Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65976

⸱

12 stycznia 2024

 ,  ,  , 
1Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Collège de France, CNRS, INSERM, Université PSL, 2Department of Developmental and Stem Cell Biology, Institut Pasteur, Université de Paris Cité, CNRS, 3Centre for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych ram do dokumentowania fizycznego wpływu cytoszkieletu na kształt jądra i wewnętrzne organelle pozbawione błony w układzie oocytów myszy. Struktura może być dostosowana do użycia w innych typach komórek i kontekstach.

Streszczenie

Głównym wyzwaniem w zrozumieniu przyczyn kobiecej niepłodności jest wyjaśnienie mechanizmów rządzących rozwojem żeńskich komórek rozrodczych, zwanych oocytami. Ich rozwój charakteryzuje się wzrostem komórek i późniejszymi podziałami, dwiema krytycznymi fazami, które przygotowują oocyt do fuzji z plemnikiem w celu zainicjowania embriogenezy. Podczas wzrostu oocyty reorganizują swoją cytoplazmę, aby umieścić jądro w środku komórki, co jest zdarzeniem predyktorującym pomyślny rozwój oocytów u myszy i ludzi, a tym samym ich potencjał embriogenny. W oocytach myszy wykazano, że ta reorganizacja cytoplazmatyczna jest napędzana przez cytoszkielet, którego aktywność generuje siły mechaniczne, które poruszają, zmieniają położenie i penetrują jądro. W związku z tym ta transmisja siły cytoplazmatycznej do nukleoplazmatycznej dostraja dynamikę organelli przetwarzających jądrowe RNA, znanych jako kondensaty biomolekularne. Protokół ten zapewnia ramy eksperymentalne do dokumentowania, z wysoką rozdzielczością czasową, wpływu cytoszkieletu na jądro w różnych skalach przestrzennych w oocytach myszy. Szczegółowo opisano w nim etapy i narzędzia do obrazowania i analizy obrazu niezbędne do oceny i) aktywności cytoszkieletu w cytoplazmie oocytów, ii) mieszania jądra oocytu przez cytoszkielet oraz iii) jego wpływu na dynamikę kondensatu biomolekularnego w nukleoplazmie oocytu. Poza biologią oocytów, opracowane tutaj metody można zaadaptować do stosowania w komórkach somatycznych, aby w podobny sposób zająć się dostrajaniem dynamiki jądrowej w różnych skalach za pomocą cytoszkieletu.

Wprowadzenie

Pozycjonowanie jądrowe jest niezbędne dla wielu funkcji komórkowych i rozwojowych1,2,3,4,5. Samice komórek rozrodczych ssaków zwane oocytami przebudowują swoją cytoplazmę, aby umieścić jądro w środku komórki, pomimo przejścia asymetrycznego podziału wielkości, który opiera się na późniejszym przesunięciu chromosomu poza centrum6 (Rysunek 1). To wyśrodkowanie jądra przewiduje pomyślny rozwój oocytów u myszy i ludzi7, 8, a tym samym ich potencjał embriogenny (Rysunek 1).

Przebudowa cytoplazmatyczna w oocytach myszy jest napędzana głównie przez cytoszkielet aktomiozyny9 (Rysunek 2). Jego aktywność generuje siły mechaniczne, które poruszają, przemieszczają i przenikają do jądra10 (Rysunek 2). W związku z tym ta transmisja siły cytoplazmatycznej do nukleoplazmy dostraja dynamikę organelli przetwarzających RNA przekaźnika jądrowego zwanych plamkami jądrowymi11, jeden z kilku bezbłonowych organelli w jądrze znanych jako kondensaty biomolekularne12,13,14,15,16 (Rysunek 2).

Obrazowanie na żywo miało decydujące znaczenie w rozszyfrowaniu funkcjonalnych implikacji mieszania jądrowego. Filmy przedstawiające wielogodzinną migrację jądrową, a także filmy o wysokiej rozdzielczości czasowej siatki aktynowej i cytoplazmy masowej, w dużej mierze przyczyniły się do opracowania teoretycznego modelu pozycjonowania jądra atomowego, łączącego różne skale czasowe9. Również filmy o wysokiej rozdzielczości czasowej cytoplazmy, zarysu jądra i składników jądrowych, takich jak chromatyna i kondensaty jądrowe, podkreśliły rolę mieszania jądra za pomocą cytoszkieletu w przetwarzaniu RNA i ekspresji genów w oocytach myszy, łącząc różne skale czasoprzestrzenne w komórce10,11. Podsumowując, takie podejście oparte na krzyżowaniu skal oparte na obrazowaniu w czasie rzeczywistym dostarczyło pierwszego uzasadnienia łączącego pobudzenie cytoszkieletu jądra z sukcesem rozwojowym oocytów.

