Method Article

Polimeryzacja dwufotonowa: druk 3D urządzeń do hodowli komórek neuronalnych w mikroskali

DOI:

10.3791/66142

⸱

June 7th, 2024

 ,  , 
1Neuroscience Department, International School for Advanced Studies, 2Mathematics Department, International School for Advanced Studies

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Druk 3D w skali mikrometrycznej umożliwia szybkie prototypowanie urządzeń polimerowych do hodowli komórek neuronalnych. Jako dowód słuszności zasady, połączenia strukturalne między neuronami były ograniczane przez tworzenie barier i kanałów wpływających na rozrost neurytów, podczas gdy funkcjonalne konsekwencje takiej manipulacji zaobserwowano za pomocą elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowle neuronów są referencyjnym modelem eksperymentalnym od kilkudziesięciu lat. Brakuje jednak układu komórek 3D, ograniczeń przestrzennych dotyczących wzrostu neurytów i realistycznych połączeń synaptycznych. To ostatnie ogranicza badania nad strukturą i funkcją w kontekście kompartmentalizacji i zmniejsza znaczenie kultur w neurobiologii. Przybliżenie ex vivo ustrukturyzowanego anatomicznego układu połączeń synaptycznych nie jest trywialne, mimo że jest kluczem do powstania rytmów, plastyczności synaptycznej i ostatecznie patofizjologii mózgu. W tym przypadku polimeryzacja dwufotonowa (2PP) jest stosowana jako technika druku 3D, umożliwiająca szybkie wytwarzanie polimerowych urządzeń do hodowli komórek przy użyciu polidimetylosiloksanu (PDMS) w skali mikrometrycznej. W porównaniu z konwencjonalnymi technikami formowania replik opartymi na mikrofotolitografii, druk w mikroskali 2PP umożliwia szybką i niedrogą realizację prototypów. Protokół ten ilustruje projektowanie i wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych opartych na PDMS, mających na celu hodowlę modułowych sieci neuronowych. Jako dowód słuszności zasady przedstawiono urządzenie dwukomorowe, które fizycznie ogranicza łączność. W szczególności faworyzuje się asymetryczny wyrostek aksonalny podczas rozwoju ex vivo i pozwala się na kierowanie z jednej komory do drugiej. W celu zbadania funkcjonalnych konsekwencji jednokierunkowych oddziaływań synaptycznych wybrano komercyjne układy mikroelektrod do monitorowania aktywności bioelektrycznej połączonych ze sobą modułów neuronalnych. W tym miejscu zilustrowano metody 1) wytwarzania form z mikrometryczną precyzją i 2) wykonywania wieloośrodkowych zapisów zewnątrzkomórkowych in vitro w kulturach neuronów kory mózgowej szczurów. Dzięki zmniejszeniu kosztów i przyszłej powszechnej dostępności druku 3D 2PP, metoda ta będzie coraz bardziej przydatna w laboratoriach badawczych na całym świecie. Zwłaszcza w neurotechnologii i wysokoprzepustowym rejestrowaniu danych neuronowych, łatwość i szybkość prototypowania uproszczonych modeli in vitro poprawi kontrolę eksperymentalną i teoretyczne zrozumienie wielkoskalowych systemów neuronowych in vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie aktywności neuronalnej w zachowujących się organizmach stanowi kilka wyzwań. Na przykład fizyczny dostęp do tkanki mózgowej jest ograniczony przez konieczność utrzymania jej integralności, więc powierzchowne obszary mózgu są łatwiejsze do rozważenia. Wyizolowanie określonych celów w nienaruszonej tkance jest często trudnym zadaniem, a czasami niemożliwym. Chociaż zdysocjowane jednorodne kultury neuronalne zapewniają wygodny dostęp do właściwości molekularnych, biochemicznych i biofizycznych poszczególnych (sub)komórkowych składników obwodu neuronalnego, realistyczna łączność i anatomiczna organizacja nienaruszonego mózgu zostaje utracona. Te fundamentalne ograniczenia zainspirowały wysiłki badawcze mające na celu osiągnięcie kompromisu, w którym unika się złożoności in vivo, a strukturę można skonstruować in vitro, co jest na żądanie1,2,3,4,5,6,7,8,9. W szczególności modułowe kultury neuronalne były przedmiotem szeroko zakrojonych badań prowadzonych w ciągu ostatnich dziesięcioleci, mających na celu rozwiązanie kluczowych pytań dotyczących fizjologii mózgu, jak opisano poniżej.

Organizacja: Badania in vivo pokazują, że mózg jest zbudowany anatomicznie w warstwach z precyzyjnymi typami komórek i układami projekcji. Testy funkcjonalne ujawniły organizację sieci neuronalnych w zespołach węzłów i modułach, z precyzyjnymi schematami połączeń10,11. Rola połączeń i motywów mikroukładów nie może być jednak odpowiednio zbadana in vivo ze względu na samą liczbę zaangażowanych synaps, a także przeplatające się efekty rozwoju i plastyczności zależnej od aktywności.

Transfer sygnału: W hodowlach in vivo lub losowych in vitro, trudno jest ocenić transfer sygnału. Badanie przewodnictwa aksonalnego i potencjału czynnościowego na całej jego długości wymaga kierowania wzrostem neurytów poprzez funkcjonalizację powierzchni lub wzorcowanie chemiczne, zapewniając wysoki stosunek sygnału do szumu w zewnątrzkomórkowych odczytach aktywności elektrycznej12.

Znaczenie translacyjne: Rozszyfrowanie wyłącznej roli elementów pre- i postsynaptycznych w różnych stanach patologicznych wymaga indywidualnego dostępu do tych elementów. Kultury modularne z ograniczoną łącznością, skutecznie segregujące elementy pre- i postsynaptyczne, są niezbędnymi narzędziami do tego celu13.

Istnieje kilka metod pozwalających na uzyskanie pewnej formy struktury w kulturze neuronalnej. Można je ogólnie podzielić na chemiczne i fizyczne manipulacje powierzchnią9. Poprzednie metody14,15 opierają się na skłonności komórek nerwowych do przyłączania się do pewnych związków (bio)chemicznych. Wymaga to osadzania kleju lub atrakcyjnych cząsteczek na powierzchni z precyzją w skali mikro i podążania za szczegółowym wzorem. Chociaż pozwala to na częściowe pokrycie powierzchni komórek, zgodnie z pożądanym wzorcem, metody chemiczne są z natury ograniczone i mają stosunkowo niski wskaźnik sukcesu w wytycznych dotyczących wzrostu neurytów16. Pełna kontrola nad kierunkowością aksonów wymaga ustanowienia przestrzennego gradientu substancji chemicznych ad hoc w celu kształtowania prowadzenia aksonów17. Te ostatnie metody obejmują fizyczną manipulację powierzchnią i są częściej stosowane do strukturyzacji sieci neuronalnych in vitro. Komórki neuronalne są fizycznie ograniczone w pożądanych miejscach przez geometryczne ograniczenia, takie jak mikroskopijne komory, ściany, kanały itp., kształtując biokompatybilny polimer, taki jak polidimetylosiloksan (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 utwardzony i zestalony w urządzenie mikroprzepływowe. De facto metodą wytwarzania mikroprzepływowego PDMS jest miękka fotolitografia21, gdzie dwuwymiarowa maska jest wzorowana w mikroskali i wykorzystywana do selektywnego wytrawiania materiału na bazie krzemu pod wpływem promieniowania UV. Krótko mówiąc, żywica utwardzana promieniami UV (tj. fotorezyst) jest powlekana na płytce krzemowej poprzez powlekanie wirowe, osiągając określoną wysokość określoną przez jej lepkość i prędkość wirowania. Następnie wzorzysta maska jest umieszczana nad fotorezystem i wystawiana na działanie światła UV. Przezroczyste obszary wewnątrz maski, odpowiadające obszarom zainteresowania, pozwolą światłu UV indukować miejscowe sieciowanie cząsteczek fotorezystu. Obszary nienaświetlonego fotorezystu są zmywane za pomocą rozpuszczalnika, co powoduje powstanie pleśni. Jest to wielokrotnie używane do wypalania wybranego elastomeru (tj. PDMS), który jest następnie grawerowany z pożądaną geometrią w dowolnej liczbie replik. Taka metoda produkcji jest najpowszechniejszą metodą wytwarzania urządzeń mikroprzepływowych22. Być może głównymi ograniczeniami miękkiej fotolitografii są warunki wstępne znacznych inwestycji kapitałowych oraz nieznajomość laboratoriów biologicznych z wymaganymi technikami i wiedzą specjalistyczną. Przygotowanie maski i etapy miękkiej fotolitografii wymagane do projektowania złożonych geometrii o wielu wysokościach i wysokim współczynniku proporcji są nietrywialne23 i często wymagają outsourcingu. Mimo że zaproponowano alternatywne i niskobudżetowe metody, nie zawsze spełniają one wysokie wymagania precyzji prototypowania biologicznego24.

