Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach HEK-293T przy użyciu systemów reporterowych opartych na GFP

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66501

⸱

2 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Protein Structure and Function, Institute of Medicine and Pharmacy, Qiqihar Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje test pozachromosomalnego łączenia niehomologicznych końców (NHEJ) i test rekombinacji homologicznej (HR) w celu ilościowego określenia efektywności NHEJ i HR w komórkach HEK-293T.

Streszczenie

Pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB) reprezentują najbardziej niebezpieczne uszkodzenia DNA, zdolne do wywołania znacznej utraty informacji genetycznej i zaniku komórek. W odpowiedzi komórki wykorzystują dwa podstawowe mechanizmy naprawy DSB: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i rekombinację homologiczną (HR). Kwantyfikacja efektywności NHEJ i HR oddzielnie ma kluczowe znaczenie dla zbadania odpowiednich mechanizmów i czynników związanych z każdym z nich. Test NHEJ i test HR są uznanymi metodami stosowanymi do pomiaru skuteczności ich odpowiednich ścieżek naprawy. Metody te opierają się na skrupulatnie zaprojektowanych plazmidach zawierających zaburzony gen białka zielonej fluorescencji (GFP) z miejscami rozpoznawania endonukleazy I-SceI, która indukuje DSB. Tutaj opisujemy pozachromosomalny test NHEJ i test HR, które obejmują kotransfekcję komórek HEK-293T z plazmidami EJ5-GFP / DR-GFP, plazmidem eksprymującym I-SceI i plazmidem eksprymującym mCherry. Wyniki ilościowe efektywności NHEJ i HR uzyskuje się poprzez obliczenie stosunku komórek GFP-dodatnich do komórek mCherry-dodatnich, zliczonych za pomocą cytometrii przepływowej. W przeciwieństwie do testów zintegrowanych chromosomalnie, te testy pozachromosomowe są bardziej odpowiednie do przeprowadzania badań porównawczych z udziałem wielu ustalonych stabilnych linii komórkowych.

Wprowadzenie

Dwuniciowe pęknięcie DNA (DSB) jest najbardziej szkodliwą formą uszkodzenia DNA, potencjalnie prowadzącą do niestabilności genomu, rearanżacji chromosomów, starzenia się komórek i śmierci komórki, jeśli nie zostanie szybko naprawiona1. Dwa dobrze ugruntowane szlaki, niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i rekombinacja homologiczna (HR), są znane ze swojej skuteczności w adresowaniu DSB DNA2,3. HR jest uważany za bezbłędny mechanizm naprawy DSB, wykorzystujący sekwencje homologiczne w chromatydzie siostrzanej jako matrycę do przywrócenia pierwotnej konfiguracji uszkodzonej cząsteczki DNA3. Z drugiej strony, NHEJ jest podatną na błędy ścieżką naprawy DSB, która łączy uszkodzone końce DNA bez polegania na jakimkolwiek szablonie2.

Test NHEJ i test HR są klasycznymi metodami pierwotnie opracowanymi w laboratorium Jasina w Memorial Sloan-Kettering Cancer Center i wykorzystanymi do ilościowego określenia efektywności NHEJ i HR, odpowiednio4,5,6,7. Testy te odgrywają kluczową rolę w badaniu odpowiednich mechanizmów i czynników związanych z NHEJ i HR8,9,10,11,12,13,14. Oba testy opierają się na implementacji dwóch zakłóconych reporterów GFP, EJ5-GFP i DR-GFP, w celu monitorowania naprawy DSB indukowanej przez endonukleazę I-SceI. Reporter EJ5-GFP jest stosowany w teście NHEJ, podczas gdy reporter DR-GFP jest używany w teście HR. Każdy reporter jest subtelnie zaprojektowany w taki sposób, że DSB indukowane przez I-SceI mogą być naprawiane tylko przez określoną ścieżkę naprawy w celu przywrócenia kasety z wyrażeniem GFP4,5.