Protokół dostarcza potok obrazowania i analizy obrazów używany do badania transmisji sił cytoplazmatycznych (generowanych głównie przez F-aktynę, a częściowo przez mikrotubule) do jądra i jego wewnętrznych składników w oocytach myszy. Wynikiem tych eksperymentów jest uchwycenie kontinuum sił w różnych skalach przestrzennych, od cytoszkieletu w cytoplazmie do wnętrza jądra za pomocą filmów o wysokiej rozdzielczości czasowej, jak pokazano w dwóch ostatnich badaniach10,11, które ustaliły związek między aktywnymi ruchami cytoplazmatycznymi, fluktuacjami konturu jądrowego, a także ruchami i fluktuacjami powierzchni jednego typu jądrowych kondensatów biomolekularnych: plamki jądrowe. To samo podejście można zastosować do innych systemów modelowych, w których oczekuje się, że siły cytoplazmatyczne ulegną zmianie, na przykład w kontekście złośliwych komórek nowotworowych17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Wspólnoty Europejskiej i zostały zatwierdzone przez francuskie Ministerstwo Rolnictwa (nr autoryzacji 75-1170) oraz przez Direction Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; Umowa GMO o numerze DUO-5291). Myszy trzymano w pomieszczeniu dla zwierząt w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, w temperaturze otoczenia 22-24 °C i wilgotności 40%-50%. Używane tutaj myszy to samica OF1 (Oncins France 1, w wieku od 8 do 12 tygodni) i samica C57BL/6 (w wieku od 10 do 14 tygodni).

1. Pobieranie i przygotowanie oocytów

  1. Zbierz oocyty od myszy w wieku od 8 do 14 tygodni zgodnie z opisem w18 i19.
    1. Krótko mówiąc, najpierw wyekstrahuj jajniki od myszy, jak w18 do wstępnie ogrzanego (37 °C) podłoża M2 + albuminy surowicy bydlęcej (BSA) uzupełnionego 1 μM Milrinone19, co zapobiega wznowieniu mejozy w oocytach.
    2. Nakłuć pęcherzyki jajnikowe igłami chirurgicznymi, aby uwolnić rosnące oocyty z pęcherzyków antralnych (koniec wzrostu oocytów20).
    3. Zebrać oocyty o wielkości potrzebnej do eksperymentów (hodowla i/lub w pełni rozwinięte oocyty) za pomocą mikropipety przeznaczonej do pobierania oocytów, przed umyciem i przeniesieniem do naczyń ze świeżą pożywką pod olejem mineralnym.
  2. Mechanicznie oddzielić oocyty od antralnych komórek pęcherzykowych poprzez pipetowanie w górę i w dół i pozostawić do ustabilizowania się na 1 godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przed przystąpieniem do kolejnych etapów doświadczalnych.
    UWAGA: Oocyty są utrzymywane w temperaturze 37 °C podczas wszystkich etapów doświadczalnych. Na potrzeby tego protokołu pobrano największe oocyty, czyli te w pełni rozwinięte.

2. Mikroiniekcja komórek jajowych

UWAGA: Aby uchwycić aktywność cytoszkieletu w cytoplazmie, stosuje się obrazowanie na żywo w jasnym polu. Mikroiniekcja markerów fluorescencyjnych nie jest zatem konieczna, a protokół można wznowić na kroku 3. Do zobrazowania zarysu nuklearnego użyto Rango, sondy wyświetlającej znacznik YFP na swoim N-końcu i znacznik CFP na C-końcu21,22. Po zobrazowaniu w oocytach przy długości fali 488 nm, oznacza całe jądro, z wyjątkiem jąderka23, i wyświetla bardzo ostry kontur jądra. Do wizualizacji plamek jądrowych użyto SRSF2-GFP (NM_011358), markera plamek jądrowych11. To samo podłoże jest używane do pobierania oocytów, mikroiniekcji, komplementarnej translacji RNA i obrazowania żywych komórek.

