokół można wznowić na kroku 3. Do zobrazowania zarysu nuklearnego użyto Rango, sondy wyświetlającej znacznik YFP na swoim N-końcu i znacznik CFP na C-końcu^21,22. Po zobrazowaniu w oocytach przy długości fali 488 nm, oznacza całe jądro, z wyjątkiem jąderka²³, i wyświetla bardzo ostry kontur jądra. Do wizualizacji plamek jądrowych użyto SRSF2-GFP (NM_011358), markera plamek jądrowych¹¹. To samo podłoże jest używane do pobierania oocytów, mikroiniekcji, komplementarnej translacji RNA i obrazowania żywych komórek.

1. Linearyzuj plazmid Rango plazmidem SfiI lub plazmidem SRSF2-GFP z enzymami restrykcyjnymi AgeI.
2. Zsyntetyzuj zamknięte komplementarne RNA (cRNA) za pomocą odpowiedniego zestawu do transkrypcji in vitro zgodnie z promotorem (T3 dla Rango i T7 dla SRSF2-GFP) i oczyść je za pomocą zestawu do oczyszczania kolumnowego, jak opisano wcześniej²⁴.
   UWAGA: Poliadenylan SRSF2-GFP RNA przy użyciu zestawu do poliadenylacji w celu zwiększenia stabilności cRNA. Ze względu na różnice w szkielecie plazmidowym stosuje się dwa różne promotory.
3. Zmierz stężenia cRNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
4. Rozcieńczyć cRNA Rango do 1000 ng/μL i cRNA SRSF2-GFP do 600 ng/μL w dH₂O.
5. Odwirować podwielokrotność cRNA w temperaturze 4 °C przez co najmniej 60 minut w temperaturze 25 000 x g przed mikroiniekcją.
6. Wstrzyknąć cRNA kodujące YFP-Rango lub SRSF2-GFP zgodnie z opisem w^11,25 do cytoplazmy oocytów w 37 °C M2+ BSA+Milrinone za pomocą mikroiniektora.
7. Inkubować oocyty przez co najmniej 2 godziny w pożywce hodowlanej w temperaturze 37 °C w celu translacji cRNA.
8. Umieścić oocyty w małych (5 μl) kropelkach pożywki hodowlanej na naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm ze szklanym dnem pokrytym olejem mineralnym. Umieść jedną komórkę jajową na kroplę, aby uniknąć fotowybielania sąsiednich oocytów.

3. Obrazowanie żywych komórek

UWAGA: Żywe oocyty myszy były badane za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw do zanurzania w oleju Plan-APO 40x/1.25 NA, zmotoryzowany pokład skanujący, komorę inkubacyjną (37 °C), kamerę CCD sprzężoną z kołem filtrów i wirujący dysk. Obrazy o wysokiej rozdzielczości czasowej są pozyskiwane za pomocą Metamorph (zwanego dalej oprogramowaniem do obrazowania) w trybie akwizycji strumieniowej.

