Kation Nanoemulsja kapsułkowana kwasem retinowym jako adiuwant w celu promowania specyficznych dla OVA odpowiedzi ogólnoustrojowych i błony śluzowej

Adiuwanty są często stosowane w celu zwiększenia skuteczności szczepionki poprzez stymulację układu odpornościowego do silniejszej reakcji na szczepionkę, zwiększając w ten sposób odporność na określony patogen¹. Adiuwant nanoemulsyjny (NE) odnosi się do koloidalnego układu dyspersyjnego o stabilności termodynamicznej poprzez emulgowanie pewnej proporcji fazy olejowej i fazy wodnej w celu wytworzenia emulsji w postaci wody w oleju (W/O) lub oleju w wodzie (O/W)². Adiuwant nanoemulsyjny O/W może wytwarzać cytokiny i chemokiny w miejscu wstrzyknięcia, indukować szybką agregację i proliferację ważnych komórek odpornościowych, takich jak monocyty, neutrofile i eozynofile, oraz wzmacniać odpowiedź immunologiczną i poprawiać immunogenność antygenów³. Obecnie trzy adiuwanty nanoemulsyjne (MF59, AS03 i AF03) zostały dopuszczone do stosowania w szczepionkach i wykazały dobre bezpieczeństwo i skuteczność⁴.

Jednakże, odporność błony śluzowej została słabo rozwiązana przez obecnie licencjonowane preparaty uzupełniające w konwencjonalnych szczepieniach pozajelitowych⁵. Doniesiono, że kwas retinowy (RZS) indukuje naprowadzanie komórek odpornościowych w jelitach, ale jego niska polarność, słaba rozpuszczalność w wodzie oraz słaba stabilność świateł i termiczna ograniczają jego zastosowanie w solidnych szczepieniach dojelitowych. Nanoemulsje dają możliwości zwiększenia biodostępności wysoce lipofilnych leków, a rdzeń olejowy adiuwantów emulsyjnych O/W nadaje się do rozpuszczania substancji niepolarnych, takich jak RA⁶. Dlatego nanoemulsje mogą być stosowane jako nośniki RZS w celu uzyskania efektu podwójnej odpowiedzi odporności ogólnoustrojowej i odporności błony śluzowej.

W porównaniu do neutralnych lub anionowych systemów dostarczania, kationowe systemy dostarczania mają stosunkowo skuteczne możliwości enkapsulacji i dostarczania antygenów, co może zwiększyć immunogenność antygenów^7,8,9. Kationowy ładunek powierzchniowy różnych systemów adiuwantowych jest ważny dla ich efektów adiuwantowych^10,11,12. Ładunek kationowy jest ważnym czynnikiem przedłużającym retencję szczepionki w miejscu wstrzyknięcia, zwiększającym prezentację antygenu i przedłużającym stymulację odporności komórkowej w organizmie¹².

Na podstawie powyższych rozważań, opracowaliśmy kationową nanoemulsję, aby skutecznie dostarczać RA i antygeny. Wielkość cząstek i potencjał zeta nanoemulsji określono za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS), a ogólnoustrojowe i śluzówkowe odpowiedzi immunologiczne nanoemulsji w połączeniu z OVA oceniono za pomocą wstrzyknięcia domięśniowego¹³.

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem po użytkowaniu i opiece nad zwierzętami laboratoryjnymi oraz zatwierdzone przez Komisję ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt Laboratoryjnych Trzeciego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego.