  1. Linearyzuj plazmid Rango plazmidem SfiI lub plazmidem SRSF2-GFP z enzymami restrykcyjnymi AgeI.
  2. Zsyntetyzuj zamknięte komplementarne RNA (cRNA) za pomocą odpowiedniego zestawu do transkrypcji in vitro zgodnie z promotorem (T3 dla Rango i T7 dla SRSF2-GFP) i oczyść je za pomocą zestawu do oczyszczania kolumnowego, jak opisano wcześniej24.
    UWAGA: Poliadenylan SRSF2-GFP RNA przy użyciu zestawu do poliadenylacji w celu zwiększenia stabilności cRNA. Ze względu na różnice w szkielecie plazmidowym stosuje się dwa różne promotory.
  3. Zmierz stężenia cRNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
  4. Rozcieńczyć cRNA Rango do 1000 ng/μL i cRNA SRSF2-GFP do 600 ng/μL w dH2O.
  5. Odwirować podwielokrotność cRNA w temperaturze 4 °C przez co najmniej 60 minut w temperaturze 25 000 x g przed mikroiniekcją.
  6. Wstrzyknąć cRNA kodujące YFP-Rango lub SRSF2-GFP zgodnie z opisem w11,25 do cytoplazmy oocytów w 37 °C M2+ BSA+Milrinone za pomocą mikroiniektora.
  7. Inkubować oocyty przez co najmniej 2 godziny w pożywce hodowlanej w temperaturze 37 °C w celu translacji cRNA.
  8. Umieścić oocyty w małych (5 μl) kropelkach pożywki hodowlanej na naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm ze szklanym dnem pokrytym olejem mineralnym. Umieść jedną komórkę jajową na kroplę, aby uniknąć fotowybielania sąsiednich oocytów.

3. Obrazowanie żywych komórek

UWAGA: Żywe oocyty myszy były badane za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw do zanurzania w oleju Plan-APO 40x/1.25 NA, zmotoryzowany pokład skanujący, komorę inkubacyjną (37 °C), kamerę CCD sprzężoną z kołem filtrów i wirujący dysk. Obrazy o wysokiej rozdzielczości czasowej są pozyskiwane za pomocą Metamorph (zwanego dalej oprogramowaniem do obrazowania) w trybie akwizycji strumieniowej.

  1. Otwórz okno Acquire (Pobierz) w oprogramowaniu do obrazowania.
  2. Ustaw czas ekspozycji na 500 ms, obszar kamery na Full Chip i binning na 1.
  3. Na karcie Pobieranie ustaw podświetlenie dla żądanego kanału. Aby zobrazować aktywność cytoplazmatyczną, oświetl oocyty światłem przechodzącym. Aby zobrazować jądro znakowane YFP-Rango lub SRSF2-GFP, należy oświetlić oocyty falą wzbudzenia o długości 491 nm.
  4. W przypadku mieszania cytoplazmatycznego lub eksperymentów YFP-Rango, skup się na jąderku oocytu, które można łatwo zaobserwować w świetle przechodzącym (Rysunek 3A). Pozyskany zostanie tylko jeden samolot. W przypadku eksperymentów z plamkami jądrowymi skup się na kropelkach SRSF2-GFP (Rysunek 3C).
  5. W zakładce Specjalne ustaw parametry, aby zoptymalizować szybkość akwizycji, jak poniżej.
    Migawka aparatu: otwarta dla ekspozycji
    Tryb czyszczenia: WYCZYŚĆ SEKWENCJĘ
  6. Otwórz okno Stream Acquisition (Akwizycja strumienia) w oprogramowaniu do obrazowania. Ustaw parametry przesyłania strumieniowego zgodnie z eksperymentem. Dla obu badań10,11, użyj parametrów opisanych poniżej.
    1. Na karcie Pobieranie ustaw następujące parametry.
      Tryb akwizycji: Strumień do RAM
      Liczba klatek: 480 (można zmniejszyć do 240 klatek, aby skrócić czas obrazowania)
      Parametry kamery: Rejestruj obrazy z szybkością klatek na sekundę
      Liczba (Nb) klatek do pominięcia: 0
    2. Na karcie Digital Camera Controller Parameters (Parametry kontrolera aparatu cyfrowego) ustaw następujące parametry.
      Stan kamery: HALT
      Tryb migawki: OPEN NEVER
      Tryb czyszczenia: CLEAR PRESEQUENCE
      Uwaga klatek do średniej: 1
      UWAGA 1: W trybie strumienia, po ustawieniu czasu ekspozycji, czas trwania filmu jest określany na podstawie liczby klatek. Na przykład czas naświetlania 500 ms i 480 klatek generują film trwający 4 minuty. Podczas akwizycji obrazu można wyświetlić podgląd.
  7. Dostosuj obszar zainteresowania (ROI) wokół obiektu. Minimalizacja obszaru zwrotu z inwestycji skraca czas pozyskania.
  8. Kliknij przycisk Acquire (Pobieranie) w oknie Stream Acquisition (Akwizycja strumienia), aby uruchomić film.
  9. Zapisz film jako plik .tif po zakończeniu pozyskiwania.
    UWAGA: Aby śledzić struktury jądrowe podczas filmów o wysokiej rozdzielczości czasowej, sondy jądrowe (YFP-Rango i SRSF2-GFP) powinny charakteryzować się wysokim stosunkiem sygnału do szumu, aby ułatwić segmentację obiektów podczas dalszych etapów analizy obrazu. Egzogenne profile ekspresji SRSF2-GFP powinny być porównywalne z endogennymi immunologicznymi plamkami jądrowymi (Rysunek 3C-D). Zmiany w profilach ekspresji SRSF2-GFP w stosunku do barwienia endogennego mogą odzwierciedlać wysokie dawki iniekcji i translacji cRNA26 (Rysunek 3C-D).

