Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65978

⸱

9 lutego 2024

 ,  , 
1Center for Neuroscience at the University of Pittsburgh, 2Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 3Pittsburgh Center for Pain Research, University of Pittsburgh

W tym artykule

Podsumowanie

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają solidną analizę na poziomie populacji sygnalizacji neuronów czuciowych. W tym miejscu opracowaliśmy nowatorskie podejście, które pozwala na wizualizację in vivo GECI aktywności neuronów zwojów nerwu trójdzielnego szczurów.

Streszczenie

Genetycznie kodowane wskaźniki wapnia (GECI) umożliwiają technikom obrazowania monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego wapnia w docelowych populacjach komórek. Ich duży stosunek sygnału do szumu sprawia, że GECI są potężnym narzędziem do wykrywania aktywności wywołanej bodźcem w neuronach czuciowych. GECI ułatwiają analizę kodowania bodźców na poziomie populacji z liczbą neuronów, które mogą być badane jednocześnie. To kodowanie populacji jest najodpowiedniejsze dla porównania in vivo. Zwoje korzenia grzbietowego (DRG), w których znajduje się soma neuronów czuciowych unerwiających struktury somatyczne i trzewne poniżej szyi, są najczęściej wykorzystywane do obrazowania in vivo, ponieważ dostęp do tych struktur jest stosunkowo łatwy. Niedawno technika ta została wykorzystana u myszy do badania neuronów czuciowych w zwoju nerwu trójdzielnego (TG), który unerwia struktury jamy ustnej i twarzoczaszki. Istnieje wiele powodów, dla których warto badać TG oprócz DRG, w tym długą listę zespołów bólowych specyficznych dla struktur jamy ustnej i twarzoczaszki, które wydają się odzwierciedlać zmiany w aktywności neuronów czuciowych, takich jak neuralgia nerwu trójdzielnego. Myszy są najszerzej wykorzystywane w badaniach neuronów DRG i TG ze względu na dostępność narzędzi genetycznych. Jednak ze względu na różnice w wielkości, łatwości obsługi i potencjalnie ważne różnice gatunkowe, istnieją powody, aby badać neurony TG szczurów, a nie myszy. W związku z tym opracowaliśmy podejście do obrazowania neuronów TG szczurów in vivo. Wstrzyknęliśmy nowonarodzonym szczeniętom (p2) dootrzewnowo AAV kodujący GCaMP6s, co spowodowało >90% zakażenie neuronów TG i DRG. TG uwidoczniono u osoby dorosłej po kraniotomii i peeltyce, a zmiany fluorescencji GCaMP6s monitorowano w neuronach TG po stymulacji okolic żuchwy i szczęki twarzy. Potwierdziliśmy, że wzrost fluorescencji był wywołany bodźcem za pomocą blokady nerwów obwodowych. Chociaż podejście to ma wiele potencjalnych zastosowań, używamy go do scharakteryzowania subpopulacji neuronów TG zmienionych w wyniku uszkodzenia nerwów obwodowych.

Wprowadzenie

Somatosensacja, neuronalne kodowanie bodźców mechanicznych, termicznych i chemicznych uderzających w skórę lub inne struktury ciała, w tym mięśnie, kości i wnętrzności, zaczyna się od aktywności w pierwotnych neuronach doprowadzających, które unerwiają te struktury1. Podejścia elektrofizjologiczne oparte na pojedynczych jednostkach dostarczyły wielu informacji na temat podtypów aferentnych biorących udział w tym procesie, a także tego, jak ich właściwości bodźca-odpowiedzi mogą zmieniać się w czasie1,2,3. Jednakże, chociaż istnieją mocne dowody na poparcie teorii znakowanej linii, która sugeruje, że określone modalności sensoryczne są przenoszone przez określone subpopulacje neuronów, zdolność wielu subpopulacji neuronów do reagowania na te same typy bodźców mechanicznych, termicznych i chemicznych sugeruje, że większość bodźców somatosensorycznych jest kodowana przez wiele subpopulacji neuronów4, 5. Tak więc lepsze zrozumienie somatosensacji przyjdzie tylko dzięki możliwości badania aktywności 10, jeśli nie setek neuronów jednocześnie.

