Pooperacyjny model mysiej niedrożności jelit

Podsumowanie

Opisujemy mysi model pooperacyjnej niedrożności jelit generowany przez manipulację jelitową. Funkcję pasażu pokarmowego, zmiany patologiczne i aktywację komórek odpornościowych oceniano 24 godziny po zabiegu.

Streszczenie

Większość pacjentów doświadcza pooperacyjnej niedrożności jelit (POI) po operacji, co wiąże się ze zwiększoną zachorowalnością, śmiertelnością i czasem hospitalizacji. POI jest konsekwencją uszkodzeń mechanicznych powstałych podczas zabiegu chirurgicznego, skutkujących zaburzeniem motoryki w przewodzie pokarmowym. Mechanizmy POI są związane z nieprawidłową wrażliwością neuronów, upośledzoną funkcją bariery nabłonkowej i zwiększonym miejscowym stanem zapalnym. Szczegóły pozostają jednak enigmatyczne. W związku z tym eksperymentalne modele mysie mają kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia patofizjologii i mechanizmu uszkodzenia POI oraz dla opracowania nowych terapii.

Tutaj wprowadzamy mysi model POI generowany za pomocą manipulacji jelitowej (IM), który jest podobny do chirurgii klinicznej; osiąga się to poprzez mechaniczne uszkodzenie jelita cienkiego poprzez masowanie brzucha 1-3 razy wacikiem. Opóźniony pasaż żołądkowo-jelitowy IM 24 godziny po zabiegu, oceniany za pomocą zgłębnika FITC-dekstranu i fluorescencyjnego wykrywania odcinka przewodu pokarmowego. Ponadto badano obrzęk tkanek podśluzówkowych i naciek komórek odpornościowych za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną oraz cytometrii przepływowej. Odpowiednie ciśnienie w jamie mózgowej i efekt przekrwienny w jelicie mają kluczowe znaczenie dla zabiegu. Ten mysi model POI może być wykorzystany do badania mechanizmów uszkodzenia jelit i rekonwalescencji po operacji jamy brzusznej.

Wprowadzenie

Pooperacyjna niedrożność jelit (POI) to zespół, który stanowi poważne wyzwanie w dziedzinie zdrowia ludzkiego, szczególnie w leczeniu pacjentów poddawanych operacji jamy brzusznej. Charakteryzuje się opóźnionym powrotem do motoryki przewodu pokarmowego, POI przyczynia się do wydłużenia pobytów w szpitalu i zwiększenia kosztów opieki zdrowotnej, ale nie istnieje żadna ustalona definicja, etiologia ani leczenie¹. Ostatnie badania rzuciły światło na kluczową rolę komórek odpornościowych w progresji POI^2,3,4, jednak konieczne są dalsze badania, aby wyjaśnić mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska.

W tym protokole wprowadzamy mysi model POI wywołany przez operację wewnątrzbrzuszną, który ściśle naśladuje wpływ operacji jamy brzusznej na przewód pokarmowy. Naszym celem było opracowanie ustandaryzowanej metody modelowania POI u myszy, co umożliwiłoby naukowcom zbadanie jej patofizjologii i zbadanie nowych interwencji terapeutycznych.

Uzasadnieniem dla rozwoju i wykorzystania tej techniki jest potrzeba wiarygodnych modeli przedklinicznych do badania POI. Tradycyjne podejścia do badania POI często nie mają znaczenia translacyjnego lub nie uwzględniają złożonej zależności między czynnikami przyczyniającymi się do tego stanu. Wprowadzając model mysi, który wiernie odwzorowuje scenariusz kliniczny, naukowcy mogą dokładniej badać mechanizmy leżące u podstaw POI i testować potencjalne interwencje terapeutyczne w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych.

W porównaniu z alternatywnymi technikami, mysi model POI przedstawiony w tym protokole oferuje kilka zalet. Początkowo połączyliśmy nasze wyniki eksperymentalne z najnowszymi osiągnięciami, aby ustalić ustandaryzowany i powtarzalny protokół wywoływania POI u zwierząt doświadczalnych. Protokół ten ułatwia spójną ocenę funkcji pasażu żołądkowo-jelitowego. Po drugie, zastosowanie barwienia histologicznego i cytometrii przepływowej umożliwiło ocenę obrzęku tkanek, proliferacji i aktywacji komórek odpornościowych, dostarczając cennych informacji na temat procesów zapalnych leżących u podstaw POI⁵.