Tutaj prezentowana jest alternatywna metoda produkcji, polegająca na polimeryzacji dwufotonowej (2PP) i wytwarzaniu przyrostowym. Jest prosty i sam w sobie nie wymaga zaawansowanej wiedzy z zakresu mikrofabrykacji i mikrofotolitografii. Dziedzina badawcza mikroprodukcji 2PP pojawiła się pod koniec lat 90-tych25 i od tego czasu była świadkiem wykładniczego wzrostu26. Więcej na temat podstawowych zasad tej techniki można znaleźć gdzie indziej26. Krótko mówiąc, skupiając impuls świetlny wzbudzenia w przestrzeni trójwymiarowej, 2PP wykorzystuje nieliniową zależność absorpcji wielofotonowej od intensywności. Daje to zdolność do ograniczonej absorpcji, zapewniając precyzyjne i selektywne wzbudzenie w bardzo zlokalizowanych regionach. Zasadniczo fotorezystor o ujemnym tonie, materiał o zmniejszonej rozpuszczalności po ekspozycji na światło, jest poddawany skupionej wiązce femtosekundowych impulsów laserowych w niskim cyklu pracy27. Pozwala to na otrzymywanie impulsów o dużym natężeniu przy niskich mocach średnich, umożliwiając polimeryzację bez uszkadzania materiału. Oddziaływanie fotoindukowanych monomerów rodnikowych prowadzi do powstania oligomerów rodnikowych, inicjując polimeryzację, która rozciąga się na cały fotorezystor aż do określonej objętości, tj. woksela, którego wielkość zależy od intensywności i czasu trwania impulsów laserowych28.

W tej pracy prezentowane są dwa elementy: A) projekt i szybkie wykonanie formy wydrukowanej w 3D, wielokrotnie wielokrotnego użytku do produkcji jednorazowych polimerowych urządzeń do hodowli komórek neuronalnych (Rysunek 1), oraz B) ich mechaniczne sprzężenie na powierzchni płaskich substratów hodowli komórek neuronalnych, lub nawet zintegrowanych z substratem układów mikroelektrod zdolnych do wielomiejscowego zapisu sygnałów bioelektrycznych.

Komputerowo wspomagane projektowanie modelu mechanicznego 3D jest tutaj bardzo krótko opisane i towarzyszą mu kroki prowadzące do wydrukowanej w 3D formy i produkcji urządzeń PDMS.

Różnorodne aplikacje do projektowania wspomaganego komputerowo mogą być używane do generowania początkowego modelu obiektowego 3D i tworzenia pliku STL do kontrolowania procesu drukowania 2PP. W Tabeli Materiałów pierwsza i ostatnia aplikacja wymienione są bezpłatne lub dostarczane z bezpłatną licencją. Konstruowanie modelu 3D zawsze wymaga stworzenia szkicu 2D, który następnie jest wyciągany w kolejnych krokach modelowania. Aby zademonstrować tę koncepcję, w sekcji protokołu przedstawiono ogólny proces projektowania oprogramowania CAD 3D, co prowadzi do struktury wykonanej z nakładających się na siebie sześcianów. Aby uzyskać bardziej wyczerpujące informacje, dostępnych jest wiele samouczków online i bezpłatnych zasobów szkoleniowych, jak wskazano w Tabeli materiałów.

Wynikowy plik STL jest następnie przekształcany w serię poleceń, które mają być wykonane przez drukarkę 3D (np. procedura krojenia). W przypadku konkretnej używanej drukarki 3D 2PP oprogramowanie DeScribe służy do importowania pliku STL i konwertowania go na zastrzeżony format ogólnego języka pisania (GWL). Sukces procesu drukowania 2PP zależy od różnych parametrów, w szczególności mocy lasera i jego prędkości skanowania, odległości zszywania i kreskowania-krojenia. Dobór tych parametrów, wraz z doborem obiektywu i fotorezystu, zależy od najmniejszych cech konstrukcji, a także od zamierzonego zastosowania. W związku z tym optymalizacja parametrów staje się niezbędna, aby spełnić wymagania różnych scenariuszy projektowych i przypadków użycia. Do tej pracy jako konfigurację parametrów drukowania została uwzględniona zalecana receptura IP-S 25x ITO Shell (3D MF). Ostatecznie stabilna mechanicznie część drukowana jest drukowana z niezbędną rozdzielczością przy jednoczesnej minimalizacji czasu drukowania 3D.

Projekt formy i związany z nim plik STL, zademonstrowany w tej pracy, składa się z kwadratowej ramki do segregacji przestrzeni hodowli komórkowej w dwóch przedziałach: obszarze zewnętrznym (tj. zwanym później Źródłem) i obszarze wewnętrznym (tj. określanym później jako Cel). Te dwa przedziały są połączone zestawami mikrokanałów, z których każdy charakteryzuje się ostrymi krawędziami, zaprojektowanymi tak, aby specjalnie utrudniać wzrost neurytów od Celu do Źródła, ale nie odwrotnie, i jako takie promują kierunkową łączność synaptyczną między neuronami rosnącymi w tych dwóch obszarach.

Wcześniejsze badania wykorzystywały różne geometrie mikrokanałów, aby zachęcić do kierunkowego wzrostu neurytów. Przykładami są kształty trójkątne18, struktury kolczaste kanałów19 i kanały zwężające20. W tym przypadku zastosowano konstrukcję z ostrymi barierami kątowymi na granicach mikrokanału, charakteryzującą się również asymetrycznymi wejściami. Te mikrokanały służą do ustanowienia ciągłości między zamkniętym wnętrzem, przedziałem docelowym, a obszarem zewnętrznym, przedziałem źródłowym. Lejkowaty kształt początkowej części mikrokanałów, od strony Źródła, ma za zadanie sprzyjać tworzeniu się wiązek aksonalnych i ich wzrostowi wzdłuż najkrótszej, tj. w linii prostej, drogi łączącej Źródło z Celem. Trójkątna przestrzeń realizowana przez skierowanie się pod ostrymi kątami ma większą objętość po stronie celu, aby skutecznie opóźnić znajdowanie drogi przez neuryty, jednocześnie sprzyjając szybkiemu strzelaniu wiązek pochodzących ze Źródła i zajęciu dostępnej przestrzeni. Wybór 540 μm dla długości mikrokanalików skutecznie odfiltrowuje ogólnie krótsze wyrostki dendrytyczne39. Ponadto ich wysokość 5 μm zapobiega przenikaniu somatów komórkowych przez mikrokanały. Ogólnie rzecz biorąc, ta konfiguracja okazała się promować jednokierunkową łączność między zewnętrznymi, źródłowymi i wewnętrznymi modułami docelowymi, i jest tutaj przedstawiona jako dowód zasady wśród wielu alternatywnych wyborów.

Podczas gdy urządzenia PDMS, wyprodukowane przez formę 2PP, mogą być przymocowane do powierzchni popularnych substratów do hodowli komórkowych, takich jak szklane szkiełka nakrywkowe lub szalki Petriego, w tej pracy użyto dostępnych na rynku układów mikroelektrod zintegrowanych z substratem. Nie podjęto żadnych wysiłków w celu optymalizacji projektu 3D pod kątem układu mikroelektrod, a mechaniczne sprzężenie zostało wykonane pod nadzorem stereomikroskopii, mając na celu jedynie ustawienie urządzenia w poprzek układu, pozostawiając część mikroelektrody odsłoniętej po obu stronach, źródle i celu. Umożliwia to wstępną ocenę funkcjonalnych konsekwencji ograniczonej łączności w hodowlach komórek neuronalnych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury związane z obchodzeniem się ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z prawem europejskim i włoskim (dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 22 września 2010 r. [2010/63/UE]; Dekret rządu włoskiego z dnia 4 marca 2014 r., nr 26), zostały wyraźnie zatwierdzone przez instytucjonalny OpBA (Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami) w Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati i zostały oficjalnie zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia (Auth. No. 22DAB. N.UVD). Doprowadziło to do udostępnienia materiału niezdolnego do odczuwania z eksplantowanej tkanki mózgowej szczura, który można wykorzystać do eksperymentalnej walidacji metody przedstawionej w tej pracy.

