Artykuł metodologiczny

Generowanie siatkówki nerwowej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

DOI:

10.3791/66246

⸱

22 grudnia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese PLA, 2Senior Department of Ophthalmology, The Third Medical Center of Chinese PLA General Hospital, 3Stem Cell and Regenerative Medicine Lab, Beijing Institute of Radiation Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje zoptymalizowany system 3D do indukcji siatkówki neuronalnej, który zmniejsza adhezję i fuzję organoidów siatkówki z wysoką powtarzalnością i wydajnością.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinopatia jest jedną z głównych przyczyn ślepoty na całym świecie. Badanie jego patogenezy jest niezbędne do wczesnej diagnozy i szybkiego leczenia retinopatii. Niestety, bariery etyczne utrudniają zbieranie dowodów od ludzi. Ostatnio liczne badania wykazały, że ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) mogą być różnicowane w organoidy siatkówki (RO) przy użyciu różnych protokołów indukcji, które mają ogromny potencjał w retinopatii w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i terapiach opartych na komórkach macierzystych. W badaniu tym opisano zoptymalizowany protokół indukcji w celu wygenerowania siatkówki nerwowej (NR), który znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo pęcherzyków i fuzji, zwiększając wskaźnik sukcesu produkcji do 60 dnia. Opierając się na zdolności PSC do samoreorganizacji po dysocjacji, w połączeniu z pewnymi czynnikami uzupełniającymi, ta nowa metoda może w szczególności napędzać różnicowanie NR. Co więcej, podejście to jest nieskomplikowane, opłacalne, wykazuje znaczną powtarzalność i wydajność, przedstawia zachęcające perspektywy dla spersonalizowanych modeli chorób siatkówki i zapewnia obfity rezerwuar komórek do zastosowań takich jak terapia komórkowa, badania przesiewowe leków i testowanie terapii genowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oko służy jako główne źródło informacji między ludzkimi narządami zmysłów, a siatkówka jest główną tkanką czuciową w oczach ssaków1. Retinopatia jest jedną z głównych globalnych przyczyn chorób oczu, prowadzącą do ślepoty2. Około 2,85 miliona ludzi na całym świecie cierpi na różnego stopnia upośledzenie wzroku z powodu retinopatii3. W związku z tym badanie jego patogenezy ma kluczowe znaczenie dla wczesnej diagnozy i szybkiego leczenia. Większość badań nad ludzką retinopatią koncentrowała się przede wszystkim na modelach zwierzęcych4,5,6. Jednak ludzka siatkówka jest złożoną, wielowarstwową tkanką składającą się z różnych typów komórek. Tradycyjne dwuwymiarowe (2D) hodowle komórkowe i systemy modeli zwierzęcych zazwyczaj nie są w stanie wiernie odtworzyć normalnego rozwoju czasoprzestrzennego i metabolizmu leków rodzimej ludzkiej siatkówki7,8.

Ostatnio, techniki hodowli 3D rozwinęły się do generowania tkanek podobnych do organów z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC)9,10. Organoidy siatkówki (RO) generowane z ludzkich PSC w systemie hodowli zawiesinowej 3D nie tylko zawierają siedem typów komórek siatkówki, ale także wykazują wyraźną strukturę warstwową podobną do ludzkiej siatkówki in vivo11,12,13. Ludzkie RO pochodzące z PSC zyskały popularność i powszechną dostępność i są obecnie najlepszymi modelami in vitro do badania rozwoju i choroby ludzkiej siatkówki14,15. W ciągu ostatnich kilku dekad wielu badaczy wykazało, że ludzkie PSC, w tym embrionalne komórki macierzyste (ESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), mogą różnicować się w RO przy użyciu różnych protokołów indukcji. Postępy te mają ogromny potencjał w retinopatii w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i terapiach opartych na komórkach macierzystych16,17,18.