4. Analiza obrazu: Mieszanie cytoplazmatyczne

UWAGA: Mieszanie cytoplazmatyczne, które odzwierciedla intensywność aktywności cytoszkieletu opartego na aktynie w oocytach, jest określane przez analizy korelacji obrazów przy użyciu oprogramowania z poprzedniej publikacji lab9 i dostępne na27. Oprogramowanie mierzy, ile intensywności pikseli jest zachowane między kolejnymi obrazami. Wynikiem jest utrata korelacji między obrazami w czasie, zaczynając od 1 i malejąc wykładniczo w czasie, jak w9.

  1. Wyrównaj surowe obrazy poklatkowe (Δt=0,5 s) za pomocą wtyczki Fiji StackReg (Plugins>StackReg). Aby zainstalować wtyczkę StackReg28, włącz aktualizację BIG-EPFL site29, aby uzyskać dostęp do wtyczki.
  2. Oblicz korelacje obrazu w jasnym polu w 3 do 4 regionach cytoplazmatycznych o wielkości ~300μm2, wykonując poniższe czynności.
    1. Przytnij regiony i zapisz je jako osobne pliki filmowe. Otwórz okno Terminala.
    2. Wpisz oocyte, naciśnij spację, a następnie naciśnij Enter. Pojawi się okno o nazwie Signal and Slot. Wybierz przycięte pliki filmowe, które będą analizowane.
      UWAGA: Można wybrać kilka filmów jednocześnie.
  3. Aplikacja zwraca pliki w tym samym folderze co filmy. Generowane są trzy różne pliki z rozszerzeniami .csv, .eps i .xls. Plik .xls zawiera dane do narysowania wykresów korelacji dla jednego regionu. Średnie wartości korelacji z różnych regionów w komórce.
  4. Dla jasności wizualnej przekształć końcowe wartości korelacji, odejmując wartość każdego punktu czasowego od 1, aby uzyskać odwróconą krzywą wykładniczą, jak w 11.

5. Analiza obrazu: Mapy wektorów cytoplazmatycznych

UWAGA: Mapy wektorów cytoplazmatycznych oocytów myszy zostały wygenerowane przez wtyczkę Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy (STICS)30 wcześniej zaimplementowaną do wykrywania przepływów cytoplazmatycznych w oocytach myszy31 na Fidżi 32 i dostępne na 33. Mapy pokazują prędkość przepływu cytoplazmycznego, wielkość i kierunek, jak in9 i11.

  1. Konwertuj obrazy poklatkowe w jasnym polu (Δt=0,5 s) do formatu 32-bitowego.
  2. Wyrównaj obrazy za pomocą wtyczki Fiji StackReg w Plugins > StackReg i wybierz transformację Rigid Body.
  3. Za pomocą stosu wtyczek odejmij średnią ruchomą jru v2 (w narzędziach Detrend z pakietu wtyczek STICS), pozbądź się nieruchomych struktur w filmie, odejmując uśredniony w czasie obraz filmu. Zaznacz pola wyboru Odejmij średnią statyczną i Wyjściowy stos podrzędny, wybierz opcję Utrzymuj średnią przestrzenną i ustaw okres na 5.
  4. Narysuj ROI wokół oocytu, z wyłączeniem kory mózgowej, aby uniknąć efektów granicznych wtyczki.
  5. Uruchom wtyczkę STICS map jru V2 (w narzędziach ICS) z rozmiarem podregionu 32 pikseli, rozmiarem kroku 16 pikseli, przesunięciem czasowym STICS wynoszącym 3, przesunięciami X i Y wynoszącymi 0, mnożnikiem prędkości 8, progiem wielkości 0 i polami wyboru Normalizuj długość wektora, Wektory środkowe, Prędkości wyjściowe i Użyj maski filmu.
    UWAGA: Wtyczka generuje mapę oocytu w formacie .tif, wyświetlając przepływy cytoplazmatyczne jako wektory z kolorami wskazującymi amplitudy przepływu, jak in9 i11, oraz plik excel ze zmierzonymi prędkościami przepływu.