1. Otwórz okno Acquire (Pobierz) w oprogramowaniu do obrazowania.
2. Ustaw czas ekspozycji na 500 ms, obszar kamery na Full Chip i binning na 1.
3. Na karcie Pobieranie ustaw podświetlenie dla żądanego kanału. Aby zobrazować aktywność cytoplazmatyczną, oświetl oocyty światłem przechodzącym. Aby zobrazować jądro znakowane YFP-Rango lub SRSF2-GFP, należy oświetlić oocyty falą wzbudzenia o długości 491 nm.
4. W przypadku mieszania cytoplazmatycznego lub eksperymentów YFP-Rango, skup się na jąderku oocytu, które można łatwo zaobserwować w świetle przechodzącym (Rysunek 3A). Pozyskany zostanie tylko jeden samolot. W przypadku eksperymentów z plamkami jądrowymi skup się na kropelkach SRSF2-GFP (Rysunek 3C).
5. W zakładce Specjalne ustaw parametry, aby zoptymalizować szybkość akwizycji, jak poniżej.
   Migawka aparatu: otwarta dla ekspozycji
   Tryb czyszczenia: WYCZYŚĆ SEKWENCJĘ
6. Otwórz okno Stream Acquisition (Akwizycja strumienia) w oprogramowaniu do obrazowania. Ustaw parametry przesyłania strumieniowego zgodnie z eksperymentem. Dla obu badań^10,11, użyj parametrów opisanych poniżej.
   1. Na karcie Pobieranie ustaw następujące parametry.
      Tryb akwizycji: Strumień do RAM
      Liczba klatek: 480 (można zmniejszyć do 240 klatek, aby skrócić czas obrazowania)
      Parametry kamery: Rejestruj obrazy z szybkością klatek na sekundę
      Liczba (Nb) klatek do pominięcia: 0
   2. Na karcie Digital Camera Controller Parameters (Parametry kontrolera aparatu cyfrowego) ustaw następujące parametry.
      Stan kamery: HALT
      Tryb migawki: OPEN NEVER
      Tryb czyszczenia: CLEAR PRESEQUENCE
      Uwaga klatek do średniej: 1
      UWAGA 1: W trybie strumienia, po ustawieniu czasu ekspozycji, czas trwania filmu jest określany na podstawie liczby klatek. Na przykład czas naświetlania 500 ms i 480 klatek generują film trwający 4 minuty. Podczas akwizycji obrazu można wyświetlić podgląd.
7. Dostosuj obszar zainteresowania (ROI) wokół obiektu. Minimalizacja obszaru zwrotu z inwestycji skraca czas pozyskania.
8. Kliknij przycisk Acquire (Pobieranie) w oknie Stream Acquisition (Akwizycja strumienia), aby uruchomić film.
9. Zapisz film jako plik .tif po zakończeniu pozyskiwania.
   UWAGA: Aby śledzić struktury jądrowe podczas filmów o wysokiej rozdzielczości czasowej, sondy jądrowe (YFP-Rango i SRSF2-GFP) powinny charakteryzować się wysokim stosunkiem sygnału do szumu, aby ułatwić segmentację obiektów podczas dalszych etapów analizy obrazu. Egzogenne profile ekspresji SRSF2-GFP powinny być porównywalne z endogennymi immunologicznymi plamkami jądrowymi (Rysunek 3C-D). Zmiany w profilach ekspresji SRSF2-GFP w stosunku do barwienia endogennego mogą odzwierciedlać wysokie dawki iniekcji i translacji cRNA²⁶ (Rysunek 3C-D).

4. Analiza obrazu: Mieszanie cytoplazmatyczne

UWAGA: Mieszanie cytoplazmatyczne, które odzwierciedla intensywność aktywności cytoszkieletu opartego na aktynie w oocytach, jest określane przez analizy korelacji obrazów przy użyciu oprogramowania z poprzedniej publikacji lab⁹ i dostępne na²⁷. Oprogramowanie mierzy, ile intensywności pikseli jest zachowane między kolejnymi obrazami. Wynikiem jest utrata korelacji między obrazami w czasie, zaczynając od 1 i malejąc wykładniczo w czasie, jak w⁹.

1. Wyrównaj surowe obrazy poklatkowe (Δt=0,5 s) za pomocą wtyczki Fiji StackReg (Plugins>StackReg). Aby zainstalować wtyczkę StackReg²⁸, włącz aktualizację BIG-EPFL site²⁹, aby uzyskać dostęp do wtyczki.
2. Oblicz korelacje obrazu w jasnym polu w 3 do 4 regionach cytoplazmatycznych o wielkości ~300^μm2, wykonując poniższe czynności.
   1. Przytnij regiony i zapisz je jako osobne pliki filmowe. Otwórz okno Terminala.
   2. Wpisz oocyte, naciśnij spację, a następnie naciśnij Enter. Pojawi się okno o nazwie Signal and Slot. Wybierz przycięte pliki filmowe, które będą analizowane.
      UWAGA: Można wybrać kilka filmów jednocześnie.
3. Aplikacja zwraca pliki w tym samym folderze co filmy. Generowane są trzy różne pliki z rozszerzeniami .csv, .eps i .xls. Plik .xls zawiera dane do narysowania wykresów korelacji dla jednego regionu. Średnie wartości korelacji z różnych regionów w komórce.
4. Dla jasności wizualnej przekształć końcowe wartości korelacji, odejmując wartość każdego punktu czasowego od 1, aby uzyskać odwróconą krzywą wykładniczą, jak w ¹¹.

5. Analiza obrazu: Mapy wektorów cytoplazmatycznych

UWAGA: Mapy wektorów cytoplazmatycznych oocytów myszy zostały wygenerowane przez wtyczkę Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy (STICS)³⁰ wcześniej zaimplementowaną do wykrywania przepływów cytoplazmatycznych w oocytach myszy³¹ na Fidżi ³² i dostępne na ³³. Mapy pokazują prędkość przepływu cytoplazmycznego, wielkość i kierunek, jak in⁹ i¹¹.

