Artykuł metodologiczny

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66527

⸱

22 marca 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Department of Medicine, University of Washington, 2Department of Orthopedics and Trauma Surgery, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Streszczenie

Ten protokół szczegółowo opisuje propagację i pasaż ludzkich iPSC oraz ich różnicowanie w osteoklasty. Po pierwsze, iPSC są dysocjowane do zawiesiny jednokomórkowej w celu dalszego wykorzystania w indukcji ciała zarodka. Po indukcji mezodermalnej ciała embrionoidalne ulegają różnicowaniu hematopoetycznemu, wytwarzając pływającą populację komórek krwiotwórczych. Następnie pobrane komórki krwiotwórcze przechodzą etap dojrzewania czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów, a na końcu różnicowanie osteoklastów. Po różnicowaniu osteoklastów, osteoklasty charakteryzują się barwieniem dla TRAP w połączeniu z barwieniem jądrowym zielenią metylową. Osteoklasty obserwuje się jako wielojądrowe polikariony TRAP+. Ich identyfikacja może być dodatkowo wsparta barwieniem katepsyną K. Testy resorpcji kości i minerałów pozwalają na charakterystykę funkcjonalną, potwierdzając tożsamość osteoklastów w dobrej wierze. Protokół ten demonstruje solidną i wszechstronną metodę odróżniania ludzkich osteoklastów od iPSC i pozwala na łatwe zastosowanie w zastosowaniach wymagających dużych ilości funkcjonalnych ludzkich osteoklastów. Można przewidzieć zastosowania w dziedzinie badań nad kośćmi, nowotworami, inżynierią tkankową i badaniami nad endoprotezami.

Wprowadzenie

Osteoklasty (OC) są pochodzenia hematopoetycznego1,2, wszechstronne typy komórek, które są powszechnie używane przez badaczy w takich dziedzinach jak badania nad chorobami kości3,4, badania nad rakiem5,6, inżynieria tkankowa7,8 i endoproteza research9,10. Niemniej jednak różnicowanie OC może być trudne, ponieważ fuzja prekursorów jednojądrzastych w wielojądrowe OC jest niezbędna do stworzenia funkcjonalnych OCs11. Do różnicowania OC niezbędnych jest kilka czynników biologicznych, takich jak aktywator receptora ligandu NF-κB (RANKL) i czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF). Doniesiono, że M-CSF ma pozytywny wpływ na proliferację komórek, przeżywalność komórek i wyrażenie RANK12,13,14. Z drugiej strony, RANKL wiąże się z RANK, który aktywuje kaskady sygnalizacyjne w dół, które indukują osteoklastogenezę. Aktywacja odbywa się za pośrednictwem czynnika 6 związanego z receptorem TNF (TRAF6), co prowadzi do degradacji czynnika jądrowego wzmacniacza genu polipeptydu światła kappa w inhibitorze limfocytów B, alfa (IκB-α), białku wiążącym, które wiąże dimery NF-kB16,17. W związku z tym degradacja IκB-α uwalnia dimery NF-kB, które następnie przemieszczają się do jądra i indukują ekspresję czynników transkrypcyjnych c-Fos i czynnika jądrowego aktywowanych komórek T 1 (NFATc1). To z kolei wyzwala transkrypcję wielu białek związanych z różnicowaniem OC 15,18. Białka o podwyższonej regulacji, takie jak DC-Stamp i Atp6v0d2, pośredniczą w fuzji prekursorów OC między komórkami, prowadząc do powstania syncytium19,20,21.

W odniesieniu do ludzkich komórek pierwotnych, PBMC CD34+ i CD14+ są obecnie najczęściej używanymi typami komórek do różnicowania na OCs22. Jednak podejście to jest ograniczone przez heterogeniczność w populacji CD34+ komórek pobranych od dawców23 i ich ograniczoną zdolność do rozbudowy. Ludzkie komórki iPS stanowią alternatywne źródło OC. Ponieważ mogą być one propagowane w nieskończoność24, pozwalają na rozbudowę i skalowanie produkcji OC. Pozwala to na różnicowanie dużej liczby OC, co ułatwia badania OC.

Opublikowano kilka protokołów do różnicowania iPSC na OCs25,26,27. Cały proces różnicowania można podzielić na część propagacyjną iPSC, część różnicowania mezodermalnego i krwiotwórczego oraz różnicowanie OC. Propagacja iPSC przed procesem różnicowania pozwala na zwiększenie skali produkcji OC przed różnicowaniem. Istnieje kilka podejść dotyczących różnicowania mezodermalnego i krwiotwórczego. Tradycyjnie tworzenie ciał zarodkowych (EB) było wykorzystywane do różnicowania komórek krwiotwórczych, ale podejścia oparte na monowarstwach stanowią kolejną strategię różnicowania układu krwiotwórczego, która nie wymaga indukcji EB. Niemniej jednak systemy oparte na monowarstwach wydają się wymagać dalszej optymalizacji, ponieważ my i inni stwierdziliśmy, że podejścia oparte na EB są bardziej odporne na różnicowanie OC.

Tutaj opisujemy różnicę między OC a ludzkimi iPSC za pomocą protokołu opartego na EB. Protokół ten został zaadaptowany z Rössler et al.26 i zmodyfikowany w celu zwiększenia wytrzymałości i umożliwienia kriokonserwacji podczas procesu różnicowania. Po pierwsze, komórki krwiotwórcze pobraliśmy tylko raz po 10 dniach różnicowania. Komórki krwiotwórcze zostały następnie poddane krioprezerwacji, aby umożliwić większą elastyczność podczas procesu różnicowania. Dodatkowo zwiększyliśmy gęstość wysiewu komórek krwiotwórczych z 1 x 105 do 2 x 105 komórek/cm2 w celu różnicowania OC. Zastosowano nowszą pożywkę bez ludzkiej surowicy iPSC (hiPSC-SFM, patrz Tabela materiałów), a powlekanie studzienek wykonano 200-300 μg/ml ekstraktu z błony podstawowej (patrz Tabela materiałów) zamiast 0,1% żelatyny. Penicylina/streptomycyna nie była dodawana do pożywki.

