Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezproblemowe podejście do klonowania konstrukcji wektora ekspresji wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66320

⸱

17 maja 2024

 ,  , 
1College of Life Sciences, China West Normal University, 2Sichuan Sports College, 3Pathology Department, Suining Central Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskania wektora wyrażenia pVAX1-PRRSV poprzez wprowadzenie odpowiednich miejsc restrykcyjnych na końcu 3' wstawek. Możemy linearyzować wektor i łączyć fragmenty DNA z wektorem jeden po drugim za pomocą technologii rekombinacji homologicznej.

Streszczenie

Budowa wektorów ekspresji genów jest ważnym elementem pracy laboratoryjnej w biologii eksperymentalnej. Dzięki postępowi technicznemu, takiemu jak Gibson Assembly, konstrukcja wektorowa staje się stosunkowo prosta i wydajna. Jednakże, gdy pełnowymiarowy genom wirusa zespołu rozrodczości i układu oddechowego świń (PRRSV) nie może być łatwo amplifikowany przez pojedynczą reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) z cDNA lub trudno jest uzyskać pełnowymiarowy wektor ekspresji genu przez homologiczną rekombinację wielu insercji in vitro, obecna technika montażu Gibsona nie osiąga tego celu.

W związku z tym, naszym celem było podzielenie genomu PRRSV na kilka fragmentów i wprowadzenie odpowiednich miejsc restrykcyjnych do odwrotnego startera w celu uzyskania fragmentów amplifikowanych PCR. Po połączeniu poprzedniego fragmentu DNA z wektorem za pomocą technologii rekombinacji homologicznej, nowy wektor uzyskał miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego. W ten sposób możemy linearyzować wektor za pomocą nowo dodanego miejsca cięcia enzymu i wprowadzić następny fragment DNA poniżej poprzedzającego fragmentu DNA.

Wprowadzone miejsce rozszczepienia enzymu restrykcyjnego na końcu 3' fragmentu DNA w górę zostanie wyeliminowane, a nowe miejsce rozszczepienia zostanie wprowadzone na końcu 3' fragmentu DNA w dalszej części DNA. W ten sposób możemy po kolei łączyć fragmenty DNA z wektorem. Ta metoda ma zastosowanie do pomyślnego skonstruowania wektora wyrażenia PRRSV i jest skuteczną metodą łączenia dużej liczby fragmentów w wektor wyrażenia.

Wprowadzenie

Jako podstawowa technika do konstruowania eksperymentalnych narzędzi do ekspresji w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych, klonowanie molekularne jest bardzo ważnym składnikiem biologii eksperymentalnej. Klonowanie molekularne obejmuje cztery procesy: nabycie DNA insercji, ligację insercji do odpowiedniego wektora, transformację wektora rekombinowanego w Escherichia coli (E. coli) oraz identyfikację pozytywnych klonów1. Do tej pory przyjęto wiele metod łączenia cząsteczek DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych2,3 i rekombinacji za pośrednictwem PCR4,5,6. Rekombinacja homologiczna, znana jako technologia klonowania bezszwowego, to grupa metod klonowania, która umożliwia niezależne od sekwencji i bezbliznowe wprowadzenie jednego lub więcej fragmentów DNA do wektora. Technologia ta obejmuje klonowanie niezależne od sekwencji i ligacji (SLIC), bezszwowy ekstrakt klonujący ligację (SLiCE), fuzję i montaż Gibsona. Wykorzystuje egzonukleazę do degradacji jednej nici insertu i wektora do generowania spójnych końców, a także naprawę in vivo lub rekombinację in vitro, aby kowalencyjnie połączyć insert z wektorem poprzez tworzenie wiązań fosfodiestrowych. Możliwość łączenia pojedynczej wstawki z wektorem w dowolnej sekwencji bez żadnych blizn jest bardzo atrakcyjna. Co więcej, technologia ma możliwość łączenia 5-10 fragmentów w ustalonej kolejności bez ograniczeń sekwencji.

