Artykuł metodologiczny

Izolacja immunomagnetyczna komórek macierzystych CD34 + rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych od myszy

DOI:

10.3791/66193

⸱

22 grudnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education and Medical Electrophysiological Key Laboratory of Sichuan Province, Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie ustaliło stabilną i efektywną metodę izolacji, hodowli i funkcjonalnego określania komórek macierzystych CD34+ rezydujących w ścianie naczyń krwionośnych (CD34+ VW-SCs). Ta łatwa do naśladowania i efektywna czasowo metoda izolacji może być wykorzystana przez innych badaczy do badania potencjalnych mechanizmów związanych z chorobami sercowo-naczyniowymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ściana naczyń odgrywa kluczową rolę w rozwoju naczyń krwionośnych, regulacji homeostazy i postępie chorób naczyniowych. W ostatnich latach liczne badania ujawniły obecność różnych linii komórek macierzystych w tętnicach. W 2004 roku grupa profesora Qingbo Xu po raz pierwszy poinformowała o istnieniu naczyniowych komórek macierzystych/progenitorowych na obrzeżach ściany naczyń krwionośnych dorosłych, wyrażających CD34, Sca-1, c-kit i Flk-11. Te naczyniowe komórki macierzyste wykazują wielokierunkowy potencjał różnicowania i proliferacji. W normalnych warunkach pozostają stosunkowo spokojne; Jednak po aktywacji przez określone czynniki mogą różnicować się w komórki mięśni gładkich, komórki śródbłonka i fibroblasty. Alternatywnie, mogą regulować macierz okołonaczyniową i tworzenie mikronaczyń poprzez efekty parakrynne, aby promować naprawę lub przebudowę uszkodzonych naczyń krwionośnych2,3,4,5,6. Ostatnio odkryto, że komórki macierzyste CD34 + rezydujące w ścianie naczyniowej odgrywają rolę w regeneracji komórek śródbłonka po uszkodzeniu przewodu prowadzącego tętnicy udowej2. W związku z tym izolacja i kwantyfikacja VW-SC CD34+ oraz badanie podstawowych cech biologicznych komórek macierzystych CD34+ mają kluczowe znaczenie dla dalszych badań szlaków sygnałowych zaangażowanych w regulację VW-SC CD34+.

Obecnie dostępne są różne metody separacji komórek, w tym techniki oparte na charakterystyce hodowli komórkowej lub właściwościach fizycznych komórek, takie jak wirowanie w gradiacji gęstości, co powoduje, że posortowane komórki zawierają wiele komórek niedocelowych i stosunkowo niską czystość7,8,9,10,11,12. Inną powszechnie stosowaną techniką jest sortowanie komórek wspomagane fluorescencją/magnetycznie. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) to złożony system o wysokich wymaganiach technicznych, stosunkowo kosztowny, czasochłonny i potencjalnie wpływający na aktywność posortowanych komórek13,14. Jednak sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS) jest bardziej wydajne i wygodne, z wysokim współczynnikiem odzysku i aktywności komórek oraz mniejszym wpływem na dalsze zastosowania8. Dlatego w tym protokole zastosowaliśmy MACS do oczyszczania CD34+ VW-SC i dalej identyfikowaliśmy komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Opracowanie metod izolacji opartych na MACS do badania komórek macierzystych ściany naczyniowej byłoby nieocenione. Po pierwsze, pozwala na eksperymentalne badania genetyczne i biologiczne komórki. Po drugie, skuteczna izolacja i hodowla komórek macierzystych rezydujących w ścianie naczyniowej pozwala na systematyczną ocenę i badania przesiewowe czynników sygnalizacyjnych regulujących funkcje komórek macierzystych. Po trzecie, identyfikacja kluczowych fenotypów w komórkach macierzystych zapewnia ważną "kontrolę jakości" w ocenie stanu komórek. W związku z tym zidentyfikowanie metod oczyszczania może być przydatne w podobnych zastosowaniach do analogicznych komórek macierzystych pochodzących z naczyń krwionośnych.