1. Konwertuj obrazy poklatkowe w jasnym polu (Δt=0,5 s) do formatu 32-bitowego.
2. Wyrównaj obrazy za pomocą wtyczki Fiji StackReg w Plugins > StackReg i wybierz transformację Rigid Body.
3. Za pomocą stosu wtyczek odejmij średnią ruchomą jru v2 (w narzędziach Detrend z pakietu wtyczek STICS), pozbądź się nieruchomych struktur w filmie, odejmując uśredniony w czasie obraz filmu. Zaznacz pola wyboru Odejmij średnią statyczną i Wyjściowy stos podrzędny, wybierz opcję Utrzymuj średnią przestrzenną i ustaw okres na 5.
4. Narysuj ROI wokół oocytu, z wyłączeniem kory mózgowej, aby uniknąć efektów granicznych wtyczki.
5. Uruchom wtyczkę STICS map jru V2 (w narzędziach ICS) z rozmiarem podregionu 32 pikseli, rozmiarem kroku 16 pikseli, przesunięciem czasowym STICS wynoszącym 3, przesunięciami X i Y wynoszącymi 0, mnożnikiem prędkości 8, progiem wielkości 0 i polami wyboru Normalizuj długość wektora, Wektory środkowe, Prędkości wyjściowe i Użyj maski filmu.
   UWAGA: Wtyczka generuje mapę oocytu w formacie .tif, wyświetlając przepływy cytoplazmatyczne jako wektory z kolorami wskazującymi amplitudy przepływu, jak in⁹ i¹¹, oraz plik excel ze zmierzonymi prędkościami przepływu.

6. Analiza obrazu: Fluktuacje konturu jądrowego

UWAGA: Fluktuacje konturów jądrowych, które odzwierciedlają wzburzenie błony jądrowej, można określić na podstawie filmów z jądrami oznaczonymi YFP-Rango (Rysunek 4A,C). Analiza obrazu pod kątem fluktuacji konturów jądrowych wymaga Fiji i instalacji wtyczek StackReg (włącz aktualizację BIG-EPFL site²⁹, aby uzyskać dostęp do wtyczki StackReg), PureDenoise³⁴ i Ovocyte_nucleus. Wtyczka StackReg przeprowadza rejestrację obrazów w celu skorygowania możliwego ruchu globalnego. Wtyczka PureDenoise usuwa szumy z wielowymiarowych obrazów zniekształconych przez mieszany szum Poissona i Gaussa i wygładza kontur jądrowy. Wtyczka Ovocyte_nucleus proguje sygnał i wypełnia otwór odpowiadający jąderkowi w celu stworzenia binarnej maski jądra, wyrównania jej ze StackRreg i obliczenia odległości r od środka ciężkości maski jądra do obwodu maski dla wszystkich kątów θ (θ° od 0° do 360° co 1°), jak w Rysunek 4. Wszystkie kody dla tych wtyczek można znaleźć pod adresem ³⁵.

1. Na Fidżi w menu Plugins > CIRB > Verlhac wybierz Ovocyte Nucleus Shape (Kształt jądra owocytów).
2. W oknie dialogowym dokonaj następującego wyboru.
   1. Wybierz folder zawierający filmy do analizy.
   2. Wybierz kąt θ (można wybrać wartość od 1° do 360°, a wartość 1° została użyta dla optymalnej rozdzielczości konturu), marginesy do kadrowania (zalecane jest 5 μm, aby zachować całe jądro).
   3. Wybierz kalibrację XY i przedział czasu. Kliknij OK.
      UWAGA: Wyniki są dostarczane jako pliki .xls w folderze wyjściowym w folderze zawierającym oryginalne filmy. W tym pliku wyświetlane są wszystkie zmierzone promienie r dla każdego momentu t i każdego kąta θ. Przykład pliku wyjściowego znajduje się w tabeli uzupełniającej 1. Folder out zawiera również film przedstawiający maskę jądra.
3. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, oblicz średni promień R dla wszystkich punktów czasowych t dla każdego zdefiniowanego kąta θ. Pozwala to na wykreślenie średniego kształtu w czasie (Rysunek 4B). Patrz przykład w tabeli uzupełniającej 2.
4. Dla każdego t i θ odejmij średni promień R w czasie od promienia r. Wariancja (r-R)² jest miarą fluktuacji otoczki jądrowej.
5. Oblicz średnią fluktuacji dla wszystkich punktów czasowych t i wszystkich kątów θ dla każdego jądra i ostatecznie dla wszystkich jąder z jednego stanu.
   UWAGA: Gdy kształt jąder jest znacząco zmieniony, jak w przypadku przerwanego cytoszkieletu, jądra oznaczone YFP-Rango są obracane na Fidżi, aby zorientować gładką część w górę, a wgłębienie w dół, przed przystąpieniem do analizy fluktuacji konturu jądra, jak w¹⁰.