Jako jedna z wielu technik rekombinacji DNA, technika montażu Gibsona, obecnie najskuteczniejsza metoda klonowania7,8, jest solidną i elegancką metodą opartą na egzonukleazie, która umożliwia bezproblemowe składanie jednego lub wielu zlinearyzowanych fragmentów DNA. Reakcja montażu Gibsona odbywa się w warunkach izotermicznych przy użyciu mieszaniny trzech enzymów, a mianowicie egzonukleazy 5', polimerazy o wysokiej wierności i termostabilnej ligazy DNA. Jednoniciowe zwisy 3' utworzone przez egzonukleazę 5'-3' przyczyniają się do wyżarzania fragmentów, które mają komplementarność na jednym końcu. Polimeraza o wysokiej wierności skutecznie wypełnia luki w wyżarzonych obszarach jednoniciowych poprzez dodanie dNTP, a termostabilna ligaza DNA uszczelnia nacięcia, tworząc wspólne cząsteczki DNA8. W związku z tym ta metoda techniczna jest szeroko stosowana do budowy wektorów ekspresji genów.

Zespół rozrodczo-oddechowy świń (PRRS) jest chorobą wirusową, która prowadzi do upośledzenia rozrodczego i niewydolności oddechowej u świń spowodowanych PRRSV w każdym wieku9. Zespół objawia się gorączką, jadłowstrętem, zapaleniem płuc, letargiem, depresją i niewydolnością oddechową. Ponadto w niektórych epidemiach obserwowano objawy kliniczne, w tym czerwono-niebieskie przebarwienia uszu. Jako członek rodziny arteriwirusów, PRRSV jest szeroko przenoszony do krajów produkujących wieprzowinę poprzez bezpośredni kontakt i wymianę płynów, w tym moczu, siary i śliny. Ze względu na rozprzestrzenianie się PRRSV w Stanach Zjednoczonych, całkowite straty ekonomiczne przemysłu wieprzowego oszacowano na około 664 miliony dolarów rocznie, w oparciu o skalę hodowli 5,8 miliona loch i 110 milionów świń10,11. Raport Inspekcji Zdrowia Zwierząt i Roślin pokazuje, że 49,8% nieszczepionych świń wykazuje obecność PRRSV w surowicy12, a niskie poziomy PRRSV u zakażonych świń są wydalane przez ślinę, wydzielinę z nosa, mocz i kał13. Zaimplementowano wiele strategii kontroli propagacji PRRSV14,15,16. Oprócz procedur eliminacyjnych mających na celu stworzenie populacji całkowicie ujemnych pod względem wirusa lub poprawy bezpieczeństwa biologicznego i zarządzania, podawanie szczepionek jest skutecznym sposobem kontrolowania PRRS.

PRRSV to otoczkowy, jednoniciowy wirus RNA o dodatnim znaczeniu o długości około 15 kilozasad (kb). Genom PRRSV składa się z co najmniej 10 otwartych ramek odczytu (ORF), krótkiego 5' nieulegającego translacji regionu (5' UTR) i ogona poli(A) na końcu 3' (Rysunek 1A)17. Genom wirusa RNA o ujemnej nici jest niezakaźny, podczas gdy genom wirusów RNA o dodatniej nicii jest zakaźny. Istnieją dwie główne strategie transfekcji RNA i DNA w celu generowania potomstwa wirusa18. Jednak klonowanie pełnowymiarowego fragmentu odpowiadającego genomowi RNA ma kluczowe znaczenie dla budowy zakaźnych klonów. Ze względu na długi i złożony charakter genomu PRRSV, pełnego genomu nie można łatwo uzyskać za pomocą PCR za jednym razem. Dodatkowo, chociaż sztuczna synteza genów PRRSV jest skutecznym rozwiązaniem, synteza długich fragmentów jest często kosztowna. Stąd, aby uzyskać wektor ekspresji o pełnej długości PRRSV, próbowaliśmy go utworzyć metodą wielokrotnej rekombinacji homologicznej z wieloma wstawianiami19,20. Niestety, nie udało nam się uzyskać pełnowymiarowego wektora ekspresji genów. Dlatego w tym badaniu dodaliśmy odpowiednie miejsca restrykcyjne do startera odwrotnego i z powodzeniem uzyskaliśmy wektor ekspresji pVAX1-PRRSV za pomocą kilku rund homologicznych reakcji rekombinacji. Co więcej, metoda ta może również osiągnąć delecję lub mutację genów docelowych i skutecznie połączyć dużą liczbę fragmentów DNA z wektorem ekspresyjnym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie matrycy genu PRRSV