6. Analiza obrazu: Fluktuacje konturu jądrowego

UWAGA: Fluktuacje konturów jądrowych, które odzwierciedlają wzburzenie błony jądrowej, można określić na podstawie filmów z jądrami oznaczonymi YFP-Rango (Rysunek 4A,C). Analiza obrazu pod kątem fluktuacji konturów jądrowych wymaga Fiji i instalacji wtyczek StackReg (włącz aktualizację BIG-EPFL site29, aby uzyskać dostęp do wtyczki StackReg), PureDenoise34 i Ovocyte_nucleus. Wtyczka StackReg przeprowadza rejestrację obrazów w celu skorygowania możliwego ruchu globalnego. Wtyczka PureDenoise usuwa szumy z wielowymiarowych obrazów zniekształconych przez mieszany szum Poissona i Gaussa i wygładza kontur jądrowy. Wtyczka Ovocyte_nucleus proguje sygnał i wypełnia otwór odpowiadający jąderkowi w celu stworzenia binarnej maski jądra, wyrównania jej ze StackRreg i obliczenia odległości r od środka ciężkości maski jądra do obwodu maski dla wszystkich kątów θ (θ° od 0° do 360° co 1°), jak w Rysunek 4. Wszystkie kody dla tych wtyczek można znaleźć pod adresem 35.

  1. Na Fidżi w menu Plugins > CIRB > Verlhac wybierz Ovocyte Nucleus Shape (Kształt jądra owocytów).
  2. W oknie dialogowym dokonaj następującego wyboru.
    1. Wybierz folder zawierający filmy do analizy.
    2. Wybierz kąt θ (można wybrać wartość od 1° do 360°, a wartość 1° została użyta dla optymalnej rozdzielczości konturu), marginesy do kadrowania (zalecane jest 5 μm, aby zachować całe jądro).
    3. Wybierz kalibrację XY i przedział czasu. Kliknij OK.
      UWAGA: Wyniki są dostarczane jako pliki .xls w folderze wyjściowym w folderze zawierającym oryginalne filmy. W tym pliku wyświetlane są wszystkie zmierzone promienie r dla każdego momentu t i każdego kąta θ. Przykład pliku wyjściowego znajduje się w tabeli uzupełniającej 1. Folder out zawiera również film przedstawiający maskę jądra.
  3. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, oblicz średni promień R dla wszystkich punktów czasowych t dla każdego zdefiniowanego kąta θ. Pozwala to na wykreślenie średniego kształtu w czasie (Rysunek 4B). Patrz przykład w tabeli uzupełniającej 2.
  4. Dla każdego t i θ odejmij średni promień R w czasie od promienia r. Wariancja (r-R)2 jest miarą fluktuacji otoczki jądrowej.
  5. Oblicz średnią fluktuacji dla wszystkich punktów czasowych t i wszystkich kątów θ dla każdego jądra i ostatecznie dla wszystkich jąder z jednego stanu.
    UWAGA: Gdy kształt jąder jest znacząco zmieniony, jak w przypadku przerwanego cytoszkieletu, jądra oznaczone YFP-Rango są obracane na Fidżi, aby zorientować gładką część w górę, a wgłębienie w dół, przed przystąpieniem do analizy fluktuacji konturu jądra, jak w10.

7. Analiza obrazu: Ruchy plamek jądrowych (dynamika dyfuzyjna)

UWAGA: Analiza ruchu plamek jądrowych pozwala wywnioskować rodzaj dynamiki (napędzanej, dyfuzyjnej lub ograniczonej) tych organelli na podstawie ich śladów.