1. Przygotowanie nanoemulsji (NEs)

1. W celu przygotowania fazy wodnej rozpuścić 0,15 g polisorbatu 80 w 28,2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), mieszając w temperaturze 40 °C.
2. Do przygotowania fazy olejowej należy użyć preparatu nanoemulsji w fazie olejowej przedstawionego w tabeli 1. Rozpuścić trileinian sornitanu 85, DOTAP i RA w skwalenie, mieszając w temperaturze 40 °C.
3. W celu przygotowania pierwotnej emulsji O/W, należy mieszać fazę olejową magnetycznie z prędkością 1400 obr./min, dodając roztwór wodny powoli i kroplami z szybkością 1 ml/min. Mieszaninę należy wstępnie zemulgować za pomocą emulgatora o wysokim ścinaniu przy 30 000 obr./min przez 6 min.
4. W przypadku homogenizacji wysokociśnieniowej (HPH) przygotowaną powyżej emulsję O/W należy poddać działaniu homogenizatora wysokociśnieniowego przez 12 cykli pod ciśnieniem 900 barów, aby uzyskać jednorodną nanoemulsję w zakresie 160-190 nm.
5. Pod koniec procesu zebrać emulsję do kolby o pojemności 50 ml i przefiltrować emulsję przez membranę filtracyjną PES o grubości 0,2 μm.
6. Podłączyć kolbę do przewodu Schlenka przez cewnik, obracając trójdrogowy zawór odcinający, aby podłączyć system do rury próżniowej i włączyć pompę próżniową, aby wytworzyć podciśnienie w kolbie. Następnie, obracając trójdrogowy kurek, podłącz system do rurki Argon i napełnij ją Argonem. Powtórz ten krok 3 razy, aby upewnić się, że kolba jest wypełniona argonem.
7. Wymienić korek i uszczelnić folią paraffine, owinąć kolbę w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Charakterystyka nanoemulsji

1. Wykrywanie wielkości cząstek i potencjału zeta
   1. Włącz przyrząd i odczekaj 30 minut, aż laserowe źródło światła się ustabilizuje.
   2. Rozcieńczyć NE 50-krotnie ultraczystą wodą i dodać 1 ml próbki do odpowiedniej celi próbki.
   3. Aby zmierzyć wielkość cząstek, ustaw temperaturę na 25 °C, wybierz wodę jako medium dyspergujące i wybierz jednorazowe plastikowe naczynia jako celę pomiarową. Załaduj próbki i zmierz automatycznie. Jako wynik końcowy należy podać średnią wartość z trzech powtórzonych pomiarów dla każdej próbki.
   4. Do pomiaru potencjału zeta należy ustawić temperaturę na 25 °C. Ze względu na wybór fazy wodnej jako medium dyspersyjnego, należy wybrać model Smoluchowsiego, a jako celę pomiarową złożoną komórkę kapilarną. Załaduj próbki i zmierz automatycznie. Jako wynik końcowy należy podać średnią z trzech powtórzonych pomiarów dla każdej próbki.
2. Oznaczanie szybkości kapsułkowania i szybkości ładowania leku
   1. Aby określić ilość RA załadowanego w NE, należy użyć absolutnego etanolu do demulgacji i ekstrakcji RA z NE. Do 5 μl próbki dodać 995 μl etanolu i oznaczyć zawartość RA w roztworze za pomocą spektrofotometru przy długości fali 355 nm. Porównaj absorbancję z krzywą wzorcową. Użyj następującego równania:
      Enkapsulacja = rzeczywiste obciążenie RZS/waga dodanego leku
      Szybkość ładowania leku = rzeczywiste ładowanie RA / jakość próbki