  1. Rozmrozić zapas wirusa w 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA (patrz Tabela materiałów).
  2. Dodaj 0,2 ml chloroformu i dokładnie wymieszaj. Inkubować przez 3 minuty.
  3. Odwirowywać mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 12 000 × g w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Mieszaninę dzieli się na trzy fazy, a mianowicie bezbarwną fazę wodną, fazę interfazową i czerwoną fazę fenolowo-chloroformową.
  4. Odpipetować bezbarwną wodną fazę i przenieść ją do nowej probówki.
  5. Dokładnie wymieszać fazę wodną z 0,5 ml izopropanolu i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Wirować przez 10 minut w temperaturze 12 000 × g w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Na dnie probówki znajduje się biały osad RNA.
  7. Za pomocą mikropipety usunąć supernatant z probówki.
  8. Dodaj 1 ml 75% etanolu, aby ponownie zawiesić osad i krótko zwirować.
  9. Wirować przez 5 minut w temperaturze 7 500 × g w temperaturze 4 °C. Za pomocą mikropipety usunąć supernatant z probówki.
  10. Suszyć RNA przez 5 minut, dodać 20-50 μl wody wolnej od RNaz w celu ponownego zawieszenia RNA i dokładnie wymieszać.
  11. Przejdź do wykonywania odwrotnej transkrypcji; ustaw reakcje tak, aby przeprowadzić odwrotną transkrypcję, jak pokazano w Tabeli 1.
    UWAGA: Aby zapewnić pomyślną odwrotną transkrypcję, należy używać wysokiej jakości matryc RNA.
  12. Otrzymany cDNA należy wykorzystać do PCR lub przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Projekt startera PCR

  1. Projektowanie podkładu do przodu
    1. Otwórz oprogramowanie i wybierz Nowy plik DNA.
    2. Wklej sekwencję genu PRRSV (GenBank: FJ548852.1) z NCBI do oprogramowania. Kliknij przycisk OK, aby wygenerować pliki sekwencji.
    3. Przeanalizuj sekwencję i zaznacz połączenia fragmentów. Zaprojektuj starter fragmentów do sekwencji specyficznej dla przodu. W większości przypadków preferowana temperatura topnienia (Tm) wynosi od 55 °C do 62 °C, a zawartość GC wynosi 40-60%.
    4. Kliknij Podkłady i wybierz Dodaj podkład.
    5. Wklej określoną sekwencję i dodaj nakładające się sekwencje wektora do pierwszego nukleotydu 5' startera określonej sekwencji. W pobliżu każdego skrzyżowania wybierz 20–40 pz, które mają służyć jako obszar nakładania się między dwoma sąsiednimi fragmentami.
    6. Nazwij przednią zasuwę zawierającą zwisy i określoną sekwencję (patrz rysunek uzupełniający S1).
    7. Kliknij Dodaj podkład do szablonu.
  2. Projektowanie podkładu odwrotnego
    1. Przeanalizuj sekwencję i zaznacz skrzyżowania fragmentów w oprogramowaniu. Zaprojektuj starter fragmentów o odwrotnej sekwencji specyficznej.
    2. Kliknij Podkłady i wybierz Dodaj podkład.
    3. Wklej określoną sekwencję i dodaj miejsce restrykcji do pierwszego nukleotydu 5' startera określonej sekwencji.
      UWAGA: Dodane miejsca ograniczeń muszą być nieobecne we fragmencie wstawiania i wektorze, z wyjątkiem wielu miejsc klonowania.
    4. Dodaj sekwencje zwisów wektorów o długości 20-40 pz do pierwszego nukleotydu 5' miejsca restrykcyjnego.
    5. Nazwij odwrócony podkład zawierający zwisy i określoną sekwencję (patrz rysunek uzupełniający S1).
    6. Kliknij Dodaj podkład do szablonu.