Jednak generowanie siatkówki nerwowej (NR) z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) jest skomplikowanym, kłopotliwym i czasochłonnym procesem. Co więcej, różnice w organoidach tkankowych między partiami mogą prowadzić do mniejszej odtwarzalności wyników19,20. Liczne czynniki wewnętrzne i zewnętrzne mogą wpływać na wydajność organoidów siatkówki (RO), takich jak liczba lub gatunek komórek wyjściowych oraz wykorzystanie czynników transkrypcyjnych i związków małocząsteczkowych21,22,23. Odkąd pierwsza ludzka RO została wygenerowana przez laboratorium Sasai11, na przestrzeni lat zaproponowano wiele modyfikacji w celu zwiększenia łatwości i skuteczności procesu indukcji13,21,24,25. Niestety, do tej pory nie ustanowiono złotego standardu dla generowania RO we wszystkich laboratoriach. Rzeczywiście, istnieje pewien stopień rozbieżności w RO wynikający z różnych metod indukcji, a także duże zróżnicowanie w ekspresji markerów siatkówki i odporności ich struktury22,26. Kwestie te mogą poważnie skomplikować pobieranie próbek i interpretację wyników badania. W związku z tym potrzebny jest bardziej skonsolidowany i solidny protokół różnicowania, aby zmaksymalizować wydajność przy minimalnej heterogeniczności wytwarzania RO.

To badanie opisuje zoptymalizowany protokół indukcji oparty na kombinacji Kuwahara et al.12 i Döpper et al.27 ze szczegółowymi instrukcjami. Nowa metoda znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo pęcherzyków organoidowych i fuzji, zwiększając wskaźnik powodzenia generowania NR. Odkrycie to jest bardzo obiecujące dla modelowania chorób, badań przesiewowych leków i terapii komórkowej w zaburzeniach siatkówki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z założeniami Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyki Chińskiego Szpitala Ogólnego ChALW. Linia ESC WA09 (H9) została pozyskana z Instytutu Badawczego WiCell.