W szerszym kontekście literatury, ustanowienie mysiego modelu POI przyczynia się do poszerzenia zakresu badań mających na celu zrozumienie patofizjologii tego schorzenia. Wypełniając lukę między naukami podstawowymi a praktyką kliniczną, modele przedkliniczne odgrywają kluczową rolę w opracowywaniu nowych strategii terapeutycznych dla POI⁶. Co więcej, dostępność standaryzowanych modeli zwierzęcych zwiększa odtwarzalność i porównywalność wyników badań w różnych laboratoriach. Jednak ten model POI opiera się na stymulacji mechanicznej podczas zabiegu chirurgicznego. Inne formy niedrożności jelit wywołanej stymulacją mogą nie być odpowiednie dla tego modelu. Ponadto podczas planowania eksperymentów z wykorzystaniem tego modelu badacze powinni wziąć pod uwagę takie czynniki, jak przepisy dotyczące dobrostanu zwierząt, względy etyczne i dostępność zasobów.

Podsumowując, wprowadzenie mysiego modelu POI oznacza godny uwagi postęp w badaniach przedklinicznych nad tym wyniszczającym schorzeniem. Dodatkowo zastosowaliśmy barwienie H&E i cytometrię przepływową, aby ocenić obrzęk tkanek oraz proliferację i aktywację komórek odpornościowych. Ustanowienie mysiego modelu POI ułatwiłoby odkrycie mechanizmów POI i promowałoby rozwój nowych terapii POI.

Protokół

Procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi w Opiece i Użytkowaniu Zwierząt (Chiny) i zostały zatwierdzone przez Komisję Oceny Etyki Szpitala Przyjaźni w Pekinie (nr 20-2056). Do badania wykorzystano myszy C57BL/6 (w wieku 8-12 tygodni).

1. Przygotowanie do operacji

1. Pościć wszystkie myszy przez 12 godzin przed planowanym modelowaniem, aby spełnić standaryzację warunków eksperymentalnych (Rysunek 1A).
2. Przygotuj i wysterylizuj narzędzia chirurgiczne.
3. Przygotuj znieczulający tribromoetanol i poduszkę grzewczą. Monitoruj poduszkę grzewczą, aby zapobiec przegrzaniu i utrzymuj ją w stałej temperaturze (37.5 °C).

2. Znieczulenie

1. Znieczulij każdą mysz tribromoetanolem.
   1. Rozcieńczyć tribromoetanol, aby przygotować roztwór o stężeniu 20 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej. Podawać 0,2 ml roztworu roboczego tribromoetanolu na 10 g masy ciała we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Użyj maści okulistycznej na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
   2. Upewnij się, że myszy są całkowicie znieczulone w ciągu 5 minut i pozostają znieczulone przez 20 minut.
2. Oceń głębokość znieczulenia, obserwując niezdolność myszy do pozostania w pozycji pionowej i sprawdź, czy mięśnie są rozluźnione. Obserwuj utratę dobrowolnych ruchów, odruchu mrugania i reakcji na stymulację odruchową (szczypanie palca u nogi lub ogona przy silnym nacisku).
3. Oceń częstość oddechów i wzorzec oddychania myszy, monitorując ruch ściany klatki piersiowej i brzucha. Upewnij się, że częstość oddechów wynosi ~ 55-65 oddechów/min w optymalnym znieczuleniu.
4. Umieść znieczuloną mysz na desce i zabezpiecz ją taśmą.
5. Po całkowitym znieczuleniu myszy użyj elektrycznej golarki do włosów, aby usunąć włosy z brzucha. Po goleniu zetrzyj wszystkie luźne włosy na brzuchu za pomocą wacika zwilżonego solą fizjologiczną.
   UWAGA: Podczas pracy z tribromoetanolem należy zapewnić odpowiednią wentylację i używać dygestorium lub komory bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować ryzyko narażenia. Podczas zabiegu należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice i fartuchy laboratoryjne, aby zapobiec przypadkowemu kontaktowi z chemikaliami i materiałami biologicznymi.