  1. Wybierz obrazy w trybie strumieniowym oocytów wykazujących ekspresję kropelek SRSF2-GFP, które poruszają się głównie w osi X-Y.
  2. Korekta do wybielania zdjęć poklatkowych oocytów wykazujących ekspresję SRSF2-GFP przy użyciu metody dopasowania histogramu na Fidżi (Image > Adjust > Bleach Correction).
  3. Wyrównaj obrazy za pomocą wtyczki Fiji StackReg.
  4. Śledź centra kropel SRSF2-GFP za pomocą wtyczki Fiji Manual Tracking (Plugins > Tracking > Manual Tracking). Naciśnij Dodaj ścieżkę, aby rozpocząć śledzenie, a po zakończeniu naciśnij Zakończ ścieżkę. Nie włączaj korekcji centrowania.
  5. Skopiuj ścieżki do pliku arkusza kalkulacyjnego, aby kontynuować obliczenia czasowych przemieszczeń średniokwadratowych (MSD), jak w 11, i oblicz czasowe zaburzenia układu mięśniowo-szkieletowego na podstawie trajektorii kropli co 20 s.
  6. Dopasuj krzywe (msd(t) = beta x tα) metodą Neldera-Meada przy użyciu oprogramowania R do oszacowania wykładnika dyfuzji alfa (α).
  7. Zmierz efektywny współczynnik dyfuzji, aby móc porównać różne warunki, ponieważ oczekuje się, że dyfuzja będzie anomalna (α< 1).
  8. Obliczyć efektywny współczynnik dyfuzji Deff z dopasowania liniowego (alfa = 1) w 40 pierwszych punktach (20 s) czasowej krzywej MSD i znormalizować przez wielkość kropli (Deff w μm2/s x 3/2 πr w μm).

8. Analiza obrazu: Fluktuacje powierzchni plamek jądrowych

UWAGA: Ewolucja konturu plamki jądrowej w czasie, odczyt aktywnej transmisji siły na te organelle, została zmierzona za pomocą specjalnie zbudowanej wtyczki Radioak36 do użytku na Fidżi i dostępnej na37. Wtyczka wyodrębnia wartości promieni danego zaznaczenia dla wszystkich kątów wokół środka wyboru. Zmienność kształtu w czasie mierzono poprzez porównanie wartości promienia w stosunku do jego średniej wartości dla każdego kąta. Wtyczka pozwala na ilościowe określenie wahań kształtu i oferuje opcję wizualizacji tej dynamiki. Aby go zainstalować, pobierz plik Radioak_.jar i umieść go w folderze wtyczek na Fidżi. Uruchom ponownie Fidżi. Ta wtyczka jest zaktualizowaną wersją wtyczki używanej do analizy powyższych fluktuacji konturu jądrowego i implementacji porównywalnego potoku.

  1. W filmach strumieniowych kropel SRSF2-GFP wybierz większe kropelki o porównywalnych rozmiarach (promień ~2,5 μm).
    UWAGA: Jeśli kropelki są zbyt małe, niewystarczająca rozdzielczość doprowadzi do nieprawidłowych pomiarów fluktuacji powierzchni.
  2. Przytnij obrazy poklatkowe kropel w ciągu 15 s (Δt= 0,5 s), rysując prostokąt wokół kropli i wybierając Image > Crop (Rysunek 5).
  3. Wyrównaj obrazy za pomocą wtyczki Fiji StackReg w Plugins > StackReg i wybierz transformację Rigid Body.
  4. Wygładź obraz, aby usunąć szum wokół kropli za pomocą opcji Wygładzanie Fidżi w obszarze Proces.
  5. Utwórz binarną maskę kropli za pomocą opcji Konwertuj na maskę na Fidżi w obszarze Proces > Binarny. Użyj metody domyślnej i ciemnej dla tła (Rysunek 5).
  6. Przeanalizuj wygenerowaną binarną maskę kropelki za pomocą opcji Analizuj cząstki na Fidżi w obszarze Analizuj, wybierz opcje Wyczyść wyniki i Dodaj do menedżera i zapisz region zainteresowań (ROI) w RoiManager (Więcej > Zapisz) w formacie zip do odczytania przez Radioak. Zwroty akcji muszą być zapisane w folderze o nazwie kontury w tym samym folderze, w którym znajdują się filmy, w plikach o nazwie imagename_UnetCortex.zip dla każdego filmu, który ma zostać znaleziony przez Radioak.
  7. W menu Fiji Plugins > CIRB > Radioak wybierz opcję Pobierz promienie, aby przetworzyć tylko jeden film, lub Wykonaj jeden folder, aby przeanalizować wszystkie filmy z tego samego folderu.
    UWAGA: Pojawi się okno, w którym można wybrać numer kąta i skalę. Radioak został uruchomiony z przyrostem kąta 1° od 0° do 360° (wejście 360) i wartości promieni zostały wyodrębnione.
  8. Wybierz film lub folder zawierający filmy do analizy. Wyniki są dostarczane jako .xls plików (po jednym dla każdego filmu) w katalogu radioakres w folderze zawierającym oryginalne filmy. Każdy plik wyświetla wszystkie zmierzone promienie r (w μm, jeśli parametr skali został wypełniony) dla każdego czasu t (w przekroju) i każdego kąta (w radianach; Rysunek 5; zob. przykład .xls danych wyjściowych w tabeli uzupełniającej 3).
  9. W arkuszu kalkulacyjnym oblicz średni promień R dla wszystkich punktów czasowych t dla każdego zdefiniowanego kąta (patrz przykład w tabeli uzupełniającej 4). Pozwala to na wykreślenie średniego kształtu w czasie.
  10. Wykreślić wariancję (r-R)2 w μm2, która odpowiada miarze fluktuacji powierzchni kropli.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Panele obrazów na Rysunku 3 przedstawiają przykłady typowego, w pełni wykształconego oocyta (Rysunek 3A), nukleoplazmę w w pełni wykształconym oocycie wykazującym ekspresję YFP-Rango (Rysunek 3B), nukleoplazmę w w pełni wykształconym oocycie wykazującym ekspresję prawidłowej (lewy panel; Rysunek 3C) lub nadmiernej (prawy panel; Rysunek 3C) dawki cRNA SRSF2-GFP oraz immunoba...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Kluczowe kroki w tym protokole obejmują prawidłową mikroiniekcję oocytów bez wpływu na ich przeżycie lub normalne funkcjonowanie 9,10,11, a także mikroiniekcję predefiniowanych ilości cRNA, które umożliwiłyby prawidłową wizualizację odpowiednich struktur, takich jak plamki jądrowe.