1. Pożywki hodowlane i przygotowanie odczynników

  1. Pożywka hodowlana u ludzi z ESC i roztwór do pasażu
    1. Pożywka konserwacyjna (MM): Przygotować 500 ml kompletnego MM (podłoże podstawowe + 5 razy suplement; patrz tabela materiałów) w sposób aseptyczny. Rozmrozić 5x suplement w temperaturze pokojowej (RT) lub przez noc w temperaturze 2-8 °C. Podgrzej do RT. Dobrze wymieszaj przed użyciem, aż suplement będzie wolny od zmętnienia.
    2. 1% macierz zewnątrzkomórkowa (ECM): Użyj wstępnie schłodzonej końcówki pipety i sterylnych probówek, aby dozować 200 μl ECM (patrz Tabela materiałów) na probówkę z lodem. Probówki należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Rozpuść ECM na lodzie i rozcieńcz wstępnie schłodzonym DMEM/F12 w stosunku 1:100.
    3. 0,5 mM pH = 8,0 EDTA: Aby przygotować 500 ml 0,5 mM EDTA, dodaj 500 μl 0,5 M EDTA i 0,9 g NaCl do 500 ml 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS) (patrz Tabela materiałów). Dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 2-8 °C.
  2. Ośrodek różnicujący siatkówkę
    1. Pożywka zdefiniowana chemicznie bez czynnika wzrostu (gfCDM): Przygotuj gfCDM, łącząc 45% zmodyfikowanego Dulbecco's medium-GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX) firmy Iscove, 45% Ham's F12-GlutaMAX (F12-Glutamax), 10% zamiennika surowicy nokautującej (KSR), 1% koncentratu lipidów cholesterolu i 450 μM tioglicerolu (patrz tabela materiałów).
  3. Związki małocząsteczkowe
    1. Y-27632 2HCl: Dodaj 50 mg proszku Y-27632 do 3,122 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Dozować i przechowywać Y-27632 (patrz tabela materiałów) w stężeniu 50 mM w temperaturze -80 °C przez 2 lata, z dala od światła. Rozcieńczyć zapas 2,500 razy (20 μM) przed użyciem, co odpowiada 0,4 μl Y-27632 na ml gfCDM.
    2. IWR1-endo: Dodać 2,4424 ml DMSO, aby rozpuścić 10 mg IWR1-endo (patrz Tabela materiałów), aby otrzymać 10 mM roztwór podstawowy. Dozować porcje i przechowywać je w temperaturze -80 °C przez okres do 2 lat. Dodać 0,3 μl 10 mM IWR1-endo na ml gfCDM dla stężenia 3 μM do indukcji.
    3. SB431542: Aby przygotować 50 mM SB431542, dodaj 10 mg SB431542 (patrz Tabela Materiałów) do 0,5203 ml DMSO i dokładnie wymieszaj. Przechowywać w temperaturze -80 °C w rozpuszczalniku maksymalnie 2 lata. W celu przygotowania SB431542 o stężeniu roboczym 10 μM, dodać 2 μl 50 mM roztworu podstawowego do 10 ml gfCDM.
    4. LDN-193189 2HCl: Rozpuścić 5 mg LDN-193189 2HCl (patrz tabela materiałów) w 10,4297 ml DMSO, aby uzyskać 1 mM roztworu podstawowego. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C (zgodnie z zaleceniami producenta). Dodaj 0,1 μl zapasu do każdych 10 ml gfCDM, co daje 100 nM LDN-193189 do indukcji.
    5. Rekombinowane białko morfogenetyczne ludzkiej kości 4 (BMP4): Rozpuścić w 50-200 μg/ml w 4 mM HCl (patrz tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze od 2 °C do 8 °C przez 1 miesiąc lub w temperaturze -20 °C przez 1 rok po rozpuszczeniu. Przeprowadzić indukcję NR za pomocą 1,5 nM BMP4.
  4. Długotrwała pożywka hodowlana NR
    1. Kwas retinowy (RA): Odmierz 6 mg proszku RZS (patrz tabela materiałów) i dodaj do 3,9941 ml DMSO. Przechowywać w porcjach 5 mM w temperaturze -80 °C i zużyć w ciągu 3 miesięcy. Aby osiągnąć stężenie robocze 0,5 μM, dodaj 10 μl mieszanki wzorcowej do 100 ml pożywki do różnicowania siatkówki nerwowej (NRDM). Dodaj tuż przed użyciem.
      UWAGA: Przechowywać z dala od światła podczas przygotowywania i przechowywania.
    2. Tauryna: Dodać taurynę w proszku (patrz tabela materiałów) o wadze 200 mg do 7,9904 ml DMSO, aby otrzymać roztwór podstawowy o stężeniu 200 mM. Dozować i przechowywać w temperaturze 2-8 °C. Stężenie robocze 0,1 mM tauryny uzyskuje się przez dodanie 50 μl roztworu podstawowego na 100 ml NRDM.
    3. NRDM: Skomponować NRDM z pożywką DMEM/F12-GlutaMAX, 1% suplementem N2, 10% płodową surowicą bydlęcą, 0,5 mM RZS i 0,1 mM tauryną (patrz tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze 2-8 °C do 2 tygodni lub 6 miesięcy w temperaturze -20 °C, aby zapewnić aktywność składników.
  5. Bufor blokujący: Rozcieńczyć w stosunku 1:9 DPBS w celu uzyskania 10% roztworu roboczego do użycia (patrz Tabela Materiałów). Przechowywać w temperaturze -20 °C do 5 lat.
    UWAGA: Wszystkie inne procedury należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, aby zapewnić sterylność, z wyjątkiem ważenia. Jeśli konieczne jest dodanie zważonych odczynników podczas procesu przygotowania, do filtracji należy użyć filtrów 0,22 μm.

