Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Tandemowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości do badania składników chemicznych Gynura bicolor DC

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66612

⸱

2 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Clinical Research Center for Dermatology, Chongqing Key Laboratory of Integrative Dermatology Research, Key Laboratory of External Therapies of Traditional Chinese Medicine in Eczema, Department of Dermatology, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine, 2General Surgery, Chongqing Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy ogólny protokół, który integruje analizę spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości i dokowanie molekularne w badaniach tradycyjnej medycyny chińskiej.

Streszczenie

Separacja i analiza pożądanych składników chemicznych są ważnymi tematami dla podstawowych badań tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM). Ultra-wysokosprawna chromatografia cieczowa z kwadrupolową tandemową spektrometrią mas czasu przelotu (UPLC-Q-TOF-MS/MS) stopniowo stała się wiodącą technologią identyfikacji składników TCM. Gynura dwukolorowa DC. (BFH), wieloletnie zioło bez łodyg używane w medycynie i żywności w Chinach, ma działanie lecznicze, takie jak usuwanie ciepła, nawilżanie płuc, łagodzenie kaszlu, rozpraszanie zastojów i łagodzenie obrzęków. Polifenole i flawonoidy zawierają liczne izomery, które utrudniają identyfikację złożonych związków w BFH. W artykule przedstawiono systematyczny protokół badania składników chemicznych BFH w oparciu o ekstrakcję rozpuszczalnikową i zintegrowane dane za pośrednictwem UPLC-Q-TOF-MS.

Opisana tutaj metoda obejmuje systematyczne protokoły wstępnej obróbki próbek, kalibracji MS, akwizycji MS, przetwarzania danych i analizy wyników. Wstępna obróbka próbki obejmuje zbieranie, czyszczenie, suszenie, kruszenie i ekstrakcję. Kalibracja MS składa się z korekcji wielopunktowej i jednopunktowej. Przetwarzanie danych obejmuje import danych, ustalanie metody, przetwarzanie analizy i prezentację wyników. W artykule przedstawiono reprezentatywne wyniki typowego wzorca fragmentacji kwasów fenolowych, estrów i glikozydów w Gynura bicolor DC. (BFH). Ponadto szczegółowo omówiono wybór rozpuszczalników organicznych, ekstrakcję, integrację danych, wybór energii zderzeń i doskonalenie metod. Ten uniwersalny protokół może być szeroko stosowany do identyfikacji złożonych związków w TCM.

Wprowadzenie

Tradycyjna medycyna chińska (TCM) jest klinicznie praktykowana w Chinach od tysięcy lat i odgrywa istotną rolę w utrzymaniu zdrowia Chińczyków1. Skład TCM jest zróżnicowany i złożony, a TCM został szeroko opisany w wielu badaniach jakościowych koncentrujących się na składzie chemicznym2. Składniki chemiczne w TCM można z grubsza podzielić na następujące kategorie, takie jak alkaloidy, kwasy organiczne, fenylopropanoidy, kumaryny, lignany, chinony, flawonoidy, terpenoidy, saponiny triterpenoidowe, saponiny steroidowe, glikozydy nasercowe i garbniki3. Biorąc pod uwagę dużą liczbę nieznanych składników i nierozróżnialnych izomerów w TCM, separacja i analiza pożądanych składników chemicznych są ważnymi tematami dla podstawowych badań TCM4.

Ultra-wysokowydajna chromatografia cieczowa kwadrupolowa spektrometria mas czasu przelotu (UPLC-Q-TOF-MS) została zastosowana do analizy substancji w tradycyjnej medycynie chińskiej (TCM), które mogą być oddzielone za pomocą ultra-wysokowydajnej chromatografii cieczowej5,6. Wysoka rozdzielczość MS może dostarczyć obszernych informacji o jonach, które są wykorzystywane do analizy bazy danych z błędem mniejszym niż 5 ppm7. Po włączeniu energii zderzenia, wtórny tryb MS może otrzymać wtórne jony fragmentacyjne, na których intensywność i liczbę wpływa wielkość energii8.