1. 3D wytwarzanie form metodą polimeryzacji dwufotonowej

  1. Generowanie plików CAD
    UWAGA: Poniższe kroki demonstrują ogólny proces projektowania 3D z wykorzystaniem oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (tj. SolidWorks). Przykładowy plik projektowy STL opisany w tej pracy (Rysunek 2) jest dostępny jako Dodatkowy Plik Kodowania 1, a także za pośrednictwem Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110).
    1. Uruchom aplikację komputerową do projektowania wspomaganego komputerowo. Na górnym pasku menu wybierz pozycję Nowy.
    2. Z opcji wybierz opcję Część: reprezentacja 3D pojedynczego komponentu projektu. Naciśnij kombinację Ctrl + 5, aby ustalić widok szkicu z góry.
    3. Na panelu bocznym wybierz opcję Szkic i wybierz opcję Prostokąt narożny. Wybierz jedną krawędź prostokąta, klikając na nią. Gdy pojawi się panel parametrów, ustaw długość na 100 jednostek.
    4. Powtórz krok 1.1.3 dla krawędzi prostopadłej do poprzedniej: ustaw jej długość na 50 jednostek. Zaznacz prostokąt, przeciągając nad nim, przytrzymując lewy przycisk myszy.
    5. Z menu Dodaj relację wybierz opcję Napraw, aby ograniczyć relacje między liniami.
    6. Zamknij szkic i powtórz kroki od 1.1.3 do 1.1.5, tworząc nowy (mniejszy) prostokąt, nakładający się na poprzedni szkic.
    7. Na panelu bocznym wybierz Operacje, a następnie wybierz Wyciągnięte dośrodkowanie/podstawę: ustaw głębokość zarówno dużego, jak i małego prostokąta odpowiednio na 5 i 10 jednostek.
    8. Z menu Plik zapisz część w formacie STL (tj. Standardowy język teselacji).
  2. Przetwarzanie plików CAD
    1. Przenieś plik STL na komputer osobisty, wyposażony w oprogramowanie użytkowe DeScribe.
    2. Uruchom Describe i z menu Plik otwórz plik STL. Pojawi się reprezentacja 3D modelu.
    3. W sekcji orientacji w menu po prawej stronie obróć model, aby odpowiednio zorientować go w przestrzeni, i wyśrodkuj go w płaszczyźnie.
    4. Dostosuj ogólne skalowanie, wybierając sekcję Skalowanie w menu po prawej stronie.
    5. Z menu rozwijanego u góry wybierz przepis IP-S 25x ITO Shell (3D MF). Określa to IP-S jako fotorezystor, 25-krotne jako moc powiększenia obiektywu, podłoże pokryte tlenkiem indu i cyny (ITO) jako podłoże do drukowania, a drukowanie w powłokach i rusztowaniach jako tryb pracy z funkcjami średniej wielkości (MF).
    6. Poruszaj się po kreatorze, wybierając i ustawiając Odległość cięcia na 1 μm i Odległość kreskowania na 0,5 μm zarówno dla powłoki, jak i rusztowania.
    7. W kroku wyjściowym kreatora importu, w sekcji dzielenia, zdefiniuj rozmiar bloku jako X = 200 μm, Y = 200 μm i Z = 265 μm, a przesunięcie bloku jako X = 133 μm, Y = 133 μm i Z = 0, upewniając się, że linie zszywania nie mają wpływu na delikatne struktury mikrokanałów.
    8. W trybie skanowania użyj domyślnego: Galvo dla płaszczyzny X-Y i Piezo dla osi Z.
    9. Naciśnij Zapisz i w następnym menu tekstowym zamień linię var $baseLaserPower = $shellLaserPower na var $baseLaserPower = 75, aby zmniejszyć do 75% moc lasera na najniższej warstwie wydruku.
    10. Przenieś pliki GWL uzyskane w powyższych krokach na stację roboczą dedykowaną do druku 3D 2PP.
  3. Druk 3D i opracowywanie próbek
    1. Uruchom aplikację NanoWrite. Po inicjalizacji drukarki kliknij Exchange Holder w interfejsie oprogramowania, aby włożyć uchwyt podłoża i zamontować obiektyw.
    2. Zamontuj obiektyw 25x w odpowiedniej pozycji na końcówce. Zidentyfikuj, która strona szklanego podłoża jest pokryta ITO, za pomocą elektronicznego multimetru ustawionego do pomiaru rezystancji: odczyt powinien być niski, taki jak 100-300 Ω, ale tylko dla strony pokrytej ITO.
    3. Umieść szklane podłoże na uchwycie, kierując stronę pokrytą powłoką ITO do góry. Użyj taśmy, aby mocno przytrzymać go na miejscu.
    4. Pod okapem oparów chemicznych nałóż kroplę fotorezystu IP-S na środek szklanego podłoża.
    5. Włóż uchwyt do drukarki 3D, kroplą żywicy skierowaną w stronę obiektywu (tj. w dół).
    6. Za pomocą menu Plik oprogramowania załaduj pliki GWL. Wybierz opcję Approach Sample (Podejdź do próbki), aby przesunąć obiektyw w pobliże kropli żywicy.
    7. Wybierz opcję Znajdź interfejs, aby umożliwić wykrywanie interfejsu drukowania ITO-fotorezystor na podstawie różnicy współczynnika załamania światła dwóch materiałów.
    8. Wybierz opcję Start Job (Rozpocznij zadanie), aby rozpocząć drukowanie. Po zakończeniu drukowania naciśnij przycisk Exchange Holder, aby odzyskać uchwyt.
    9. Wyjmij uchwyt i delikatnie usuń podłoże z częścią drukowaną. Zanurz szklane podłoże w octanie eteru metylowego glikolu propylenowego (PGMEA) na 20 minut pod wyciągiem, aby rozwinąć wydrukowaną część.
    10. Usuń podłoże z PGMEA i zanurz je w izopropanolu na 5 minut. Pozostaw wydrukowaną część do wyschnięcia na powietrzu, pod okapem oparów chemicznych.
  4. Obróbka po wydruku i montaż formy
    1. Utwardź wydrukowaną część przez wystawienie na działanie światła UV (tj. 365-405 nm) z wystarczającą mocą przez 5-20 minut (szczegóły dotyczące mocy znajdują się w Dyskusji).
    2. Pod pokrywą z przepływem laminarnym delikatnie wyjmij wydrukowaną część ze szklanego podłoża. Upuść ~2 μL żywicy na dno szalki Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm.
    3. Ostrożnie umieść wydrukowaną część nad kroplą i pozwól, aby żywica przepłynęła pod częścią. Następnie utwardź wydrukowaną część poprzez wystawienie jej na działanie światła UV przez 5 minut.
    4. Przykryj szalkę Petriego nakrętką i przenieś ją do piekarnika w celu utwardzenia termicznego przez 30 minut w temperaturze 80 °C. Nie podgrzewaj piekarnika, aby uniknąć deformacji lub pęknięcia części drukowanej. Po utwardzeniu wydrukowana część zostanie na stałe przymocowana do dna szalki Petriego. Od tej pory wydrukowana i zamontowana część będzie określana jako forma.

2. Wytwarzanie urządzeń PDMS z form i substratów do hodowli komórkowych

  1. Produkcja urządzeń PDMS
    1. Przygotować 20 ml mieszaniny 10:1 (stosunek wagowy) bazy iutwardzacza niespolimeryzowanego PDMS. Dla każdego urządzenia i w zależności od jego wymaganej wysokości wystarczy 1-2 ml mieszaniny PDMS. Nadmiar niespolimeryzowanego PDMS należy przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.
    2. Pod okapem z przepływem laminarnym dokładnie mieszaj mieszaninę przez 4 minuty. Ponieważ mieszanina równomiernie zatrzymuje pęcherzyki powietrza, stanie się nieprzezroczysta.
    3. Przenieść mieszaninę do probówki μtube o pojemności 50 μl i odwirować ją przy 168 x g przez 5 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza z mieszaniny i uzyskać klarowny wygląd.
    4. Potraktuj formę 10 μl środka hydrofobicznego (tj. Repel-silane ES) i pozwól jej odpocząć przez 7 minut, zapewniając późniejsze płynne oderwanie spolimeryzowanego PDMS od formy.
    5. Przepłucz formę 1x 70% etanolem i 2x wodą dejonizowaną (DI). Pozostaw formę do wyschnięcia na powietrzu pod okapem z przepływem laminarnym.
    6. Delikatnie wylej mieszaninę PDMS na formę, aż do osiągnięcia zamierzonej ostatecznej wysokości urządzenia. Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza, mieszaninę należy wlać delikatnie i z bliskiej odległości do powierzchni formy.
    7. Przykryj formę i przenieś ją na 18 minut do piekarnika, który został wstępnie nagrzany i ustabilizowany w temperaturze 80 °C, w celu utwardzenia. W przypadku urządzeń o wysokości większej niż 5 mm i do 1 cm należy wydłużyć czas utwardzania z 18 do 25 minut.
    8. Pod okapem z przepływem laminarnym delikatnie oderwij utwardzony blok PDMS od formy i zanurz go w izopropanolu na co najmniej 10 minut, wewnątrz szklanej szalki Petriego. Izopropanol eliminuje nieusieciowany PDMS. Zawsze utrzymuj blok PDMS zakryty.
    9. Odnów izopropanol i pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie wytnij centralną kwadratową część urządzenia (zidentyfikowaną jako obszar docelowy w tej pracy) za pomocą noża okulistycznego. Następnie przystąp do dalszego cięcia wzdłuż krawędzi, aby uzyskać ostateczny kształt urządzenia.
    10. Wyjmij urządzenie z izopropanolu i zanurz je w etanolu na 30 min, a następnie przepłucz 3x sterylną wodą DI. Od tego momentu należy zachować sterylność.
    11. Pod okapem z przepływem laminarnym przenieś urządzenie na nową szalkę Petriego, pozostawiając jego nasadkę lekko uchyloną. Pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.
  2. Montaż urządzenia i przygotowanie substratów do hodowli komórkowych.
    1. Wysterylizuj każdą matrycę mikroelektrod (MEA), zanurzając ją w 70% etanolu na 30 minut, a następnie przepłucz ją 3x sterylną wodą DI.
    2. Za pomocą sterylnej cienkiej pęsety, pod osłoną z przepływem laminarnym i mikroskopem stereoskopowym, zamontuj urządzenie PDMS na wewnętrznej powierzchni MEA. Wyrównaj jedną stronę urządzenia PDMS do środka wewnętrznego obszaru MEA, wyposażonego w mikroelektrody zintegrowane z podłożem, tak aby niewiele mikroelektrod pozostało odsłoniętych zarówno z obszaru źródłowego, jak i docelowego (patrz Rysunek 2).
      UWAGA: Do tej pracy nie jest konieczne dopasowywanie mikroelektrod MEA do mikrokanału urządzenia PDMS. Delikatne naciśnięcie urządzenia może być wymagane w celu uzyskania szczelnego uszczelnienia między urządzeniem PDMS a powierzchnią MEA. Za wszelką cenę unikaj dotykania mikroelektrod końcówką pęsety.
    3. Włóż MEA z urządzeniem PDMS do komory czyszczenia plazmowego, aby aktywować aktywację powierzchniową za pomocą plazmy powietrznej. Rozpocznij proces od 4-minutowego opróżnienia komory pompą próżniową. Następnie lekko otwórz zawór powietrza, aby umożliwić kontrolowane odpowietrzanie. Zamknij zawór powietrza i włącz induktory plazmowe, regulując poziom mocy RF w zakresie od 10 W do 18 W.
    4. Gdy pojawi się świecące światło, pozwól procesowi działać przez 80 sekund. Następnie wyłącz induktor plazmowy, zamknij zawór pompy próżniowej i delikatnie otwórz zawór powietrza. Otwórz komorę, aby pobrać MEA.
      UWAGA: Jeśli obróbka plazmowa polega na wystawieniu MEA na działanie niesterylnego środowiska, umieść każdy MEA pod światłem UV w okapie z przepływem laminarnym na 30 minut, aby zapewnić sterylność.
    5. Dodać 1 ml roztworu polietylenoiminy (PEI) o stężeniu 0,1% wag./obj. do MEA i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Odessać roztwór PEI i spłukać sterylną wodą DI 5x. Dodać 1 ml pożywki do hodowli komórkowej do MEA i inkubować ją przed wysiewem komórek.