2. Hodowla H9-ESC

  1. Rozmrażanie H9-ESC
    1. Dodaj 1 ml 1% ECM do każdego dołka na płytce 6-dołkowej. Inkubować przez 1 godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2.
      UWAGA: Unikaj dodawania ECM wzdłuż ścianek studni, ponieważ może on przykleić się do powierzchni.
    2. Weź wywar kriogeniczny H9-ESC ze zbiornika z ciekłym azotem i szybko wstrząśnij nim w wodzie o temperaturze 37 °C przez 30 s.
      UWAGA: Nie dopuścić do całkowitego rozmrożenia fiolki.
    3. Wyjąć fiolkę i ostrożnie wysterylizować ją za pomocą 75% środka dezynfekującego w sprayu. Dodać rozmrożony H9-ESC z kriowialu do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml MM z 10 μM Y-27632.
    4. Odwirować probówkę o stężeniu 190 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usunąć większość supernatantu za pomocą pipety o pojemności 1 ml, pozostawiając około 50 μl supernatantu, aby uniknąć utraty komórek.
    5. Dodać 1 ml MM zawierającego 10 μM Y27632 do osadu komórkowego i delikatnie zawiesić osad komórkowy za pomocą pipety o pojemności 1 ml, pipetując w górę iw dół 5-10 razy.
    6. Usunąć powłokę ECM po 1 godzinie inkubacji. Do każdej studzienki dodać 2 ml wstępnie podgrzanego MM zawierającego 10 μM Y-27632.
    7. Dozować 0,5 ml zawiesiny komórek na dołek. Delikatnie potrząśnij płytką na boki, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.
    8. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez co najmniej 24 godziny, nie dotykając jej.
    9. Zmieniaj medium codziennie. Gdy gęstość klonowania osiągnie 70% i więcej, wymagane jest pasażowanie.
  2. Pasażowanie H9-ESC
    1. Przygotować płytkę pokrytą ECM, jak opisano powyżej (krok 2.1.1) i dodać 2 ml MM do dołka.
    2. Usuń zużyte podłoże z płytek 6-dołkowych. Umyj każdą studzienkę dwukrotnie 1 ml DPBS.
    3. Przemyj każdą studzienkę dwukrotnie, powoli dodając 1 ml EDTA i inkubując z 1 ml EDTA przez 4-7 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Podczas inkubacji badać płytkę 6-dołkową przez 3 minuty pod mikroskopem. Przejdź natychmiast do następnego kroku, jeśli większość komórek jest bliska odłączenia od naczynia. Unikaj długotrwałej inkubacji, aby zmniejszyć negatywny wpływ na komórki.
    4. Odrzuć EDTA i dodaj 1 ml MM, aby przerwać trawienie.
    5. Delikatnie postukaj w płytkę studzienki, aż większość komórek zostanie odłączona.
    6. Ostrożnie przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 5 ml. Delikatnie zawieś kolonie H9-ESC w górę i w dół 3-5 razy, aby wymieszać je z pitette Pasteura. Przenieś 20-100 μl zawiesiny komórek do nowego 6-dołkowego naczynia hodowlanego pokrytego ECM i potrząśnij nim w przód iw tył.
    7. Gdy gęstość komórek zostanie zaobserwowana pod mikroskopem jako wystarczająca, inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 przez co najmniej 24 godziny, nie dotykając jej.
    8. Zmieniaj nośniki codziennie. Przy gęstości klonów 70% i wyższej wymagane jest przejście.

3. Generacja ludzkich NR

UWAGA: Gdy kolonie osiągną około 70% konfluencji, mogą być skierowane w kierunku różnicowania w organoidy siatkówki (RO), korzystając z kroków proceduralnych opisanych w Rysunek 1.