Postępy w podejściu optycznym wraz ze stosunkowo niedawnym pojawieniem się technik obrazowania konfokalnego, a następnie wielofotonowego i cyfrowego, umożliwiły wykonywanie stosunkowo nieinwazyjnych analiz aktywności neuronalnej na poziomie populacji6,7. Jedną z ostatnich przeszkód w zastosowaniu tej technologii było opracowanie narzędzi umożliwiających optyczną ocenę aktywności neuronalnej. Biorąc pod uwagę prędkość potencjału czynnościowego, który może rozpocząć się i zakończyć w czasie krótszym niż milisekunda, barwnik wrażliwy na napięcie, zdolny do śledzenia zmian potencjału błonowego z prędkością potencjału czynnościowego, byłby idealnym narzędziem do tego celu. Ale chociaż nastąpił ogromny postęp w tej dziedzinie7,8,9,10, stosunek sygnału do szumu dla wielu z tych barwników nadal nie jest wystarczająco wysoki, aby umożliwić analizę populacji setek neuronów na poziomie pojedynczej komórki. Jako alternatywne podejście badacze zwrócili się ku monitorowaniu zmian wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2 + ([Ca2 + ]i). Ograniczenia tej strategii były jasne od samego początku i obejmują fakt, że wzrost [Ca2+]i jest pośrednią miarą aktywności neuronalnej11; że wzrost [Ca2+]i może wystąpić niezależnie od napływu Ca2+ związanego z aktywacją kanałów Ca2+ bramkowanych napięciem (VGCCs)12,13; że wielkość i czas trwania stanu przejściowego Ca2+ mogą być kontrolowane przez procesy niezależne od aktywności VGCC11,12,14; i że przebieg czasowy stanów nieustalonych Ca2+ znacznie przekracza przebieg potencjału czynnościowego15. Niemniej jednak istnieje szereg istotnych zalet związanych ze stosowaniem Ca2+ jako pośredniej miary aktywności neuronalnej. Nie mniej ważny jest stosunek sygnału do szumu związany z większością wskaźników Ca2 +, odzwierciedlający zarówno wielkość zmiany w wewnątrzkomórkowym Ca2 +, jak i fakt, że sygnał powstaje z trójwymiarowej przestrzeni cytozolu, a nie z dwuwymiarowej przestrzeni błony komórkowej. Ponadto, wraz z rozwojem genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI), możliwe jest wykorzystanie strategii genetycznych do kierowania ekspresją wskaźników Ca2+ w określonych subpopulacjach komórek, ułatwiając analizy na poziomie populacji w nienaruszonych preparatach (np. patrz16).

Biorąc pod uwagę ilość narzędzi genetycznych dostępnych obecnie u myszy, nie powinno dziwić, że GECI były najczęściej stosowane u tego gatunku. Opracowano linie myszy z konstytutywną ekspresją GECI w subpopulacjach neuronów czuciowych7,16,17. Wraz z rozwojem linii myszy wyrażających rekombinazy w określonych typach komórek, możliwe jest zastosowanie jeszcze bardziej wyrafinowanych strategii do kontrolowania ekspresji GECI15. Jednak, chociaż narzędzia te są coraz potężniejsze, istnieje wiele powodów, dla których inne gatunki, takie jak szczury, mogą być bardziej odpowiednie do niektórych pytań eksperymentalnych. Należą do nich większy rozmiar, ułatwiający szereg eksperymentalnych manipulacji, które są trudne, jeśli nie niemożliwe, w przypadku mniejszej myszy; łatwość szkolenia szczurów w stosunkowo złożonych zadaniach behawioralnych; i przynajmniej kilka dowodów na to, że właściwości biofizyczne i wzorce ekspresji kilku kanałów jonowych w neuronach czuciowych szczurów mogą być bardziej podobne do tych obserwowanych w ludzkich neuronach czuciowych niż te same kanały u myszy w stosunku do klasy human18.