3. Hodowla komórek neuronalnych i elektrofizjologia

  1. Przygotować wcześniej pożywkę do preparacji, roztwór do wytrawiania i roztwory 1-3 (patrz Tabela 1).
  2. Zdysocjowana hodowla komórek nerwowych.
    1. Delikatnie chwyć za pysk nowonarodzonego szczeniaka szczura rasy Wistar w wieku 0-1 dni i wykonaj szybką dekapitację za pomocą ostrych nożyczek.
    2. Zdejmij skórę głowy, wykonaj nacięcie wzdłuż strzałkowej linii środkowej czaszki za pomocą cienkich nożyczek, a następnie wykonaj nacięcie koronalne przez czaszkę na styku móżdżku
      3. .
    3. Usunąć czaszkę, wyjąć mózg cienką szpatułką i przenieść go do zimnego (4 °C) podłoża preparacyjnego.
    4. Usuń tkankę podkorową, hipokamp i opony mózgowe. Zmielić tkankę na małe kawałki (tj. 1-2 mm3) i przenieść je do probówki o pojemności 15 ml. Wyrzucić roztwór i wypłukać tkankę za pomocą świeżego podłoża preparacyjnego, a następnie przepłukać pożywką wytrawiającą.
    5. Odrzucić pożywkę wytrawiającą, a następnie dodać 1 ml roztworu 1. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Odrzucić roztwór 1 i spłukać tkankę świeżym podłożem preparacyjnym. Następnie dodać 1 ml roztworu 2 i przechowywać mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Odrzucić roztwór 2 i opłukać tkankę świeżym podłożem preparacyjnym. Następnie dodaj 1 ml roztworu 3. Mechanicznie rozdzielić komórki, powoli pipetując roztwór w górę iw dół od 20 do 30 razy. Gdy pojawi się jednolicie mętna mieszanina zdysocjowanych komórek, zwiększ jej objętość do 3 ml, dodając pożywkę do rozwarstwienia.
    7. Zebrać osad komórkowy, odwirowując mieszaninę przy 100 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.
    8. Policz komórki (tj. za pomocą komory do zliczania komórek) i odpowiednio dostosuj gęstość roztworu do wysiewu komórek.
    9. Zasiać każdy MEA 1 ml roztworu wysiewającego o nominalnej gęstości komórek 1,8 x 106 (~ 6500 komórek/mm2). Inkubować wysiane MEA w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Wymieniaj pożywkę na świeżą (tj. cotygodniową) pożywkę hodowlaną co 2 dni.
  3. Elektrofizjologia zewnątrzkomórkowa
    UWAGA: Zdysocjowane hodowle komórek nerwowych osiągają w pełni dojrzały fenotyp elektryczny po 2-3 tygodniach in vitro. Poniższe sekcje opisują protokół stymulacji zewnątrzkomórkowej przy użyciu komercyjnego oprogramowania aplikacyjnego MEA (Experimenter) do elektrycznej stymulacji jednej z populacji neuronów hodowanych w modułach, tj. Source lub Target, przy jednoczesnym rejestrowaniu aktywności obu populacji w dojrzałych sieciach.
    1. Delikatnie zamontuj jeden MEA wewnątrz stopnia głównego wielokanałowego wzmacniacza elektronicznego, w suchym inkubatorze (37 °C, 5% CO2) i pozwól mu się pomieścić przez 10 minut. Niestandardowa nasadka PDMS może być wytwarzana osobno i używana jako szczelna osłona dla każdego MEA, aby zmniejszyć parowanie wody i zachować sterylność.
    2. Uruchom oprogramowanie Experimenter. Ustaw częstotliwość próbkowania na 25 kHz i rozpocznij akwizycję danych, naciskając Start DAQ. W panelu Wyświetlanie danych pojawiają się nieprzetworzone ślady aktywności zarejestrowanej poza siecią komórkową dla każdego kanału.
    3. Monitoruj spontaniczną aktywność oraz wizualnie identyfikuj i wybieraj 3 pary sąsiednich mikroelektrod, które są aktywne podczas impulsów spontanicznych zsynchronizowanych impulsów aktywności w całej sieci, zarówno z mikroelektrod po stronie źródłowej, jak i docelowej.
    4. W panelu stymulatora oprogramowania skonfiguruj parametry dla każdej z par mikroelektrod stymulujących w konfiguracji bipolarnej: wybierz dwufazowy przebieg impulsu i ustaw amplitudy pików na ± 800 mV, a czas trwania impulsu na 200 μs.
    5. Ustaw rejestrator i nagrywaj na okres 300 ms przed do 1000 ms po stymulacji.
    6. Powtórz kroki od 3.3.3 do 3.3.5 dla strony źródłowej i docelowej z przeplotem dla wymaganej liczby powtórzeń.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja 2-komorowego polimerowego (neuronalnego) urządzenia do hodowli komórek jest opisana tutaj, co jest przykładem zastosowania druku 3D 2PP do szybkiego prototypowania urządzeń PDMS. W szczególności wytwarza się urządzenie do modułowych sieci neuronowych z jednokierunkową łącznością synaptyczną, a jego charakterystykę funkcjonalną przedstawiono w kategoriach wielomiejscowej elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej. Krótko mówiąc, forma w skali mikrometrycznej została zrealizowana za pomocą bezpośredniego pisania laserowego, przy użyciu dostępnej na rynku drukarki 3D. W szczególności drukarka dostarcza moc 50 mW poprzez impulsy laserowe o środkowej długości fali 780 nm i czasie trwania od 80 do 100 fs. Podczas procesu produkcyjnego wiązka laserowa jest skupiana przez obiektyw (25x, NA = 0,8) drukarki na fotorezyście o ujemnym tonie (IP-S) w celu zeskanowania objętości wydruku za pomocą skanera galvo dla osi x i y oraz stolika piezoelektrycznego dla osi z. Objętość druku została odpowiednio podzielona na bloki o wymiarach 200 mm x 200 mm x 265 mm, aby uzyskać formę o całkowitych wymiarach 6500 mm x 6500 mm x 545 mm i nominalnej objętości 12,423 ml. Rysunek 2A przedstawia szkic 2D formy, podkreślając jej wymiary i rozmiar, podczas gdy Rysunek 2B pokazuje zbliżenie gotowego urządzenia zamontowanego na MEA. Formy przygotowane zgodnie z opisem w poprzednim rozdziale były trwałe i mogły być ponownie użyte ponad 50 razy do produkcji urządzeń PDMS.