3. Procedury szczepień i pobieranie próbek

1. Procedura szczepień i grupowanie szczepień
   1. Grupa samic myszy Balb/C w wieku 6-8 tygodni i o wadze około 18-21 g w zestawach po 5 sztuk do immunizacji w dniu 0, dniu 14, dniu 28 według następujących grup eksperymentalnych: (1) grupa PBS, (2) grupa albuminy jaja kurzego (OVA), (3) grupa OVA+ NE-RA (OVA/ NE-RA), (4) grupa OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA).
   2. Uodpornić wszystkie myszy przez wstrzyknięcie domięśniowe do górnych mięśni czworogłowych za pomocą 200 μl różnych preparatów szczepionek: 100 μl emulsji i 15 μg OVA wchłoniętych w 100 μl PBS, zmieszanych przed podaniem. Wstrzyknąć 100 μl/tylną nogę. Dla myszy w grupie kontrolnej podawać sam PBS.
   3. Eutanazja: Poddaj eutanazji wszystkie myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg 1% pentobarbitalu sodu 2 tygodnie po zakończeniu trzech szczepień.
   4. Pobieranie i przetwarzanie próbek: Po eutanazji użyj nożyczek, aby rozciąć klatkę piersiową myszy i włóż strzykawkę bezpośrednio do serca, aby odessać około 0,5 ml pełnej krwi. Pozostawić krew na 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować przy 1800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać surowicę, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.
   5. Zbierz krew pełną, śledzionę, płyn z płukania pochwy (VLF), płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), płyn z płukania nosa (NLF) i płyn z płukania jelita cienkiego (SILF).
2. Izolacja limfocytów śledziony
   1. Namocz myszy w etanolu 75% (v/v) w celu krótkiej sterylizacji, przenieś myszy na czystą ławkę. Przetnij skórę na lewym brzuchu nożyczkami, odsłoń i usuń śledzionę.
   2. Umieścić śledzionę na szalce Petriego zawierającej 3 ml PBS, zmielić i przefiltrować do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą sita (200 oczek, 70 μm) i pręta mielącego.
   3. Odwirować komórki przy 650 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i zawiesić osad w 3 ml roztworu do lizy czerwonych krwinek, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   4. Dodać 10 ml PBS do probówki i dobrze wstrząsnąć, aby zakończyć reakcję, a następnie odwirować ją przy 650 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml PBS, dodać 20 μl rozcieńczenia komórek do automatycznego licznika komórek w celu zliczenia komórek.
   6. Odwirować komórki przy 650 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i rozcieńczyć komórki do 1 x 10⁶ komórek/ml za pomocą 1640 kompletnej pożywki (1% penicylina-streptomycyna, 10% płodowa surowica bydlęca).
3. Pobieranie VLF: Przepłukać pochwę 4 razy 75 μl 1%BSA/PBST, połączyć roztwór do płukania i zebrać do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 5000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut, a następnie zebrać supernatant pipetą i przechowywać w temperaturze -80 °C.
4. Kolekcja BALF i NLF
   1. Zdezynfekuj myszy po uśmierceniu za pomocą 75% (v/v) etanolu. Trzymaj mysz brzuchem do góry i wyprostuj szyję. Użyj nożyczek, aby wykonać podłużne nacięcie w skórze szyi myszy i użyj kleszczy, aby oddzielić mięśnie i odpowiednio odsłonić tchawicę.
   2. Przeciąć tchawicę przez mały poprzeczny otwór i wprowadzić wąż w kierunku płuc, podłączyć strzykawkę do węża i wstrzyknąć 0,5 ml PBS do płuc i wycofać, powtórzyć płukanie 3x i odwirować przy 650 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, przechowywać supernatant (BALF) w temperaturze -80 °C.
   3. Odwróć wąż do jamy nosowej, podłącz strzykawkę do węża i wstrzyknij 0,5 ml PBS, płyn przepłynie przez jamę nosową do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odessać popłuczynę z probówki wirówkowej i powtórzyć płukanie 2x, następnie odwirować przy 650 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, przechowywać supernatant (NLF) w temperaturze -80 °C.
5. Kolekcja SILF
   1. Przygotować roztwór PBS zawierający 0,1 mg/ml inhibitora trypsyny, 50 mM/L EDTA-2Na, 1 mM/l fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) jako roztwór do płukania jelita cienkiego. Mieszać w temperaturze pokojowej do rozpuszczenia i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   2. Rozciąć jelito cienkie wzdłuż rurki jelitowej i zanurzyć w 3 ml płynu z płukania jelita cienkiego. Mieszać przez pionowe wytrząsanie przy 15 obr./min przez 30 min w temperaturze 4 °C. Wirować przy 1440 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min i zebrać supernatant za pomocą pipety, następnie odwirować przy 5000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 min. Przechowywać supernatant (SILF) w temperaturze -80 °C.