Podczas gdy transdukcja bodźców somatosensorycznych zazwyczaj odbywa się w peryferyjnych końcach pierwotnych aferentów, potencjał czynnościowy zainicjowany na peryferiach musi przejść przez strukturę, w której mieści się pierwotna somata aferentna, określana jako korzeń grzbietowy (DRG) lub zwoje nerwu trójdzielnego (TG), zanim dotrze do ośrodkowego układu nerwowego19. Chociaż istnieją dowody na to, że nie każdy potencjał czynnościowy rozchodzący się wzdłuż pierwszorzędowego aksonu aferentnego zaatakuje ciało komórki20, co jest konsekwencją faktu, że pierwotne somaty aferentne są połączone z głównym aksonem aferentnym za pomocą złącza T19, większość potencjałów czynnościowych zainicjowanych na peryferiach wydaje się atakować soma21. Daje to trzy korzyści eksperymentalne przy użyciu GECI do oceny kodowania populacji w pierwotnych aferentach: duży rozmiar ciała komórki w stosunku do aksonów dodatkowo zwiększa sygnał do szumu przy użyciu [Ca2 + ]i jako pośredniej miary aktywności aferentnej; DRG są na ogół łatwo dostępne; Ocena aktywności w miejscu, które jest przestrzennie odległe od końcówek doprowadzających, minimalizuje potencjalny wpływ operacji potrzebnej do odsłonięcia zwojów na właściwości bodziec-odpowiedź końcówek doprowadzających. Ponieważ jednak TG znajdują się pod mózgiem (lub nad paletą), są znacznie trudniej dostępne niż DRG. Co więcej, chociaż istnieje wiele podobieństw między neuronami DRG i TG, istnieje również rosnąca lista różnic. Obejmuje to z grubsza somatotopową organizację neuronów w klasie TG22, unikalne struktury unerwione, różne wzorce zakończenia centralnego końca23,24,25,26, a teraz rosnąca lista różnic zarówno w ekspresji genów27,28 i funkcjonalnym wyrażeniu receptora29. Ponadto, ponieważ jesteśmy zainteresowani identyfikacją obwodowych mechanizmów bólu, stosunkowo duża liczba zespołów bólowych, które wydają się być unikalne dla układu trójdzielnego (np. migrena, neuralgia nerwu trójdzielnego, zespół pieczenia jamy ustnej), które wydają się wiązać z nieprawidłową aktywnością u pierwotnych aferentów30,31,32, sugeruje, że TG musi być badany bezpośrednio.

Tak więc, podczas gdy właściwości bodźców-odpowiedzi neuronów TG były badane za pomocą GECI w klasie mouse16, ponieważ powody wymienione powyżej sugerują, że szczur może być bardziej odpowiednim gatunkiem do odpowiedzi na różnorodne pytania eksperymentalne, celem obecnego badania było opracowanie podejścia do wykorzystania GECI do badania neuronów TG u szczura. Aby to osiągnąć, zastosowaliśmy podejście wirusowe do kierowania ekspresją GECI GCaMP6s w obwodowym układzie nerwowym. Następnie usunęliśmy przodomózgowie, aby umożliwić dostęp do TG. Na koniec na twarz nałożono bodźce mechaniczne i termiczne, podczas gdy odpowiedzi neuronalne oceniano pod mikroskopią fluorescencyjną. Razem dane te wspierają rolę wykorzystania szczura do badania zmian w TG w wielu stanach, rozszerzając zestaw narzędzi dla badaczy zainteresowanych kodowaniem sensorycznym w układzie trójdzielnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z wykorzystaniem zwierząt w badaniach zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami określonymi przez National Institutes of Health oraz International Association for the Study of Pain i zostały zatwierdzone przez University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee (protokół #22051100). Pod koniec każdego eksperymentu szczury były poddawane eutanazji poprzez wykrwawianie z sercową perfuzją lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), podejście zatwierdzone przez Amerykańskie Stowarzyszenie Lekarzy Weterynaryjnych i IACUC Uniwersytetu w Pittsburghu.

1. Indukcja GCaMP

  1. Zamów szczury Sprague Dawley w ciąży w ciąży, aby młode mogły otrzymać zastrzyk w odpowiednim czasie po urodzeniu.
  2. Spryskaj rękawice 70% EtOH przed kontaktem z każdym szczeniakiem szczura. To zniechęci tamę do kanibalizacji młodych.
  3. Wymaz ze szczeniąt szczura (P1-2) z 70% EtOH i znieczulenie na lodzie przez 3 min.
  4. Wstrzyknąć 15 μl AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 (Addgene) dootrzewnowo za pomocą sterylnej, gazoszczelnej strzykawki Hamilton o pojemności 25 μl.