Protokół Rössler et al.26 został pierwotnie zaadaptowany z iPSC do protokołu różnicowania makrofagów28, który wykorzystuje tworzenie EB do różnicowania układu krwiotwórczego. Podczas gdy tworzenie EB było używane przez badaczy przez dłuższy czas do różnicowania układu krwiotwórczego29,30, w literaturze opisano kilka metod indukcji EB, takich jak spontaniczna agregacja, wirowanie na okrągłej płytce studziennej, hodowla kropli wiszących, hodowla bioreaktorów, stożkowa hodowla probówkowa, wolno obracające się naczynie boczne i kultura żelu mikromold31. Protokół ten wykorzystuje wirowanie zdysocjowanych iPSC w płytce dołka z okrągłym dnem w celu zbliżenia pojedynczych komórek iPSC do siebie i umożliwienia tworzenia kuli (EB), jak opisano poniżej.

Protokół

UWAGA: Wszystkie odczynniki używane w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów. O ile nie określono inaczej, wszystkie media zostały wstępnie wyważone do temperatury 37 °C przed użyciem. Wszystkie etapy wirowania przeprowadza się w temperaturze 37 °C i w trybie najwolniejszego przyspieszania/zwalniania. O ile nie określono inaczej, supernatant jest zawsze usuwany za pomocą jednorazowych szklanych pipet Pasteura.

1. Rozmrażanie i rozmnażanie ludzkich iPSC

  1. Na dzień przed rozmrożeniem iPSC pokryj studzienkę 6-dołkowej płytki 1 ml podstawowego ekstraktu błonowego o stężeniu 200-300 μg/ml. Umieścić na noc płytkę studzienkową w temperaturze 4 °C.
  2. Następnego dnia rozmrozić i przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety P1000. Kroplami dodaj 5-7 ml DMEM/F-12 z 15 mM HEPES.
  3. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie usunąć komórki z wirówki i uważać, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
  4. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki wolnej od surowicy hiPSC (hiPSC-SFM zawierającej 10 μM inhibitora kinazy Rho (ROCK) Y-27632) przy użyciu P1000 z końcówkami o szerokim otworze.
  5. Odessać podstawowy ekstrakt błonowy z dołka pokrytego poprzedniego dnia (etap 1.1) i przenieść 1 ml hiPSC-SFM z 10 μM Y-27632 do studzienki. Dodaj zawieszone iPSC do studzienki, aby osiągnąć końcową objętość 2 ml na studzienkę.
  6. Zakręć płytką, aby równomiernie rozprowadzić agregaty iPSC przed umieszczeniem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Pełne zmiany pożywki należy wykonywać co drugi dzień za pomocą hiPSC-SFM (bez dodatku inhibitora ROCK Y-27632). iPSC zwykle osiągają 70-80% konfluencji po 3-4 dniach namnażania.

2. Przejazdy iPSC

  1. Na dzień przed pasażowaniem iPSC należy pokryć studzienki 6-dołkowej płytki podstawowym ekstraktem błonowym o stężeniu 200-300 μg/ml. Umieścić płytkę studzienkową w temperaturze 4 °C na noc.
    UWAGA: Upewnij się, że komórki osiągnęły około 70-80% konfluencji. Upewnij się, że iPSC nie ulegają nadmiernemu zlewaniu (ponad 80% konfluencji), ponieważ będzie to sprzyjać spontanicznemu różnicowaniu.
  2. Pasażowanie iPSC należy rozpocząć od usunięcia zróżnicowanych regionów lub regionów z wieloma martwymi agregatami iPSC pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą końcówek do pipet o pojemności 10 μl lub 20 μl lub skrobaka do komórek. Zróżnicowane obszary będą miały gęstszy lub bielszy kolor.
    UWAGA: Zeskrobane agregaty komórkowe mogą nadal częściowo przyczepiać się do dna studni.
  3. Umyj dno studzienki kilka razy pipetą P1000 o szerokim otworze, aby usunąć wszelkie kruszywa, które mogą być nadal częściowo przyczepione do dna studni.
  4. Wyrzucić zużyte podłoże, w którym hodowano iPSC, zawierające oderwane agregaty iPSC. Powtórz etap płukania jeszcze dwa razy roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  5. Następnie dodaj 1 ml 5 U/ml Dispazy na dołek. Krawędzie kolonii iPSC oderwą się od płytki studzienki, co można zaobserwować pod mikroskopem stereoskopowym po 3-5 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej.
  6. Ostrożnie usunąć Dispase, aby uniknąć przemieszczenia lekko oderwanych kruszyw i dodać 1 ml DMEM/F-12 z 15 mM HEPES. Użyj jednorazowego podnośnika do komórek, aby pokroić agregaty na małe rozmiary. Spójność rozmiarów agregatów iPSC można poprawić za pomocą narzędzia do pasażowania komórek macierzystych.
  7. Zmyć pokrojone agregaty iPSC z pożywką w studzience i przenieść pożywkę z kruszywem do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml lub P1000 z końcówką o szerokim otworze.
  8. Przepłukać studzienkę preparatem DMEM/F-12 i przenieść pożywkę do probówki o pojemności 15 ml z agregatami iPSC.
  9. Odwirować pokrojone agregaty iPSC przy 200 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant za pomocą szklanej pipety Pasteura i dodać 2 ml hiPSC-SFM w celu usunięcia i ponownego zawieszenia iPSC za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml lub P1000 z końcówkami o szerokim otworze.
  10. Odessać resztki ekstraktu z błony podstawowej z wstępnie pokrytej płytki (płytek) dołka i dodać 1 ml hiPSC-SFM do każdej studzienki płytki 6-dołkowej.
  11. Przenieś iPSC do nowych studzienek na płytce 6-dołkowej, tak aby końcowa objętość wynosiła 2 ml hiPSC-SFM na studzienkę za pomocą P1000 z końcówkami o szerokim otworze. W zależności od linii iPSC należy zoptymalizować współczynniki podziału. W tym przypadku zastosowano podział 1:6.
  12. Sprawdź studnię pod kątem pływających agregatów i wielkości agregatów pod mikroskopem stereoskopowym. Idealnie, wielkość kruszywa powinna wynosić od 50 do 200 μm.
  13. Zakręcić płytką studzienki, aby równomiernie rozprowadzić komórki na płytce po przeniesieniu agregatów i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 aż do zbiegu 70-80%.

