Artykuł metodologiczny

Rozszerzona 78% hepatektomia w mysim modelu chirurgicznym

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66528

⸱

24 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Vascular and Endovascular Surgery and the Center for Vascular Biology Research, Department of Surgery, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School, 2The Transplant Institute and the Division of Nephrology, Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Mysi model częściowej 2/3 (66%) hepatektomii jest dobrze opisany w literaturze, ale rzadko stosowano bardziej rozbudowane hepatektomie naśladujące zespół małego dla rozmiaru po przeszczepie wątroby. Opisujemy rozszerzoną 78% procedurę hepatektomii w modelu mysim, która powoduje około 50% śmiertelności pooperacyjnej u zdrowych myszy.

Streszczenie

Częściowa hepatektomia 2/3 u myszy jest wykorzystywana w badaniach nad zdolnością regeneracyjną wątroby i badaniem wyników resekcji wątroby w wielu modelach chorobowych. W klasycznej częściowej hepatektomii 2/3 u myszy dwa z pięciu płatów wątroby, a mianowicie lewy i środkowy płat reprezentujący około 66% masy wątroby, są wycinane en bloc z oczekiwanym przeżyciem pooperacyjnym wynoszącym 100%. Bardziej agresywne częściowe hepatektomie są technicznie trudniejsze i dlatego rzadko są stosowane u myszy. Nasza grupa opracowała mysi model techniki rozszerzonej hepatektomii, w której trzy z pięciu płatów wątroby, w tym lewy, środkowy i prawy górny płat, są wycinane oddzielnie w celu usunięcia około 78% całkowitej masy wątroby. Ta przedłużona resekcja u zdrowych myszy pozostawia resztki wątroby, która nie zawsze jest w stanie utrzymać odpowiednią i terminową regenerację. Brak regeneracji ostatecznie skutkuje 50% śmiertelnością pooperacyjną w ciągu 1 tygodnia z powodu piorunującej niewydolności wątroby. Ta procedura rozszerzonej 78% hepatektomii u myszy stanowi unikalny model chirurgiczny do badania zespołu małego dla rozmiaru i oceny strategii terapeutycznych w celu poprawy regeneracji wątroby i wyników w warunkach przeszczepu wątroby lub rozszerzonej resekcji wątroby w przypadku raka.

Wprowadzenie

Modele chirurgicznej resekcji wątroby u myszy i szczurów, po raz pierwszy opisane w 1931 roku, są najczęstszymi modelami eksperymentalnymi wykorzystywanymi do badania molekularnych podstaw regeneracji wątroby. Mogą być również przydatne w translacyjnych badaniach naukowych w celu testowania i opracowywania strategii poprawy wyników po rozszerzonej resekcji wątroby lub przeszczepie nieoptymalnych przeszczepów wątroby1,2,3,4. Częściowa hepatektomia (PH) u myszy polega na usunięciu około 2/3 (66%) całkowitej masy wątroby (TLM), co w przypadku przeprowadzenia u zdrowych zwierząt daje wyjątkowe wyniki5. Procedura jest krótkotrwała, łatwa do odtworzenia ze względu na niewielkie różnice w anatomii wątroby myszy, a przeżycie pooperacyjne zwykle zbliża się do 100%1.

Częściowa hepatektomia 2/3 obejmująca resekcję lewego płata (LL) i środkowego płata (ML) pozwala na regenerację pozostałych płatów względnie bez przeszkód spowodowanych zapaleniem płata lub ograniczeniem dopływu i odpływu wątroby. Zwiększony przepływ żylny wrotnej, a następnie naprężenie ścinające sinusoidalne komórki śródbłonka wątroby po PH powodują trwałą regulację w górę ekspresji śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS), a następnie uwalnianie tlenku azotu (NO), co przyczynia się do pobudzania hepatocytów do proliferacji i regeneracji wątroby3. Wyniki powszechnie badane po 2/3 PH w modelach chorób, takich jak niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby lub w określonym tle genetycznym, obejmują ryzyko ostrej niewydolności wątroby, jakościowe i ilościowe pomiary zdolności regeneracyjnych wątroby oraz inne reakcje biologiczne na stres lub uraz1,3.

Jednak mysi model naśladujący funkcjonalny lub anatomiczny zespół małych dla dużych rozmiarów, jaki występuje po rozszerzonej resekcji wątroby z powodu raka lub przeszczepie marginalnych (stłuszczenie lub przedłużony czas niedokrwienia) lub częściowych (podzielonych lub z wątroby żywego dawcy) przeszczepów wątroby, pozostaje do ugruntowania. Aby zaspokoić tę potrzebę, potrzebne są modele bardziej rozległych resekcji wątroby, które wykraczają poza utrzymanie minimalnej (i funkcjonalnej) masy wątroby, do modelowania zespołu wątroby o małej wielkości i zwiększonej śmiertelności, która jest związana z tym zespołem6,7.