2. Operacja odsłonięcia zwoju nerwu trójdzielnego

  1. Podawać koktajl znieczulający (55 mg/kg ketaminy, 5,5 mg/kg ksylazyny, 1 mg/kg acepromazyny) dootrzewnowo w przeliczeniu na masę ciała 6-8 tygodniowym szczurom (około 150-200 g).
    UWAGA: Jest to na ogół wystarczające do utrzymania chirurgicznej płaszczyzny znieczulenia, ocenianej na podstawie braku odruchu wycofania na szkodliwe szczypanie tylnej łapy. Należy jednak uzupełnić izofluranem przez stożek nosowy, jeśli zwierzęta stają się lekkie.
  2. Po całkowitym znieczuleniu zgol włosy i wąsy głowy i twarzy.
  3. Zamontuj szczura na ramie stereotaktycznej z nausznikami i umieść pod nią poduszkę grzewczą (~37 oC), aby utrzymać temperaturę ciała.
  4. Monitoruj parametry życiowe (tętno, częstość oddechów, nasycenie krwi tlenem) za pomocą pulsoksymetru myszy lub porównywalnego.
    UWAGA: Temperatura ciała jest monitorowana za pomocą sondy doodbytniczej i utrzymywana poprzez umieszczenie szczurów na sterowanym sprzężeniem zwrotnym krążącym kocu wodnym.
  5. Umieść gazę zanurzoną w lodowatej soli fizjologicznej na głowie, aby zwęzić naczynia krwionośne i zminimalizować krwawienie. Używając skalpela w rozmiarze 15, wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry i mięśnia nad czaszką.
  6. Użyj cięcia skóry i mięśni, aby odsłonić czaszkę.
  7. Za pomocą okrągłego wiertła 1/4 ostrożnie przedziurawić nasadkę czaszki, aby odsłonić przodomózgowie. Następnie użyj rongeurs (miseczka 2,5 mm), aby ostrożnie przeciąć czaszkę.
  8. Za pomocą skalpela w rozmiarze 15 wykonaj nacięcie w mózgu (Bregma: -3,80) i opuszki węchowej.
    UWAGA: Przecięcie bardziej doogonowo poza ten punkt spowoduje śmierć szczura
  9. Użyj szpatułki, aby ostrożnie odłączyć oponę twardą od czaszki i delikatnie podnieś odcięty mózg, aby odsłonić TG i podstawę czaszki.
    UWAGA: Dodatkowe zastosowanie lodowatej perfuzji soli fizjologicznej podczas ekstrakcji zminimalizuje krwawienie i zoptymalizuje następujące pole preparacji.
  10. Za pomocą wstrzykiwacza kauterycznego zatamować wszelkie krwawienia wynikające z ekstrakcji.
    UWAGA: Przecięcie opony twardej spowoduje nieuniknione krwawienie. Najlepiej jest przygotować lodowaty aCSF (119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM glukozy, 2,5 mM CaCl2) do kąpieli jamy czaszki, aby pomóc zwęzić naczynia krwionośne przy jednoczesnym utrzymaniu zdrowia neuronów.

3. Obrazowanie GCaMP6s

UWAGA: Biorąc pod uwagę rozmiar i gęstość tych neuronów, używany system obrazowania i akwizycji danych (obiektyw, mikroskop, źródło światła, kamera) określi liczbę wizualizowanych komórek GECI+. Źródło światła, obiektyw i aparat będą również określać parametry używane do pozyskiwania obrazu, w tym czas ekspozycji i szybkość przechwytywania obrazu. Podczas gdy techniki wielofotonowe i konfokalne mogą być stosowane w zależności od parametrów eksperymentu, mikroskopia epifluorescencyjna może być wystarczająca do rozdzielenia wielu komórek. Można użyć dowolnego pakietu do akwizycji obrazu. Idealnie byłoby, gdyby aplikacja stymulująca była zablokowana czasowo z pakietem oprogramowania do akwizycji obrazu.