Ten raport dostarcza szczegółowej demonstracji stabilnej i niezawodnej metody hodowli CD34+ VW-SCs, w tym identyfikacji komórek i oceny funkcjonalnej przeprowadzanej za pomocą cytometrii przepływowej, barwienia immunofluorescencyjnego i pomiaru sygnalizacji Ca2+. Badanie to stanowi podstawę do dalszych pogłębionych badań nad funkcją VW-SC CD34+ i ich mechanizmami regulacyjnymi w stanach fizjologicznych i patologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone, a zwierzęta były traktowane zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi zarządzania i użytkowania zwierząt laboratoryjnych w Chinach. Badania ściśle przestrzegały wymogów etycznych eksperymentów na zwierzętach, za zgodą Komisji Etyki Zwierząt (numer zatwierdzenia: SWMU2020664). Do niniejszego badania wykorzystano ośmiotygodniowe, zdrowe myszy C57BL/6 obu płci, ważące od 18 do 20 g. Zwierzęta były trzymane w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Południowo-Zachodniego Uniwersytetu Medycznego (SWMU).

1. Hodowla bloków tkankowych przydanek z aorty i tętnic krezkowych

  1. Izolacja rezydentnych CD34+ VW-SC
    1. Znieczulić dwie myszy 3% inhalacją izofluranu (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Potwierdź odpowiednie znieczulenie, szczypiąc palec u nogi. Ułóż mysz na wznak taśmą medyczną i spryskaj ją 70% etanolowym środkiem dezynfekującym, aby zdezynfekować sierść myszy. Otwórz jamę piersiową i brzuszną za pomocą sterylnych nożyczek okulistycznych i kleszczy, aby odsłonić serce i jelita. Po wypreparowaniu izolowanej aorty i tętnic krezkowych, przypnij aortę i łożysko krezkowe na szalce Petriego zawierającej elastomer krzemowy i wypełnionej fizjologicznym roztworem soli. Za pomocą innego zestawu wysterylizowanych nożyczek i kleszczy szybko wypreparuj tłuszcz wokół aorty i tętnic krezkowych.
    2. Wypreparowane tkanki przenieść na 6-centymetrową szalkę Petriego zawierającą 1% roztwór penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny B (patrz tabela materiałów). Po dwukrotnym przepłukaniu przenieś tętnice do okapu do hodowli tkankowej pod mikroskopem stereoskopowym.
    3. Przetnij tętnice wzdłużnie i za pomocą cienkich kleszczyków odklej zewnętrzną warstwę aorty i pierwszą odnogę tętnic krezkowych. Przenieść zewnętrzne warstwy na 3,5 cm szalkę Petriego zawierającą 0,1-0,2 ml pożywki hodowlanej (patrz tabela materiałów). Pokrój zewnętrzne warstwy na drobne kawałki (około 1 mm3).
    4. Przenieść kawałki tkanek do kolby T25 pokrytej żelatyną, zapewniając równomierne rozprowadzenie na dnie kolby. Zachowaj umiarkowaną odległość między fragmentami tkanki, aby ułatwić pełzanie i wzrost komórek. Umieścić kolbę pionowo w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 3 godziny, aby bloki tkanek przylgnęły do dna kolby.
    5. Po 3 godzinach dodaj 5 ml pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy, aby zanurzyć bloki tkankowe. Ustawić kolbę T25 poziomo. Monitoruj migrację komórek wokół bloków tkankowych pod mikroskopem w odstępach 3-dniowych.
      UWAGA: Pożywka powinna zawierać 20% płodowej surowicy bydlęcej, 0,2% czynnika hamującego białaczkę (LIF), 0,2 mM β-merkaptoetanolu i 1% penicyliny/streptomycyny (patrz tabela materiałów). Surowica bydlęca płodu wspomaga proliferację komórek, a LIF i β-merkaptoetanol utrudniają różnicowanie komórek7,8.
    6. Gdy komórki w kolbie T25 osiągną około 80% konfluencji, należy je przepuścić i wyhodować w jednej lub dwóch kolbach T75. Subkulturuj komórki przez pięć pasaży, aby zapewnić prawidłowy wzrost i zdrowie.
  2. Separacja magnetyczna rezydujących komórek macierzystych CD34+
    1. Gdy komórki w jednej lub dwóch kolbach T75 osiągną 80% konfluencji, zdysocjuj komórki trypsyną i ponownie zawieś je w 1 ml buforu sortującego (2 mM EDTA i 0,5% FBS). Oznaczyć liczbę komórek (kolba 107/T75) i odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 5 minut (w temperaturze pokojowej).
    2. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 98 μl buforu sortującego na 107 komórek. Dodać 2 μl przeciwciała CD34 (patrz tabela materiałów). Dobrze wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4°C w ciemności, od czasu do czasu wstrząsając.
    3. Przemyć komórki, dodając 2 ml buforu sortującego i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Ostrożnie i całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 80 μl buforu sortującego.
    5. Dodać 20 μl mikrokulek anty-FITC (na 107 komórek, patrz tabela materiałów) do buforu. Dobrze wymieszać przez wielokrotne pipetowanie i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności, z przerywanym wstrząsaniem.
    6. Umyj komórki dwukrotnie, dodając 2 ml buforu i odwiruj przy 300 x g przez 5 minut w celu ponownego osadzenia komórek. Całkowicie odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu.
    7. Umieścić jedną kolumnę MS w polu magnetycznym odpowiedniego separatora, upewniając się, że probówka zbiorcza (np. probówka wirówkowa o pojemności 15 ml) jest umieszczona pod kolumną MS w celu zebrania oddzielonych składników. (patrz Tabela materiałów). Przepłukać kolumnę buforem o pojemności 500 μl i poczekać, aż całkowicie się przejrzy.
    8. Załadować zawiesinę komórek do kolumny i zebrać przepływowy roztwór zawierający nieoznakowane komórki do probówki o pojemności 15 ml.
    9. Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją w nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wprowadzić 500 μl buforu do kolumny, a następnie niezwłocznie wypłukać magnetycznie znakowane komórki, wciskając tłok do kolumny.
    10. Aby zwiększyć czystość komórek CD34+, eluowaną frakcję można poddać wzbogacaniu za pomocą drugiej kolumny MS. Powtórz proces separacji, jak wspomniano powyżej. Ocenić czystość posortowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Zazwyczaj uzyskuje się 10%-20% komórek CD34+, z około 70%-80% komórek ujemnych i około 10% strat spowodowanych barwieniem i procedurami wirowania.
    11. Aby dodatkowo potwierdzić czystość komórek macierzystych CD34 + ściany naczyniowej, zidentyfikuj posortowane komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Obecne badanie wykazało czystość ponad 90%.