Anatomia wątroby myszy wykazuje minimalne różnice. Wątroba myszy składa się z pięciu płatów, z których każdy stanowi następujący procent całkowitej masy wątroby: płat lewy (LL; 34,4 ± 1,9%), płat środkowy (ML; 26,2 ± 1,9%), prawy górny (zwany również prawym górnym) płat (RUL; 16,6 ± 1,4%), prawy dolny (zwany również prawym dolnym) płat (RLL; 14,7 ± 1,4%) i płat ogoniasty (CL, 8.1 ± 1.0%)1,5. Każdy płat jest zaopatrywany przez triadę wrotną, w tym gałąź tętnicy wątrobowej, gałąź żyły wrotnej i przewód żółciowy5. Historycznie opisano kilka technik wykonywania 2/3 PH poprzez resekcję LL i ML. Należą do nich: 1) technika klasyczna, która składa się z pojedynczej ligatury en bloc u podstawy każdego z wyciętych płatów; 2) technika klipsa hemostatycznego, wykorzystująca klipsy tytanowe nakładane u podstawy wyciętych płatów; 3) technikę oszczędzania miąższu zorientowaną na naczynie, polegającą na zakładaniu szwów kłujących proksymalnie do klamry; oraz 4) technika mikrochirurgiczna zorientowana na naczynia, w której żyła wrotna i gałęzie tętnicy wątrobowej są podwiązywane przed resekcją płata1. Chociaż każda technika ma względne mocne i słabe strony, żadna z nich nie zapewnia większej śmiertelności1,8,9.

W tym badaniu prezentujemy nowatorską metodę na rozszerzone 78% pH u myszy. W tym modelu trzy z pięciu płatów wątroby, w tym LL, ML i RUL, są usuwane oddzielnie przy użyciu techniki ligaturowej (Rysunek 1). Zabieg ten prowadzi do resekcji około 78% (77,2 ± 5,2%) całkowitej masy wątroby. Nasz wybór usunięcia LL i ML osobno, a nie "en bloc", jak w klasycznej technice PH, minimalizuje powikłania związane z resekcją en bloc tych dwóch płatów, takie jak zwężenie żyły głównej nadwątrobowej i zwiększone ryzyko martwicy pozostałych płatów, gdy pojedyncza ligatura jest stosowana zbyt blisko żyły głównej1, 10,11,12,13,14. Ma to kluczowe znaczenie przed przejściem do ostatniego kroku tej procedury, aby usunąć RUL. Ta rozległa hepatektomia u myszy C57BL/6 typu dzikiego w wieku 8-12 tygodni powoduje 50% śmiertelność w ciągu 1 tygodnia od operacji z powodu nieudanej regeneracji wątroby powodującej piorunującą niewydolność wątroby15,16. Ten mysi model zwiększonej śmiertelności po rozszerzonej hepatektomii o sile 78% odpowiednio podsumowuje patofizjologię zespołu małego dla rozmiaru i umożliwia opracowanie i przetestowanie nowych strategii w celu poprawy wyników.

Protokół

Metody opisane w tym protokole procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Beth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC). Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IACUC i ośrodka badawczego BIDMC.

1. Przygotowanie przedoperacyjne myszy

  1. Ogol brzuch myszy od połowy mostka do okolicy nadłonowej za pomocą maszynki do strzyżenia.
  2. Wywołaj znieczulenie ogólne za pomocą 1-4% izofluranu w 100% tlenu. Po znieczuleniu połóż mysz na wznak na polu operacyjnym z poduszką grzewczą pod spodem. Przed wykonaniem nacięcia mocno ściśnij palec u nogi, aby upewnić się, że nie ma odruchu pedałowania (jeśli jest obecny, zwierzę zareaguje). Dostosuj poziom znieczulenia zgodnie z potrzebami, aby osiągnąć stan znieczulenia ogólnego.
    UWAGA: Miareczkowanie izofluranu należy stosować w razie potrzeby, aby utrzymać odpowiednie znieczulenie ogólne.
  3. Podawać 1,2 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu (ER) podskórnie w celu znieczulenia pooperacyjnego. Ułóż mysz na wznak z wyprostowanymi kończynami przednimi i tylnymi i zabezpiecz kończyny taśmą; Następnie przygotuj sterylne pole do zabiegu.
    UWAGA: Upewnij się, że kończyny przednie są rozluźnione, gdy są zabezpieczone, aby oddychanie nie było utrudnione.
  4. Przygotuj jamę brzuszną za pomocą ciepłych sterylnych wacików z solą fizjologiczną i betadyną, naprzemiennie 3 razy między każdym wacikiem. Ułóż brzuch w sterylny sposób.