  1. Umieść jamę czaszki pod obiektywem i ustaw ostrość TG za pomocą światła widzialnego.
  2. Długość fali wzbudzenia GCaMP6s wynosi 496 nm, a długość fali emisji wynosi 513 nm, dlatego należy użyć odpowiednich kostek dichroicznych i filtrujących, aby zlokalizować komórki GCaMP+. Dostosuj ostrość, aby zlokalizować i rozwiązać obszar zwojów, w którym neurony reagują na bodźce zastosowane do recepcyjnego pola zainteresowania.
  3. Użyj celu 10x, aby umożliwić wizualizację większości neuronów w TG reagujących na bodźce mechaniczne zastosowane do obszaru twarzy o powierzchni 1cm2 16. Użyj suchego obiektywu 20x o dużej odległości roboczej (10,8 mm), aby zwiększyć rozdzielczość.
  4. Użyj oprogramowania do akwizycji (np. Metamorph) do zbierania danych fluorescencyjnych w czasie i w odpowiedzi na zastosowanie bodźca.
    1. Aby zminimalizować fotobielenie neuronów, należy stosować jak najkrótszy czas ekspozycji, aby wykryć wyjściowy i wywołany wzrost fluorescencji. Dzięki obiektywowi powietrznemu 20x, 0,40 NA, źródłu światła halogenku rtęci o mocy 120 W i komplementarnej kamerze metalowo-tlenkowo-półprzewodnikowej (CMOS) użytej w niniejszym badaniu, czasowi naświetlania 300 ms i szybkości akwizycji obrazu 3 Hz, uzyskaj stabilne nagrania podstawowe przez >90 min.
      UWAGA: 1) Te parametry akwizycji obrazu muszą być określone empirycznie. 2) Mechaniczne (szczotka, punktacja, wibracje, szczypanie), termiczne (ciepło i zimno) i chemiczne (kapsaicyna, mentol, mediatory stanu zapalnego) mogą być stosowane do pola recepcyjnego. Stosunkowo niedrogim podejściem subiektywnym jest ręczne stosowanie bodźców. Zalecane są jednak bardziej obiektywne i powtarzalne podejścia, w których siłowniki sterowane sprzężeniem zwrotnym mogą być używane do wielokrotnego stosowania ze znaną siłą. Podczas gdy urządzenia Peltiera sterowane sprzężeniem zwrotnym są przydatne do kontrolowanego ogrzewania i chłodzenia, nie są idealne do stymulacji termicznej zakrzywionej twarzy. Źródła światła podczerwonego sterowane sprzężeniem zwrotnym są alternatywą dla ogrzewania, a zimny natrysk jest mniej niż idealną alternatywą dla chłodzenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ponieważ wcześniej odnieśliśmy sukces w zastosowaniu serotypu AAV9 do infekcji neuronów sensorycznych szczura15, wykorzystaliśmy ten serotyp do ekspresji GCaMP6s w neuronach zwoju szyjnego (TG) szczura. W związku z tym najpierw postanowiliśmy ocenić wydajność infekcji neuronów sensorycznych za pomocą AAV9-CAG-GCaMP6s-WPRE-SV40 (AAV9-GCaMP), gdy wirus ten został podany noworodkom szczurów20. Wirus ten wykorzystuje promotor CAG, który indukuje i utrzymuje wysokie poziomy eksp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj demonstrujemy szybki, nieinwazyjny sposób generowania szczura GECI do obrazowania TG. Wybraliśmy promotor CAG, aby napędzać i utrzymywać wysoki poziom ekspresji genów. Podczas gdy poprzednie badania sugerują, że inne serotypy AAV mogą skutecznie napędzać ekspresję genów w neuronach DRG39, nasze wyniki są zgodne z niedawnym badaniem obejmującym dootrzewnowe wstrzyknięcie AAV u noworodków32, co wskazuje, że serotyp AAV9 jest wysoce skuteczny w infekcji neuronów czuciowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Dr Gold otrzymywał wsparcie grantowe od Grunenthala podczas opracowywania tego preparatu. Tematyka badań Grunenthala i preparatu opisanego w tym manuskrypcie nie pokrywały się. Żaden z pozostałych autorów nie ma do ujawnienia żadnych innych potencjalnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować doktorom Kathy Albers i Brianowi Davisowi za korzystanie z ich programu Leica Microscope and Metamorph, Charlesowi Warwickowi za pomoc w budowie naszego termicznego urządzenia Peltiera, oraz dr Raymondowi Sekuli za pomoc w rozwiązywaniu problemów związanych z przygotowaniem chirurgicznym. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) i R01NS122784 (MSG i RS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 Addgene100844-AAV9Wirus AAV9-GCaMP6s
Maleinian ACEpromazineCovetrus11695-0095-510 mg/ml
AnaSed (ksylazyna) do wstrzykiwańAKORN Animal Health23076-35-920 mg/ml
CTR5500 Skrzynka elektronicznaLeica11 888 820Zasilacz
Wiertło do zadziorówCutwell Ransom & Randolph¼ okrągły
DM 6000 FSLeica11 888 928Podstawka
EL6000LeicaEL6000Źródło światła z żarówką rtęciową 120 W
KleszczeFST11252-00Dumont No. 05
Friedman rongeursFST16000-14Rozmiar miseczki 2,5 mm
Friedman-Pearson rongeursFST16021-141 mm rozmiar miseczki
Poduszka grzewcza (podkładka do terapii temperaturowej)STRYKER8002-062-022
Chlorowodorek ketaminyCovetrus1695-0703-1100 mg/ml
Plan Fluor 20x/0,40Obiektyw LeicaMRH0010520x, 0,4 NA10,8 mm
Długopis kauteryzacyjny WD Power z uchwytem wysokotemperaturowymBovieHIT1Ręczny długopis kauteryzacyjny Change-A-Tip
Prime 95BFotometriaAparat CMOS Prime 95BSaline
Fisher ScientificNC02917990,9% sterylne ostrze skalpela z soli fizjologicznej
Fisher Scientific22-079-701rozmiar 15 jednorazowe ostrze
Szpatułka SzpatułkaBRI48-1460szpatułka do mózgu
Nożyczki sprężynoweFST91500-09Student Vannas, krawędź tnąca 5 mm
Nożyczki sprężynoweFST15012-12Noyes, krawędź tnąca 14 mm
STP6000 Inteligentny panel dotykowyLeica11 501 255Panel sterowania
StrzykawkaHamilton8020125 μ L Model 1702 Strzykawka Luer Tip
Podgrzewacz wodyAdroitHTP-1500
Długopis kauteryzacyjny