7. Analiza obrazu: Ruchy plamek jądrowych (dynamika dyfuzyjna)

UWAGA: Analiza ruchu plamek jądrowych pozwala wywnioskować rodzaj dynamiki (napędzanej, dyfuzyjnej lub ograniczonej) tych organelli na podstawie ich śladów.

1. Wybierz obrazy w trybie strumieniowym oocytów wykazujących ekspresję kropelek SRSF2-GFP, które poruszają się głównie w osi X-Y.
2. Korekta do wybielania zdjęć poklatkowych oocytów wykazujących ekspresję SRSF2-GFP przy użyciu metody dopasowania histogramu na Fidżi (Image > Adjust > Bleach Correction).
3. Wyrównaj obrazy za pomocą wtyczki Fiji StackReg.
4. Śledź centra kropel SRSF2-GFP za pomocą wtyczki Fiji Manual Tracking (Plugins > Tracking > Manual Tracking). Naciśnij Dodaj ścieżkę, aby rozpocząć śledzenie, a po zakończeniu naciśnij Zakończ ścieżkę. Nie włączaj korekcji centrowania.
5. Skopiuj ścieżki do pliku arkusza kalkulacyjnego, aby kontynuować obliczenia czasowych przemieszczeń średniokwadratowych (MSD), jak w ¹¹, i oblicz czasowe zaburzenia układu mięśniowo-szkieletowego na podstawie trajektorii kropli co 20 s.
6. Dopasuj krzywe (msd(t) = beta x t^α) metodą Neldera-Meada przy użyciu oprogramowania R do oszacowania wykładnika dyfuzji alfa (α).
7. Zmierz efektywny współczynnik dyfuzji, aby móc porównać różne warunki, ponieważ oczekuje się, że dyfuzja będzie anomalna (α< 1).
8. Obliczyć efektywny współczynnik dyfuzji D_eff z dopasowania liniowego (alfa = 1) w 40 pierwszych punktach (20 s) czasowej krzywej MSD i znormalizować przez wielkość kropli (D_eff w μm²/s x 3/2 πr w μm).

8. Analiza obrazu: Fluktuacje powierzchni plamek jądrowych

UWAGA: Ewolucja konturu plamki jądrowej w czasie, odczyt aktywnej transmisji siły na te organelle, została zmierzona za pomocą specjalnie zbudowanej wtyczki Radioak³⁶ do użytku na Fidżi i dostępnej na³⁷. Wtyczka wyodrębnia wartości promieni danego zaznaczenia dla wszystkich kątów wokół środka wyboru. Zmienność kształtu w czasie mierzono poprzez porównanie wartości promienia w stosunku do jego średniej wartości dla każdego kąta. Wtyczka pozwala na ilościowe określenie wahań kształtu i oferuje opcję wizualizacji tej dynamiki. Aby go zainstalować, pobierz plik Radioak_.jar i umieść go w folderze wtyczek na Fidżi. Uruchom ponownie Fidżi. Ta wtyczka jest zaktualizowaną wersją wtyczki używanej do analizy powyższych fluktuacji konturu jądrowego i implementacji porównywalnego potoku.