Test NHEJ i test HR mogą być przeprowadzone przy użyciu podejścia zintegrowanego chromosomalnie lub pozachromosomalnego15,16. Podejście zintegrowane chromosomalnie wymaga integracji zakłóconych reporterów GFP z genomem, co pozwala na analizę naprawy DSB w kontekście chromosomalnym6,15. Jednak takie podejście wymaga długotrwałego pasażowania komórek i nie nadaje się do badań porównawczych obejmujących wiele linii komórkowych ze względu na arbitralną integrację chromosomalną, wprowadzając dodatkowy czynnik zakłócający oprócz nieodłącznych różnic. W tym protokole opisujemy pozachromosomalny test NHEJ i testy HR, obejmujące przejściową transfekcję zakłóconych plazmidów GFP i I-SceI do komórek HEK-293T, a następnie analizę cytometrii przepływowej (przebieg eksperymentu pokazano w Rysunek 1). Te niezintegrowane testy reporterowe zostały pierwotnie zgłoszone przez laboratorium Jasina w celu zbadania naprawy międzyniciowych połączeń międzyniciowych DNA16 i zostały wykorzystane do oceny wydajności NHEJ i wydajności HR przez kilka laboratoriów9,10,11,12,13,14,17,18,19, w tym nasz11. Te pozachromosomalne podejścia ułatwiają analizę naprawy DSB w badaniach porównawczych obejmujących wiele ustalonych stabilnych linii komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja plazmidu

  1. Przekształć kompetentną E. coli za pomocą plazmidów EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plazmid eksprymujący I-SceI) i PCI2-HA-mCherry (plazmid eksprymujący mCherry) (patrz Tabela materiałów) zgodnie ze standardowym protokołem transformacji20.
    UWAGA: PCI2-HA-mCherry można zastąpić innymi plazmidami eksprymującymi mCherry lub DsRed.
  2. Hodować przekształcone bakterie E. coli w 500 ml płynnego podłoża LB uzupełnionego 100 μg/ml ampicyliny przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
  3. Wyizoluj plazmidy za pomocą dostępnego w handlu zestawu do maksymalnej izolacji plazmidu wolnego od endotoksyn, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
  4. Określić ilościowo stężenia plazmidów za pomocą spektrofotometrów mikroobjętościowych nanokropli. Dostosuj stężenie plazmidu do 1 μg/μl.

2. Przygotowanie i transfekcja komórek

  1. Hodowla komórek HEK-293T w pożywce DMEM uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą. Upewnij się, że komórki HEK-293T lub ustabilizowane komórki stabilne HEK-293T są w dobrym stanie wzrostu.
    UWAGA: Zamrożone komórki powinny przejść co najmniej dwie rundy podziału przed transfekcją.
  2. W dniu poprzedzającym transfekcję wysiewaj komórki HEK-293T na 6-dołkowej płytce w 2 × 105 komórek/basenik, aby osiągnąć około 60% konfluencji następnego dnia.
  3. W dniu transfekcji potwierdź zbieżność komórek, dążąc do około 60%. W przypadku testu NHEJ należy transfekować eksperymentalne komórki próbki na 6-dołkowej płytce z 1 μg EJ5-GFP, 1 μg pCBASceI i 1 μg plazmidów PCI2-HA-mCherry, używając komercyjnego odczynnika do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). W teście HR zastąp plazmid EJ5-GFP plazmidem DR-GFP.
  4. W przypadku kontroli kalibracyjnych FACS należy pozostawić studzienkę komórek nietransfekowaną jako kontrolę ujemną. Transfekować komórki na 6-dołkowej płytce za pomocą (1) 1 μg EJ5-GFP (dla testu NHEJ) lub 1 μg DR-GFP (dla testu HR), razem z 1 μg pCBASceI jako jednokolorowej kontroli GFP lub (2) 1 μg PCI2-HA-mCherry jako jednokolorowej kontroli mCherry.

