Obecny protokół opisuje zoptymalizowany system 3D do indukcji siatkówki neuronalnej, który zmniejsza adhezję i fuzję organoidów siatkówki z wysoką powtarzalnością i wydajnością.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Generowanie siatkówki nerwowej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Retinopatia jest jedną z głównych przyczyn ślepoty na całym świecie. Badanie jego patogenezy jest niezbędne do wczesnej diagnozy i szybkiego leczenia retinopatii. Niestety, bariery etyczne utrudniają zbieranie dowodów od ludzi. Ostatnio liczne badania wykazały, że ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) mogą być różnicowane w organoidy siatkówki (RO) przy użyciu różnych protokołów indukcji, które mają ogromny potencjał w retinopatii w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i terapiach opartych na komórkach macierzystych. W badaniu tym opisano zoptymalizowany protokół indukcji w celu wygenerowania siatkówki nerwowej (NR), który znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo pęcherzyków i fuzji, zwiększając wskaźnik sukcesu produkcji do 60 dnia. Opierając się na zdolności PSC do samoreorganizacji po dysocjacji, w połączeniu z pewnymi czynnikami uzupełniającymi, ta nowa metoda może w szczególności napędzać różnicowanie NR. Co więcej, podejście to jest nieskomplikowane, opłacalne, wykazuje znaczną powtarzalność i wydajność, przedstawia zachęcające perspektywy dla spersonalizowanych modeli chorób siatkówki i zapewnia obfity rezerwuar komórek do zastosowań takich jak terapia komórkowa, badania przesiewowe leków i testowanie terapii genowej.
Wprowadzenie
Oko służy jako główne źródło informacji między ludzkimi narządami zmysłów, a siatkówka jest główną tkanką czuciową w oczach ssaków1. Retinopatia jest jedną z głównych globalnych przyczyn chorób oczu, prowadzącą do ślepoty2. Około 2,85 miliona ludzi na całym świecie cierpi na różnego stopnia upośledzenie wzroku z powodu retinopatii3. W związku z tym badanie jego patogenezy ma kluczowe znaczenie dla wczesnej diagnozy i szybkiego leczenia. Większość badań nad ludzką retinopatią koncentrowała się przede wszystkim na modelach zwierzęcych4,5
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z założeniami Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Chińskiego Szpitala Ogólnego ChALW. Linia ESC WA09 (H9) została pozyskana z Instytutu Badawczego WiCell.
1. Pożywki hodowlane i przygotowanie odczynników
- Pożywka hodowlana u ludzi z ESC i roztwór do pasażu
- Pożywka konserwacyjna (MM): Przygotować 500 ml kompletnego MM (podłoże podstawowe + 5 razy suplement; patrz tabela materiałów) w sposób aseptyczny. Rozmrozić 5x suplement w temperaturze pokojowej (RT) lub przez noc w temperaturze 2-8 °C. Podgrzej do RT. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Graficzny przegląd zmodyfikowanego protokołu przedstawiono na Rysunku 1. H9-ESC zostały wykorzystane do generowania RO, gdy komórki osiągnęły gęstość 70%-80%. Zawiesiny pojedynczych komórek H9-ESC w 96-dołkowych stożkowych studzienkach o dnie w kształcie litery V uległy agregacji w 1. dniu i do 6. dnia utworzyły wyraźnie odgraniczone, okrągłe EB. Wraz z wydłużeniem czasu hodowli objętość EB stopniowo wzrastała. W 30. dniu, podczas długotrwałej różnicowania NR, wyraźnie uformowały się i pogru.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ludzkie RO mogą przestrzennie i czasowo odtworzyć rozwój siatkówki płodu, a wczesne RO wykazują wysoki stopień podobieństwa do siatkówki płodu na równoważnych etapach rozwoju15. Pod względem morfologii tkanek i ekspresji molekularnej, ludzka RO ściśle odzwierciedla rzeczywisty stan wzrostu tkanki siatkówki, zapewniając ogromne i niespotykane możliwości w dziedzinie modelowania chorób, badań przesiewowych leków i medycyny regeneracyjnej. Obecnie ustalono kilka różnych metod generowania RO z ludzkic.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Plastry do prania |
| 4% Paraformaldehyd | Servicebio | G1101-500ML | Napraw organoidy siatkówki |
| 5 ml Pipeta Pasteura | NEST | Biotechnology 318516 | Organoidy siatkówki |
| 96 studzienek stożkowych z dnem w kształcie litery V | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Szkiełka mikroskopowe adhezyjne | CITOTEST | 188105 | Plastry Fix |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Etanol bezwodny | SINOPHARM | 10009218 | Odwodnienie |
| Anty-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Przeciwciało pierwszorzędowe |
| Roztwór przeciw blaknięciu | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anty-KI67 | Abcam | ab16667 | Przeciwciało pierwszorzędowe |
| anty-NESTIN | Sigma | N5413 | Przeciwciało pierwszorzędowe |
| Antyneuronalna klasa III β-tubulina (TUJ1) | Beyotime | AT809 | Przeciwciało |
| Anty-PAX6 | Abcam | ab195045 | Pierwotne przeciwciało |
| Roztwór dysocjacji komórek (CDS) | STEMCELL Technologie | 7922 | Dysocjacja komórek |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | Inhibitor GSK-3 i alfa;/β |
| Koncentrat lipidowy cholesterolu | Gibco | 12531018 | 250 razy; |
| Roztwór do odzyskiwania antygenu cytrynianowego | Servicebio | G1202-250ML | 20&razy;, pH 6,0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Medium do zamrażania komórek |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Jądrowy przeciwbarwnik |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Przeciwciało wtórne |
| Osioł anty-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Przeciwciało drugorzędowe |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0,5 M, pH 8,0, dysocjacja komórek |
| Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) | Corning | 354277 | Płytki powlekające |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Płodowa surowica bydlęca | Gibco | A5669701 | |
| Przepływowy analizator ilościowy komórek tkankowych | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Sekcje skanowania |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Inhibitor Wnt |
| KnockOut Wymiana surowicy | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Płytki 24-dołkowe o niskiej przyczepności | Corning | 3473 | |
| Płytki 6-dołkowe o niskiej przyczepności | Corning | 3471 | |
| Podłoże konserwacyjne (MM) | STEMCELL Technologie | 85850 | Średni |
| suplement N2 | Gibco | 17502048 | |
| Normalna surowica osła | Solarbio | SL050 | Bufor blokujący |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tkanka zatapiająca |
| PBS pH 7,4 podstawowa (1x) | Gibco | C10010500BT | Bez Ca+,Mg+ |
| Rekonstanant białka morfogenetycznego ludzkiej kości-4 (rhBMP4) | R& D | 314-BP | Kluczowy czynnik białkowy |
| Kwas retinowy | Sigma | R2625 | Proszek, przechowywać z dala od światła |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | Inhibitor ALK5 |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Inhibitor kinazy tyrozynowej |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Tauryna | Sigma | T0625-10G | |
| Tioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilizacja |
| WA09 linia embrionalnych komórek macierzystych | Badawczy WiCell | Linia komórkowa | |
| Ksylen | SINOPHARM | 10023418 | Deparafiing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
Bibliografia
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Steinmetz, J. D., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