3. Zamrażanie z powrotem iPSC

  1. Aby ponownie zamrozić komórki iPSC, należy przejść komórki zgodnie z powyższym opisem (patrz krok protokołu "2. Pasażowanie iPSC"). Po pokrojeniu komórek na kolonie i zmyciu z dna studzienki (krok 2.10), wirować pokrojone agregaty w ilości 200 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant.
  2. Dodać 1 ml pożywki do kriokonserwacji bez surowicy na dołek płytki 6-dołkowej do probówki o pojemności 15 ml i ponownie zawiesić pokrojone kruszywa za pomocą P1000 z końcówką o szerokim otworze.
  3. Przenieś komórki do wstępnie oznakowanych krioprobówek. Zamknąć probówki i przenieść probówki do wstępnie schłodzonego pojemnika do kriokonserwacji w temperaturze 4 °C. Przechowywać komórki w temperaturze -80 °C przez 24-48 godzin.
  4. Przenieś kriowiale do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Schematyczne podsumowanie procesu różnicowania OC jest zilustrowane na rysunku Rysunek 1.

4. Indukcja ciała embrionalnego

  1. Hoduj i rozwijaj wystarczającą ilość iPSC, jak opisano powyżej, do indukcji EB.
    UWAGA: Produkcję OC można zwiększyć poprzez zwiększenie liczby ciał zarodkowych, co z kolei daje ogólnie wyższą wydajność komórek krwiotwórczych. Jedna studzienka składająca się z 70-80% zlewających się iPSC daje około 8,4 x 105 komórek na studzienkę 6-dołkowej płytki. Do utworzenia jednego ciała zarodkowego potrzeba 12 500 jednokomórkowych iPSC.
  2. Odessać zużytą pożywkę z kultur iPSC i przepłukać kolonie iPSC D-PBS.
  3. Dodaj 0,5 ml podgrzanego do temperatury pokojowej odczynnika do dysocjacji pojedynczych komórek do każdego dołka na 6-dołkowej płytce i zawiruj naczynie hodowlane, aby pokryć całą powierzchnię studzienki. Inkubować naczynie hodowlane w temperaturze 37 °C przez 5-8 minut.
  4. Wyjąć naczynie z inkubatora, odessać odczynnik do dysocjacji pojedynczych komórek i dodać 1 ml pożywki różnicującej etapu 1 do studzienek, składającej się z pożywki wolnej od surowicy hiPSC z 50 ng/ml ludzkiego białka morfogenetycznego kości 4 (hBMP4), 50 ng/ml ludzkiego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego-165 (hVEGF), 20 ng/ml ludzkiego czynnika komórek macierzystych (hSCF), oraz 10 μM Y-27632.
  5. Delikatnie odłącz komórki, spłukując studzienkę pożywką Stage 1. Zgrupuj zdysocjowane iPSC w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
  6. Dodać 1 ml pożywki różnicującej etapu 1 do studzienek i zmyć pozostałe komórki lub użyć skrobaka do komórek w przypadku kolonii, które nie zmywają się łatwo.
  7. Po przeniesieniu wszystkich komórek do probówki, odwirować przy 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć osad komórkowy. Odessać i ponownie zawiesić komórki w sumie 2 ml wstępnie zbalansowanej pożywki różnicującej etapu 1 za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml lub P1000 z końcówką o szerokim otworze.
  8. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego urządzenia do liczenia komórek. Dodać pożywkę do 15 ml probówki zawierającej zawiesinę jednokomórkową na płytkę 12 500 komórek na basenie na 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem o bardzo niskim nasadce w 100 μl pożywki różnicującej etapu 1.
    UWAGA: Pod mikroskopem komórki pojawią się jako zawiesina jednokomórkowa z komórkami rozproszonymi w całej studzience.
  9. Odwirować 96-dołkowe płytki przez 3 minuty przy 100 x g. Po odwirowaniu komórki powinny zacząć przypominać sferoidy, gdy są oglądane pod mikroskopem. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 24 godziny.
  10. Zmień połowę pożywki w dniu 1 i dniu 2 za pomocą pożywki różnicującej etapu 1. Aby zwiększyć wydajność, za pomocą pipety wielokanałowej należy przelać 50 μl zużytego podłoża różnicującego etapu 1 na płytkę Petriego.
  11. Po wyrzuceniu pożywki z płytki 96-dołkowej sprawdź, czy pod mikroskopem stereoskopowym nie ma EB, które mogły zostać przypadkowo usunięte. Przenieś przypadkowo usunięte EB na płytkę 96-dołkową za pomocą pipety P1000 z końcówkami o szerokim otworze.
  12. Dodać 50 μl świeżej pożywki różnicującej etapu 1 do każdego dołka 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem o bardzo niskim nasadce za pomocą pipety wielokanałowej.