2. Identyfikacja komórek za pomocą immunofluorescencji

  1. Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych (średnica 8 mm) wstępnie pokryte 0,04% żelatyną.
  2. Gdy komórki osiągną około 60%-70% konfluencji, spłucz dwa razy PBS i utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 10 minut.
  3. Myć komórki PBS przez 3 minuty (3 razy) i przepuszczać komórki 0,2% Triton X-100 (w PBS) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Płucz komórki PBS przez 3 minuty (3 razy) i blokuj niespecyficzne wiązanie przeciwciał 5% surowicą osła (w PBS) przez 1 godzinę.
  5. Usuń bufor blokujący, przytrzymując każde szkiełko nakrywkowe na jego krawędzi kleszczami i odsączając je na arkusz niestrzępiącej się chusteczki.
  6. Inkubować komórki w 100 razy rozcieńczonych przeciwciałach pierwszorzędowych (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, patrz tabela materiałów) w 1% BSA (w PBS) przez noc w temperaturze 4 °C.
  7. Zdekantować roztwór i przemywać komórki PBS przez 3 minuty (3 razy). Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym Alexa Fluor 488 (1:200 w 1% BSA) (patrz Tabela materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  8. Wykonaj barwienie przeciwstawne DAPI, rozcieńczając roztwór podstawowy DAPI do 0,5 μg/ml w PBS i inkubując komórki przez 5 minut.
  9. Spłukać PBS i uszczelnić szkiełka nakrywkowe odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu. Rejestruj obrazy pod laserowym skaningowym mikroskopem konfokalnym.