Bibliografia

  1. Gold, M. S., Gebhart, G. F. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med. 16 (11), 1248-1257 (2010).
  2. Gold, M. S., Caterina, M. J. The Senses: A Comprehensive Reference. , Academic Press. (2008).
  3. Lawson, S. N., Fang, X., Djouhri, L. Nociceptor subtypes and their incidence in rat lumbar dorsal root ganglia (DRGs): focussing on C-polymodal nociceptors, Aβ-nociceptors, moderate pressure receptors and their receptive field depths. Curr Opin Physiol. 11, 125-146 (2019).
  4. Handler, A., Ginty, D. D. The mechanosensory neurons of touch and their mechanisms of activation. Nat Rev Neurosci. 22 (9), 521-537 (2021).
  5. Jankowski, M. P., et al. Cutaneous neurturin overexpression alters mechanical, thermal, and cold responsiveness in physiologically identified primary afferents. J Neurophysiol. 117 (3), 1258-1265 (2017).
  6. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. 192, 64826(2023).
  7. Anderson, M., Zheng, Q., Dong, X. Investigation of pain mechanisms by calcium imaging approaches. Neurosci Bull. 34 (1), 194-199 (2018).
  8. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  9. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).
  10. Tada, M., Takeuchi, A., Hashizume, M., Kitamura, K., Kano, M. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo. Eur J Neurosci. 39 (11), 1720-1728 (2014).
  11. Lu, S. G., Zhang, X., Gold, M. S. Intracellular calcium regulation among subpopulations of rat dorsal root ganglion neurons. J Physiol. 577 (Pt 1), 169-190 (2006).
  12. Warwick, C., et al. Cell type-specific calcium imaging of central sensitization in mouse dorsal horn. Nat Commun. 13 (1), 5199(2022).
  13. Scheff, N. N., Yilmaz, E., Gold, M. S. The properties, distribution and function of Na(+)-Ca(2+) exchanger isoforms in rat cutaneous sensory neurons. J Physiol. 592 (Pt 22), 4969-4993 (2014).
  14. Scheff, N. N., Gold, M. S. Trafficking of na+/ca2+ exchanger to the site of persistent inflammation in nociceptive afferents. J Neurosci. 35 (22), 8423-8432 (2015).
  15. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225(2020).
  16. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954 (2017).
  17. Cichon, J., et al. Imaging neuronal activity in the central and peripheral nervous systems using new Thy1.2-GCaMP6 transgenic mouse lines. J Neurosci Methods. 334, 108535(2020).
  18. Zhang, X., et al. Nicotine evoked currents in human primary sensory neurons. J Pain. 20 (7), 810-818 (2019).
  19. Devor, M. Unexplained peculiarities of the dorsal root ganglion. Pain. Suppl 6, S27-S35 (1999).
  20. Amir, R., Devor, M. Electrical excitability of the soma of sensory neurons is required for spike invasion of the soma, but not for through-conduction. Biophys J. 84 (4), 2181-2191 (2003).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Gregg, J. M., Dixon, A. D. Somatotopic organization of the trigeminal ganglion in the rat. Arch Oral Biol. 18 (4), 487-498 (1973).
  23. Dessem, D., Moritani, M., Ambalavanar, R. Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem. J Neurophysiol. 98 (1), 214-223 (2007).
  24. Dessem, D., Luo, P. Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat. Exp Brain Res. 128 (4), 451-459 (1999).
  25. Sessle, B. J., Dubner, R., Greenwood, L. F., Lucier, G. E. Descending influences of periaqueductal gray matter and somatosensory cerebral cortex on neurones in trigeminal brain stem nuclei. Can J Physiol Pharmacol. 54 (1), 66-69 (1976).