5. Różnicowanie układu krwiotwórczego

  1. Na dzień przed rozpoczęciem różnicowania układu krwiotwórczego należy pokryć studzienkę 6-dołkowej płytki 1 ml ekstraktu z błony podstawowej o stężeniu 200-300 μg/ml. Umieścić płytkę studzienkową w temperaturze 4 °C na noc.
    UWAGA: Każdy odwiert otrzyma 8 EB w późniejszym momencie tego protokołu. W zależności od liczby przygotowanych EB należy odpowiednio pokryć studzienki.
  2. Odessać nadmiar podstawowego ekstraktu błonowego i wstępnie napełnić studzienki 6-dołkowej płytką 3 ml pożywki różnicującej etapu 2, składającej się z hematopoetycznego podłoża podstawowego, do którego dodaje się 2 mM ultraglutaminy, 55 μM 2-merkaptoetanolu, 25 ng/ml ludzkiej interleukiny 3 (hIL-3) i 100 ng/ml ludzkiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (hM-CSF).
  3. Używając P1000 z końcówkami o szerokim otworze, przenieś 8 EB do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Po przeniesieniu potwierdzić na oko lub pod mikroskopem stereoskopowym, że w każdym dołku znajduje się 8 EB.
    UWAGA: Po 1 dniu pływające EB przylgną do dna studni. W ciągu kolejnych 5-7 dni powinna stać się widoczna pływająca populacja komórek składająca się z komórek krwiotwórczych. Okres różnicowania układu krwiotwórczego może być zróżnicowany, począwszy od 7 dni. Różnicowanie przez 10 dni wykazało populację krwiotwórczą składającą się z dużych subpopulacji CD45+, CD14+ i CD11b+.
  4. Po 5 dniach leczenia pożywką różnicującą etapu 2 należy przeprowadzić zmianę pożywki, usuwając zużyte podłoże i dozując je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pipetować powoli, starając się usunąć jak najmniej pływających komórek i utrzymać naprężenia ścinające na jak najniższym poziomie. Pipetowanie pod mikroskopem stereoskopowym może pomóc uniknąć przypadkowego usunięcia komórek.
  5. Natychmiast dodać 1 ml świeżej pożywki różnicującej etapu 2 do studzienek. W celu odzyskania pływających komórek krwiotwórczych, które mogą być już obecne na tym etapie procesu różnicowania, nie należy wyrzucać dozowanej pożywki. Zamiast tego należy wirować probówkę ze zużytym podłożem o stężeniu 300 x g przez 5 minut i odessać supernatant.
  6. Dodać świeżą pożywkę różnicującą etapu 2 do probówki i zawiesić ponownie w celu odłączenia komórek, które mogły zostać przeniesione ze zużytą pożywką.
  7. Dodaj 2 ml świeżej pożywki różnicującej etapu 2 z odzyskanymi komórkami do każdej studzienki, która została wcześniej wypełniona 1 ml pożywki różnicującej etapu 2.
  8. W 10 dniu różnicowania układu krwiotwórczego sprawdź, czy nie ma dużej liczby pływających komórek krwiotwórczych. Zbierz je, zbierając je do probówki o pojemności 50 ml. Można je zamrozić z powrotem w 10% DMSO, 50% FBS i 40% pożywce lub natychmiast użyć do różnicowania komórek w OC.

6. Dojrzewanie M-CSF i różnicowanie OC

  1. Komórki nasienne w stężeniu 200 000 komórek/cm2 na kulturze tkankowej dobrze potraktowane płytki i potraktowane alfa-MEM, uzupełnione 10% FBS i 50 ng / ml hM-CSF.
  2. Aby przeprowadzić testy funkcjonalne lub obrazowanie, należy odłączyć dojrzałe komórki M-CSF 3 dni po wysiewie, przemłukując wstępnie podgrzanym PBS do temperatury 37 °C za pomocą P1000 z końcówką o szerokim otworze. Do całkowitego odłączenia komórek może być konieczne powtarzanie etapów mycia.
  3. Przenieść oderwane komórki do probówki o pojemności 15 ml za pomocą P1000 z końcówką o szerokim otworze i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
  4. Ponownie zawiesić i rozpuścić osad komórkowy za pomocą pożywki różnicującej OC, składającej się z alfa-MEM uzupełnionego 10% FBS, 50 ng / ml hM-CSF i 80 ng / ml hRANKL. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego urządzenia do liczenia komórek i ponownie zasiaj dojrzałe komórki M-CSF o gęstości 200,00-250,000 komórek/cm2 w odpowiednim roztworze hodowlanym do testów funkcjonalnych lub obrazowania (tj. Testy resorpcji kości, szkiełka nakrywkowe do obrazowania itp.).
  5. Różnicuj za pomocą pożywki różnicującej OC przez 7-9 dni. Co 2-3 dni należy wykonywać pełną wymianę pożywki studzienkowej ze świeżą pożywką różnicującą OC.
    UWAGA: Wielojądrowe OC pojawiają się zwykle po 5-7 dniach.

Wyniki

Monitorowanie morfologii komórek w przebiegu procesu różnicowania
Wszystkie opisane poniżej wyniki uzyskano przy użyciu linii iPSC MCND-TENS2 do różnicowania w komórki OC. Ta linia iPSC była wcześniej wykorzystywana w kilku badaniach32,33. Niemniej jednak, inne linie iPSC zostały również z powodzeniem zastosowane w tym protokole różnicowania.