3. Indukowane różnicowanie i charakterystyka CD34+ VW-SC

  1. Wysiewać komórki macierzyste CD34+ o odpowiedniej gęstości (40%-50% konfluencji) odpowiednio na szkiełkach nakrywkowych i płytkach 6-dołkowych.
  2. Indukuj różnicowanie zorientowane na komórki śródbłonka z komórek CD34 + poprzez hodowlę komórek w pożywce do hodowli komórek śródbłonka EBM-2 (patrz tabela materiałów) przez 1 tydzień.
  3. Indukuj różnicowanie zorientowane na komórki fibroblastów z komórek CD34 + poprzez hodowlę komórek w pożywce do hodowli komórek fibroblastów FM-2 (patrz tabela materiałów) przez 3 dni.
  4. Poddaj niezróżnicowane i zróżnicowane komórki barwieniu immunofluorescencyjnemu (jak wspomniano w kroku 2) przy wzbudzeniu laserowym 488 nm i obiektywie 40x. Wykryj ekspresję markerów komórek śródbłonka (CD31, VWF) i markerów komórek fibroblastów (PDGFRα, wimentyna) (patrz tabela materiałów).
  5. Oddzielić komórki za pomocą trypsyny i otrzymać osad komórkowy przez odwirowanie (300 x g, 5 min, temperatura pokojowa). Zawiesić komórki za pomocą 100 μl buforu sortującego. Wstępnie inkubować zawiesinę komórkową z oczyszczonym mAb anty-mysim CD16/CD32 (1 μg) (patrz tabela materiałów) w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  6. Dodać 2 μl przeciwciała monoklonalnego PE Rat anty-mysiego CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) APC (2 μL, 1:50) i przeciwciała monoklonalnego FITC CD140a (PDGFRa) (2 μL, 1:50) bezpośrednio do wstępnie inkubowanych komórek w obecności mysiego bloku Fc i dalej inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 min.
  7. Przemyć komórki dwukrotnie, dodając 2 ml buforu i odwirować przy 300 x g przez 5 minut (temperatura pokojowa) w celu ponownego osadzenia komórek. Supernatant należy całkowicie odrzucić i ponownie zawiesić komórki w 300 μl buforu. Umieść probówki przepływowe z barwionymi komórkami w zamrażalniku gotowym do cytometrii przepływowej.