  1. Dzień 0 - Tworzenie się ciała zarodka (EB)
    1. Po umyciu komórek 2 ml DPBS dodać 0,5 ml CDS (patrz tabela materiałów) zawierającej 20 μM Y27632 do studzienki. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2.
      UWAGA: Sprawdź pod mikroskopem. Skróć czas inkubacji tak bardzo, jak to możliwe, aby uniknąć szkodliwego wpływu na komórki.
    2. Przerwać trawienie, dodając 3 ml MM zawierającego 20 μM Y27632. Odwirować przy 190 × g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
    3. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml gfCDM zawierającym 20 μM Y27632 i policzyć komórki. Dodaj odpowiednią objętość dla 1,2 × 106 komórek (1,2 × 104 komórek na studzienkę) do 10 ml gfCDM, który jest wstępnie włączony do 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 i 100 nM LDN-193189 (patrz Tabela materiałów).
    4. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka z 96 studzienkami stożkowymi z dnem w kształcie litery V. Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 do dnia 6.
      UWAGA: Nie przesuwaj naczyń przez co najmniej 24 godziny, aby zwiększyć przyczepność EB.
  2. Dzień 6 - Indukcja siatkówki
    1. W dniu 6 dodaj 10 ml gfCDM zawierającego 55 ng/ml BMP4, aby umożliwić całkowitą zmianę pożywki hodowlanej na EB. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
      UWAGA: Pipetę należy kierować w stronę ścianek studzienki stożkowej o średnicy 96 V z dnem w kształcie litery V, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Unikaj pobierania jakichkolwiek organoidów podczas zmiany podłoża.
    2. Przeprowadzić połowę średniej zmiany w dniu 9, dniu 12 i dniu 15. Zastąp połowę pożywki świeżym gfCDM, aby stopniowo rozcieńczać BMP4.
  3. Dzień 18 - Długotrwała hodowla NR
    1. W 18 dniu ostrożnie przenieś uformowane EB do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml za pomocą pipet Pasteura o pojemności 5 ml i delikatnie spłucz ponownie NRDM. Przenieś EB na płytki 6- lub 24-dołkowe o niskiej adsorpcji (patrz tabela materiałów). Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze.
    2. Co 3 dni wymieniaj pożywkę na świeży NRDM.
      UWAGA: Wyłącz światło podczas wymiany medium, ponieważ RA jest wrażliwy na światło. Usuń źle zróżnicowane organoidy i oddziel przylegające organoidy pod mikroskopem.