Regularna ocena wizualna ujawnia odmienne i wyraźne cechy morfologiczne iPSC w całym procesie różnicowania do OCs (Rysunek 2). Kolonie iPSC (Rysunek 2A) zostały rozdzielone do zawiesiny pojedynczych komórek, która przed wirowaniem przejawia się jako poszczególne komórki w płytce z dołkami o okrągłym dnie (Rysunek 2B). Po wirowaniu (krok 4.9 w protokole) komórki zbiorą się w centrum płytki o okrągłym dnie o ultra-niskiej adhezji i następnie utworzą sfery (ciała embrionalne, EBs, Rysunek 2C). EBs zwiększą swoją wielkość dwu- lub trzykrotnie w procesie różnicowania mezodermalnego (Rysunek 2D) i staną się łatwo widoczne gołym okiem pod koniec 4-dniowego okresu różnicowania (Rysunek 2E). Po przeniesieniu do dołków płytki 6-dołkowej w celu różnicowania hematopoetycznego można zaobserwować przyleganie i zlewanie się EBs z dnem płytki (Rysunek 2F, krok 5.3 w protokole). Po 7-8 dniach w pożywce hodowlanej stają się widoczne duże ilości pływających komórek hematopoetycznych (Rysunek 2G). Po zbiorze i ponownym wysianiu komórek hematopoetycznych następuje faza dojrzewania z zastosowaniem M-CSF i rozpoczyna się różnicowanie do OC (krok 6.4 w protokole). W ciągu 5-6 dni po raz pierwszy pojawiają się komórki wielojądrowe z dużym, przezroczystym ciałem komórkowym (Rysunek 2H). Na tym etapie wciąż widoczna jest duża liczba komórek jednojądrowych. Po kolejnych 2-3 dniach różnicowania do OC, komórki OC będą dalej zlewać się z sąsiednimi komórkami, tworząc duże polikariony z jeszcze większą liczbą jąder (Rysunek 2I).

Ocena populacji krwiotwórczej pochodzącej z ciał embroidalnych (EB)
Różnicowanie krwiotwórcze może być prowadzone przez zmienny okres czasu. W literaturze opisano okresy trwające od 7 dni do 9 tygodni. W niniejszym protokole różnicowanie krwiotwórcze przeprowadza się przez okres 10 dni. Stwierdzono, że 10 dni różnicowania krwiotwórczego pozwoliło uzyskać niską liczbę wczesnych progenitorów CD34+ (0,53%, Ryc. 3A) oraz większą liczbę progenitorów krwiotwórczych CD43+ (48,5%, Ryc. 3B) na etapie pośrednim. Co ważniejsze, po 10-dniowym okresie inkubacji wygenerowano wystarczające ilości HPC CD45+ (96,2%, Ryc. 3C), CD14+ (33%, Ryc. 3D) i CD11b+ (35,9%, Ryc. 3E), aby móc je dalej różnicować w osteoklasty (OC). Niemniej jednak okres traktowania cytokinami w celu różnicowania krwiotwórczego (krok 5.4 protokołu) może wymagać korekty i optymalizacji w zależności od linii iPSC, aby uzyskać odpowiednią liczbę komórek CD45+, CD14+ i CD11b+.

Średnio, po 10 dniach różnicowania, z każdej studzienki zawierającej 8 EB zebrano 6 milionów komórek krwiotwórczych.

Ocena morfologii i aktywności OC
Po różnicowaniu OC można ocenić morfologicznie i funkcjonalnie. Prekursory OC są ponownie wysiewane na szkiełka z komorami lub szkiełka podstawowe po etapie dojrzewania z użyciem M-CSF, aby poprawić jakość obrazu podczas barwienia na TRAP lub katepsynę K. Enzymatyczne barwienie na TRAP po różnicowaniu OC wykazuje duże, wielojądrowe, TRAP-dodatnie OC (Rysunek 4A). Dodatkowo, pomiędzy wielojądrowymi OC można zaobserwować słabo TRAP-dodatnie komórki jednojądrowe. Kontrole negatywne bez dodatku RANKL nie wykazują stopionych, wielojądrowych OC. Niemniej jednak, można dostrzec niewielką liczbę słabo TRAP-dodatnich komórek jednojądrowych (Rysunek 4B).

Obrazy z konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (CLSM) przedstawiają osteoklasty (OCs) barwione na katepsynę K (turkusowy) i F-aktynę (czerwony) wraz z barwieniem jądrowym DAPI (niebieski) (Rysunek 4C, 4D). Po zastosowaniu RANKL zgodnie z protokołem widoczne są duże wielojądrowe osteoklasty, charakteryzujące się rozbudowaną strukturą cytoszkieletu F-aktynowego oraz dodatnim barwieniem na katepsynę K (Rysunek 4C). W kontrolach negatywnych, bez dodatku RANKL, nie obserwuje się zfuzowanych komórek wielojądrowych.

Aktywność funkcjonalną osteoklastów (OC) można dodatkowo ocenić poprzez pomiar aktywności resorpcyjnej. Do określenia aktywności resorpcyjnej można zastosować testy resorpcji kości lub minerałów. W tym przypadku prekursory OC wysiano do studzienek pokrytych fosforanem wapnia i poddano terminalnemu różnicowaniu. Obszary, w których nastąpiła resorpcja powłoki mineralnej, są widoczne w kolorze niebiesko-szarym (Rycina 4E). Można zidentyfikować dołki resorpcyjne o różnych rozmiarach. Pozostała, nieresorbowana powłoka fosforanu wapnia jest widoczna w kolorze brązowym. Obecność dołków resorpcyjnych potwierdza tożsamość zróżnicowanych komórek wielojądrowych jako OC. Ponadto dołki resorpcyjne można poddać ilościowej ocenie w celu analizy i porównania aktywności resorpcyjnej. Całkowity obszar zresorbowanego minerału w stosunku do całkowitej powierzchni studzienki można określić jako wartość procentową. Dodatkowo można zmierzyć rozmiar i liczbę dołków resorpcyjnych. Nieleczone kontrole negatywne nie wykazały obecności dołków resorpcyjnych (Rycina 4F).