1. W filmach strumieniowych kropel SRSF2-GFP wybierz większe kropelki o porównywalnych rozmiarach (promień ~2,5 μm).
   UWAGA: Jeśli kropelki są zbyt małe, niewystarczająca rozdzielczość doprowadzi do nieprawidłowych pomiarów fluktuacji powierzchni.
2. Przytnij obrazy poklatkowe kropel w ciągu 15 s (Δt= 0,5 s), rysując prostokąt wokół kropli i wybierając Image > Crop (Rysunek 5).
3. Wyrównaj obrazy za pomocą wtyczki Fiji StackReg w Plugins > StackReg i wybierz transformację Rigid Body.
4. Wygładź obraz, aby usunąć szum wokół kropli za pomocą opcji Wygładzanie Fidżi w obszarze Proces.
5. Utwórz binarną maskę kropli za pomocą opcji Konwertuj na maskę na Fidżi w obszarze Proces > Binarny. Użyj metody domyślnej i ciemnej dla tła (Rysunek 5).
6. Przeanalizuj wygenerowaną binarną maskę kropelki za pomocą opcji Analizuj cząstki na Fidżi w obszarze Analizuj, wybierz opcje Wyczyść wyniki i Dodaj do menedżera i zapisz region zainteresowań (ROI) w RoiManager (Więcej > Zapisz) w formacie zip do odczytania przez Radioak. Zwroty akcji muszą być zapisane w folderze o nazwie kontury w tym samym folderze, w którym znajdują się filmy, w plikach o nazwie imagename_UnetCortex.zip dla każdego filmu, który ma zostać znaleziony przez Radioak.
7. W menu Fiji Plugins > CIRB > Radioak wybierz opcję Pobierz promienie, aby przetworzyć tylko jeden film, lub Wykonaj jeden folder, aby przeanalizować wszystkie filmy z tego samego folderu.
   UWAGA: Pojawi się okno, w którym można wybrać numer kąta i skalę. Radioak został uruchomiony z przyrostem kąta 1° od 0° do 360° (wejście 360) i wartości promieni zostały wyodrębnione.
8. Wybierz film lub folder zawierający filmy do analizy. Wyniki są dostarczane jako .xls plików (po jednym dla każdego filmu) w katalogu radioakres w folderze zawierającym oryginalne filmy. Każdy plik wyświetla wszystkie zmierzone promienie r (w μm, jeśli parametr skali został wypełniony) dla każdego czasu t (w przekroju) i każdego kąta (w radianach; Rysunek 5; zob. przykład .xls danych wyjściowych w tabeli uzupełniającej 3).
9. W arkuszu kalkulacyjnym oblicz średni promień R dla wszystkich punktów czasowych t dla każdego zdefiniowanego kąta (patrz przykład w tabeli uzupełniającej 4). Pozwala to na wykreślenie średniego kształtu w czasie.
10. Wykreślić wariancję (r-R)² w μm², która odpowiada miarze fluktuacji powierzchni kropli.

Wyniki

Panele obrazów w Rysunek 3 pokazuje przykłady typowego w pełni rozwiniętego oocytu (Rysunek 3A), nukleoplazmy w całkowicie rozwiniętym oocycie wykazującym ekspresję YFP-Rango (Rysunek 3B), nukleoplazmy w całkowicie rozwiniętym oocycie wykazującym prawidłową ekspresję (lewy panel; Rysunek 3C) lub nadmierny (prawy panel; Rysunek 3C) dawki cRNA SRSF2-GFP oraz barwienie immunologiczne plamek jądrowych w pełni rozwiniętym oocycie przy użyciu przeciwciała SC35 (Rysunek 3D). Prawidłową dawkę cRNA SRSF2-GFP do mikroiniekcji określono na podstawie wizualnych porównań profili ekspresji SRSF2-GFP z endogennymi profilami plamek jądrowych.

Cytoplazmatyczne siły mieszania w oocytach, jak wykazały poprzednie prace z laboratorium przy użyciu map wektorowych STICS i analizy korelacji obrazów (zobacz⁹ i¹¹), mogą być zmniejszone przez zaburzenia cytoszkieletu, zarówno genetyczne (np. mysz z mutacją FMN2), jak i chemiczne (np. cytochalazyna D). Mapy STICS oocytów kontrolnych wyświetlają liczne wektory, z kolorami wskazującymi na wysokie prędkości przepływu, podczas gdy mapy oocytów z zakłóconymi siłami cytoszkieletu wyświetlają mniej wektorów, z kolorami wskazującymi niskie prędkości przepływu. Podobnie, korelacja obrazu jest tracona bardzo szybko w komórkach jajowych z grupy kontrolnej w porównaniu z oocytami z zaburzonymi siłami cytoszkieletu. Można to zaobserwować na krzywych korelacji, z szybszym spadkiem krzywej dla oocytów kontrolnych w porównaniu z oocytami z zakłóconymi siłami cytoszkieletu⁹ lub szybszym wzrostem, gdy krzywa jest odwrócona¹¹.