2. Hepatektomia

  1. Wykonaj pionowe nacięcie laparotomii w linii środkowej przez skórę od wyrostka mieczykowatego do okolicy nadłonowej za pomocą skalpela. Następnie naciąć linię białą ostrymi nożyczkami, aby wejść do jamy otrzewnej i przedłużyć to nacięcie na długość nacięcia skóry.
    UWAGA: Bezpieczniej jest najpierw naciąć linea alba w obszarze podmieczykowatym, gdzie wątroba znajduje się głęboko w ścianie brzucha, aby uniknąć uszkodzenia leżącego poniżej jelita.
  2. Cofnąć ścianę brzucha na boki za pomocą odpowiednich zwijaczy, a następnie zacisnąć wyrostek mieczykowaty hemostatem i cofnąć mostek wyżej, aby odsłonić wątrobę.
  3. Cofnij wątrobę niżej, aby odsłonić więzadło pospolite, a następnie przeciąć więzadło wzdłuż wątroby za pomocą ostrych nożyczek. Cofnij wątrobę wyżej w kierunku klatki piersiowej, aby odsłonić więzadło wątrobowo-żołądkowe i więzadła wewnątrzwątrobowe płata i przeciąć te struktury za pomocą ostrych mikronożyczek.
    UWAGA: Retrakcja powinna być wykonywana bardzo delikatnie za pomocą wilgotnych aplikatorów z bawełnianą końcówką, ponieważ wątroba, otoczona kapsułką Glissona, jest bardzo delikatna i łatwa do posiniaczenia i skaleczenia.
  4. Cofnij płat środkowy wyżej, utrzymując lewy płat w pierwotnej pozycji anatomicznej. Owiń jedwabny szew 5-0 wokół górno-środkowej części LL. Odbij LL wyżej w kierunku klatki piersiowej, aby odsłonić dolną powierzchnię płata, zbliż końce szwu u podstawy płata i zawiąż szew u podstawy. Upewnij się, że szew nie utrudnia przepływu krwi w żyle głównej dolnej (IVC) lub żyle wrotnej przed zawiązaniem szwu w celu podwiązania LL.
    UWAGA: Najlepiej jest zawiązać ten szew, gdy LL odbija się wyżej w kierunku klatki piersiowej, tak aby triada wrotna była dobrze odsłonięta podczas podwiązania. Ułatwia to resekcję płata w pobliżu podstawy bez naruszania sąsiednich struktur.
  5. Wytnij LL tuż dystalnie do opaski szwu za pomocą ostrych nożyczek i upewnij się, że mały mankiet tkanki (~ 2 mm) oddziela szew od krawędzi wyciętego płata. Potwierdź hemostazę.
  6. Odbić płat środkowy wyżej w kierunku klatki piersiowej, umieścić jedwabny szew 5-0 wokół podstawy ML i przywrócić ML do pierwotnej pozycji anatomicznej. Przybliż końce szwów nad podstawą górnej części ML i upewnij się, że zawiąż je u podstawy płata. Wyciąć podwiązany ML, pozostawiając mały mankiet z resztkami tkanki wokół opaski szwowej. Potwierdź hemostazę.
  7. Zmobilizuj wątrobę od prawej do lewej, aby odsłonić prawy górny i dolny płat i ostrożnie odzwierciedlić te płaty przyśrodkowo i dolnie. Owiń szew 5-0 na górno-przyśrodkowym aspekcie RUL, aby upewnić się, że szew otacza podstawę RUL, a następnie odbija RUL w kierunku klatki piersiowej. Owiń szew pod RUL i zawiąż końce blisko jego podstawy, a następnie wyciąć go, pozostawiając mały mankiet z resztkami tkanki wokół opaski do szwów.
    UWAGA: Wiązanie zbyt proksymalnie u podstawy RUL może upośledzać dopływ krwi do RLL, co może skutkować niedokrwieniem RLL i śmiercią myszy w ciągu 24 godzin po operacji. W przeciwieństwie do tego, wiązanie zbyt dystalnie od podstawy RUL zmniejsza ilość wyciętej masy wątroby, zwiększając w ten sposób wskaźniki przeżycia pooperacyjnego ponad to, czego się oczekuje.
  8. Przywróć pozostałą wątrobę do spoczynkowej pozycji anatomicznej i zapewnij hemostazę. W razie potrzeby należy uciskać gazą miejsca niewielkiego krwawienia na wyciętych brzegach wątroby.
  9. Zamknij ścianę brzucha w linii środkowej (warstwy powięzi i mięśni) za pomocą nici poliglaktynowej 5-0 w nieprzerwany sposób. Zamknij nacięcie skóry zszywkami lub szwami monofilamentowymi 5-0.
  10. Przerwij znieczulenie i monitoruj mysz, aż odzyska przytomność i będzie mogła normalnie się poruszać.