Schemat różnicowania iPSC; przebieg procesu rozwoju komórek hematopoetycznych i osteoklastów.
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja procesu różnicowania osteoklastów z ludzkich iPSC. Ilustracja wykonana przez Hannah Blümke przy użyciu Affinity Designer 2.1.1. Ilustracja wykorzystuje rysunki użyte wcześniej33. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Sekwencja wzrostu hodowli komórkowej; obrazy mikroskopowe przedstawiające etapy agregacji komórek i zmiany morfologiczne.
Rycina 2: Obrazy mikroskopowe z całego procesu różnicowania ludzkich iPSC w osteoklasty. (A) Niezróżnicowane kolonie iPSC podczas propagacji. (B) iPSC w dołkach o okrągłym dnie po dysocjacji do zawiesiny pojedynczych komórek przed wirowaniem. (C) Pojedyncze komórki iPSC zebrane w centrum po wirowaniu. (D) Ciałka zarodkowe (EBs) zwiększają swoją wielkość podczas 4-dniowego okresu różnicowania mezodermalnego. (E) Widoczne ciałka zarodkowe po różnicowaniu mezodermalnym. (F) Po przeniesieniu ciałek zarodkowych na płytki 6-dołkowe pokryte ekstraktem z błony podstawnej, widoczne jest ich przyleganie i fuzja z dnem dołka. (G) Po 5–7 dniach różnicowania hematopoetycznego w medium można zaobserwować dużą liczbę pływających komórek hematopoetycznych. (H) Po dojrzewaniu w obecności M-CSF, pierwsze osteoklasty z 3–4 jądrami pojawiają się po 5–7 dniach różnicowania z RANKL. (I) Pod koniec różnicowania osteoklastów można zaobserwować duże komórki wielojądrowe. Paski skali: A, D, F, G = 200 µm, B, C, H, I = 50 µm, E = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy cytometrii przepływowej wykazujące ekspresję markerów CD (CD34, CD43, CD45, CD14, CD11b).
Rycina 3: Analiza markerów powierzchniowych komórek krwi pochodzących z ciał embrionalnych za pomocą cytometrii przepływowej. Ekspresja markerów umożliwia analizę komórek krwi i identyfikację subpopulacji po bramkowaniu singletów i żywych komórek. (A) Populacja wczesnych ontogenetycznie progenitorów krwi CD34+ jest bardzo mała lub nieobecna przy zastosowaniu tego protokołu. (B) Komórki CD43+ stanowią około 50% całej populacji. (C) Progenitory krwi CD45+ na późniejszym etapie stanowią największą część populacji krwiotwórczej, wynosząc 96,2%. (D, E) Bezpośrednie prekursory OC CD14+ i CD11b+ stanowią odpowiednio 33% i 36%. Na czerwono: niebarwiona kontrola negatywna, na niebiesko: kontrole izotypowe, na żółto: komórki zabarwione przeciwciałem do odpowiedniego markera. Wykresy wykorzystują wcześniej opublikowane dane33. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia leczenia RANKL M-CSF; powstawanie osteoklastów, analiza fluorescencyjna, morfologia komórek.
Rycina 4: Ocena morfologiczna i funkcjonalna ludzkich osteoklastów zróżnicowanych z iPSC. (A) Barwienie TRAP po zróżnicowaniu osteoklastów wykazuje duże, wielojądrowe, TRAP-dodatnie osteoklasty. Między wielojądrowe osteoklasty wplecione są słabo TRAP-dodatnie komórki jednojądrowe. (B) Kontrole negatywne bez dodatku RANKL, barwione na TRAP, nie wykazują zfuzowanych wielojądrowych osteoklastów. Niemniej jednak można zaobserwować niewielką liczbę słabo TRAP-dodatnich komórek jednojądrowych. (C) Obrazy z konfokalnej mikroskopii laserowej skaningowej komórek hematopoetycznych zróżnicowanych w osteoklasty na szkiełku przedmiotowym, barwione na F-aktynę (czerwony) i katepsynę K (turkusowy) w połączeniu z barwieniem jąder DAPI (niebieski), wykazują duże wielojądrowe osteoklasty dodatnie pod kątem katepsyny K. (D) Kontrole negatywne bez dodatku RANKL wykazują komórki jednojądrowe podobne do tych w (B) przy niższej gęstości komórek. (E) Ocenę funkcjonalną można przeprowadzić poprzez analizę aktywności resorpcyjnej osteoklastów. W tym celu zróżnicowanie osteoklastów przeprowadza się w teście resorpcji kości lub minerałów. Obrazy z mozaiki studzienek uzyskane za pomocą odwróconego mikroskopu szerokopolowego w trybie kontrastu fazowego przedstawiają duże obszary resorpcji warstwy mineralnej fosforanu wapnia. Aktywność resorpcyjna może być dodatkowo ilościowo określona poprzez pomiar powierzchni resorpcji w stosunku do powierzchni całkowitej. (F) Kontrole negatywne bez dodatku RANKL nie wykazują obszarów resorpcyjnych. Paski skali: A, B = 100 µm, C, D = 50 µm, E, F = 1 mm. Obrazy zostały opracowane na podstawie wcześniej opublikowanych danych33. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół ten oferuje niezawodną i solidną metodę różnicowania iPSC na OC. Niemniej jednak istnieje kilka pułapek, które można napotkać w całym procesie różnicowania. Ludzkie linie iPSC wygenerowane z komórek o różnym pochodzeniu tkankowym zostały z powodzeniem zróżnicowane przy użyciu tego protokołu33. W przypadku ponownego zamrażania iPSC (patrz krok protokołu "3. Zamrażanie z powrotem iPSC"), jedna studzienka w punkcie pasażowania została zamrożona z powrotem w jednym kriowiale. Podczas rozmrażania (patrz krok protokołu "1. Rozmrażanie i rozmnażanie ludzkich iPSC"), jeden kriowial rozmrażono w pojedynczym dołku na 6-dołkowej płytce. Różne linie iPSC będą zachowywać się nieco inaczej, a tempo proliferacji będzie się różnić. Współczynnik podziału będzie musiał zostać odpowiednio dostosowany.