Siły cytoszkieletu poruszają jądro i jego wewnętrzne organelle, w szczególności kondensaty jądrowe, takie jak plamki jądrowe^10,11. W Rysunek 4A, jądro oocytów kontrolnych jest poddawane istotnym fluktuacjom obwodowym, co jest widoczne za pomocą sondy jądrowej YFP-Rango. Kształt jądra w oocytach z zaburzonymi siłami cytoszkieletu jest stabilny w czasie (Rysunek 4C). Analiza fluktuacji konturów jądrowych jest kluczem do precyzyjnego określenia ilościowego pobudzenia. Określając wariancję odległości od środka ciężkości jądra do jego obrzeża, (r-R)² (Rysunek 4B), można określić ilościowo fluktuacje, pokazując, że pobudzenie jądra jest 6 razy wyższe w oocytach kontrolnych niż w oocytach z zakłóconymi siłami cytoszkieletu¹⁰. W Rysunek 5A-B, plamki jądrowe (kropelki SRSF2-GFP⁺) są pokazane w kontrolnych i zakłóconych kontekstach sił cytoplazmatycznych w wysokiej rozdzielczości czasowej. W grupie kontrolnej powierzchnia kropelki waha się znacznie bardziej niż powierzchnia kropel w oocytach z zakłóconymi siłami cytoplazmatycznymi, które można wizualizować i określać ilościowo za pomocą wtyczki Radioak³². Wizualnie, kolory zielony i czerwony (wyjście Radioak widoczne na dolnych obrazach Rysunek 5A-B) wskazują kąty, pod którymi wtyczka wykryła zmiany powierzchni między kolejnymi obrazami, a biały wskazuje na brak zmian powierzchni.