Wydrukowana forma została użyta do odlewania urządzenia PDMS, które następnie zostało zamontowane na wewnętrznej powierzchni zintegrowanych z podłożem szklanym układów mikroelektrod (MEA), aby było używane do wielopunktowych zewnątrzkomórkowych zapisów aktywności elektrycznej neuronów i jako dowód zasady. Komercyjne MEA zintegrowane z substratem wykorzystano do monitorowania aktywności kultur modułowych w odpowiedzi na przestrzennie zlokalizowane bodźce elektryczne dostarczane zewnątrzkomórkowo przez podzbiór mikroelekrodu znajdującego się w każdym przedziale hodowli. Każdy MEA zawiera 120 mikroelektrod azotanu tytanu (TiN) o średnicy 30 μm i podziałce międzyelektrodowej 100 μm. Rysunek 2C-D pokazuje umiejscowienie urządzenia PDMS na górze MEA. Cechy geometryczne poszczególnych mikrokanałów urządzenia wraz z ogólnym śladem komory pokazanym na Rysunek 2C, prowadzą do podziału hodowanych neuronów na przedziały. Można je rozróżnić na podstawie komory, do której należą, w obszarze zewnętrznym (Źródło) urządzenia lub w obszarze wewnętrznym (Cel) urządzenia. Preferowane prowadzenie aksonalne, ograniczone od Źródła do Celu, jest podyktowane ostrymi krawędziami mikrokanałów. Rysunek 2D pokazuje umiejscowienie urządzenia polimerowego na MEA oraz względny obszar pokrycia elektrod rejestrujących znajdujących się w komorze źródłowej lub docelowej. Należy pamiętać, że precyzyjne wyrównanie wnętrza mikrokanałów urządzenia do jednego lub więcej rzędów mikroelektrod MEA nie było wymagane w naszym studium przypadku ani nie było kontynuowane.

Reprezentatywny dowód asymetrycznego wzrostu neurytów znajduje się w Rysunek 3, podczas rozwoju ex vivo, pokazujący fluorescencyjnie oznaczone neuryty w obrazowaniu na żywo, 6 dni (Rysunek 3A) i 2 dni po posiewie komórek (Rysunek 3B-D). Podczas gdy neuryty po stronie docelowej urządzenia napotykały bariery pod ostrymi kątami jako przeszkody utrudniające im postęp w przestrzeni, neuryty pochodzące ze strony Źródła rozwijały się nieprzerwanie i przecinały kanały. Ta asymetria sprzyja jednokierunkowemu połączeniu aksonalnemu między neuronami w dwóch przedziałach, rzutującym od źródła do celu, zgodnie z wyraźnym zamierzeniem projektu. Wynik ten jest dodatkowo wspierany przez (funkcjonalną) elektrofizjologiczną ocenę reakcji elektrycznych wywoływanych przez bodźce dostarczane naprzemiennie w każdym z dwóch przedziałów.

Po 3-4 tygodniach in vitro, gdy sieci neuronowe osiągnęły pełną dojrzałość29,30, funkcjonalna łączność między dwoma przedziałami mogła być badana po dostarczeniu krótkich bodźców elektrycznych i monitorowaniu reakcji neuronalnych, które wywołały31. Dwufazowe impulsy elektryczne o amplitudzie 800 mV były następnie stosowane alternatywnie tylko do Źródła lub tylko do populacji docelowych (N powtórzeń = 150, N kultur modułowych = 6), dostarczane przez 3 zestawione pary płaskich mikroelektrod w konfiguracji bipolarnej i w sposób przeplatany. W związku z tym 3 pary elektrod mogą znajdować się w obszarze źródłowym MEA lub w obszarze docelowym MEA. Reakcje elektryczne wywołane przez każdy bodziec mogą być następnie wykryte przez wszystkie mikroelektrody MEA po opóźnieniu propagacji. Nagrania wykonano z częstotliwością próbkowania 25 kHz/kanał, a uzyskane zewnątrzkomórkowe surowe sygnały elektryczne zdigitalizowano w rozdzielczości konwersji analogowo-cyfrowej wynoszącej 16 bitów. Algorytm wykrywania pików przekraczających próg32 został użyty w trybie offline do wykrycia czasu wystąpienia zewnątrzkomórkowych potencjałów czynnościowych, bez wykonywania sortowania skoków. Rysunek 4A-B wyraźnie ujawnia silną asymetrię wywołanych odpowiedzi, powtórzonych 150 razy, w zależności od miejsca dostarczenia bodźca, sugerując znaczący funkcjonalny wpływ ograniczeń geometrycznych na preferowaną kierunkowość łączności. W rzeczywistości, po stymulacji strony Źródła, szybkość wypalania populacji neuronów Źródła - oszacowana na podstawie histogramu czasów skoków wokół bodźca - wzrosła zgodnie z oczekiwaniami, generując pełny wybuch sieci potencjałów czynnościowych33,31,34, a następnie, po pewnym opóźnieniu, nastąpił wzrost szybkości wypalania populacji docelowej. Jednakże, ponieważ stymulacja była dostarczana w populacji docelowej, wzrastała tylko szybkostrzelność populacji docelowej, a populacja źródłowa pozostawała w większości cicha. Rysunek 4C-D powtarza ten sam paradygmat bodziec/odpowiedź w kulturze kontrolnej, bez obecności urządzenia polimerowego (tj. nieustrukturyzowanej hodowli neuronalnej), bodźce zewnątrzkomórkowe były również dostarczane przez 4 powtórzenia. W przypadku takich warunków kontrolnych nie wystąpiła asymetria w reakcjach wywołanych przez którykolwiek z bodźców. Podczas gdy podzbiór mikroelektrod MEA używanych do dostarczania bodźców był zgodny z podzbiorem stosowanym w sieciach modułowych, lokalizacja dostarczania bodźca doprowadziła do podobnej wywołanej reakcji całej populacji. Potwierdza to, że urządzenie PDMS faworyzowało jednokierunkową łączność synaptyczną między dwoma przedziałami. Ogólnie rzecz biorąc, reakcje asymetryczne wywoływane w kulturach modułowych (N = 6) i reakcje symetryczne wywoływane w kulturach kontrolnych (N = 4) silnie wskazują na ograniczoną łączność anatomiczną systemu in vitro z przedziałami. Dane elektrofizjologiczne i skrypty używane do generowania Rysunek 4, są udostępniane przez Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990).