  26. Shammah-Lagnado, S. J., Negrão, N., Silva, B. A., Ricardo, J. A. Afferent connections of the nuclei reticularis pontis oralis and caudalis: a horseradish peroxidase study in the rat. Neuroscience. 20 (3), 961-989 (1987).
  27. Korczeniewska, O. A., et al. Differential gene expression changes in the dorsal root versus trigeminal ganglia following peripheral nerve injury in rats. Eur J Pain. 24 (5), 967-982 (2020).
  28. Megat, S., et al. Differences between dorsal root and trigeminal ganglion nociceptors in mice revealed by translational profiling. J Neurosci. 39 (35), 6829-6847 (2019).
  29. Pineda-Farias, J. B., Loeza-Alcocer, E., Nagarajan, V., Gold, M. S., Sekula, R. F. Jr Mechanisms underlying the selective therapeutic efficacy of carbamazepine for attenuation of trigeminal nerve injury pain. J Neurosci. 41 (43), 8991-9007 (2021).
  30. Burchiel, K. J., Baumann, T. K. Pathophysiology of trigeminal neuralgia: new evidence from a trigeminal ganglion intraoperative microneurographic recording. Case report. J Neurosurg. 101 (5), 872-873 (2004).
  31. Jääskeläinen, S. K. Is burning mouth syndrome a neuropathic pain condition. Pain. 159 (3), 610-613 (2018).
  32. Ashina, M., et al. Migraine and the trigeminovascular system-40 years and counting. Lancet Neurol. 18 (8), 795-804 (2019).
  33. Yang, O. J., et al. Evaluating the transduction efficiency of systemically delivered AAV vectors in the rat nervous system. Front Neurosci. 17, 1001007(2023).
  34. Gemes, G., et al. Calcium signaling in intact dorsalroot ganglia: New observations and the effect of injury. Anesthesiology. 113 (1), 134-146 (2010).
  35. Xu, Q., Dong, X. Calcium imaging approaches in investigation of pain mechanism in the spinal cord. Exp Neurol. 317, 129-132 (2019).
  36. Wu, W., et al. Long-term in vivo imaging of mouse spinal cord through an optically cleared intervertebral window. Nat Commun. 13 (1), 1959(2022).
  37. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Front Neural Circuits. 14, 25(2020).
  38. Romano, S. A., et al. An integrated calcium imaging processing toolbox for the analysis of neuronal population dynamics. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005526(2017).
  39. Mason, M. R., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
  40. Sharma, N., et al. The emergence of transcriptional identity in somatosensory neurons. Nature. 577 (7790), 392-398 (2020).
  41. Matsuka, Y., Neubert, J. K., Maidment, N. T., Spigelman, I. Concurrent release of ATP and substance P within guinea pig trigeminal ganglia in vivo. Brain Res. 915 (2), 248-255 (2001).
  42. Hu, M. Visualization of trigeminal ganglion neuronal activities in mice. Curr Protoc Cell .Biol. 83 (1), e84(2019).
  43. von Buchholtz, L. J., et al. Decoding cellular mechanisms for mechanosensory discrimination. Neuron. 109 (2), 285-298 (2021).
  44. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. elife. 8, e38173(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Obrazowanie in vivogenetycznie kodowane wskaźniki wapniaból neuropatycznymodel szczurzyfluorescencja GCaMP6sstymulacja mechanicznauszkodzenie nerwu obwodowego
In-vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów czuciowych w zwoju trójdzielnym szczura
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.