Rysunek 1: Ilustracja późnej oogenezy myszy i wczesnej embriogenezy. Ilustracja centrowania jądra, które zachodzi w późnym wzroście oocytów, centrowania chromosomu, które zachodzi podczas podziału oocytu, oraz wczesnych etapów (stadia 1-komórkowe i 2-komórkowe) embriogenezy. Genomy żeńskie (jądro oocytu i przedjądrze żeńskie) są koloru różowego, przedjądrze męskie jest niebieskie. Jądra zarodka (po fuzji genomów rodzicielskich) są fioletowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ilustracja cytoplazmatycznego i jądrowego przebudowy w różnych skalach u rosnących oocytów myszy. Ten rysunek podsumowuje kluczowe wnioski z^9,10,11. Ilustracja przebudowy cytoplazmy opartej na aktomiozynie, pobudzenia jądrowego i funkcjonalnej przebudowy biomolekularnego kondensatu jądrowego w skalach czasoprzestrzennych. Przemodelowanie plamek jądrowych poprzez krzyżowanie się między skalami wzmacnia reakcje biomolekularne związane z ich funkcją (tj. Splicing pre-mRNA). Należy zauważyć, że protokół ten pozwala na ocenę pobudzenia jądrowego tylko w skalach przestrzennych, ale nie czasowych, ponieważ wszystkie obrazowania są wykonywane z tą samą rozdzielczością czasową 0,5 s między klatkami obrazu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przykładowe obrazy w pełni rozwiniętego oocytu i nukleoplazmy. (A) Obraz w jasnym polu w pełni rozwiniętego oocytu pokazujący chromatynę (cyjan) otaczającą jąderko. Przerywane białe kółko wyznacza jądro. (B) Żywe jądro oocytu wykazujące ekspresję YFP-Rango; Zwróć uwagę na brak fluorescencji w jąderku. (C) Przykład żywego jądra oocytu wykazującego ekspresję SRSF2-GFP po mikroiniekcji prawidłowych dawek cRNA (lewy panel) lub wysokich dawek cRNA (prawy panel); Zwróć uwagę na fazę skondensowaną (kropelkową) i rozpuszczoną po lewej stronie oraz ich brak w stanie po prawej. (D) Barwienie immunologiczne plamkami jądrowymi w utrwalonym oocycie; zwróć uwagę na endogeniczny profil ekspresji, który jest porównywalny do tego w C (lewy panel). Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wyjścia wtyczki kontroli i zakłóconych fluktuacji konturów jądrowych. (A) Time-lapse jądra kontrolnego oocytu z ekspresją YFP-Rango (na górze) i odpowiadającej mu maski binarnej wygenerowanej przez wtyczkę Ovocyte_nucleus (na dole). (B) Zasada pomiaru fluktuacji zarysu jądra w czasie i w danym kierunku. Kierunki są wyznaczane przez kąt obrotu θ z krokiem 1° od 0° do 360°. Reprezentowane są dwa reprezentatywne kształty w t=0 s (żółty) i t=135 s (fioletowy). Niebieski kształt odpowiada średniemu kształtowi w czasie. (C) Fluktuacje zarysu jądra jądra w oocycie ze zmniejszonymi siłami cytoszkieletu spowodowane zakłóceniem zarówno F-aktyny (mysz z mutacją FMN2), jak i mikrotubul (leczenie nokodazolem; jak w¹⁰). Podziałka skali = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wyjścia wtyczki kontroli i zakłóceń fluktuacji powierzchni kropel. (A) Kadrowanie kontrolnej kropli jądrowej SRSF2-GFP zobrazowane z prędkością 500 ms na klatkę i pokazane w tabeli Ice Look Up Table (LUT) (na górze); binarna maska tej samej kropli wygenerowanej przez Fidżi (w środku); a wyjścia wtyczki Radioak po analizie fluktuacji powierzchni kropli (na dole), przy czym kolor zielony i czerwony oznaczają kąty, w których wtyczka wykryła zmiany powierzchni między kolejnymi obrazami, a biały oznacza brak zmian powierzchni. (B) Fluktuacje powierzchni kropli jądrowej w oocytach ze zmniejszonymi siłami cytoszkieletu spowodowanymi rozerwaniem zarówno F-aktyny, jak i mikrotubul (jak w¹¹). Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Przykład wyniku analizy wtyczki Ovocyte_nucleus. To samo jądro analizowane, co pokazane na Rysunek 4A. Theta (θ) to kąt w stopniach, a t1 do t600 odpowiada numerowi ramy, który można przeliczyć w czasie. Promienie są podane w μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Przykładowy arkusz kalkulacyjny używany do obliczania fluktuacji konturów jądrowych. To samo jądro analizowane, co pokazane na Rysunek 4A. Theta (θ) to kąt w stopniach, a t1 do t600 odpowiada numerowi ramy, który można przeliczyć w czasie. Zakładka Surowe i średnie: Promienie są w μm. Tab. r-R: Odległości r-R są podane w μm. Tabela (r-R)²: Wartości fluktuacji podane są w μm². Tabulatory x i y odpowiadają współrzędnym kartezjańskim promieni z zakładki Surowy i średni. Pozwalają one na narysowanie średniego kształtu jądra w czasie w zakładce średniego kształtu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3: Przykład wyniku analizy wtyczki Radioak. Ta sama kropla analizowana, co ta pokazana w Rysunek 5A. Pokazane są zmierzone promienie w różnych punktach czasowych i pod różnymi kątami. Promienie są podane w μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 4: Przykładowy arkusz kalkulacyjny używany do obliczania fluktuacji powierzchni kropel jądrowych. Ta sama kropla analizowana, co ta pokazana w Rysunek 5A. Theta (θ) to kąt w stopniach, a t1 do t600 odpowiada numerowi ramy, który można przeliczyć w czasie. Zakładka Surowe i średnie: Promienie są w μm. Tab. r-R: Odległości r-R są podane w μm. Tabela (r-R)²: Wartości fluktuacji podane są w μm². Tabors x i y odpowiadają współrzędnym kartezjańskim promieni z zakładki Surowy i średni. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Kluczowe kroki w tym protokole obejmują prawidłową mikroiniekcję oocytów bez wpływu na ich przeżycie lub normalne funkcjonowanie ^9,10,11, a także mikroiniekcję predefiniowanych ilości cRNA, które umożliwiłyby prawidłową wizualizację odpowiednich struktur, takich jak plamki jądrowe.

Ustalenie związku między dynamiką cytoplazmatyczną i (wewnątrz)jądrową jest niezbędne podczas badania, w jaki sposób cytoszkielet porusza jądro lub jego wnętrze. Protokół ten, z niewielkimi modyfikacjami, pozwala na to poprzez korelację intensywności mieszania cytoplazmatycznego z dynamiką kropel jądrowych YFP-Rango lub SRSF2-GFP (jak w¹¹). Aby kontynuować, oocyty powinny być najpierw filmowane przez 120 s w trybie jasnego pola, aby uchwycić mieszanie cytoplazmatyczne, a następnie natychmiast filmowane przez 120 s laserem o długości fali 491 nm w celu uchwycenia konturu jądra lub dynamiki kropel. W przypadku kropel jądrowych SRSF2-GFP korelację można po prostu ocenić, porównując ich efektywne współczynniki dyfuzji (patrz krok 7 w niniejszym protokole) z odwróconymi maksymalnymi wartościami intensywności mieszania cytoplazmatycznego uzyskanymi za pomocą analiz korelacji obrazu (patrz krok 4 w niniejszym protokole). Kolejną ważną kwestią jest wielkość kondensatów wybieranych do analiz fluktuacji powierzchni kropel. Krople o podobnej średnicy powinny być wybierane do analiz porównawczych, aby zapobiec odchyleniu, ponieważ rozmiar moduluje intensywność fluktuacji powierzchni.