3. PCR do amplifikacji fragmentów

  1. Przygotuj sześć indywidualnych reakcji PCR (Tabela 2): dla fragmentu 1 użyj starterów P1 i P2 (patrz rysunek uzupełniający S2); dla fragmentu 2 użyj starterów P3 i P4 (patrz rysunek uzupełniający S2); dla fragmentu 3 użyj starterów P5 i P6 (patrz rysunek uzupełniający S2); dla fragmentu 4 użyj starterów P7 i P8 (patrz rysunek uzupełniający S2); dla fragmentu 5 użyj starterów P9 i P10; i użyć starterów P11 i P12 do amplifikacji fragmentu 6 (patrz rysunek uzupełniający S2).
    UWAGA: Rozmrozić, wymieszać i krótko odwirować każdy składnik przed użyciem.
  2. Uruchom PCR, korzystając z trzyetapowego protokołu przedstawionego w Tabeli 2.
  3. Dodać 1 μl 6x buforu ładującego DNA do 5 μl produktu PCR, wymieszać i krótko odwirować zawartość.
  4. Analizować próbki za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym.

4. Oczyszczanie fragmentów PCR

UWAGA: Oczyszczanie produktów PCR z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (patrz Tabela Materiałów) jest ważne dla budowy wektorów.

  1. Dodać 9 μl 6x buforu ładującego DNA do 45 μl produktów PCR, wymieszać i krótko odwirować zawartość.
  2. Wykonaj 1% elektroforezę w żelu agarozowym/goldview, aby oddzielić fragmenty DNA.
    UWAGA: Nie używaj ponownie buforu TAE, ponieważ jego wartość pH wpłynie na odzyskiwanie fragmentów DNA.
  3. Po odpowiednim oddzieleniu prążków użyj ostrego skalpela, aby ostrożnie wyciąć prążki DNA.
    UWAGA: Zminimalizuj rozmiar plastra żelu, odcinając nadmiar agarozy.
  4. Zważyć plasterek żelu w czystej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, dodać równą objętość buforu wiążącego do wycinka żelu (np. 0,3 ml na plasterek 0,3 g) i inkubować w temperaturze 60 °C przez 7 minut.
  5. Włożyć mini kolumnę do probówki zbiorczej o pojemności 2 ml. Dodać 700 μl roztworu DNA/agarozy z kroku 4.4 do mini kolumny.
  6. Wirować przy 10 000 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wyrzucić filtrat i ponownie użyć probówki zbiorczej.
  7. Dodać 300 μl buforu wiążącego i odwirować w stężeniu 13 000 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wyrzucić filtrat i ponownie użyć probówki zbiorczej.
  8. Dodać 700 μl buforu do płukania i odwirować w stężeniu 13 000 × g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Wyrzucić filtrat i ponownie użyć probówki zbiorczej.
  9. Wiruj pustą mini kolumnę przez 2 minuty z maksymalną prędkością, aby wysuszyć matrycę kolumny. Umieść mini kolumnę w czystej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  10. Dodać 20 μl wody dejonizowanej bezpośrednio do środka membrany kolumny i pozostawić w temperaturze pokojowej na 2 minuty. Wirować z prędkością 13 000 × g przez 1 min.
  11. Przechowywać DNA w temperaturze -20 °C.

5. Przygotowanie wektora zlinearyzowanego

UWAGA: Po przygotowaniu plazmidu, wybrane enzymy mogą być użyte do jego cięcia. Długie trawienie lub trawienie podwójne enzymatyczne ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia trawienia całego DNA. Zmniejszy to liczbę fałszywie dodatnich klonów w kolejnych eksperymentach.