3. Opieka pooperacyjna

  1. Obserwuj mysz po operacji, aby zapewnić odpowiednią regenerację (tj. mysz jest przytomna, czujna i porusza się w klatce) i kontrolę bólu. Badaj mysz co 2 godziny do 6 godzin po zabiegu, a następnie codziennie.
    UWAGA: Oczekuje się, że po operacji mysz będzie poruszać się wolniej w klatce. Mysz powinna dojść do siebie w odizolowanej klatce od innych myszy i wrócić do towarzystwa innych myszy dopiero wtedy, gdy jest w pełni wyleczona.
  2. Podawać podgrzane normalne zastrzyki z soli fizjologicznej (0,1-1,0 ml, podskórnie lub dootrzewnowo), jeśli mysz stanie się hipowolemiczna z powodu niewyczuwalnego płynu lub nadmiernej utraty krwi po operacji.

Wyniki

Udana rozszerzona hepatektomia 78% powinna spowodować 50% śmiertelność w ciągu 1 tygodnia u zdrowych dorosłych myszy w wieku 8-12 tygodni16. Przy prawidłowym wykonaniu spodziewana jest minimalna utrata krwi. Utrzymujące się krwawienie resztkowe można kontrolować za pomocą ręcznego ucisku. Zgon okołooperacyjny w ciągu 24 godzin od operacji jest często spowodowany błędami technicznymi. Awarie techniczne obejmują nieumyślne uszkodzenie dużych naczyń krwionośnych powodujące trudny do opanowania krwotok śródoperacyjny; znaczny krwotok pooperacyjny, często spowodowany resztkowym krwawieniem z wyciętych brzegów wątroby; uszkodzenie otaczającej struktury, takie jak nieumyślne podwiązanie sąsiedniej triady wrotnej, żyły wrotnej lub IVC; niedokrwienie RLL wtórne do podwiązania RUL zbyt proksymalnie do podstawy płata; i powikłania po znieczuleniu ogólnym. Objawy niewydolności wątroby obejmują postępujący letarg, zlepianie się włosów, jadłowstręt i hipoglikemię, które często ujawniają się w ciągu 24 godzin od zabiegu.

Dwa oczekiwane wyniki po przedłużonej hepatektomii 78% to albo przeżycie, albo śmierć. W pierwszym scenariuszu mysz odpowiednio regeneruje się po operacji, wznawia normalną aktywność w ciągu 72 godzin i przeżywa dłużej niż 7 dni. Laparotomia wykonana 9-10 dni po operacji wykazuje pełne wyzdrowienie przedoperacyjnej masy wątroby4,16,17,18. Drugim wynikiem byłaby śmiertelność w ciągu 2-7 dni po operacji. Mysz może wykazywać początkowe oznaki powrotu do zdrowia w ciągu pierwszych 12 godzin po operacji, ale pogarsza się stosunkowo szybko po zabiegu z powodu rozwoju piorunującej niewydolności wątroby16. Mysz wykazuje oznaki stresu, utraty wagi i postępującego letargu aż do śmierci. Przykłady nieoczekiwanych wyników obejmują śmierć z powodu powikłań technicznych lub wskaźniki przeżycia myszy znacznie powyżej lub poniżej 50% po rozszerzonej hepatektomii o sile 78%.

Nasze laboratorium było pionierem tej rozszerzonej 78% hepatektomii i potwierdziło jej przydatność we wcześniejszym manuskrypcie pokazującym, że przedłużona 78% hepatektomia u 8-tygodniowych zdrowych myszy BALB/c skutkuje 50% śmiertelnością, która mogłaby zostać zniesiona, gdyby wątroba myszy została wstępnie zaprojektowana do ekspresji A20 (Tumor Necrosis Factor Inducible Protein 3 [TNFAIP3]), dostarczanej dożylnie za pomocą rekombinowanego adenowirusa16. W tym badaniu przeprowadzonym przez Longo i wsp., zdrowa mysz BALB/c przeszła hepatektomię z 78% procentowym udziałem 5 dni po podaniu rekombinowanego wektora adenowirusowego wykazującego ekspresję ludzkiego A20 (rAd.A20) lub kontrolnej β-galaktozydazy (rAd.βGal). Uwzględniono również dodatkową nieleczoną grupę kontrolną. Po 78% hepatektomii Longo i wsp. zaobserwowali, że 6 z 12 (50%) nieleczonych myszy przeżyło zabieg ( Ryc. 2) < klasa sup = "xref">16.