Istnieją pewne ograniczenia dotyczące tego protokołu. Analizy fluktuacji konturów jądrowych opierają się na pełnym barwieniu wewnątrzjądrowym, takim jak YFP-Rango lub NLS-GFP. W przypadku analiz plamek jądrowych, mikroiniekcja nadmiernych ilości cRNA SRSF2-GFP może prowadzić do pozornych zmian we właściwościach separacji faz tego markera kondensatu (Figura 3C), jak wcześniej analizowane przez innych²⁶. Sprawdzenie, czy profile ekspresji białek egzogennych są porównywalne z endogennymi, ma zatem kluczowe znaczenie. Ponadto stosunkowo małe kropelki (promień <2 μm) powinny być wyłączone z procesów analizy fluktuacji powierzchni ze względu na ograniczenia rozdzielczości przestrzennej za pomocą zdefiniowanych tutaj narzędzi. Ten problem rozdzielczości można zwykle rozwiązać za pomocą bardziej rozdzielczych mikroskopów, które na przykład mogą być niezbędne do zbadania fluktuacji powierzchni mniejszych kondensatów w jądrze oocytu lub w znacznie mniejszym jądrze komórek somatycznych.

Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten umożliwia wychwytywanie mieszania jądra oocytu myszy za pomocą aktyny i cytoszkieletu mikrotubul w różnych skalach. W szczególności umożliwia dokumentowanie mobilizacji cytoplazmy opartej na cytoszkielecie, fluktuacji konturów jądrowych, wraz z podobnymi do cieczy przemieszczeniami plamek jądrowych i fluktuacjami powierzchni. Chociaż niektóre badania nad innymi typami komórek zajmują się niektórymi z tych kwestii 38,39,40 za pomocą odrębnych protokołów o różnej złożoności w indywidualnych skalach przestrzennych, ten prosty protokół zapewnia narzędzia niezbędne do rozwiązania wspomnianej dynamiki komórkowej w wielu skalach w jednym potoku roboczym po raz pierwszy. Co więcej, dane uzyskane w wyniku tego podejścia, uzupełnione o modelowanie biofizyczne, jak w^10,11, umożliwiają minimalnie inwazyjną ocenę: i) zmian w mechanice jądrowej¹⁰; ii) przenoszenie sił czynnych opartych na cytoszkielecie w cytoplazmie do kondensatów w jądrze¹¹; oraz iii) rozpraszanie tej aktywnej energii przez różne przedziały komórkowe ^10,11. Co ważne, protokół ten jest wszechstronny, ponieważ można go dostosować nie tylko do innych kondensatów jądrowych, takich jak jąderko²³, ale także do innych typów komórek, takich jak komórki rakowe, w których udokumentowano zmiany zarówno w zachowaniu cytoszkieletu, jak i kondensatu jądrowego ^17,41.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 Mikroskop DMI6000B z wirującym dyskiem	Yokogawa
	Mikrowtryskiwacz Leica
Femtojet	Eppendorf
Fidżi
Koło filtrów	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Oprogramowanie Metamorph	Obrazowanie uniwersalne,		wersja 7.7.9.0
Olej mineralny	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Myszy Thermo Scientific
OF1 i C57BL/6	Charles River Laboratories
Poly(A) Zestaw do usuwania odpadów	Kamera CCD Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3	Zestaw QImaging
RNAeasy	Przeciwciało Qiagen	74104
SC35	Abcam	ab11826	Przeciwciało w postaci plamki jądrowej; mysi anty-SRSF2/SC35 (1:400)
Plazmid SRSF2-GFP	OriGene Technologies	MG202528
NM_011358 mikropipeta do strippera	XLAB Solutions		specjalizuje się w pobieraniu oocytów
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Termostatyczna komora	Usługa
Windows Excel	Windows