Podczas pasażowania iPSC lub dysocjacji iPSC do zawiesiny pojedynczej komórki w celu indukcji EB ważne jest, aby usunąć wszelkie spontanicznie zróżnicowane kolonie lub agregaty martwych komórek, aby poprawić skuteczność i wydajność różnicowania mezodermalnego i krwiotwórczego. Można to zrobić pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą skrobaka do komórek, końcówek do pipet z pipety P10 lub P20 lub narzędzia do skrobania zbudowanego z pipety Pasteura35.

Jak wspomniano powyżej, protokół ten obejmuje dysocjację kolonii iPSC w zawiesinę jednokomórkową w celu indukcji EB, podczas gdy w przypadku innych protokołów iPSC pozostawia się jako agregaty do odwirowania w celu indukcji EB36. Doniesiono, że rozmiar, liczba komórek, kształt i morfologia EB wpływają na różnicowanie 37,38,39. W związku z tym stawiamy hipotezę, że dysocjacja do zawiesiny jednokomórkowej pozwala na lepszą jednorodność EB do EB pod względem wielkości i kształtu po odwirowaniu, a tym samym bardziej spójne wyniki produkcji komórek krwiotwórczych31.

Opisano inne metody indukcji EB. Doniesiono, że takie metody, które wykorzystują zawiesinę pojedynczej komórki w połączeniu z inhibitorem ROCK w celu poprawy przeżycia komórek, są korzystne w kontrolowaniu wielkości EB i wyniku różnicowania31.

Opisana w niniejszym protokole metoda indukcji EB na 96-dołkowej płytce okrągło-dołkowej jest odpowiednia do produkcji EB na dużą skalę i pozwala na zwiększenie skali produkcji OC. Niedawno opisano bardziej nowatorskie metody różnicowania układu krwiotwórczego bez etapu indukcji ciała zarodkowego, które mogą ułatwić proces różnicowania32. Niemniej jednak protokoły te nie zostały jeszcze ustalone dla różnicowania OC33.

W wyżej wymienionym protokole opisujemy zmianę pożywki w 5. dniu różnicowania układu krwiotwórczego. Niewielka liczba pływających komórek może pojawić się już około 4-5 dnia różnicowania. Aby uniknąć wyrzucenia jakichkolwiek pływających komórek, pożywkę należy zebrać do probówki i odwirować przed wyrzuceniem. Osad komórkowy na dnie probówki musi następnie zostać usunięty ze świeżą pożywką i powinien zostać przeniesiony z powrotem do studzienek na płytce 6-dołkowej. Znaczenie wczesnej populacji komórek pływających w różnicowaniu OC nadal wymaga jednak ustalenia.

Produkcję komórek krwiotwórczych można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej. Wysoka wydajność komórek CD45 +, CD14 + i CD11b + jest pożądana dla różnicowania osteoklastów33. Doniesiono, że kriokonserwacja pobranych pływających komórek krwiotwórczych jest trudna ze względu na ogólnie ograniczone wskaźniki odzysku i niską żywotność komórek40,41. Poprzez krioprezerwację komórek krwiotwórczych w pożywce do kriokonserwacji składającej się w 50% z pożywki do eksplandowania komórek krwiotwórczych bez surowicy (patrz tabela materiałów), 40% FBS i 10% DMSO, byliśmy w stanie odzyskać komórki o żywotności komórek około 90,3% ± 2,62 SD (n = 7) po rozmrożeniu.

Osteoklastogeneza wymaga fuzji wielu monojądrowych prekursorów OC w celu wytworzenia wielojądrowych osteoklastów, które są zdolne do resorpcji minerałów i kości. Podczas gdy mysie linie komórkowe prekursorowe OC po prostu potrzebują dodania RANKL do indukowania tworzenia OC42, ludzkie prekursory wymagają dodatkowego M-CSF do przeżycia i proliferacji komórek43. OSCAR został niedawno odkryty jako dodatkowy receptor zaangażowany w różnicowanie OC, mimo że do tej pory tylko kolagen typu I został zidentyfikowany jako ligand. Podczas gdy badania OSCAR z OC pochodzącymi z iPSC są nadal ograniczone, suprafizjologiczne stężenia RANKL i M-CSF in vitro w mysiej linii komórkowej wydają się omijać konieczność aktywacji OSCAR44, aktywacja OSCAR in vivo wydaje się być niezbędnym sygnałem kostymulującym dla osteoklastogenezy45. Dodatkowym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest powierzchnia płytki studziennej. Wiadomo, że chemiczne właściwości powierzchni46 i fizyczne47 wpływają na różnicowanie osteoklastów i mogą sprzyjać lub utrudniać pomyślne różnicowanie. Pewna heterogeniczność w populacji prekursorów wydaje się również kluczowa dla udanej fuzji OC, ponieważ różne czynniki związane z fuzją, takie jak CD47 i DC-STAMP, działają na różnych etapach fuzji osteoklastów48.