Dwa determinanty biegłości to 1) ograniczenie komplikacji technicznych, jak wymienione powyżej, z których głównym jest niedokrwienie RLL, powodujące przedwczesną śmierć, oraz 2) zapewnienie wystarczającej mobilizacji RUL, bez której nie można docenić pełnego rozmiaru RUL, a co za tym idzie, nie udaje się go prawidłowo zrekonstruować. Zmniejsza to ilość wyciętej masy wątroby, a tym samym poprawia ogólny wskaźnik przeżycia znacznie powyżej oczekiwanych 50%. W początkowym okresie szkolenia badacza/autora, 10 z 15 (67%) zdrowych dorosłych samców i samic myszy CD1 i C57BL/6 w wieku 11-21 tygodni przeżyło 1 tydzień po 78% hepatektomii (z wyłączeniem 3 zgonów technicznych) (Tabela 1)19,20,21. Dalsze szkolenie w kontekście doceniającego zrozumienia anatomii wątroby myszy w celu poprawy mobilizacji RUL i ułatwienia odpowiedniej resekcji, mierzonej za pomocą szacowanego procentu hepatektomii, było niezbędne do osiągnięcia oczekiwanego wskaźnika przeżycia na poziomie 50% po hepatektomii w 78%. Po tym, jak uznano, że biegłość techniczna została w pełni osiągnięta, 8 z 16 myszy (50%; z wyłączeniem 1 zgonu technicznego) przeżyło 1 tydzień po 78% hepatektomii.

Diagram anatomii wątroby szczura; chirurgiczne punkty podwiązania do eksperymentalnego usunięcia płata wątroby.
Rysunek 1: Umiejscowienie myszy po hepatektomii i anatomia wątroby. (Po lewej) Wizualna reprezentacja pozycji myszy do laparotomii i rozszerzonej hepatektomii 78%. Mysz jest przedstawiona na wznak z nacięciem laparotomii w linii środkowej. (Po prawej) Anatomia wątroby myszy przedstawiona od dołu z kolorowymi liniami wyznaczającymi miejsca resekcji. Lewy płat, środkowy płat i prawy górny płat są resekcjonowane w sposób sekwencyjny po podwiązaniu szwem u ich podstawy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

78% wykres przeżycia po hepatektomii; porównuje NI, rAd. A20, rAd. β-galonowe dni pooperacyjne.
Rysunek 2: Przewaga w przeżywalności po przedłużonej (78%) hepatektomii myszy zmodyfikowanych do nadekspresji A20. Dane dotyczące przeżycia po 78% rozszerzonej hepatektomii u kontrolnych myszy nieleczonych (niezakażonych NI), rAd.βGal i myszy leczonych rAd.A20. Nadekspresja A20 w wątrobach myszy dała znaczną przewagę w zakresie przeżycia w porównaniu z kontrolami NI (50%) i rAd.βGal (13%) (n = 12 myszy / grupa). Ten rysunek pochodzi z Longo et al.16. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

PrzeżyłzmarłyAwaria technicznałącznySzacowany % HepatektomiaPrzeżycie
Wstępna biegłość1053Rozdział 1868 ± 3,9%10/15 (66%)
Po osiągnięciu biegłości8811779 ± 2,4%8/16 (50%)

Tabela 1: Rozszerzone wyniki szkolenia z hepatektomii o sile 78%. Wyniki przeżycia w ciągu 1 tygodnia po rozszerzonej 78% hepatektomii u zdrowych dorosłych myszy CD1 i C57BL / 6 w wieku 11-21 tygodni. Biegłość techniczna została określona samodzielnie poprzez obserwowalną poprawę sukcesu technicznego i odpowiednią resekcję prawego górnego płata, obliczoną na podstawie szacowanej procentowej hepatektomii (średnia ± SEM).

Dyskusja

Aby skutecznie przeprowadzić rozszerzoną 78% hepatektomię powodującą 50% śmiertelność u myszy, bardzo ważne jest, aby każdy płat wątroby został precyzyjnie wycięty. Ten poziom kompetencji i precyzji można osiągnąć tylko wtedy, gdy procedura jest wykonywana wielokrotnie. Krzywa szkolenia różni się w zależności od operatora, ale zazwyczaj wymaga 3-6 miesięcy praktyki. Resekcja wątroby, która usuwa mniej niż 78% TLM, skutkowałaby wyższymi wskaźnikami przeżycia, podczas gdy resekcja wątroby, która usuwa więcej niż 78% TLM, skutkowałaby większą śmiertelnością. Każda resekcja płata jest wyzwaniem, choć nie w takim samym stopniu.