3. Analiza komórek GFP-dodatnich i mCherry-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Dwa dni po transfekcji potwierdź ekspresję białek GFP i mCherry za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
  2. Trzy dni po transfekcji usuń pożywkę z dołków, przemyj raz PBS i dodaj 500 μl trypsyny do każdej studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu oderwania wszystkich komórek od płytki. W tym i kolejnych krokach chroń komórki przed bezpośrednim światłem.
  3. Dodaj 500 μl kompletnej pożywki DMEM do każdej studzienki, ponownie zawieś komórki, upewniając się, że nie są widoczne żadne grudki.
  4. Przenieść wszystkie komórki z każdej studzienki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml, a następnie odwirowywać komórki przez 2 minuty w temperaturze 1000 × g w temperaturze pokojowej.
  5. Ostrożnie usunąć sklarowany osad za pomocą pipetowania i przemyć go jednorazowo 1,0 ml PBS.
  6. Ponownie ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipetowania, ponownie zawiesić komórki w 500 μl PBS i przenieść komórki do probówek FACS (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, rozpocznij analizę cytometrii przepływowej natychmiast po pobraniu komórek. Alternatywnie komórki można przechowywać na lodzie przez kilka godzin.
  7. Skalibruj FACS z komórkami nietransfekowanymi (kontrola ujemna), komórkami transfekowanymi EJ5-GFP/DR-GFP i komórkami transfekowanymi pCBASceI (kontrola jednokolorowa GFP) i komórkami transfekowanymi mCherry (kontrola jednokolorowa mCherry). Dostosuj napięcie i kompensację, aby zminimalizować rozlewanie się fluorescencji między GFP a mCherry.
  8. Zdobądź i zapisz co najmniej 10 000 nienaruszonych komórek z każdej probówki.

4. Analiza danych

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane za pomocą oprogramowania FlowJo (patrz Tabela materiałów) do analizy danych FACS. Porównywalne procedury można wykonać w alternatywnym oprogramowaniu do analizy.