Gynura bicolor DC. (BFH), wieloletnie zioło bez łodyg, szeroko stosowane w medycynie i żywności (Rysunek 1A), jest rzadką i zagrożoną rośliną unikalną dla Chin9. BFH ma obfite antocyjany, polifenole, flawonoidy i silne zdolności przeciwutleniające10. BFH ma działanie lecznicze, w tym usuwanie ciepła, chłodzenie krwi, nawilżanie płuc, łagodzenie kaszlu, rozpraszanie zastojów, łagodzenie obrzęków, łagodzenie letnich upałów i eliminowanie ciepła. Niewiele badań koncentrowało się na składzie chemicznym BFH11. Polifenole i flawonoidy zawierają liczne izomery, które utrudniają identyfikację złożonych związków w BFH. Konieczne jest opracowanie uniwersalnej metody identyfikacji składników chemicznych, która będzie mogła być stosowana do wszystkich rodzajów TCM. Badanie to miało na celu przedstawienie systematycznego protokołu badania składników chemicznych BFH w oparciu o ekstrakcję rozpuszczalnikową i zintegrowane dane za pośrednictwem UPLC-Q-TOF-MS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wstępna obróbka próbki

  1. Umyj całe ziele BFH w czystej wodzie, aż nie będzie widocznych osadów i zanieczyszczeń. Umieść czysty BFH w naczyniu, a następnie włóż go do piekarnika (Rysunek 1B). Nastaw piekarnik na 50 °C na 24 godz.
    UWAGA: Cała roślina BFH została zebrana w prowincji Syczuan w Chinach.
  2. Rozdrobnić suszony BFH w wielofunkcyjnej kruszarce szybkoobrotowej. Przenieś gruboziarnisty proszek na sito o oczkach 50 (Rysunek 1C). Zbierz drobny proszek w hermetycznej torbie i przechowuj go w wieży suszącej.
  3. Dokładnie zważyć sześć próbek BFH po 0,25 g każda i umieścić je w sześciu stożkowych kolbach. Dodaj 30 ml rozpuszczalnika organicznego (50% etanolu z wody, 70% etanolu z wody, chloroformu, eteru naftowego, octanu etylu i alkoholu n-butylowego) do każdej stożkowej butelki (Rysunek 1D).
  4. Przenieść mieszaninę do sonikatora w kąpieli ultradźwiękowej na 30 minut ekstrakcji w temperaturze 25 °C. Odwirować próbkę przy 14 000 x g przez 5 minut. Przygotować strzykawkę do wstrzykiwań i organiczny mikroporowaty filtr membranowy o wielkości 0,22 μm. Przefiltrować wszystkie supernatanty do butelek na próbki o pojemności 2 ml.