Lewy płat jest najłatwiejszy do niezawodnego wycięcia. Podstawa LL jest wąska, a po lepszym odbiciu operator może łatwo zidentyfikować podstawę wątroby i zawiązać szew w tej samej pozycji z prawie identyczną objętością resekcji płata za każdym razem. Płat środkowy ma najszerszą podstawę w porównaniu z LL i RUL. W związku z tym wymaga to od operatora dokładnego oszacowania, gdzie należy umieścić szew i starannego przybliżenia końców szwu u podstawy ML przed wycięciem płata. Gdy ML jest zawiązany zbyt proksymalnie, szew może utrudnić żylny drenaż wątroby lub utrudnić powrót krwi z IVC do serca. Gdy ML jest zawiązany zbyt dystalnie, dochodzi do resekcji niewystarczającej masy wątroby, a ryzyko krwotoku na brzegu resekcji wzrasta, ponieważ podstawa ML jest szersza. Prawy górny płat jest prawdopodobnie najtrudniejszy do wiarygodnej sekcji. Anatomiczne umiejscowienie RUL z tyłu w jamie otrzewnej utrudnia całkowite owinięcie szwu wokół jego podstawy, co może skutkować niepełną resekcją tego płata. W przeciwieństwie do tego, jeśli szew jest zawiązany zbyt proksymalnie u podstawy RUL, dopływ krwi do prawego dolnego płata może być zagrożony, powodując niedokrwienie tego RLL i zwiększając prawdopodobieństwo śmiertelności pooperacyjnej.

Inne kluczowe elementy minimalizujące ryzyko związane z zabiegiem obejmują minimalizację znieczulenia ogólnego (np. Izofluranu) w celu zmniejszenia toksyczności i zapewnienie odpowiedniej hemostazy po każdej resekcji płata w celu ograniczenia krwotoku pooperacyjnego. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że rozszerzona 78% hepatektomia jest korzystnie wykonywana u dorosłych myszy w wieku 8-12 tygodni, ponieważ starsze myszy mogą wykazywać większą zmienność wskaźników przeżycia ze względu na większą masę ciała i zmniejszoną zdolność regeneracyjną wątroby, podczas gdy młodsze myszy mogą cierpieć na większe komplikacje techniczne ze względu na mniejszy rozmiar wątroby i wyższy wskaźnik powikłań związanych ze znieczuleniem. Przypuszczamy, że obserwowana 50% śmiertelność po 78% hepatektomii odpowiada wewnętrznym cechom pojedynczej myszy, które odnoszą się do subtelnych zmian anatomicznych we względnym procencie masy każdego płata wątroby w stosunku do całkowitej masy wątroby między poszczególnymi zwierzętami. 78% hepatektomia u myszy stanowi anatomiczny próg, przy którym tylko 50% zwierząt może w porę i skutecznie zregenerować się i przeżyć, podczas gdy pozostałe 50% nie udaje się tego zrobić i umiera. Przyznajemy również, że subtelne różnice w manipulacji wątrobą mogą być związane z różnym stopniem uszkodzenia wątroby, a tym samym wypaczają tę delikatną równowagę w kierunku niepowodzenia regeneracjii śmierci.

Jednak najbardziej ograniczającym czynnikiem pozostaje opanowanie samego zabiegu chirurgicznego, co może przyjść tylko z praktyką. Praktyka jest niezbędna, aby zapewnić powtarzalny wynik poprzez precyzyjne mapowanie szwów u podstawy każdego płata wątroby. Jedną z uwag ostrzegawczych jest to, że indywidualne różnice w anatomii wątroby u myszy - które są rzadkie - mogą wymagać pewnych modyfikacji w technice. Inne interwencje, które należy rozważyć indywidualnie dla każdego przypadku w celu poprawy sukcesu, obejmują podawanie zwykłych bolusów z soli fizjologicznej w przypadku dużych niewykrywalnych strat płynów lub znacznego krwotoku oraz przedłużony ręczny ucisk lub elektrokoagulację na brzegu wątroby w przypadkach utrzymującego się krwotoku.

Podsumowując, rozszerzona 78% hepatektomia w modelu mysim jest cenną techniką dla badań translacyjnych. Intensywne szkolenie ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia technicznie pomyślnego wyniku związanego z tą procedurą. Myszy są nie tylko preferowanym gatunkiem małych zwierząt, które są łatwe w obsłudze i stosunkowo niedrogie, ale są również dostępne w wielu dobrze przebadanych szczepach wsobnych, a także w stale rosnącej liczbie linii genetycznie modyfikowanych (transgenicznych, nokautujących (KO), specyficznych dla typu komórkowego i warunkowych KO), co umożliwia dokładne badania mechanistyczne 3,9,23. Oprócz genetycznie zmodyfikowanych myszy, różne patologie, w tym niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby, marskość wątroby i cukrzyca, o których wiadomo, że wpływają na przeżycie i wyniki po resekcji wątroby, można łatwo wywołać u myszy 24,25,26,27,28,29,30,31.