3. Chirurgia

1. Całkowicie rozciągnij kończyny, aby odsłonić brzuch. Upewnij się, że głowa myszy jest ustawiona tak, aby utrzymać drożność dróg oddechowych (Rysunek 1B).
2. Dwukrotnie zdezynfekuj skórę pola operacyjnego za pomocą wacika nasączonego 75% alkoholem. Po dezynfekcji użyj suchej, sterylnej gazy medycznej, aby usunąć nadmiar alkoholu z brzucha. Lidokainę (10 mg/kg mc., podskórnie) należy podawać w zamierzone miejsce przed nacięciem.
3. Użyj sterylnego skalpela, aby wykonać nacięcie w skórze i podnieś mięsień prosty brzucha na środku brzucha za pomocą pęsety.
   1. Wykonaj małe nacięcie wzdłuż środkowej linii mięśnia prostego brzucha, uważając, aby uniknąć obrażeń różnych narządów w jamie brzusznej.
   2. Upewnij się, że przybliżony zakres nacięcia jest następujący. Upewnij się, że górny brzeg nacięcia znajduje się 6-8 mm od wyrostka mieczykowatego mostka, dolny brzeg znajduje się 6-8 mm od zewnętrznych narządów płciowych, a długość nacięcia wynosi ~1 cm.
4. Umieść kawałek sterylnej serwety chirurgicznej lub sterylnej gazy po obu stronach nacięcia brzucha. Użyj kleszczyków hemostatycznych, aby przymocować sterylną gazę do górnej i dolnej krawędzi nacięcia, odsłaniając nacięcie (Rysunek 1C).
   UWAGA: W grupie pozorowanej nacięcie przykryto mokrą gazą przez 5 minut bez żadnej operacji chirurgicznej.
5. Prawidłowo przymocuj sterylną serwetę lub gazę, a następnie użyj dwóch bawełnianych wacików wstępnie zwilżonych solą fizjologiczną, aby delikatnie docisnąć po obu stronach ściany brzucha przylegającej do nacięcia. Wyciśnij niewielką ilość rurki jelitowej przez nacięcie i odsłoń ją, umieszczając ją na sterylnej zasłonie lub gazie (Rysunek 1D).
6. Całkowicie zwilż dwa sterylne waciki bawełniane zwykłą solą fizjologiczną. Delikatnie chwyć tkankę jelitową zwilżonymi wacikami i ostrożnie usuń jelito cienkie.
   1. Zlokalizuj kątnicę, a następnie wyjmij jelito sterylnymi wacikami bawełnianymi do 2 cm przed żołądkiem, aby uniknąć dotykania trzustki. Przedłuż jelito od bliższego końca więzadła trzustkowo-dwunastniczego do dystalnego końca okolicy krętniczo-kątniczej.
7. Wywieraj stały nacisk wzdłuż całego jelita cienkiego od bliższego do dystalnych końców. Zapewnić równomierne przyłożenie siły przez 5 minut, aż na powierzchni jelita pojawią się małe krwawiące plamki (Rysunek 1E).
8. Po 5 minutach użyj wstępnie zwilżonych sterylnych wacików, aby ostrożnie umieścić całe jelito cienkie z powrotem w jamie brzusznej, postępując zgodnie z normalną fizjologiczną anatomiczną pozycją jelita cienkiego.
9. Delikatnie masuj brzuch w poprzek sterylnej gazy i ściany brzucha przez 3-5 sekund, aby upewnić się, że jelito zostanie przywrócone do naturalnej anatomicznej pozycji i zapobiec sztucznej mechanicznej niedrożności jelit lub skrętowi krezki po operacji.
10. Wstrzyknąć 100 μl soli fizjologicznej do jamy brzusznej w celu uzupełnienia utraconych płynów podczas operacji i nasmarowania tkanki brzusznej.
11. Zamknij jamę brzuszną za pomocą szwu chirurgicznego 6-0 i wykonaj dwuwarstwowe zamknięcie w nacięciu brzucha. Zacznij od zamknięcia warstwy mięśniowej ciągłymi szwami, uważając, aby nie uszkodzić narządów jamy brzusznej. Podnieś mięsień prosty brzucha podczas szycia (Ryc. 1F).
12. Po całkowitym zamknięciu mięśnia prostego brzucha, zszyj go całkowicie prostymi szwami przerywanymi za pomocą szwu chirurgicznego 6-0. Utrzymuj długość ściegu ~0,5 mm i rozstaw igieł ~2 mm.
13. Po zamknięciu nacięcia brzusznego delikatnie przetrzyj obszar w pobliżu nacięcia suchą, sterylną gazą medyczną, aby był suchy i czysty z krwi, płynu tkankowego lub zwykłej soli fizjologicznej.
14. Nałóż niewielką ilość medycznego kleju do nacięć na nacięcie i wokół niego, aby uniknąć pękania po operacji.
15. Po całkowitym wyschnięciu kleju do nacięć medycznych przenieś myszy na ręcznik papierowy i umieść ręcznik papierowy w klatce na podgrzewanym kocu utrzymywanym w stałej temperaturze 37,5 °C, aż myszy w pełni wyzdrowieją. Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka.
16. Przenieś obudzone myszy do środowiska bariery żywieniowej dla zwierząt i pozwól im swobodnie pić do czasu wykrycia.