4. Ocena odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla OVA po podaniu domięśniowym

1. Określić poziomy IgG w surowicy, podklasy IgG1, IgG2a oraz poziomy swoistego sIgA w VLF, BALF, NLF i SILF za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).
2. W przypadku powlekania antygenowego rozcieńczyć OVA do 5 μg/ml buforem powlekającym i pokryć 96-dołkowe płytki ELISA przez noc w temperaturze 4 °C 100 μl roztworu OVA na studzienkę.
3. Przemyć płytki ELISA 5x PBST i blokować przez inkubację z 250 μl 1%BSA/PBST w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
4. Przemyć płytki ELISA 5x PBST, następnie dodać 100 μl próbki rozcieńczonej zgodnie z opisem poniżej do badania i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Rozcieńczyć surowicę, VLF, BALF, NLF 0,5% BSA/PBST, rozcieńczyć SILF 20% płodową surowicą cielęcą (FCS)/PBST.
   1. Rozpocząć od rozcieńczenia surowicy 1000x, stosując dwuetapową procedurę rozcieńczania: rozcieńczyć 20 μl surowicy do 1 ml, następnie rozcieńczyć 25 μl tej rozcieńczonej surowicy do 500 μl. Użyj tego rozcieńczenia surowicy do wykrycia IgG1, IgG2a.
5. Dodać 200 μl surowicy rozcieńczonej 1000x do pierwszego rzędu powlekanej płytki i dodać 100 μl 0,5% BSA/PBST do wszystkich studzienek z wyjątkiem pierwszego rzędu. Przenieść 100 μl z pierwszego rzędu do drugiego rzędu i wymieszać 10x z pipetą. Powtórzyć ten krok do wiersza 8 i wylać 100 μl płynu, uzyskano surowicę o różnych stężeniach w celu wykrycia IgG.
6. Wykonaj rozcieńczenie 1:1 BALF, NLF i SILF, aby wykryć IgA. W przypadku VLF należy stosować tę samą procedurę rozcieńczania, co w przypadku surowicy.
7. Umyj płytki ELISA 5x za pomocą PBST. Dodać 100 μl sprzężonych z HRP kozich anty-mysich IgG/IgG1/IgG2a/IgA (rozcieńczonych w stosunku 1:10000 PBST) do odpowiednich studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 40 minut.
8. Płytki ELISA przemyć 5x PBST, dodać 100 μL podłoża TMB ELISA (bardzo wrażliwego) i przenieść płytkę w miejsce chronione przed światłem na 5 min. Natychmiast dodać 100 μL roztworu zatrzymującego o długości 450 nm dla substratu TMB, aby zatrzymać reakcję.
9. Zmierzyć absorbancję (OD) przy 450 nm dla każdej studzienki i obliczyć miano przeciwciał, przyjmując 2,1-krotność wartości surowicy myszy z grupy ślepej jako wartość odpowiedzi dodatniej.

5. Test ELISpot

1. Postępuj zgodnie z wytycznymi dotyczącymi ELISpot Plus, użyj myszy IFN-γ (ALP) z zestawu, aby wykonać testy.
2. Wyjąć płytkę z szczelnie zamkniętego opakowania i przemyć 4x sterylnym PBS (200 μL/basenik). Kondycjonować płytkę w 1640 kompletnym podłożu (200 μl/basenik) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć pożywkę i dodać dostosowane stężenie zawiesiny limfocytów przygotowanej w kroku 3.2.2 (100 μl/dołek) do płytki, a następnie dodać 100 μl bodźca, tj. 1640 kompletnej pożywki zawierającej 20 μg/ml OVA257~264 lub OVA323~339 lub 1640 kompletnej pożywki. Umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 przez} 48 godzin. Owiń talerz folią aluminiową, aby uniknąć parowania.
4. Wyrzucić zawiesinę komórkową i przemyć płytkę 5x PBS (200 μl/basenik). Rozcieńczyć przeciwciało wykrywające (R4-6A2-biotyna) do 1 μg/ml w PBS zawierającym 0,5% płodowej surowicy cielęcej (PBS-0,5% FCS). Dodać 100 μl/basenik i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
5. Umyj płytę jak w kroku 5.2. Rozcieńczyć streptawidynę-ALP (1:1000) w PBS-0,5% FCS i dodać 100 μl/basenik, inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
6. Umyj płytę jak w kroku 5.2. Przefiltruj gotowy do użycia roztwór substratu (BCIP/NBT-plus) przez filtr 0,45 μm i dodaj 100 μl/studzienkę. Rozwijaj się, aż pojawią się wyraźne plamy.
7. Zatrzymaj rozwój koloru, myjąc go intensywnie w wodzie z kranu, usuń miękki plastik i pozostaw płytkę do wyschnięcia.
8. Sprawdź i policz miejsca w czytniku ELISpot.