Jak wspomniano wcześniej, klasyczne pH 2/3 pozostaje niezwykle cenne, ale nie podsumowuje wysokiej śmiertelności, która jest związana z przedłużoną resekcją wątroby z powodu raka lub zespołem małego dla rozmiaru po przeszczepieniu wątroby, gdy masa wątroby jest anatomicznie lub funkcjonalnie nieodpowiednia (np. w stłuszczeniu wątroby)7,32,33,34 . Prawidłowo wykonana rozszerzona 78% hepatektomia powoduje 50% zgon pooperacyjny, co lepiej odzwierciedla rzeczywistość kliniczną, taką jak po rozległych resekcjach wątroby z powodu urazu lub raka oraz w kontekście zespołu małego dla rozmiaru po przeszczepieniu brzeżnych przeszczepów wątroby, a także po zwykłej operacji wątroby u pacjentów z ciężkim niealkoholowym stłuszczeniowym zapaleniem wątroby (NASH) lub marskością wątroby16, Lokal mieszkalny 32. Ten mysi model stanowi bardzo cenny i niezbędny krok w celu przetestowania nowych strategii terapeutycznych w celu poprawy wyników we wszystkich tych warunkach. Wszelkie pozytywne wyniki na myszach z pewnością znacznie zmniejszą liczbę zwierząt potrzebnych do przeprowadzenia przedtranslacyjnych badań na dużych zwierzętach przed klinicznym przełożeniem innowacyjnych terapii.

Oświadczenia

Nie ma żadnych konfliktów interesów, które można by ujawnić.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01 DK063275 i HL086741 dla CF. PB i TA są odbiorcami stypendium NRSA z grantu szkoleniowego NHLBI T32 HL007734.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2 x 2gaza Covidien2146Chirurgia: rozwarstwienie
5-O Nylonowy szew monofilamentowyOasis50-118-0631Chirurgia: Zamknięcie skóry
5-O Jedwabny szewFine Science Tools18020-50Chirurgia: podwiązanie płata wątroby
5-O Vicryl SutureEthiconNC9335902Chirurgia: Zamknięcie ściany brzucha
KleszczeAddsonaBraintree ScientificFC028Surgery:
waciki nasączone alkoholem do preparacji (2)BD326895Środek dezynfekujący
Buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu ZoopharmN/A Akumulatorowydo analgezji
Braintree ScientificCLP-9868-14Zakrzywione
kleszczeBraintree ScientificFC0038Chirurgia: rozwarstwienie
HemostatBraintree ScientificFC79-1Chirurgia: rozwarstwienie
Izofluran Inhalacyjny środek znieczulający Patterson VeterinaryRXISO-250znieczulenia ogólnego
(2-szczelinowy) (2)Braintree ScientificACD-001Chirurgia: do trzymania małych zwijaczy
Stabilizator magnetyczny (4-szczelinowy) Braintree ScientificACD-002Chirurgia: do trzymania małych retraktorów
MikronożyczkiBraintree ScientificSC-MI 151Chirurgia: rozwarstwienie
Taca operacyjnaBraintree ScientificACD-0014Chirurgia: do ustalenia pola operacyjnego 
Powidon jod 10% wacik (2)Skalpel dezynfekującyMedlineMDS093901ZZ
15 ostrzy)Produkty chirurgiczne Aspen371615Chirurgia: preparacja
Ostre nożyczki (zakrzywione)Braintree ScientificSC-T-406Chirurgia: rozwarstwienie
Ostre nożyczki (proste)Braintree ScientificSC-T-405Chirurgia: rozwarstwienie
Mały Aplikatory z bawełnianą końcówkąFisher Scientific23-400-118Chirurgia: preparacja
Kleszcze tkankowe (proste x2)Braintree ScientificFC1001Chirurgia: rozwarstwienie
Podkładka rozgrzewająca (18" x 26")podkładów rozgrzewającychStrykerTP 700
grzewającegoStrykerTP 700
(2) Braintree ScientificACD-005Surgery: w celu ułatwienia odsłonięcia jamy otrzewnej
Xenotec Isoflurane Small Animal Anesthesia SystemBraintree ScientificEZ-108SAZnieczulenie ogólne: Zawiera wazylizator izofluranu i konsolę, komorę indukcyjną, regulator/wąż, maskę na twarz (M)
trymer do golenia Stabilizator magnesu do (Pompka do Zwijacz z drutu