4. Analiza ludzkich NR

  1. Montaż RO
    1. Wybierz różne generacje H9-ESC, aby wywołać trzy partie RO.
      UWAGA: Trzy tabliczki z liczbą tworzących NR dla każdej z trzech ocenianych metod (Kuwahara et al.12, Döpper et al.27 oraz zmodyfikowana metoda w niniejszym badaniu) są obliczane w celu oceny wskaźnika powodzenia indukcji. Indukcja jest uważana za udaną, jeśli mikroskopia świetlna ujawni tworzenie się struktur przypominających nabłonek nerwowy w 30 dniu.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne RO
    1. Przenieś 3-5 RO do probówek o pojemności 1,5 ml. Odpipetować nadmiar pożywki i raz umyć RO 1 ml DPBS w temperaturze pokojowej. Pozwól RO zatonąć i ostrożnie wyjmij DPBS. Dodać 1 ml 4% paraformaldehydu (patrz tabela materiałów) na probówkę o pojemności 1,5 ml i utrwalić w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: RO w dniu 6 i dniu 18, fix 2 h. Poprawka na 12 godzin w dniu 30 i 14 godzin w dniu 60.
    2. Po utrwaleniu odwodnić za pomocą alkoholu gradientowego. Pozostaw RO na 15 minut w 50%, 60% i 70% alkoholu, a następnie na 10 minut w 80%, 90%, 95%, 100% i 100% alkoholu. Następnie dodaj mieszaninę 1:1 100% alkoholu i ksylenu przez 10 minut, a następnie ksylen dwa razy po 10 minut.
    3. Umieść RO w metalowych foremkach wypełnionych stopionym paraplastem (patrz Tabela Materiałów) na 40 minut, a następnie schładzaj formy na lodzie, aby utrwalić RO. Umieść pudełka do zatapiania w foremkach i zamroź je w temperaturze -20 °C przez noc. Następnie ostrożnie odłącz pudełka do osadzania. Na koniec przechowuj je w RT.
    4. Twórz ciągłe sekcje (o grubości 5 μm) za pomocą krajalnicy do parafiny. Przymocuj plastry do szkiełek mikroskopu adhezyjnego, wysusz i przechowuj w temperaturze RT.
    5. Wykonaj deparafinację i ponowne nawodnienie przed naprawą antygenu12,27.
    6. Dodać 10 ml 20x roztworu do odzyskiwania antygenu cytrynianowego o pH 6,0 (patrz tabela materiałów) do 190 ml ddH2O (podwójnie destylowanegoH2O). Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej w trybie wysokim przez 4 minuty, aż się zagotuje. Po dodaniu skrawków parafiny podgrzewaj sekcje w trybie niskim przez 20 minut, aby zakończyć naprawę antygenu.
    7. Pozwól sekcjom parafiny naturalnie ostygnąć w wentylowanym miejscu, a następnie umieść je w wilgotnej komorze.
    8. Użyj pisaka (patrz Spis materiałów), aby obrysować sekcje. Inkubować z 0,2% Tritonem X-100 w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby rozbić membrany, a następnie trzykrotnie umyć szkiełka TPBS, po 5 minut każde.
    9. Blok z 10% surowicą osła rozcieńczoną w DPBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w wilgotnej komorze o objętości 10 μl na obszar barwienia.
    10. Dodaj przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone w 10% surowicy osła. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w komorze wilgotnościowej. Przemyć próbki trzykrotnie TPBS przez 10 minut każda, aby usunąć niezwiązane przeciwciało.
      UWAGA: Przeciwciała pierwszorzędowe są następujące: anty-PAX6 (1: 250), anty-SOX2 (1: 200), anty-KI67 (1: 200), anty-CHX10 (1: 200), anty-β tubulina III (1: 250) i anty-NESTIN (1: 200) (patrz tabela materiałów).
    11. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w DPBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Powtórz krok prania z TPBS trzy razy po 10 minut każdy.
      UWAGA: Przechowywać w ciemności, aby zapobiec wygaszeniu fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego. Przeciwciała drugorzędowe to Alexa Fluor 488 sprzężona z anty-mysią IgG osła i Alexa Fluor 568 skoniugowana z anty-króliczą IgG osła w rozcieńczeniu 1:400 (patrz tabela materiałów).
    12. Inkubować z DPBS zawierającym DAPI (1:500; patrz tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Umyj trzy razy TPBS po 10 minut.
    13. Upuść odpowiednią ilość uszczelniacza antyfluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów) na szkiełko i przykryj szkiełkami nakrywkowymi.
    14. Wizualizacja za pomocą przepływowego analizatora ilościowego komórek tkankowych (patrz tabela materiałów) lub podobnego.
    15. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności po analizie mikroskopowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Graficzny przegląd zmodyfikowanego protokołu jest pokazany w Rysunek 1. H9-ESC użyto do wygenerowania RO, gdy komórki były hodowane do gęstości 70%-80%. Jednokomórkowe zawiesiny H9-ESC w 96 studzienkach stożkowych z dnem w kształcie litery V agregowały się w dniu 1 i tworzyły dobrze opisane okrągłe EB w dniu 6. Wraz ze wzrostem czasu hodowli stopniowo zwiększała się objętość EB. W 30 dniu struktury przypominające neuronabłonek były wyraźnie uformowane i pogrubione podczas długotrwałego różni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie RO mogą przestrzennie i czasowo odtworzyć rozwój siatkówki płodu, a wczesne RO wykazują wysoki stopień podobieństwa do siatkówki płodu na równoważnych etapach rozwoju15. Pod względem morfologii tkanek i ekspresji molekularnej, ludzka RO ściśle odzwierciedla rzeczywisty stan wzrostu tkanki siatkówki, zapewniając ogromne i niespotykane możliwości w dziedzinie modelowania chorób, badań przesiewowych leków i medycyny regeneracyjnej. Obecnie ustalono kilka różnych metod generowania RO z ludzkic...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,01 M TPBSServicebioG0002Plastry do prania