2. Kalibracja MS

  1. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl przenieś 500 μl 0,1 M roztworu wodorotlenku sodu do kolby miarowej o pojemności 100 ml, a następnie przenieś 450 μl wody dejonizowanej lub ultraczystej do kolby miarowej o pojemności 100 ml (Rysunek 2).
  2. Używając pipety o pojemności 200 μl, dodać 50 μl kwasu mrówkowego do kolby miarowej o pojemności 100 ml. Uzupełnić całkowitą objętość 100 ml roztworem 2-propanolu:wody w proporcji 90:10 i sonikować roztwór przez 5 minut. Oznaczyć kolbę jako 0,5 mM roztworu mrówczanu sodu w wodzie 2-propanolu w proporcji 90:10 i przechowywać w lodówce.
    UWAGA: Roztwór mrówczanu sodu traci ważność w ciągu 1 tygodnia w temperaturze pokojowej.
  3. Uruchom oprogramowanie sterujące UPLC-Q-TOF-MS, a następnie otwórz okno MS tune. W panelu Sample Flow Control (Sterowanie przepływem próbki) ustaw wartość 25 μl/min w opcji Infusion Flow Rate (Natężenie przepływu infuzji) i wybierz C w opcji Reservoir (Zbiornik). Poczekaj około 1 minuty, aż automatyczne przedmuchiwanie zakończy się.
  4. Kliknij przycisk Przepływ, aby rozpocząć podawanie roztworu mrówczanu sodu. Kliknij przycisk Dodatni, aby przełączyć się na tryb jonów dodatnich, a następnie kliknij przycisk Czułość, aby przełączyć się na tryb czułości.
    UWAGA: Przejdź do następnego kroku, aż w oknie widma w czasie rzeczywistym pojawią się charakterystyczne piki mrówczanu sodu.
  5. W oprogramowaniu sterującym UPLC-Q-TOF-MS otwórz okno MS Console. W lewej pozycji wybierz kolejno opcje SYNAPT XS i Intellistart.
  6. Zaznacz Utwórz kalibrację i kliknij przycisk Start. Kliknij przycisk Dalej i wybierz Profil kalibracji z menu rozwijanego. Kliknij przycisk Dalej i wybierz tryb czułości w Polaryzacja dodatnia. Kliknij kolejno przyciski Dalej, Dostrój stronę, Dalej i Start.
  7. Przejdź do okna MS tune i kliknij przycisk Ujemny, aby przełączyć się na tryb jonów ujemnych. Wróć do okna MS Console.
  8. Zaznacz Utwórz kalibrację i kliknij przycisk Start. Kliknij przycisk Dalej i wybierz Profil kalibracji z menu rozwijanego. Kliknij przycisk Dalej i wybierz Tryb czułości w Polaryzacja ujemna. Kliknij kolejno przyciski Dalej, Dostrój stronę, Dalej i Start.
  9. W panelu sterowania przepływem LockSpray ustaw natężenie przepływu 50 μl/min i kliknij przycisk Przepływ, aby roztwór LE wszedł do spektrometru masowego. Przejdź do okna MS tune, zaznacz konfigurację źródła LockSpray i kliknij przycisk Start, aby rozpocząć kalibrację.

3. Przejęcie MS

  1. Przejdź do głównego interfejsu i kliknij prawym przyciskiem myszy kolumnę Plik wlotowy, aby otworzyć metodę chromatografii cieczowej.
  2. Kliknij przycisk Wlot, a następnie ustaw parametry, w tym czas pracy i nachylenie. Kliknij przycisk Autosampler, a następnie ustaw parametry, w tym Czas pracy, Kolumnę i Próbkę. Kliknij przycisk Zapisz.
  3. Kliknij prawym przyciskiem myszy kolumnę Metoda MS, aby otworzyć metodę spektrometrii mas.
  4. Kliknij przycisk Informacje, a następnie ustaw parametry, w tym czas zakończenia, polaryzację, tryb analizatora, niską masę, wysoką masę i energię zderzenia z przeniesieniem rampy. Kliknij przycisk OK, a następnie przycisk Zapisz.
  5. Wypełnij tabelę sekwencji, w tym nazwę pliku, fiolkę i objęt. Kliknij przycisk Zapisz.
  6. Zaznacz wiersz w tabeli sekwencji dla próbki, którą chcesz uruchomić. Kliknij przycisk Uruchom i kliknij przycisk OK w oknie, które właśnie się pojawi.

4. Przetwarzanie danych

  1. Uruchom oprogramowanie do analizy danych. W kolumnie Moja praca kliknij przycisk Importuj dane MassLynx, aby otworzyć nowe okno.
  2. Kliknij przycisk ze znakiem plus i sprawdź wszystkie pięć plików RAW w trybie pozytywnym. Wprowadź nazwę grupy i kliknij przycisk Utwórz zestaw próbek UNIFI, aby rozpocząć import danych (Rysunek 3A).
  3. Kliknij dwukrotnie plik Analysis Method w trybie pozytywnym. Kliknij etykietę Przetwarzanie, a następnie kliknij przycisk Cel masowy. Wprowadź liczbę 5 ppm w polu wejściowym po polach Docelowa tolerancja dopasowania i Tolerancja dopasowania fragmentu.
  4. Kliknij przycisk Strona główna, a następnie kliknij przycisk Adducts. Wybierz rzędy +H i +Na, a następnie kliknij prawy przycisk w kształcie strzałki. Kliknij przycisk Zapisz (Rysunek 3B).
  5. Kliknij dwukrotnie plik Metoda analizy w trybie ujemnym. Kliknij etykietę Przetwarzanie, a następnie kliknij przycisk Cel masowy. Wprowadź liczbę 5ppm w polu wejściowym po polach Docelowa tolerancja dopasowania i Tolerancja dopasowania fragmentu.
  6. Kliknij przycisk Strona główna, a następnie kliknij przycisk Przydukty. Wybierz wiersze -H i +HCOO i kliknij przycisk w kształcie strzałki w prawo. Kliknij przycisk Zapisz.
  7. W kolumnie Moja praca kliknij przycisk Analiza, aby otworzyć nowe okno. Wybierz właśnie zaimportowane dane i właśnie utworzoną metodę, a następnie kliknij przycisk Dalej. Wprowadź nazwę pliku. Wybierz folder, w którym przechowywane są dane analizy, a następnie kliknij przycisk Zakończ
  8. Kliknij przycisk Proces i poczekaj kilka minut, aż pojawią się wyniki (Rysunek 3C).
  9. Skopiuj tabelę wyników do pustego formularza (Rysunek 3D).