4. Wykrywanie wewnątrzkomórkowejsygnalizacji Ca2+ w naczyniowych komórkach macierzystych CD34+

  1. Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych 10 godzin przed eksperymentami w gęstości do 70% konfluencji.
  2. Wyjmij szkiełka nakrywkowe i przymocuj je do dna niestandardowej komory z dowolną wazeliną.
  3. Szkiełka nakrywkowe przemyć raz PBS, zastąpić Fura-2/AM (5 μM) w roztworze Tyrode'a (NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl2 1,2 mM, glukoza 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2,4 mM) (patrz tabela materiałów) i inkubować komórki przez 30 minut w ciemności.
  4. Usuń barwnik, traktując go roztworem Tyrode'a przez 10 minut, aby umożliwić deestryfikację fura-2/AM.
  5. Zamontuj komorę na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w system obrazowania szerokokątnego zawierający monochromator i kamerę CCD (patrz tabela materiałów).
  6. Otwórz okno główne, przejdź do okna dialogowego Ustawienia chwytania i strony kamery, a następnie naciśnij przycisk na żywo, aby wyświetlić obraz na żywo.
  7. Wybierz typ obrazu fluorescencyjnego, ustaw czasy powtarzania pętli 340 nm/380 nm, rozmiar obrazu i czas ekspozycji aparatu na 380 nm i 340 nm, aby uzyskać optymalną jasność obrazu.
  8. Zrób pojedyncze migawki i narysuj kilka odręcznych linii, aby zakreślić komórki różnymi kolorami i wstępnie zdefiniować region zainteresowań (ROI), wskazując tło jako ROI 0.
  9. Ponownie edytuj już osadzony protokół w widoku obszaru roboczego i utwórz nowy obszar roboczy.
  10. Wykonaj protokół, a "Fluorescencja 340 nm div Fluorescencja 380 nm (Live Kinetic)" wyświetli wykres kinetyczny online.
  11. W widoku numerycznym widoczny będzie arkusz kalkulacyjny prezentujący kolumny wartości w skali szarości i odpowiadające im informacje o czasie. Wyeksportuj dane arkusza kalkulacyjnego za pomocą schowka.
  12. Obliczać F340 nm/F380 nm wskazujące wewnątrzkomórkowe zmiany Ca2+ po odjęciu fluorescencji tła (ROI 0).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja i oczyszczanie CD34+ VW-SCs
Wysoką czystość CD34 + VW-SC uzyskuje się z przydanki mysiej tętnicy aortalnej i krezkowej poprzez przyczepienie tkanek i magnetyczne sortowanie mikrokulek. Procent komórek CD34 + w ścianie naczynia wynosi na ogół 10%-30%. Cytometria przepływowa potwierdza, że czystość komórek CD34+ uzyskana metodą magnetycznego sortowania kulek wynosi ponad 90% (Rysunek 1A). Barwienie immunofluorescencyjne komórkowe ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zapewnia szybką i wygodną metodę uzyskiwania funkcjonalnych CD34+ VW-SC z aorty i tętnic krezkowych myszy. CD34+ VW-SC otrzymane tą metodą wykazują aktywność proliferacyjną i wielokierunkowe właściwości różnicujące. Receptory trifosforanowo-inozytolowo-1,4,5-trifosforanowe (IP3Rs), receptory ryanodyny (RyR) i kanały wapniowe obsługiwane przez magazyn pośredniczą w uwalnianiu i wnikaniu Ca2 + do CD34 + VW-SC. Opracowanie tej techniki stworzy podstawy do dal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantów Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82070502, 31972909, 32171099), Programu Nauki i Technologii Sichuan prowincji Syczuan (23NSFSC0576, 2022YFS0607). Autorzy pragną podziękować Qingbo Xu z Uniwersytetu Zhejiang za pomoc w hodowli komórkowej, a autorzy dziękują za naukową i techniczną pomoc platformy cytometrii przepływowej na Południowo-Zachodnim Uniwersytecie Medycznym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2% roztwór żelatynySigmaG1393
Przeciwciało anty-CD31R& DAF3628
Przeciwciało anty-CD34Abcamab81289
Przeciwciało anty-c-kitCST77522
Mikrokulki anty-FITCMiltenyi Biotec130-048-701 
Przeciwciało anty-FITC MicroBeads MACSMiltenyi Biotec130-048-701
Przeciwciało anty-Flk-1Abcamab24313
Przeciwciało anty-Ki67CST34330
Przeciwciało anty-PDGFR&alfaAbcamab131591
Przeciwciało anty-Sca-1Invitrogen710952
CD140a (PDGFRA) Monoklonalne Przeciwciało (APA5), FITCeBioscience   Invitrogen11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Przeciwciało monoklonalne (390), APCeBioscience  Invitrogen17-0311-82
CD34 Przeciwciało, przeciwciało przeciw myszy, FITC, REAfinity Klon REA383Miltenyi Biotec130-117-775
kaptur do hodowli komórkowejJIANGSU SUJING GROUP CO., LTD Wirówka SW-CJ-2FD
  CENA   L530
CO2  inkubatory                       Thermofisher Scientific4111
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy Zeiss ZEISS 980   
Pożywka DMEM o wysokiej zawartości glukozyATCC30-2002
Pożywka hodowlana EBM-2LonzaCC-3162
FACSMelody   BD Biosciences
FACSMelody&handel; System 
Płodowa surowica bydlęcaMilliporeES-009-C
Pożywka hodowlana FM-2ScienCell2331
Fura-2/AM InvitrogenM1292
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor Plus 488  Thermofisher Naukowy     A32731
Czynnik hamujący białaczkęMilliporeLIF2010
mikroskopie OlympusIX71
MiniMACS    Zestaw startowyMiltenyi Biotec130-090-312
Roztwór penicyliny-streptomycyny-amfoterycyny BBeyotimeC0224
Oczyszczony szczur Anti-Mouse CD16/CD32 (mysz BD Fc Block)BD Pharmingen553141
Mikroskop stereoskopowy OlympusSZX10 
Program TILLvisION 4.0   T.I.L.L.Photonics GmbHpolichromia V 
Przeciwciało monoklonalne VWF (F8/86)Thermofisher Scientific  MA5-14029
β-MerkaptoetanolThermofisher Scientific21985023
BD