Bibliografia

  1. Martins, P. N., Theruvath, T. P., Neuhaus, P. Rodent models of partial hepatectomies. Liver Int. 28 (1), 3-11 (2008).
  2. Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of the liver I. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch Pathol. 12, 186-202 (1931).
  3. Koniaris, L. G., McKillop, I. H., Schwartz, S. I., Zimmers, T. A. Liver regeneration. J Am Coll Surg. 197 (4), 634-659 (2003).
  4. Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43 (2), S45-S53 (2006).
  5. Inderbitzin, D., et al. Magnetic resonance imaging provides accurate and precise volume determination of the regenerating mouse liver. J Gastrointest Surg. 8 (7), 806-811 (2004).
  6. Clavien, P. A., et al. What is critical for liver surgery and partial liver transplantation: size or quality. Hepatology. 52 (2), 715-729 (2010).
  7. Dahm, F., Georgiev, P., Clavien, P. A. Small-for-size syndrome after partial liver transplantation: definition, mechanisms of disease and clinical implications. Am J Transplant. 5 (11), 2605-2610 (2005).
  8. Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
  9. Kamali, C., et al. Extended liver resection in mice: state of the art and pitfalls-a systematic review. Eur J Med Res. 26 (1), 6(2021).
  10. Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
  11. Borowiak, M., et al. Met provides essential signals for liver regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (29), 10608-10613 (2004).
  12. Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Lab Anim (NY). 37 (11), 529-532 (2008).
  13. Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J Invest Surg. 16 (2), 99-102 (2003).
  14. Mitchell, C., Willenbring, H. Erratum: A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat Protoc. 9 (6), 1532(2014).
  15. Studer, P., et al. Significant lethality following liver resection in A20 heterozygous knockout mice uncovers a key role for A20 in liver regeneration. Cell Death Differ. 22 (12), 2068-2077 (2015).
  16. Longo, C. R., et al. A20 protects mice from lethal radical hepatectomy by promoting hepatocyte proliferation via a p21waf1-dependent mechanism. Hepatology. 42 (1), 156-164 (2005).
  17. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
  18. Diehl, A. M., Rai, R. M. Liver regeneration. 3. Regulation of signal transduction during liver regeneration. FASEB J. 10 (2), 215-227 (1996).
  19. Diehl, L., Morse, M. A comparison of selected organ weights and clinical pathology parameters in male and female CD-1 and CByB6F1 hybrid mice 12-14 weeks in age. , Available from: https://www.criver.com/sites/default/files/resources/doc_a/AComparisonofSelectedOrganWeightsandClinicalPathologyParametersinMaleandFemaleCD-1andCByB6F1HybridMice12-14WeeksinAge.pdf (2023).
  20. CD-1® IGS mouse. Charles River Laboratories. , Available from: https://www.criver.com/products-services/find-model/cd-1r-igs-mouse?region=3611 (2023).
  21. C57BL/6J mouse organ weight. The Jackson Laboratory. , Available from: https://www.jax.org/de/-/media/jaxweb/files/jax-mice-and-services/b6j-data-summary.xlsx (2023).
  22. Inderbitzin, D., et al. Regenerative capacity of individual liver lobes in the microsurgical mouse model. Microsurgery. 26 (6), 465-469 (2006).
  23. Zhou, X., et al. L-carnitine promotes liver regeneration after hepatectomy by enhancing lipid metabolism. J Transl Med. 21 (1), 487(2023).
  24. Linecker, M., et al. Omega-3 fatty acids protect fatty and lean mouse livers after major hepatectomy. Ann Surg. 266 (2), 324-332 (2017).
  25. Haber, B. A., et al. High levels of glucose-6-phosphatase gene and protein expression reflect an adaptive response in proliferating liver and diabetes. J Clin Invest. 95 (2), 832-841 (1995).
  26. Rickenbacher, A., et al. Arguments against toxic effects of chemotherapy on liver injury and regeneration in an experimental model of partial hepatectomy. Liver Int. 31 (3), 313-321 (2011).
  27. Aravinthan, A. D., et al. The impact of preexisting and post-transplant diabetes mellitus on outcomes following liver transplantation. Transplantation. 103 (12), 2523-2530 (2019).
  28. Gonzalez, H. D., Liu, Z. W., Cashman, S., Fusai, G. K. Small for size syndrome following living donor and split liver transplantation. World J Gastrointest Surg. 2 (12), 389-394 (2010).
  29. Mahmud, N., et al. Risk prediction models for post-operative mortality in patients with cirrhosis. Hepatology. 73 (1), 204-218 (2021).
  30. Kooby, D. A., et al. Impact of steatosis on perioperative outcome following hepatic resection. J Gastrointest Surg. 7 (8), 1034-1044 (2003).
  31. Ma, K., et al. A mesenchymal-epithelial transition factor-agonistic antibody accelerates cirrhotic liver regeneration and improves mouse survival following partial hepatectomy. Liver Transpl. 28 (5), 782-793 (2022).
  32. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
  33. Ramsey, H. E., et al. A20 protects mice from lethal liver ischemia/reperfusion injury by increasing peroxisome proliferator-activated receptor-alpha expression. Liver Transpl. 15 (11), 1613-1621 (2009).
  34. Arvelo, M. B., et al. A20 protects mice from D-galactosamine/lipopolysaccharide acute toxic lethal hepatitis. Hepatology. 35 (3), 535-543 (2002).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

rozszerzona hepatektomiaregeneracja w trobycz ciowa hepatektomiazesp ma ej w troby small for size syndromeresekcja w trobyhepatoprotekcyjna terapia genowaterapia genowa A20marginalne przeszczepy w trobyniewydolno w troby

Powiązane artykuły