5. Analiza wyników

  1. Wybierz związek w tabeli wyników. Odpowiednie widmo masy wtórnej zostanie wyświetlone w prawym dolnym rogu (Rysunek 4A).
  2. Kliknij przycisk w kształcie tabeli i wybierz opcję Fragmenty o wysokiej energii, aby wyświetlić tabelę wtórnych jonów fragmentów (Rysunek 4B).
  3. Wybierz wtórny jon fragmentacyjny w tabeli. Najedź myszką na pik jonowy odpowiadający wtórnemu widmu masy, a odpowiednie pęknięcie strukturalne zostanie wyświetlone na ekranie (Rysunek 4C).
    UWAGA: Ręcznie oceń zasadność pękania podaną przez oprogramowanie i rozróżnij izomery na podstawie jonów wtórnych fragmentów.
  4. Ręcznie narysuj wzór fragmentacji w oprogramowaniu do rysowania.
    UWAGA: Przykłady wzorców fragmentacji są szczegółowo opisane w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do prezentacji reprezentatywnych wyników wykorzystano identyfikację składu chemicznego BFH jako modelu. Chromatogramy pików bazowych Gynura bicolor DC. ekstrahowanych rozpuszczalnikiem przedstawiono w Supplemental File 1-Supplemental Figure S1-S6, a zaobserwowany czas retencji (RT), nazwę składnika, wzór, stosunek masy do ładunku (m/z) oraz błąd masy wymieniono w tabelach S1-S6. W ZBTK zidentyfikowano wszystkie 35 rodzajów związków z rozdzielonych pików w UPLC-TOF-MS. Jak pokazano w Supp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oprócz wywaru wodnego12, ekstrakcja rozpuszczalnikiem organicznym jest kolejną powszechną metodą wstępnej obróbki TCM13. Zgodnie z zasadą rozpuszczania w podobnych fazach, wiele składników zostało wyekstrahowanych przez połączenie różnych rozpuszczalników organicznych14. Ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami jest jedną z głównych metod stosowanych do otrzymywania składników w TCM15. Ekstrakcja dwutlenkiem węgla w stanie nadkryt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82104881), Zespół ds. Dziedziczenia i Innowacji Leczenia Chorób Immunologicznych TCM, Chongqing Medical Scientific Research Project (Wspólny projekt Komisji Zdrowia Chongqing oraz Biura Nauki i Technologii) (2022DBXM007), Specjalny projekt motywacyjny i przewodnicki Instytutu Badań Naukowych Chongqing (cstc2022jxjl120005), Specjalny projekt dla Chongqing Postdoctoral Science Fundacja (2022CQBSHTB3035), Program Starszych Talentów Medycznych Chongqing dla Yong i osób w średnim wieku, Program dla Instytucji Naukowych Chongqing (niezależny projekt badawczy nr 2022GDRC015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
chloroformSinopharm Chemical ReagentCo., LtdCAS 67-66-3
etanolChuandongChemicalCAS 64-17-5
octan etyluChuandongChemicalCAS 141-78-6
chromatograf cieczowyWatersACQUITY Class 1 plus
oprogramowanie
sterujące MassLynx Waters V4.2 MSAlkohol n-butylowyChuandongChemicalCAS 71-36-3
eter naftowyChuandongChemicalCAS 8032-32-4
Kwadrupolowa spektrometria mas czasu przelotuWodySYNAPT XS
UNIFIWatersOprogramowanie do analizy danych