4% ParaformaldehydServicebioG1101-500MLNapraw organoidy siatkówki
5 ml Pipeta PasteuraNESTBiotechnology 318516Organoidy siatkówki
96 studzienek stożkowych z dnem w kształcie litery VSumitomo BakelitMS-9096VZ
Szkiełka mikroskopowe adhezyjneCITOTEST188105Plastry Fix
AggreWell mediumSTEMCELL Technologies5893Medium
Etanol bezwodnySINOPHARM10009218Odwodnienie 
Anty-CHX10Santa Cruzsc-365519Przeciwciało pierwszorzędowe
Roztwór przeciw blaknięciuZSGB-BIOZLI-9556
Anty-KI67Abcamab16667Przeciwciało pierwszorzędowe
anty-NESTINSigmaN5413Przeciwciało pierwszorzędowe
Antyneuronalna klasa III β-tubulina (TUJ1)BeyotimeAT809Przeciwciało
Anty-PAX6Abcamab195045Pierwotne przeciwciało
Roztwór dysocjacji komórek (CDS)STEMCELL Technologie7922Dysocjacja komórek
CHIR99021SelleckchemS2924Inhibitor GSK-3 i alfa;/β
Koncentrat lipidowy cholesteroluGibco12531018250 razy;
Roztwór do odzyskiwania antygenu cytrynianowegoServicebioG1202-250ML20&razy;, pH 6,0
CS10STEMCELL Technologies1001061Medium do zamrażania komórek
DAPIRoche10236276001Jądrowy przeciwbarwnik
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD2650
DMEM/F12Gibco11330032Medium
DMEM/F12-GlutaMAXGibco10565018Medium
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32766Przeciwciało wtórne
Osioł anty-Rabbit Alexa Fluor 568InvitrogenA10042Przeciwciało drugorzędowe
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)BiosharpBL518A0,5 M, pH 8,0, dysocjacja komórek
Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM)Corning354277Płytki powlekające
F12-GlutamaxGibco31765035Medium
Płodowa surowica bydlęcaGibcoA5669701
Przepływowy analizator ilościowy komórek tkankowychTissueGnosticsTissueFAXS PlusSekcje skanowania
IMDM-GlutaMAXGibco31980030Medium
IWR1-endoSelleckchemS7086Inhibitor Wnt
KnockOut Wymiana surowicyGibco10828028
LDN-193189 2HClSelleckchemS7507BMP-inhibitor
Płytki 24-dołkowe o niskiej przyczepnościCorning3473
Płytki 6-dołkowe o niskiej przyczepnościCorning3471
Podłoże konserwacyjne (MM)STEMCELL Technologie85850Średni
suplement N2Gibco17502048
Normalna surowica osłaSolarbioSL050Bufor blokujący
ParaplastLeica39601006Tkanka zatapiająca
PBS pH 7,4 podstawowa (1x)GibcoC10010500BTBez Ca+,Mg+
Rekonstanant białka morfogenetycznego ludzkiej kości-4 (rhBMP4)R& D314-BPKluczowy czynnik białkowy
Kwas retinowySigmaR2625Proszek, przechowywać z dala od światła
SB431542SelleckchemS1067Inhibitor ALK5
SU5402SelleckchemS7667Inhibitor kinazy tyrozynowej
Super PAP PenZSGB-BIOZLI-9305
TaurynaSigmaT0625-10G
TioglycerolSigmaM1753
Triton X-100SigmaX100Permeabilizacja
WA09 linia embrionalnych komórek macierzystychBadawczy WiCellLinia komórkowa
KsylenSINOPHARM10023418Deparafiing
Y-27632 2HCLSelleckchemS1049ROCK-inhibitor
pierwszorzędowe Instytut

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina,, Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  2. Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
  3. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  4. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
  5. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
  6. Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
  7. Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022(2021).
  8. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  9. Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
  10. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
  11. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286(2015).
  13. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047(2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  16. Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205(2019).
  18. Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
  19. Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39(2022).
  20. Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212(2021).
  21. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686(2019).
  22. Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478(2022).
  23. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439(2021).
  24. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  25. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  26. Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
  27. Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120(2020).
  28. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy siatk wkir nicowanie siatk wkimodelowanie chor bprzesiewanie lek wterapia kom rkowaindukcja siatk wkicia a embrionalneindukcja BMP4

Powiązane artykuły