  1. Linearyzacja pVAX1
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej we wskazanej kolejności (tabela 3).
      UWAGA: Należy dodać objętość wody, aby zachować wskazaną całkowitą objętość reakcji. Tutaj 1 μg plazmidu trawiono enzymami w mieszaninie reakcyjnej. W zależności od stężenia plazmidu, objętość plazmidu można regulować w mieszaninie reakcyjnej.
    2. Delikatnie wymieszaj, a następnie odwiruj. Inkubować w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym lub termostacie wodnym przez 60 minut.
    3. Przeprowadzić oczyszczanie żelu podobne do oczyszczania fragmentów PCR w sekcji 4 za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (patrz Tabela materiałów).
  2. pVAX1-F1 linearyzacja
    UWAGA: pVAX1-F1 jest wektorem otrzymanym z pierwszej rundy rekombinacji pVAX1 (NdeI i HindIII) i fragmentu 1. pVAX1-F2 jest wektorem otrzymanym z rundy rekombinacji pVAX1-F1 (NdeI) i fragmentu 2. pVAX1-F3 jest wektorem otrzymanym z rundy rekombinacji pVAX1-F2 (NdeI) i fragmentu 3. pVAX1-F4 jest wektorem otrzymanym z rundy rekombinacji pVAX1-F3 (NdeI) i fragmentu 4. pVAX1-F5 jest wektorem otrzymanym z rundy rekombinacji pVAX1-F4 (EcoRV i NtoI) i fragmentu 5.
    1. Dla każdego wektora mieszaninę reakcyjną należy przygotować oddzielnie w temperaturze pokojowej we wskazanej kolejności (tabela 3).
    2. Delikatnie wymieszaj, a następnie odwiruj. Inkubować w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym lub termostacie wodnym przez 60 minut.
    3. Przeprowadzić oczyszczanie żelu podobne do oczyszczania fragmentów PCR w sekcji 4 za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (patrz Tabela materiałów).

6. Subklonowanie do nowego wektora

UWAGA: Dobrą efektywność klonowania można osiągnąć przy użyciu 50-200 ng wektora i wstawień.

  1. Skonfiguruj płynną reakcję klonowania i montażu ExonArt (Tabela 4). Dostosować całkowitą objętość reakcji do 10 μl za pomocą wysterylizowanego dejonizowanegoH2Oi wymieszać.
  2. Inkubować reakcję w termocyklerze przez 15-60 minut w temperaturze 50 °C. Próbki przechowywać na lodzie.
    UWAGA: Wydłużenie inkubacji do 60 minut może zwiększyć wydajność montażu.
  3. Rozmrozić chemicznie kompetentne komórki DH5α na lodzie.
  4. Dodać 10 μl produktu do montażu do odpowiednich komórek, a następnie delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół.
  5. Umieść mieszaninę na lodzie na 30 minut.
  6. Szok termiczny w temperaturze 45 °C przez 45 s i przenieść probówki na lód na 3 minuty.
  7. Dodać 900 μl pożywki SOC do probówki.
  8. Wytrząsać probówkę z prędkością 225 obr./min przez 1 godzinę w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C.
  9. Odwirować reakcję przemiany przy 6 000 × g przez 2 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl świeżej pożywki SOC.
  10. Rozprowadzić zawiesinę przekształconych komórek na osobnej płytce LB z 50 μg/ml kanamycyny.
  11. Inkubować wszystkie płytki przez noc w temperaturze 37 °C. Wybrać pojedyncze izolowane kolonie z każdej płytki doświadczalnej.