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, Y., et al. Abundant progenitor cells in the adventitia contribute to atherosclerosis of vein grafts in ApoE-deficient mice. J Clin Invest. 113 (9), 1258-1265 (2004).
  2. Jiang, L., et al. Nonbone marrow CD34+ cells are crucial for endothelial repair of the injured artery. Circ Res. 129 (8), e146-e165 (2021).
  3. Tamma, R., Ruggieri, S., Annese, T., Ribatti, D. Vascular wall as a source of stem cells able to differentiate into endothelial cells. Adv Exp Med Biol. 1237, 29-36 (2020).
  4. Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key soxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
  5. Zhang, L., Issa Bhaloo, S., Chen, T., Zhou, B., Xu, Q. Roles of stem cells in vascular remodeling. Chin J Cell Biol. 43 (7), 1352-1361 (2021).
  6. Zhang, L., et al. Role of resident stem cells in vessel formation and arteriosclerosis. Circ Res. 122 (11), 1608-1624 (2018).
  7. Wu, Y., et al. Effects of estrogen on growth and smooth muscle differentiation of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Atherosclerosis. 240 (2), 453-461 (2015).
  8. Tang, J. M., et al. Isolation and culture of vascular wall-resident CD34+ stem/progenitor cells. Cardiol Plus. 4 (4), 116-120 (2019).
  9. Sukumaran, P., et al. Calcium signaling regulates autophagy and apoptosis. Cells. 10 (8), 2125(2021).
  10. van der Sanden, B., Dhobb, M., Berger, F., Wion, D. Optimizing stem cell culture. J Cell Biochem. 111 (4), 801-807 (2010).
  11. Rotmans, J. I., et al. In vivo, cell seeding with anti-CD34 antibodies successfully accelerates endothelialization but stimulates intimal hyperplasia in porcine arteriovenous expanded polytetrafluoroethylene grafts. Circulation. 112 (1), 12-18 (2005).
  12. Qu, R., et al. The role of serum amyloid A1 in the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells basing on single-cell RNA sequencing analysis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 187(2022).
  13. Flynn, J., Gorry, P. Flow Cytometry Analysis to Identify Human CD8+ T Cells. Methods Mol Biol. 2048, 1-13 (2019).
  14. Bacon, K., Lavoie, A., Rao, B. M., Daniele, M., Menegatti, S. Past, present, and future of affinity-based cell separation technologies. Acta Biomater. 112, 29-51 (2020).
  15. Ma, H. G., Liu, H. Q., Liu, S. D., Tang, Y. Y. Primary culture and identification of rat glomerular microvascular endothelial cells. Acta Physiol Sin. 73 (6), 926-930 (2021).
  16. Liu, W. H., Wang, P., Yang, J. Isolation, culture and identification of rats hair follicle neural crest stem cells. Chin J Neuroanat. 35 (2), 207-211 (2019).
  17. Kumar, P., Garg, N. Flow cytometry approaches to obtain medulloblastoma stem cells from bulk cultures. Methods Mol Biol. 2423, 87-94 (2022).
  18. Haroon, M. M., Vemula, P. K., Palakodeti, D. Flow cytometry analysis of planarian stem cells using DNA and mitochondrial dyes. Bio Protoc. 12 (2), e4299(2022).
  19. Catchpole, T., Nguyen, T. D., Gilfoyle, A., Csaky, K. G. A profile of circulating vascular progenitor cells in human neovascular age-related macular degeneration. PLOS One. 15 (2), e0229504(2020).
  20. Wang, G., Yu, G., Wang, D., Guo, S., Shan, F. Comparison of the purity and vitality of natural killer cells with different isolation kits. Exp Ther Med. 13 (5), 1875-1883 (2017).
  21. Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. Consortium SI. Isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PLOS One. 14 (3), e0213832(2019).
  22. Jiang, L. H., Mousawi, F., Yang, X., Roger, S. ATP-induced Ca2+-signalling mechanisms in the regulation of mesenchymal stem cell migration. Cell Mol Life Sci. 74 (20), 3697-3710 (2017).
  23. Ong, H. L., Subedi, K. P., Son, G. Y., Liu, X., Ambudkar, I. S. Tuning store-operated calcium entry to modulate Ca2+-dependent physiological processes. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1037-1045 (2019).
  24. Garcia-Carlos, C. A., et al. Angiotensin II, ATP and high extracellular potassium induced intracellular calcium responses in primary rat brain endothelial cell cultures. Cell Biochem Funct. 39 (5), 688-698 (2021).
  25. Reggiani, C. Caffeine as a tool to investigate sarcoplasmic reticulum and intracellular calcium dynamics in human skeletal muscles. J Muscle Res Cell Motil. 42 (2), 281-289 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki macierzyste CD34kom rki macierzyste ciany naczyniowejsortowanie za pomoc kulek magnetycznychcytometria przep ywowabarwienie immunofluorescencyjneobrazowanie wapniahodowla blok w tkankowychr nicowanie w kierunku endotelialnymr nicowanie w kierunku fibroblastycznymizolacja aorty mysiej

Powiązane artykuły