4. Test pasażu żołądkowo-jelitowego

1. Podaj 200 μl roztworu FITC-dekstranu (5 mg / ml w PBS) myszom na czczo przez zgłębnik 22,5 godziny po operacji (Rysunek 1A).
2. Poddaj myszy eutanazji przy użyciu metody zatwierdzonej przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC), takiej jak wdychanie CO₂, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
   1. Aby odizolować przewód pokarmowy, wykonaj nacięcie w linii środkowej od przepony do miednicy, ostrożnie usuwając otaczające tkanki łączne i narządy.
   2. Oddziel przewód pokarmowy od otaczających tkanek i narządów, upewniając się, że obejmuje cały przewód od żołądka do odbytu.
3. Podziel przewód pokarmowy na 15 równych segmentów (od żołądka do okrężnicy), ponumerowanych kolejno od 1 do 15 w oparciu o pozycję fizjologiczną (sekwencja: St -S1:S10-Ce-L1:L3) (Rysunek 2A).
4. Pokrój każdy segment tkanki jelitowej wraz z jego zawartością na kawałki o wielkości 1-4 mm i umieść je w oddzielnych probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml zawierających 1 ml DPBS.
5. Wirować probówki wirówkowe przez 10 sekund w celu homogenizacji próbek.
6. Odwirować probówki o masie 500 × g przez 1 minutę. Zebrać supernatant do ilościowego oznaczania fluorescencji FITC za pomocą wielomodowego czytnika mikropłytek.
7. Opisz pasaż żołądkowo-jelitowy, obliczając środek geometryczny (GC) dekstranu FITC, i oblicz za pomocą następującego wzoru: (Σ[% FITC na segment x numer segmentu])/100.

5. Osadzanie parafiny i barwienie hematoksyliną i eozyną (HE)

1. Poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO_{2 ,} a następnie zwichnięcie szyjki macicy po 24 godzinach. Na tym samym zwierzęciu należy wykonać testy zatapiania parafiny i przewodu pokarmowego.
2. Otwórz jamę brzuszną i pobierz tkankę jelita cienkiego do dalszej analizy.
3. Utrwalić całe jelito z treścią jelitową w utrwalaczu Carnoya (60% metanol + 10% kwas octowy + 30% chloroform) w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
4. Odkwaszaj tkankę, spłukując ją dwukrotnie metanolem przez 30 minut za każdym razem.
5. Zastąp metanol etanolem dwa razy na 30 minut za każdym razem.
6. Odkwaszaj tkankę, spłukując ją dwukrotnie metanolem przez 30 minut za każdym razem. Aby uzyskać przezroczystość tkanek za pomocą ksylenu, zanurz tkankę w ksylenie i inkubuj przez 1 godzinę.
7. Zanurz tkankę w wosku parafinowym za pomocą maszyny do zatapiania parafiny. Pokrój osadzoną tkankę na plastry o grubości 4 μm za pomocą mikrotomu.
   UWAGA: Podziel jelito cienkie na różne woski, aby poprawić wydajność. Prawidłowo oznacz segmenty, aby zidentyfikować ich lokalizację.
8. Wykonaj barwienie HE za pomocą zestawu do barwienia HE. Uszczelnij szkiełka i zbadaj je pod mikroskopem w celu analizy.