7. Analiza transformantów

  1. Wybierz osiem kolonii do 20 μl pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny.
  2. Skonfiguruj reakcję PCR kolonii i uruchom PCR (Tabela 5).
    UWAGA: W reakcji PCR kolonii dla fragmentu 1 należy użyć starterów P1 i P2 (patrz plik uzupełniający 1); dla fragmentu 2 należy użyć starterów P3 i P4 (patrz plik uzupełniający 1); dla fragmentu 3 należy użyć starterów P5 i P6 (patrz plik uzupełniający 1); dla fragmentu 4 należy użyć starterów P7 i P8 (patrz rysunek uzupełniający S2); dla fragmentu 5 użyj starterów P9 i P10; i użyć starterów P11 i P12 do wykrycia fragmentu 6 (patrz rysunek uzupełniający S2).
  3. Dodać 1 μl 6x buforu ładującego DNA do 5 μl produktu PCR, wymieszać i krótko odwirować zawartość.
  4. Przeanalizuj wyniki za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym.
  5. Wybrać jedną dodatnią kolonię do 5 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny i hodować przez noc w temperaturze 37 °C.
  6. Uzyskaj plazmid za pomocą mini zestawu plazmidowego DNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
  7. Wizualizacja wyników za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym 1%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiamy system rekombinacji in vitro służący do składania i naprawy nakładających się cząsteczek DNA z wykorzystaniem primera odwrotnego poprzez stale wprowadzane miejsca restrykcyjne (Rycina 1B). System ten jest prostą i wydajną procedurą obejmującą przygotowanie liniowego wektora oraz fragmentów insertów zawierających nawisy wprowadzone za pomocą PCR z primerami posiadającymi odpowiednie sekwencje wydłużenia 5' oraz miejsca restrykcyjne; jedną izotermiczną...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technika składania Gibsona to metoda klonowania molekularnego oparta na rekombinacji in vitro w celu złożenia fragmentów DNA8. Metoda ta umożliwia składanie wielu fragmentów DNA w kolisty plazmid w reakcji izotermicznej z jedną rurką. Jednak jedną z przeszkód w technice montażu Gibsona jest pozyskiwanie długich fragmentów z cDNA. Długie fragmenty są trudne do dokładnego amplifikacji z wielu powodów. Na przykład startery są łatwiejsze do niedopasowania podczas długiego wydłużania się, cDNA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez wsparcie finansowe funduszy na inicjację badań doktoranckich dostarczonych przez China West Normal University (nr 20E059).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 kb plus drabinka DNATiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Uniwersalna zielona mieszanka mistrzowska PCR RongWei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Mikrowirówka stołowaThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Clean BenchSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
Sprzęt do elektroforezy DNACleaver Scientific  Co., Ltd170905117
Bufor ładujący DNA (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Zestaw do ekstrakcji żeluOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Kultywator do elektroogrzewania stojącegoShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
ExonArt Zestaw do bezszwowego klonowania i montażuRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix z dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Barwnik żelowy z kwasem nukleinowymShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
Kostkarka do loduShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II Polimeraza DNAThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Płytka agarowa (Kanamycyna)Sangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.B530113-0010
LB sterylne płynne podłoże (Kanamycyna)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MikropipetyThermo Fisher Scientific  Co., Ltd—
Kuchenka mikrofalowaPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Wytrząsarki orbitalneShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
Wirus PRRSVUniwersytet Rolniczy w Syczuanie—
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1Do projektowania starterów
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
Odczynnik TRIzolThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026odczynnik do ekstrakcji RNA

Bibliografia

  1. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Jr Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5(2008).
  3. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Horton, R. M. PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes. Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).
  5. Bang, D., Church, G. M. Gene synthesis by circular assembly amplification. Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).
  6. Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Res. 35 (7), e55(2007).
  7. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  8. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  9. Cho, J. G., Dee, S. A. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).
  10. Holtkamp, D. J., et al. Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers. J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).
  11. Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage. Front Vet Sci. 7, 500(2020).
  12. Dwivedi, V., et al. Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions. Virol J. 9, 45(2012).
  13. Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of "atypical" PRRS. Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).
  14. Dee, S. A., Joo, H. S. Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation. Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).
  15. Dee, S. A., Joo, H. Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences. Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).
  16. Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction. Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).
  17. Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group. Virology. 193 (1), 329-339 (1993).
  18. Han, M. Y., Yoo, D. W. Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives. Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).
  19. Bryksin, A. V., Matsumura, I. Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).
  20. Wang, S., et al. Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning. J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).
  21. Zhang, Z. D., et al. The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis. Front Vet Sci. 9, 1024720(2022).
  22. Chen, N. H., et al. High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019. Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).
  23. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  24. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  25. Zhang, S. R., et al. Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid. Virol J. 8, 410(2011).
  26. Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region. Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wektor ekspresyjny PRRSVrekombinacja homologicznamontaż Gibsonaklonowanie za pomocą enzymów restrykcyjnychamplifikacja fragmentu PCRelektroforeza w żelu agarozowymcolony PCRlinearyzacja wektoramontaż fragmentów DNA
Bezproblemowe podejście do klonowania konstrukcji wektora ekspresji wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.