6. Analiza statystyczna

1. Przeanalizuj różnice między danymi z 4 grup za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie wielokrotnego porównania Tukeya po teście. Wyraż wszystkie wyniki jako średnią ± SD. Wartość P mniejsza niż 0,05 została uznana za istotną.

W sumie przygotowano cztery preparaty nanoemulsyjne, które zostały scharakteryzowane pod względem wielkości cząstek (Rysunek 1), potencjału zeta i skuteczności enkapsulacji, jak przedstawiono w Tabeli 2. Wielkość cząstek była skoncentrowana wokół 160-190 nm, a dodanie DOTAP odwróciło potencjał Zeta nanoemulsji. Poziom przeciwciał IgG w surowicy swoistych dla OVA i poziom przeciwciał w podgrupie w surowicy wykryto 2 tygodnie po trzecim szczepieniu. Szczepionka z adiuwantem nanoemulsyjnym znacznie zwiększyła miana przeciwciał IgG, IgG1 i IgG 2a specyficznych dla OVA w surowicy (Ryc. 2). Co ważniejsze, poziomy specyficznego sIgA w płynie z płukania pochwy i płynie z płukania jelita cienkiego uległy znacznemu zwiększeniu, gdy OVA było adiuwantowane CNE-RA (Ryc. 3). W teście ELISpot nie stwierdzono istotnych plamek.

Rysunek 1: Średnica i rozkład rozmiaru. (A) Średnica i rozkład NE-RA. (B) Wielkość, średnica i rozmieszczenie CNE-RA. d.nm jest średnią średnicą cząstek w nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Poziomy przeciwciał w surowicy swoiste dla OVA i ich podgrupy przeciwciał w surowicy. Poziomy przeciwciał w surowicy swoiste dla OVA i ich podgrupy w surowicy 2 tygodnie po zakończeniu trzech szczepień. (A) Wartość Log2 mian IgG. (B) Gęstość optyczna IgG1 przy 450 nm. (C) Gęstość optyczna IgG2a przy 450 nm. Dane są wyrażone jako średnia ± SD (n=5), ***: P<0,001. Porównania różnic między grupami a grupą PBS są pokazane bezpośrednio nad kolumnami na rysunku i są oznaczone w następujący sposób: ns: brak znaczenia, #p<0,05, ###p<0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: sIgA specyficzne dla OVA. SIgA specyficzne dla OVA w płynie z płukania pochwy, płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, płynie z płukania nosa, płynie z płukania jelita cienkiego. (A) płyn z płukania pochwy, (B) płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, (C) płyn z płukania nosa i (D) płyn z płukania jelita cienkiego. Dane są wyrażone jako średnia ± SD (n=5), ns: brak istotności, *p<0,05; p<0,001. Porównania różnic między grupami a grupą PBS są pokazane bezpośrednio nad kolumnami na rysunku i są oznaczone w następujący sposób: ns: brak znaczenia, ###p<0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Formuła NEs w fazie olejowej.

Tabela 2: Charakterystyka fizykochemiczna NE.

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów w związku z tą pracą.