6. Izolacja komórek odpornościowych i cytometria przepływowa

1. Przygotuj następujące rozwiązania.
   1. Roztwór do wstępnego trawienia: Przygotuj zbilansowany roztwór soli Hanka bez Ca²⁺ i Mg²⁺ z 1 mM ditiotreitolem (DTT) i 10 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
   2. Roztwór do wytrawiania: Przygotować roztwór zawierający 200 μg/ml DNAazy I, 500 μg/ml kolagenazy IV, 4% FBS i 100 μM buforu HEPES w RPMI 1640.
   3. Bufor do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS): Przygotować bufor zawierający 5 g/L BSA i 2 mM EDTA w PBS bez Ca²⁺ lub Mg²⁺.
2. Usuń zawartość kału, myjąc jelita zwykłą solą fizjologiczną. Usuń plastry Peyera i tkankę łączną jelita cienkiego. Jelito cienkie rozciąć wzdłużnie, a następnie pokroić na 1 cm segmenty w lodowatym PBS.
3. Przemywać segmenty jelita roztworem do wstępnego trawienia w temperaturze 37 °C przez 20 minut na wytrząsarce orbitalnej. Zebrać roztwór do wstępnego trawienia i przefiltrować go przez sitka komórkowe o wielkości 70 μm, aby uzyskać limfocyty śródnabłonkowe (IEL).
4. Trawić segmenty w roztworze wytrawiającym przez 30 minut, a następnie przefiltrować zawiesinę przez sitka do komórek 70 μm w celu uzyskania limfocytów blaszki właściwej (LPL).
5. Odwirować komórki LPL o masie 500 × g przez 10 minut i odrzucić supernatant.
6. Przemyć i zawiesić komórki za pomocą DPBS (azydek sodu, Tris i bez białka) w stężeniu 1 x 10⁶ komórek/100 μl.
7. Inkubować komórki z fluorescencyjnym barwnikiem żywotności (1:500) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności.
8. Zawiesić komórki za pomocą buforu MACS i odwirować je w stężeniu 500 × g przez 5 minut.
9. Policz wybarwione komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Zawiesić komórki w stężeniu 1 x 10⁶ komórek/100 μl buforu MACS. Przeprowadzić barwienie przeciwciał (1:200-1:400), dodając odpowiednią objętość przeciwciała do zawiesiny komórkowej i inkubując w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
10. Umyj komórki zgodnie z opisem w kroku 6.8.
11. Wykrywaj próbki za pomocą cytometrii przepływowej i analizuj dane za pomocą powiązanego oprogramowania do cytometrii przepływowej^7,8.

Wyniki

W niniejszym protokole POI wywołano chirurgicznie poprzez manipulację jelitową (IM), co odpowiada efektowi operacji klinicznej. W grupie pozorowanej (sham) wykonano nacięcie bez przeprowadzenia IM. Myszy z POI uśpiono 24 h po operacji POI wraz z myszami z grupy kontrolnej sham. Krytyczną funkcję przewodu pokarmowego, jaką jest funkcja transportu treści, wykryto za pomocą zgłębnikowego podania FITC-dekstranu. Model POI uznano za udany, ponieważ intensywność FITC wzrosła w bliższej części jelita cienkiego (

Dyskusja

Powodzenie operacji zależy od kilku kluczowych etapów. Po pierwsze, utrzymanie spójności podczas śródściennej operacji jelita (IM) jest niezbędne do wywołania rozległego uszkodzenia jelita cienkiego. Odpowiedni ucisk wywierany podczas zabiegu domięśniowego i wynikający z niego efekt przekrwienia jelita mają kluczowe znaczenie dla powodzenia operacji. Obserwacja całego przewodu pokarmowego, który po potarciu wacikiem zmienił kolor na różowy i wykazywał czerwone plamki krwotoczne, była wskaźnikiem udanej operacji. Ponadto ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 M HEPES	Thermo	15630080
APC przeciw myszom I-A/I-E (MHC-II)	Biolegend	107614
APC przeciw myszom TCRb	Biolegend	109212
APC/Cy7 przeciw myszom CD4	Biolegend	100414
APC/Cy7 przeciw myszom Ly6G	Biolegend	127624
Brilliant Violet 421 anty-mysz CD69	Biolegend	104545
Brilliant Violet 421 anty-mysz F4/80	Biolegend	123132
Brilliant Violet 785 anty-myszy/człowiek CD44	Biolegend	103041
BUV395 anty-mysie CD8a	BD	563786
BUV737 anty-mysie CD3e	BD	612771
Kolagenaza IV	Sigma-Aldrich	C5138
Mikroskop hodowlany	CKX53	Olympus
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej (DNaza I)	Sigma-Aldrich	DN25-5G
DL-Ditiothreitol roztwór	Sigma-Aldrich	43816-10ML
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS-100G
FITC anty-mysi CD45	Biolegend
FITC-dekstran (70 kWM)	Sigma-Aldrich	FD70-100MG	pasażu pokarmowego
Zestaw do barwienia HE	solarbio	G1120
PE anty-mysie CD11b	Biolegend	101208
PE anty-mysie PD-1	Biolegend	114118
PE/Cy7 anty-mysie CD11c	Biolegend	117318
Percoll	GE (Pharmacia)	17-0891-01
Symphony A5 Cytometr przepływowy	BD-Immunologiczne		wykrywanie i sortowanie komórek
Tribromoetanol	Sigma-Aldrich	T48402	Znieczulenie
Varioskan LUX	Thermo	N16699	Wielomodowy czytnik mikropłytek
Zombie Aqua Fixable Zestaw żywotności	Biolegend	423102	Fluorescencyjny Barwnik żywotności

147709 Test