figure-results-1
Rysunek 1: Szkic produkcji mikroform 2PP i formowania replik PDMS. (A) Model 3D jest projektowany w CAD i eksportowany do pliku w formacie Standard Tessellation Language (STL), (B) instruując jego 2-fotonowy druk 3D poprzez polimeryzację indukowaną laserowo w kropli żywicy (IP-S). (C) Powstała struktura jest używana jako forma do wielokrotnego wytwarzania replik PDMS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przykład wewnętrznego szybkiego prototypowania urządzenia PDMS do hodowli komórek polimerowych (neuronalnych). (A) W czasie krótszym niż 24 godziny produkcja addytywna w skali mikro umożliwia przejście od modelu CAD do wydrukowanego w 3D wzorca, który można natychmiast i wielokrotnie wykorzystać jako replikę formy z biokompatybilnymi elastomerami, takimi jak PDMS. (B-C) Powstałe w ten sposób urządzenia PDMS są sprzężone z płaskim substratem do hodowli komórek neuronalnych, w tym przypadku reprezentowanym przez szereg mikroelektrod. Dla konkretnego projektu próbki w (A) zdefiniowano dwie komory: jedną określaną jako Źródło i oznaczoną przez S, a drugą określaną jako Cel i oznaczoną przez T. (D) Neurony umieszczone w każdej komorze mogą rozwijać swoje neuryty tylko przez szereg mikrokanałów. Po odpowiednim ustawieniu pod kontrolą mikroskopii stereoskopowej w (C), dwa zestawy mikroelektrod zintegrowanych z substratem pozostawia się odsłonięte, tak aby można było stymulować i rejestrować aktywność bioelektryczną pobliskich neuronów znajdujących się w obu przedziałach. Zauważmy tutaj, że wyrównanie mikroelektrod w poszczególnych mikrokanałach nie było priorytetem tego dowodu słuszności zasady. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Obrazowanie na żywo nieprzepuszczalnych dla komórek fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych, identyfikuje neuryty wydłużone przez neurony, kilka dni po posiewie komórek. (A-D) Reprezentatywne konfokalne mikrofotografie fluorescencyjne modułowych kultur neuronalnych urządzenia wytworzonego z Rysunek 1 i Rysunek 2 (N = 4, 128 pojedynczych mikrokanałów) zostały uzyskane 2 i 6 dni po posiewie komórek. (B-D) 40-krotne powiększenie i odwrócona skala szarości mikrofotografii dla zwiększenia widoczności. Zakończenia mikrokanałów z przedziałów źródłowych i docelowych są oznaczone odpowiednio literami S i T. (A) pokazuje obraz kultury o szerokim skanie, w którym źródło (tj. wewnętrzny kwadratowy obszar) i cel (tj. obszar zewnętrzny) są pełne komórek, 6 dni po posiewaniu. (B) i (C) pokazują, we wcześniejszym punkcie czasowym 2 dni po posiewie, wzrost neurytów odpowiednio po stronie źródłowej i docelowej mikrokanałów. Małe czarne trójkąty wskazują reprezentatywne przykłady przypuszczalnych końcówek wiązek aksonów, najwyraźniej pochodzących tylko ze Źródła. Granice mikrokanalików w kształcie strzały wskazują na wydłużenie neurytów wzdłuż krawędzi (B), gdzie ich przejście jest nieprzerwane i kierowane w stronę Celu. W przeciwnym kierunku, obok zakończenia celu mikrokanału (C), neuryty pochodzące z celu i posuwające się do strony źródłowej są uwięzione w ostrych rogach. (D) dalej ujawnia szczegóły rozrostu neurytów wewnątrz mikrokanału. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Funkcjonalna charakterystyka neuronalnych reakcji elektrycznych, z urządzeniem PDMS i bez niego. MEA wykorzystano jako substraty do hodowli komórek i wykorzystano do pomiaru reakcji impulsowych w całej sieci wywołanych przez bardzo krótki (tj. 200 μs, 0,8 V) dwufazowy impuls stymulacji elektrycznej, dostarczany w konfiguracji dwubiegunowej. W przypadku urządzenia PDMS o nazwie Rysunek 2, neuronalne reakcje impulsowe zarejestrowane ze źródła (czerwony) i z celu (niebieski) różnią się w zależności od tego, gdzie bodziec jest dostarczany. Przypuszczalne opóźnienia aksonalne, synaptyczne i integracyjne stają się widoczne w (A), ale nie w (B), co sugeruje, że istnieje preferowana łączność synaptyczna (tj. od źródła do celu). (C-D) W warunkach kontrolnych (tj. bez urządzenia PDMS) wywołane reakcje wykryte w dwóch różnych zestawach mikroelektrod MEA nie zależą od miejsca dostarczenia bodźca. Blade cieniowanie, otaczające linie na wykresach, oznacza chwilowy błąd standardowy średniej (N bodźców = 150). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nazwa rozwiązaniaKompozycja
polietylenoimina (PEI) 0,1%1 ml roztworu podstawowego PEI, 9 ml sterylnej wody dejonizowanej (DI).
Pożywka hodowlana (50 ml)Minimum Essential Medium (MEM), uzupełnione o 20 μM glukozy, 50 μg/ml gentamycyny, 50 μM L-glutaminy i 10% inaktywowanej termicznie surowicy końskiej.
Pożywka preparcyjna (1000 ml)Hanks′ Sole zrównoważone 9,52 g, Wodorowęglan sodu 350 mg, HEPES 2,83 g, D-(+)-glukoza 6 g, Kwas kynureninowy (stężenie końcowe 200 μM), D-AP5 (stężenie końcowe 25 μM), gentamycyna 250 μl, Albumina surowicy bydlęcej 300 mg, Siarczan magnezu 1,44 g. Dostosuj pH do 7,3, chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4°C.
Pożywka wytrawiająca (100 ml)Chlorek sodu 800 mg, Chlorek potasu 37 mg, Wodorofosforan di-sodu 99 mg, HEPES 600 mg, Wodorowęglan sodu 35 mg, Kwas kynureninowy, 200 μL (z zapasów 100 mM), D-AP5 100 μL (z zapasów 25 mM). Ustawić pH na 7,4, chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
Rozwiązanie 1Trypsyna 5 mg, Deoksyrybonukleaza I 1,5 mg, w 2 ml pożywki trawiącej.
Rozwiązanie 2Inhibitor trypsyny 5 mg, w 5 ml pożywki preparucyjnej.
Rozwiązanie 3Deoksyrybonukleaza I 1,5 g, w 2,5 ml pożywki preparucyjnej.

Tabela 1: Tabela rozwiązań. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z opisami produktów.

Dodatkowy plik kodowania 1: Plik projektu STL odpowiada strukturze przedstawionej w Rysunek 2A. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo dziesięcioleci, zastosowanie technologii 2PP w formowaniu replik na podstawie PDMS w skali mikrometrycznej jest niedawnym osiągnięciem43,44. W tym kontekście, poniżej omówiono szereg punktów, które mają pomóc użytkownikom w skutecznym odtworzeniu tego dzieła.

W przypadku projektowania modelu 3D upewnij się, że model nie ma otworów ani samoprzecięć. Uprzywilejuj format pliku binarnego podczas zapisywania jako STL, ze względu na mniejszy rozmiar pliku niż w przypadku pliku zakodowanego w formacie ASCII. Jest to szczególnie korzystne w przypadku projektów o skomplikowanej geometrii i obiektów o szerokości mililitrów. Korzystanie z binarnych plików STL wiąże się również z niskim obciążeniem procesora, co w późniejszym okresie procesu wymaga przygotowania części mechanicznej do druku 3D. Fizyczne wymiary elementów w pliku STL są reprezentowane w jednostkach bezwymiarowych. Podczas przetwarzania końcowego pliku STL jednostki są interpretowane jako mikrometry. Dlatego zaleca się, aby przy sporządzaniu pliku z góry przyjąć jednostkę zainteresowania, tj. mikrometr. Dokładność drukowanego modelu jest określana przez liczbę powierzchni aproksymujących mozaikowe trójkąty. W przypadku niewystarczającej liczby powierzchni pojawi się niepożądana chropowatość powierzchni. Niemniej jednak dążenie do zbyt dużej dokładności przez bardzo dużą liczbę powierzchni odbywa się kosztem dużego obciążenia obliczeniowego, co powoduje powolne przetwarzanie plików.

W przypadku druku 3D, podczas drukowania, fizyczny obiekt 3D jest formowany za pomocą szybkiego skanowania galvo w płaszczyźnie x-y i ruchu piezoelektrycznego w kierunku z. Powoduje to skupienie wiązki lasera femtosekundowego w obrębie dowolnego woksela 3D. Jeśli jednak struktury drukarskie są większe niż zakresy pokrycia przestrzennego galvo i piezo, obiekt musi zostać programowo podzielony na bloki. Chociaż jest to wymóg w przypadku części drukowanych o rozmiarach milimetrowych, połączenia między blokami są związane z (niedoskonałymi) liniami zszywania. Staranna optymalizacja liczby bloków i rozmieszczenie linii zszywania w kierunkach x, y i z ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć zakłócenia krytycznych cech geometrycznych końcowego obiektu liniami zszywania. Pęcherzyki mogą tworzyć się na interfejsie drukowania z różnych powodów (np. podłoża, zanieczyszczenia i niejednorodności fotorezystu) i negatywnie wpływać na jakość i integralność drukowanej struktury. Co więcej, wyższa moc lasera może prowadzić do zwiększenia ich występowania. Zmniejszenie mocy lasera na najniższej warstwie drukowanej części zminimalizuje ryzyko tworzenia się pęcherzyków. Jako alternatywę dla drukowania całej części jako konstrukcji bryłowej można rozważyć metodę skorupowo-rusztowania. Polega ona na wydrukowaniu jedynie zewnętrznej powierzchni części (powłoki) oraz znajdujących się w jej obrębie trójkątnych elementów pryzmatycznych. Elementy te są oddzielone poziomymi warstwami (rusztowaniami), utrzymującymi niespolimeryzowaną żywicę w małych kieszeniach. Metoda ta znacznie skraca czas drukowania, co ma znaczenie zwłaszcza w przypadku konstrukcji o rozmiarach milimetrowych. Jednakże, ponieważ pozostaje żywica niespolimeryzowana, ekspozycja na promieniowanie UV po wydrukowaniu jest konieczna, aby zapewnić pełną stabilność mechaniczną, chociaż ten krok należy wykonać delikatnie, aby uniknąć deformacji drukowanej części. Czas utwardzania zależy od wybranej żywicy, grubości części i mocy UV40. W celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się przeprowadzenie wstępnej próby w celu oszacowania czasu potrzebnego do utwardzenia na pełnej głębokości, przy użyciu kropli fotorezystu i oceny jej przekroju, po ekspozycji na promieniowanie UV. Zwykle czas utwardzania wynosi od 5 do 20 minut.