  1. Przeciągnij wszystkie pliki FACS do pulpitu nawigacyjnego. Kliknij dwukrotnie jeden z plików, aby wyświetlić wykres FSC/SSC.
  2. Utwórz bramę wielokątną, aby zaznaczyć nienaruszone komórki, z wyłączeniem gruzu w lewym dolnym rogu. Nazwij tę subpopulację "Nienaruszone komórki" i przeciągnij tę bramę do paska "Wszystkie próbki". Przewiń każdą próbkę za pomocą przycisku Następna próbka, aby zapewnić odpowiednie bramkowanie dla każdej próbki (Rysunek 2A).
  3. Kliknij dwukrotnie subpopulację nienaruszonych komórek w próbce kontroli ujemnej (komórki nietransfekowane), aby wyświetlić nową powierzchnię. Zmień osie na FL1-H (oś x, GFP) i FL2-H (oś y, mCherry).
  4. Wybierz narzędzie Quad Gating i kliknij prawy górny róg ujemnej populacji komórek (Rysunek 2B). Przeciągnij cztery prostokątne bramki na pasek "Nienaruszone komórki". Przewiń próbki jednokolorowej kontroli GFP lub jednokolorowej kontroli mCherry za pomocą przycisku Następna próbka, aby zapewnić odpowiednie bramkowanie do rozróżniania GFP-dodatnich lub mWiśniowo-dodatnich od ujemnych komórek kontrolnych (Rysunek 2C,D). W razie potrzeby dostosuj bramkowanie kwadrantowe i zastosuj to bramkowanie do wszystkich populacji "nienaruszonych komórek".
  5. Kliknij Edytor układu. Kliknij prawym przyciskiem myszy reprezentatywne działki i wybierz polecenie Kopiuj do Edytora układu. Zaznacz wszystkie reprezentatywne wykresy, a następnie kliknij dwukrotnie, aby otworzyć Definicję wykresu. Dostosuj etykietę osi, adnotację i legendę zgodnie z potrzebami.
  6. Procent komórek mCherry-dodatnich w próbkach eksperymentalnych służy jako kontrola wydajności transfekcji. Oblicz względną skuteczność naprawy DNA, porównując liczbę komórek GFP-dodatnich z liczbą komórek mCherry-dodatnich na tym samym wykresie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zapewnić dokładność analizy NHEJ oraz HR, konieczne jest zastosowanie odpowiedniej korekty kompensacji i strategii bramkowania. Zazwyczaj fluorescencja mCherry nie przejawia się w detektorze GFP przy użyciu filtra 530 nm. Jednak w przypadkach komórek wykazujących niezwykle wysoką ekspresję GFP, fluorescencja GFP może zanieczyszczać detektor mCherry przy użyciu filtra 575 nm. Aby rozwiązać te problemy, do kompensacji i regulacji strategii bramkowania wykorzystano kontrolę negatywną, kontrolę jednobarwną GFP oraz kontr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda została wykorzystana w kilku artykułach do oceny efektywności NHEJ i efektywności HR 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Metoda ta jest przydatna do wyjaśnienia mechanizmów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by ujawnić.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Heilongjiang w Chinach (YQ2022C036) oraz Fundację Innowacji dla Absolwentów Uniwersytetu Medycznego Qiqihar (QYYCX2022-06). Rysunek 1 utworzony przy użyciu MedPeer.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynia 6 cm BBIF611202-9001
Płytki 6-dołkoweCorning3516
AmpicillinBeyotimeST007Stężenie robocze: 100 μ g/ml
DH5&alfa; Competent CellsTIANGENCB101
DMEMHycloneSH30022.01
DR-GFPAddgene26475
EJ5-GFPAddgene44026
EndoFree Maxi Plasmid  kitTIANGENDP117alternatywny zestaw do ekstrakcji plazmidu bez endotoksyn może być stosowany
ProbówkiFACS FALCON352054
surowicy bydlęcejpłodu CLARKFB25015
Cytometr przepływowyBD BiosciencesBD FACSCalibur
FlowJo V.10.1użyć alternatywnego oprogramowania do analizyTreestar
Komórki HEK-293TKrajowa Infrastruktura Linii Komórkowych Zasób1101HUM-PUMC000091
Lipo3000InvitrogenL3000015można zastosować alternatywne regenty transfekcji
PBSBiosharpBL601A
pCBASceIAddgene26477Plazmid eksprymujący SceI
PCI2-HA-mWiśniaalternatywne plazmidy zawierające DsRed mogą być używane
TrypsynaGibco25200-056
Można użyć alternatywnego oprogramowania do analizy Można

Bibliografia

  1. Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
  2. Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).
  3. Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).
  4. Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
  5. Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).
  6. Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).
  7. Zuo, N., et al. Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays. Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).
  8. Schrank, B. R., et al. Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair. Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).
  9. Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response. Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).
  10. Xu, R., et al. hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy. Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).
  11. Wang, T., et al. WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair. iScience. 25 (1), 103676(2022).
  12. Guo, G., et al. Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling. Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).
  13. Watkins, J., et al. Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers. Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).
  14. Chen, Y., et al. USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma. Nat Commun. 13 (1), 501(2022).
  15. Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells. JoVE. (43), e2002(2010).
  16. Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. DNA recombination: Methods and Protocols. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).
  17. Cavallo, F., et al. Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition. PLoS One. 7 (12), e51563(2012).
  18. Unfried, J. P., et al. Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).
  19. Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).
  21. Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences. Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

pęknięcia dwuniciowe DNAtest reporterowy GFPcytometria przepływowawydajność naprawy DNAtransfekcja plazmidowakontrola mCherrybiałko WASH
Analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach HEK-293T przy użyciu systemów reporterowych opartych na GFP
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.