Ustalenie związku między dynamiką cytoplazmatyczną i (wewnątrz)jądrową jest niezbędne podczas badania, w jaki sposób cyto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

A.A.J. i M.A. wspólnie napisali manuskrypt, a wszyscy współautorzy skomentowali manuskrypt. M. A. jest wspierany przez CNRS i "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322).A.A.J. jest wspierany przez Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel i Fondation du Collège de France.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma A3311
CSU-X1-M1 Mikroskop DMI6000B z wirującym dyskiemYokogawa
 Mikrowtryskiwacz Leica
FemtojetEppendorf
Fidżi
Koło filtrówSutter Instruments Roper Scientific
FluorodishWorld Precision InstrumentsFD35-100
Oprogramowanie Metamorph Obrazowanie uniwersalne, wersja 7.7.9.0
Olej mineralnySigma AldrichM8410-1L
NanoDrop 2000 Myszy Thermo Scientific
OF1 i C57BL/6 Charles River Laboratories
Poly(A) Zestaw do usuwania odpadów Kamera CCD Thermo FisherAM1350
Retiga 3 Zestaw QImaging
RNAeasy Przeciwciało Qiagen74104
SC35Abcamab11826Przeciwciało w postaci plamki jądrowej; mysi anty-SRSF2/SC35 (1:400)
Plazmid SRSF2-GFP   OriGene TechnologiesMG202528
NM_011358 mikropipeta do strippera  XLAB Solutionsspecjalizuje się w pobieraniu oocytów
T3 mMessage mMachineThermo FisherAM1384 
T7 mMessage mMachine Thermo FisherAM13344
Termostatyczna komoraUsługa
Windows ExcelWindows
obrazowania żywotności