W przypadku formowania replik PDMS, czysta produkcja urządzenia PDMS z funkcjami skali mikrometrycznej, bez urządzeń w pomieszczeniach czystych, może być wyzwaniem: mikrocząsteczki unoszące się w powietrzu mogą znajdować się na wysoce przyczepnej powierzchni PDMS i utrudniać uszczelnienie między urządzeniem a podłożem lub blokować przekrój poszczególnych mikrokanałów. Wykonywanie kroków protokołu pod okapem z przepływem laminarnym i konsekwentne osłanianie powierzchni PDMS izopropanolem znacznie minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia. Temperatura utwardzania i czas jego trwania mają bezpośredni wpływ na sieciowanie PDMS i wynikające z niego właściwości fizyczne. W szczególności kluczowym czynnikiem jest przyczepność utwardzonego PDMS. Z jednej strony wymagane jest szczelne uszczelnienie między urządzeniem PDMS a powierzchnią używaną do hodowli komórek neuronalnych (np. szklanym szkiełkiem nakrywkowym lub MEA), aby skutecznie ograniczyć przejście neurytów. Z drugiej strony urządzenie PDMS powinno przyczepiać się do podłoża odwracalnie, tak aby delikatna warstwa izolacyjna MEA nie uległa uszkodzeniu po zdjęciu urządzenia. Podczas gdy skurcz PDMS podczas utwardzania występuje i może zostać skorygowany przez wcześniejsze przeskalowanie formy, dla wskazanych tutaj temperatur i interwałów utwardzania skurcz będzie mniejszy niż 2%42 i nie wpłynie znacząco na jednowarstwowe urządzenia PDMS. Ogólnie rzecz biorąc, dokładnie przestrzegaj zalecanych wartości temperatury i czasu utwardzania, aby uzyskać najlepsze rezultaty.

Przegląd zalet i ograniczeń metody
Zaproponowano technikę opartą na bezpośrednim zapisie laserowym 2-fotonowym do szybkiego wytwarzania urządzeń polimerowych w mikroskali do eksperymentalnego badania modułowych sieci neuronowych. W przeciwieństwie do miękkiej fotolitografii, proponowane podejście nie wymaga wysokiego poziomu wiedzy technicznej, pod warunkiem, że funkcjonalna konfiguracja druku 3D 2PP jest dostępna i działa. Co ciekawe, metoda ta umożliwia przejście od zaprojektowanego przez CAD modelu 3D do funkcjonalnego urządzenia PDMS w ciągu jednego dnia, zapewniając w ten sposób bezpośrednią i wydajną ścieżkę od koncepcji do namacalnej realizacji. W szczególności wybór trybu drukowania w skorupie i rusztowaniu znacznie skraca czas potrzebny na stworzenie formy, ponieważ drukowany jest tylko ułamek jej objętości. Późniejsze utwardzanie drukowanego elementu promieniami UV gwarantuje jego stabilność mechaniczną i wytrzymałość, co zostało potwierdzone w ponad 50 cyklach odlewania za pomocą PDMS.

W porównaniu z tradycyjnymi metodami, druk 3D 2PP ma wyraźną przewagę, która jest najbardziej widoczna, jeśli chodzi o wytwarzanie form o znacznych proporcjach, wysokich wymaganiach dotyczących rozdzielczości i złożonych geometriach trójwymiarowych. Produkcja form wzorcowych przy użyciu standardowej litografii UV jest ograniczona przez grubość rezystu wynoszącą około 200 μm. Aby osiągnąć większą wysokość i proporcje, wymagane są skomplikowane sekwencje cykli powlekania wirowego i naświetlania35, kosztowne procesy LIGA (litografia, galwanizacja i formowanie) lub głębokie reaktywne trawienie jonowe (DRIE)36 . W ostrym kontraście, jak wykazano w pionierskiej pracy Kumi i in. w 2010 r.37 , technika 2PP oferuje zasadniczo nieograniczony zakres proporcji drukowanych części, od submikrometra do milimetra. W tym miejscu zilustrowano proces mikroprodukcji formy ze znaczną różnicą wysokości jej porcji, charakteryzujący się ponad 100-krotną różnicą między wysokością mikrokanalików (5 μm) a maksymalną wysokością formy (545 μm; patrz rysunek 2).

Ponadto rozdzielczość submikrometrową można łatwo osiągnąć, postępując zgodnie z opisanymi specyfikacjami protokołu. Dla porównania, osiągnięcie lepszych rozdzielczości formy za pomocą fotolitografii UV wymaga inwestycji kapitałowych. Maski o najwyższej rozdzielczości, wykorzystujące osadzanie chromu na kwarcu o nominalnej rozdzielczości 600 nm, są wyceniane o kilka rzędów wielkości wyżej niż drukowane laserowo maski przezroczyste nad głową, które mają rozdzielczość 250 μm35, jednak patrz praca Pirlo i wsp.41. Aby można ją było stosować we własnym zakresie, wybrana metoda musi być opłacalna. Dla wielu laboratoriów biologicznych całkowite koszty związane z konwencjonalną miękką fotolitografią lub bezpośrednim pisaniem laserowym stanowią barierę. Chociaż możliwe jest zwiększenie dostępności obu technologii poprzez zakup i montaż niezbędnych komponentów, podejście to wymaga dodatkowej wiedzy specjalistycznej i nadal wymaga znacznych inwestycji. W tym kontekście istotną kwestią, którą należy wziąć pod uwagę, jest szersze spektrum zastosowań, które można osiągnąć dzięki bezpośredniemu pisaniu laserowemu. W przeciwieństwie do konwencjonalnej miękkiej fotolitografii, ograniczonej głównie do mikroprodukcji form, druk 3D 2PP wykazuje niezwykłą wszechstronność. Jego potencjalne zastosowania obejmują zarówno mikrofluidykę i mikrooptykę, jak i zintegrowaną fotonikę i mikromechanikę. To sprawia, że inwestowanie w tę technologię jest atrakcyjne jako wspólny obiekt dla wielu i różnorodnych dziedzin nauki. Na przykład metodologia oparta na 2PP opracowana w tym protokole jest wynikiem interdyscyplinarnej współpracy między wydziałami neuronauki i matematyki w naszej instytucji. Dodatkowo, rozwój fotorezystu jest aktywnym polem badań i może potencjalnie rozszerzyć zakres zastosowań druku 3D 2PP. Dobrym przykładem jest niedawne wprowadzenie żywicy IP-PDMS. Polimeryzując w struktury o właściwościach takich jak PDMS38, żywica ta uwalnia potencjał do bezpośredniej mikrofabrykacji biokompatybilnych komponentów, które mają pofałdowaną powierzchnię lub zawierają puste przestrzenie. Te zawiłości stanowią barierę w osiąganiu podobnych wyników za pomocą konwencjonalnych procedur formowania replik.

Jako demonstrację tej metody przedstawiono dowody sugerujące rozwój jednokierunkowej łączności między dwoma modułami w modułowej sieci neuronowej. Forma w mikroskali, wykonana techniką 2PP, miała wystarczającą wytrzymałość, aby poddać się wielokrotnemu odlewaniu PDMS i ma wymaganą precyzję w mikroskali. Podsumowując, zakres stosowania protokołu opisanego w niniejszej pracy wykracza poza zilustrowany przypadek. Ponieważ dostęp do technologii druku 2PP staje się coraz powszechniejszy, początkowe inwestycje wymagane do jej wdrożenia będą się zmniejszać, a zakres jej potencjalnych zastosowań będzie się rozszerzał.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.G. dziękuje za wsparcie finansowe z Programu Ramowego Unii Europejskiej H2020 za pośrednictwem Europejskiej Rady ds. Innowacji (projekt IN-FET, GA n. 862882, projekt Arbor-IO, FLAG-ERA i Human Brain Project, ID 650003) oraz od SISSA (Obszar Neuronauki). G.N. dziękuje za wsparcie finansowe od włoskiego Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych (MUR) poprzez grant Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (Obszar Matematyki). Dziękujemy M. Gigante, B. Pastore i M. Grandolfo za ich pomoc w druku 3D, hodowli komórek i obrazowaniu na żywo, a także dr P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente i H.C. Schultheiss za dyskusje. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-PropanolSigma-Aldrich650447
BB utwardzanyPCube SrlDługości fal 365-405 nm, moc 120W
BioMed Amber Resin 1 Lformlabs Żywicaużywana do montażu formy drukowanej w 3D na szalce Petriego
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9418
Oprogramowanie aplikacyjne CAD SolidWorksDassault Systè mes SolidWorks Corporation, USFusion 360 (Autodesk Inc., Stany Zjednoczone), AutoCAD (Autodesk Inc., Stany Zjednoczone), PTC Creo (PTC Corp., Stany Zjednoczone), SolidWorks (Dassault Systè mes SolidWorks corp., Stany Zjednoczone) i Tinkercad (Autodesk Inc., Stany Zjednoczone).
                                                                --------------------------------------
Poradniki: https://www.mycadsite.com/tutorials.html
Szkolenia: https://www.autodesk.com/training
CellTracker Green CMFDAInvitrogenC7025
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270
D-AP5Tocris#0106
Deoxyribonuclease ISigma-AldrichD5025
DeScribeNanoscribe GmbH & Co. 
Wodorofosforan soduSigma-Aldrich106585
GentamycynaThermo Fisher15710049
Hanks′ Sole zrównoważoneSigma-AldrichH2387
HEPESSigma-AldrichH7523
Surowica końskaSigma-AldrichH1138
system rejestracji MEA in vitro MEA2000 miniMultichannel Systems GmBH, Reutlingen, Niemcy
IP-S PhotoresistNanoscribe GmbH & Co. 
Kwas kynureninowySigma-AldrichK3375
L-Glutamina (200 mM)Gibco25030081
Siarczan magnezuSigma-AldrichM2643
Oprogramowanie aplikacyjne do nagrywania MEA (Eksperymentator)Systemy wielokanałowe GmBH, Reutlingen, Niemcy
Minimum Essential MediumSigma-Aldrich51412C
NanoWriteNanoscribe GmbH & Co. 
nóż okulistyczny 15°HESTIA Medical
Photonic Professional GT2 (PPGT2)Nanoscribe GmbH & Co.  KGSN617
Myjka plazmowaHARRICK PLASMA
Roztwór poli(etyleniminy)Sigma-AldrichP3143
Chlorek potasuSigma-AldrichP3911
Octan eteru metylowego glikolu propylenowego (PGMEA)Sigma-Aldrich484431
Repel-silan ESSigma-AldrichGE17133201
Podłoża sodowo-wapniowe ITO dla 3D MF DiLLNanoscribe GmbH & Co. 
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS6014
Chlorek soduSigma-AldrichS9888
Zintegrowane z substratem planarne MEA (120MEA100/30iR-ITO-gr)Systemy wielokanałowe GmBH, Reutlingen, NiemcyElektrody TiN, izolator SiN, 4 wewnętrzne elektrody odniesienia, 120 elektrod rejestrujących, Rozstaw elektrod 100 i mikro; m, średnica elektrody 30 i mikro; m
SYLGARD 184 ZestawDow Corning
TrypsinSigma-AldrichT1005
Inhibitor trypsynyPompa próżniowa Sigma-AldrichT9003
Jednofazowa asynchroniczna 2-biegunowa CIMAMOTORI
Kompaktowy polimeryzator KGKGKGDrukarka 3D KG