Podsumowując, protokół ten umożliwia odróżnienie OC u ludzi od iPSC w celu ułatwienia i przyspieszenia badań nad OC.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratorium Giachelli za ich pomoc techniczną i wsparcie. Dziękujemy Centrum Mikroskopii im. W. M. Kecka i kierownikowi Centrum Keck, dr Nathanialowi Petersowi, za pomoc w uzyskaniu obrazów mikroskopii konfokalnej i mikroskopii szerokokątnej. Dziękujemy również UW Flow Core Facility oraz kierownikowi Flow Core Facility, Aurelio Silvestronie, za wsparcie techniczne i pomoc. Na koniec dziękujemy Hannah Blümke za wsparcie w zakresie ilustracji i projektowania graficznego.

Finansowanie zapewniono dzięki grantowi National Institutes of Health R35 HL139602-01. Uznajemy również grant NIH S10 S10 OD016240 na finansowanie instrumentu w Centrum W. M. Keck, a także grant NIH 1S10OD024979-01A1 na finansowanie instrumentów w UW Flow Core Facility.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało 2-merkaptoetanoloweSigma AldrichM6250-10ML
- Anty-Katepsyna K Przeciwciało Abcamab19027
- Przeciwciało anty-ludzkie CD45555485
APC - IgG1 myszy sprzężone z APC, κ Przeciwciało 555751 kontrolneizotypu
sprzężone z BV711
- koniugaty BV711 Mysie IgG2b, κ Isotype ControlBD563125
Przeciwciało - Kozia Anty-Królicza IgG H& L Alexa Fluor® 647Przeciwciało Abcamab150079
- anty-ludzkie CD14 sprzężone z PER& D SystemsFAB3832P-025
Przeciwciało - Anty-ludzka integryna alfa M/CD11b sprzężona z PER& Przeciwciało D SystemsFAB16991P-025
- Przeciwciało anty-ludzkie CD34BD560710
PE-Cy7 - IgG1 i kappa myszy sprzężone z PE-Cy7; Przeciwciało kontrolneBD557872
- PE / cyjanina sprzężona z anty-ludzkim CD11b301308
PE / cyjanina 5 sprzężona z mysią IgG1 i kappa; Isotype CtrlBiolegend400118
Przeciwciało - PerCP-Cy5.5-sprzężone z Myszą IgG1 κ Przeciwciało Isotype ControlBD550795
BD563521sprzężony z PerCpCy5.5
CosmoBioUSACSR-BRA-24KIT
Automatyczny licznik komórek Countess 3ThermoFisher16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Ekstrakt z błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostuR& D Sytems3434-010-02Podstawowy ekstrakt membranowy
DAPIR& D Systems5748/10
Dispaza (5 U/ml)STEMCELL Technologies7913
DMEM/F-12 z komórką macierzystą 15 mM HEPES36254
DMSOSigma AldrichD2650
DPBSSigma AldrichD8537-500ML
Białko morfogenetyczne ludzkiej kości 4 (hBMP4)STEMCELL Technologies78211
Ludzka IL-3STEMCELL Technologies78146.1
Ludzki czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (hM-CSF)STEMCELL Technologies78150.1
Ludzki rozpuszczalny receptor aktywujący czynnik jądrowy-κ B Ligand (hsRANKL)STEMCELL Technologies78214.1
Czynnik ludzkich komórek macierzystych (hSCF)STEMCELL Technologies78155.1
Ludzki TruStain FcX (roztwór blokujący receptor Fc)Biolegend422301
Ludzki czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego-165 (hVEGF165)STEMCELL Technologies78073
Invitrogen Rodamina falloidynaInvitrogenR415
MEM α, nukleozydy, bez czerwieni fenolowejThermoFisher41061029
mFreSRSTEMCELL Technologies05855Pożywka do kriokonserwacji bez surowicy
mTeSR Plus STEMCELLTechnologies100-0276Pożywka wolna od ludzkiej iPSC (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, poddana działaniu nunclon Sphera, dno w kształcie litery U MicroplateThermo Scientific174925Okrągłodenna, ultra-niska płytka 96-dołkowa
P1000 Końcówki o szerokim otworzeThermoFisher2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632STEMCELL Technologies72304
StemSpan SFEMStemCell09650Pożywka do hodowli komórek krwiotwórczych
TrypLE Select Enzyme (1X), bez czerwieni fenolowejThermo Fisher12563011Odczynnik do dysocjacji pojedynczych komórek
UltraglutamineBioscience LonzaBE17-605E/U1
X-VIVO 15 Podłoże z komórek krwiotwórczych bez surowicyBioscience Lonza04-418QHematopoietic bazal medium
i mikro;-Slide 8 Well HighIbidi80806
BD sprzężone z - Przeciwciało anty-ludzkie CD14 BD 563372 sprzężone z Przeciwciało - - Zestaw do oznaczania resorpcji kości CD43

Bibliografia

  1. Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
  2. Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
  3. Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144(2021).
  4. Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895(2019).
  5. Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311(2017).
  6. Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
  7. Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465(2013).
  8. Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913(2022).
  9. Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060(2022).
  10. Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
  11. Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
  12. Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
  13. Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
  14. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  15. Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
  16. Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35(2015).
  17. Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
  18. Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
  19. Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871(2009).
  20. Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337(2005).
  21. Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402(2016).
  22. Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698(2023).
  23. Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
  24. Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23(2014).
  25. Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
  26. Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
  27. Chen, I. -P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
  28. Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  29. Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
  30. Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
  31. Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595(2015).
  32. Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600(2019).
  33. Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319(2023).
  34. Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087(2022).
  35. Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
  36. Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
  37. Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
  38. Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
  39. Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
  40. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038(2020).
  41. Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282(2019).
  42. Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631(2022).
  43. Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
  44. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201(2002).
  45. Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162(2021).
  46. Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109(2017).
  47. Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
  48. Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73(2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Różnicowanie osteoklastówludzkie iPSCindukcja ciał embrionalnychróżnicowanie hematopoetycznedojrzewanie M-CSFbarwienie TRAPbarwienie katepsyną Ktest resorpcji kościcytometria przepływowawielojądrowe osteoklasty
Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.