Bibliografia

  1. Quinlan, M. E. Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte. Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).
  2. Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. A physical perspective on cytoplasmic streaming. Interface Focus. 5 (4), 20150030(2015).
  3. Gundersen, G. G., Worman, H. J. Nuclear positioning. Cell. 152 (6), 1376-1389 (2013).
  4. Metzger, T. MAP and kinesin-dependent nuclear positioning is required for skeletal muscle function. Nature. 484 (7392), 120-124 (2012).
  5. Roman, W. Muscle repair after physiological damage relies on nuclear migration for cellular reconstruction. Science. 374 (6565), 355-359 (2021).
  6. Almonacid, M., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Control of nucleus positioning in mouse oocytes. Semin Cell Develop Biol. 82, 34-40 (2018).
  7. Brunet, S., Maro, B. Germinal vesicle position and meiotic maturation in mouse oocyte. Reproduction. 133 (6), 1069-1072 (2007).
  8. Levi, M., Ghetler, Y., Shulman, A., Shalgi, R. Morphological and molecular markers are correlated with maturation-competence of human oocytes. Hum Reprod. 28 (9), 2482-2489 (2013).
  9. Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 17 (4), 470-479 (2015).
  10. Almonacid, M., et al. Active fluctuations of the nuclear envelope shape the transcriptional dynamics in oocytes. Dev Cell. 51 (2), 145-157 (2019).
  11. Al Jord, A., et al. Cytoplasmic forces functionally reorganize nuclear condensates in oocytes. Nat Commun. 13 (1), 5070(2022).
  12. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), eaaf4382(2017).
  13. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev. Mol Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).
  14. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  15. Gordon, J. M., Phizicky, D. V., Neugebauer, K. M. Nuclear mechanisms of gene expression control: pre-mRNA splicing as a life or death decision. Curr Opin Genet Dev. 67, 67-76 (2021).
  16. Barutcu, A. R. Systematic mapping of nuclear domain-associated transcripts reveals speckles and lamina as hubs of functionally distinct retained introns. Mol Cell. 82 (5), 1035-1052.e9 (2022).
  17. Guo, M. Probing the stochastic, motor-driven properties of the cytoplasm using force spectrum microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
  18. Verlhac, M. H., Kubiak, J. Z., Clarke, H. J., Maro, B. Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes. Development. 120 (4), 1017-1025 (1994).
  19. Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M., Jones, K. T. APCcdh1 activity in mouse oocytes prevents entry into the first meiotic division. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-540 (2006).
  20. El-Hayek, S., Clarke, H. J. Control of oocyte growth and development by intercellular communication within the follicular niche. Results Probl Cell Differ. 58, 191-224 (2016).
  21. Dumont, J. A centriole- and RanGTP-independent spindle assembly pathway in meiosis I of vertebrate oocytes. J Cell Biol. 176 (3), 295-305 (2007).
  22. Kaláb, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells. Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).
  23. Lafontaine, D. L. J., Riback, J. A., Bascetin, R., Brangwynne, C. P. The nucleolus as a multiphase liquid condensate. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 165-182 (2021).
  24. Terret, M. E., et al. DOC1R: a MAP kinase substrate that control microtubule organization of metaphase II mouse oocytes. Development. 130 (21), 5169-5177 (2003).
  25. Dumont, J., Verlhac, M. H. Using FRET to study RanGTP gradients in live mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957, 107-120 (2013).
  26. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Gene Develop. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  27. OOCytes. , https://github.com/Carreau/OOCytes (2014).
  28. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  29. ImageJ. , https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl (2023).
  30. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys J. 88 (5), 3601-3614 (2005).
  31. Yi, K., et al. Dynamic maintenance of asymmetric meiotic spindle position through Arp2/3-complex-driven cytoplasmic streaming in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 13 (10), 1252-1258 (2011).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  33. Stowers ImageJ Plugins. , https://research.stowers.org/imagejplugins/ (2023).
  34. Luisier, F., Vonesch, C., Blu, T., Unser, M. Fast interscale wavelet denoising of Poisson-corrupted images. Signal Process. 90 (2), 415-427 (2010).
  35. Ovocyte_Nucleus. , https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus (2023).
  36. Letort, G. gletort/ImageJFiles: GLijplugs_v0.2.0. , doi: 10.5281/zenodo.6854802 (2022).
  37. ImageJFiles. , https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak (2023).
  38. Chu, F. Y., Haley, S. C., Zidovska, A. On the origin of shape fluctuations of the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (39), 10338-10343 (2017).
  39. Caragine, C. M., Haley, S. C., Zidovska, A. Surface fluctuations and coalescence of nucleolar droplets in the human cell nucleus. Phys Rev Lett. 121 (14), 148101(2018).
  40. Introini, V., Kidiyoor, G. R., Porcella, G., Cicuta, P., Cosentino Lagomarsino, M. Centripetal nuclear shape fluctuations associate with chromatin condensation in early prophase. Commun Biol. 6 (1), 1-11 (2023).
  41. Boija, A., Klein, I. A., Young, R. A. Biomolecular condensates and cancer. Cancer Cell. 39 (2), 174-192 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Cytoszkielet oocytuagitacja jądraoocyty mysiesiły cytoplazmatycznekondensaty biomolekularnemechanika jądraanaliza obrazuobrazowanie żywych komórekplamki jądrowetransdukcja mechaniczna
Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.