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kanagasabapathi, T. T., et al. Dual-compartment neurofluidic system for electrophysiological measurements in physically segregated and functionally connected neuronal cell culture. Front Neuroeng. 4, 13(2011).
  2. Maeda, E., Robinson, H. P. C., Kawana, A. The mechanisms of generation and propagation of synchronized bursting in developing networks of cortical neurons. J Neurosci. 15 (10), 6834-6845 (1995).
  3. Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Designing neural networks in culture. Proc IEEE Inst Electr Electron Eng. 98 (3), 398-406 (2010).
  4. DeMarse, T. B., Pan, L., Alagapan, S., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Feed-forward propagation of temporal and rate information between cortical populations during coherent activation in engineered in vitro networks. Front Neural Circuits. 10, 32(2016).
  5. Kanagasabapathi, T. T., et al. Functional connectivity and dynamics of cortical-thalamic networks co-cultured in a dual compartment device. J Neural Eng. 9 (3), 036010(2012).
  6. Brofiga, M., Pisano, M., Tedesco, M., Raiteri, R., Massobrio, P. Three-dimensionality shapes the dynamics of cortical interconnected to hippocampal networks. J Neural Eng. 15 (5), 056044(2020).
  7. Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PLoS One. 9 (9), e107400(2014).
  8. Hasan, M. F., Berdichevsky, Y. Neural circuits on a chip. Micromachines. 7 (9), 157(2016).
  9. Aebersold, M. J., et al. 34;Brains on a chip": Towards engineered neural networks. TrAC Tren Anal Chem. 78, 60-69 (2016).
  10. Zamora-López, G., Chen, Y., Deco, G., Kringelbach, M. L., Zhou, C. Functional complexity emerging from anatomical constraints in the brain: The significance of network modularity and rich-clubs. Sci Rep. 6, 38424(2016).
  11. Eytan, D., Marom, S. Dynamics and effective topology underlying synchronization in networks of cortical neurons. J Neurosci. 26 (33), 8465-8476 (2006).
  12. Pan, L., Alagapan, S., Franca, E., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Propagation of action potential activity in a predefined microtunnel neural network. J Neural Eng. 8 (4), 046031(2011).
  13. Virlogeux, A., et al. Reconstituting corticostriatal network on-a-chip reveals the contribution of the presynaptic compartment to Huntington's disease. Cell Rep. 22 (1), 110-122 (2018).
  14. Kleinfeld, D., Kahler, K., Hockberger, P. E. Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates. J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).
  15. Vogt, A. K., Wrobel, G., Meyer, W., Knoll, W., Offenhäusser, A. Synaptic plasticity in micropatterned neuronal networks. Biomaterials. 26 (15), 2549-2557 (2005).
  16. Staii, C., et al. Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using atomic force microscopy. Biomaterials. 30 (20), 3397-3404 (2009).
  17. Fricke, R., et al. Axon guidance of rat cortical neurons by microcontact printed gradients. Biomaterials. 32 (8), 2070-2076 (2011).
  18. Gladkov, A., et al. Design of cultured neuron networks in vitro with predefined connectivity using asymmetric microfluidic channels. Sci Rep. 7 (1), 15625(2017).
  19. le Feber, J., Postma, W., de Weerd, E., Weusthof, M., Rutten, W. L. Barbed channels enhance unidirectional connectivity between neuronal networks cultured on multi electrode arrays. Front Neurosci. 9, 412(2015).
  20. Peyrin, J. M., et al. Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers. Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).
  21. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie - International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
  22. Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. Eur Phys J Spec Top. 204, 85-101 (2012).
  23. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. J Vis Exp. (119), e55276(2017).
  24. Levis, M., Ontiveros, F., Juan, J., Kavanagh, A., Zartman, J. J. Rapid fabrication of custom microfluidic devices for research and educational applications. J Vis Exp. (153), e60307(2019).
  25. Maruo, S., Nakamura, O., Kawata, S. Three-dimensional microfabrication with two-photon-absorbed photopolymerization. Opt Lett. 22 (2), 132-134 (1997).
  26. Baldacchini, T. Three-dimensional microfabrication using two-photon polymerization: Fundamentals, technology, and applications. , Elsevier. (2015).
  27. Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication. , CRC Press. (2018).
  28. Sun, H. B., Kawata, S. Two-photon photopolymerization and 3D lithographic microfabrication. NMR, 3D Anal, Photopolymeriz. Adv Poly Sci. 170, 169-273 (2004).
  29. Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: Lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
  30. Kamioka, H., Maeda, E., Jimbo, Y., Robinson, H. P. C., Kawana, A. Spontaneous periodic synchronized bursting during formation of mature patterns of connections in cortical cultures. Neurosci Lett. 206 (2-3), 109-112 (1996).
  31. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), e2056(2010).
  32. Mahmud, M., Pulizzi, R., Vasilaki, E., Giugliano, M. QSPIKE tools: A generic framework for parallel batch preprocessing of extracellular neuronal signals recorded by substrate microelectrode arrays. Front Neuroinform. 8, 26(2014).
  33. Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6 (1), 24701(2016).
  34. Scarsi, F., Tessadori, J., Chiappalone, M., Pasquale, V. Investigating the impact of electrical stimulation temporal distribution on cortical network responses. BMC Neurosci. 18 (1), 49(2017).
  35. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).
  36. Kim, K., et al. Rapid replication of polymeric and metallic high aspect ratio microstructures using PDMS and liga technology. Microsystem Technologies. 9 (1-2), 5-10 (2002).
  37. Kumi, G., Yanez, C. O., Belfield, K. D., Fourkas, J. T. High-speed multiphoton absorption polymerization: Fabrication of microfluidic channels with arbitrary cross-sections and high aspect ratios. Lab Chip. 10 (8), 1057-1060 (2010).
  38. Bunea, A. I., et al. et al.Micro 3D printing by two-photon polymerization: Configurations and parameters for the nanoscribe system. Micro. 1 (2), 164-180 (2021).
  39. Taylor, A., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  40. Oakdale, J. S., Ye, J., Smith, W. L., Biener, J. Post-print UV curing method for improving the mechanical properties of prototypes derived from two-photon lithography. Opt. Express. 24 (24), 27077-27086 (2016).
  41. Pirlo, R. K., Sweeney, A. J., Ringeisen, B. R., Kindy, M., Gao, B. Z. Biochip/laser cell deposition system to assess polarized axonal growth from single neurons and neuron/glia pairs in microchannels with novel asymmetrical geometries. Biomicrofluidics. 5 (1), 13408(2011).
  42. Madsen, M. H., Feidenhans'l, N. A., Hansen, P. E., Garnæs, J., Dirscherl, K. Accounting for PDMS shrinkage when replicating structures. J Micromech Microeng. 24 (12), 127002(2014).
  43. Comina, G., Suskaa, A., Filippini, D. PDMS lab-on-a-chip fabrication using 3D printed templates. Lab Chip. 14 (2), 424-430 (2013).
  44. Chan, H. N., et al. one-step molding of 3D-printed structures for convenient fabrication of truly 3D PDMS microfluidic chips. Microfluid Nanofluid. 19, 9-18 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two Photon Polymerization3D Cell CultureMicrofluidic DevicesPDMS FabricationNeuronal NetworksMicroelectrode ArraysExtracellular RecordingsModular Neural NetworksSynaptic ConnectivityElectrophysiology Analysis

Related Articles