Bibliografia

  1. Lin, P., et al. Qualitative and quantitative analysis of the chemical profile for gualou-xiebai-banxia decoction, a classical traditional chinese medicine formula for the treatment of coronary heart disease, by uplc-q/tof-ms combined with chemometric analysis. J Pharm Biomed Anal. 197, 113950(2021).
  2. Hui, D., et al. Uplc-q-tof/ms-based metabolomic studies on the toxicity mechanisms of traditional chinese medicine chuanwu and the detoxification mechanisms of gancao, baishao, and ganjiang. Chinese J Nat Med. 13 (9), 687-698 (2015).
  3. Newman, D. J. Modern traditional chinese medicine: Identifying, defining and usage of tcm components. Adv Pharmacol. 87, 113-158 (2020).
  4. Liu, S., Yi, L. Z., Liang, Y. Z. Traditional chinese medicine and separation science. J Sep Sci. 31 (11), 2113-2137 (2008).
  5. Yuan, L., et al. Rapid classification and identification of complex chemical compositions in traditional chinese medicine based on uplc-q-tof/ms coupled with data processing techniques using the kudiezi injection as an example. Anal Methods. 7 (12), 5210-5217 (2015).
  6. Wang, F., et al. Hplc coupled with chemical fingerprinting for multi-pattern recognition for identifying the authenticity of clematidis armandii caulis. JoVE. (189), e64690(2022).
  7. Gao, Y., et al. Ultra high-performance liquid chromatography-mass spectrometry and self-established database analysis of chinese herbal medicine components. JoVE. (201), e66091(2023).
  8. Fu, X., et al. Standardized identification of compound structure in tibetan medicine using ion trap mass spectrometry and multiple-stage fragmentation analysis. JoVE. (193), e65054(2023).
  9. Wang, Y., et al. Comparison of morphological and physiological characteristics in two phenotypes of a rare and endangered plant, begonia fimbristipula hance. Photosynthetica. 54, 381-389 (2016).
  10. Zhang, P., et al. Response of population canopy color gradation skewed distribution parameters of the rgb model to micrometeorology environment in begonia fimbristipula hance. Atmosphere. 13 (6), 890(2022).
  11. Yu, L., Ning, L., Youzhen, D. Studies on microwave extraction of the pigment from begonia fimbristipula hance. Guangdong Trace Elements Science. 11 (10), 60-63 (2004).
  12. Xiao, Q., et al. Novel fusion protein consisting of metallothionein, cellulose binding module, and superfolder gfp for lead removal from the water decoction of traditional chinese medicine. ACS Omega. 5 (6), 2893-2898 (2020).
  13. Huang, H., et al. Using multiple light scattering to examine the stability of phyllanthus emblica l. Extracts obtained with different extraction methods. JoVE. (194), e65130(2023).
  14. Miao, W. G., Tang, C., Ye, Y., Quinn, R. J., Feng, Y. Traditional chinese medicine extraction method by ethanol delivers drug-like molecules. Chin J Nat Med. 17 (9), 713-720 (2019).
  15. Olejar, K. J., et al. Ultrasonic-assisted extraction of cannabidiolic acid from cannabis biomass. JoVE. (183), e63076(2022).
  16. Zhu, H. Y., et al. Sedative and hypnotic effects of supercritical carbon dioxide fluid extraction from schisandra chinensis in mice. J Food Drug Anal. 24 (4), 831-838 (2016).
  17. Lin, X., Wang, Y., Liu, X., Huang, S., Zeng, Q. Ils-based microwave-assisted extraction coupled with aqueous two-phase for the extraction of useful compounds from chinese medicine. Analyst. 137 (17), 4076-4085 (2012).
  18. Wu, T., Lv, H., Wang, F., Wang, Y. Characterization of polyphenols from lycium ruthenicum fruit by uplc-q-tof/mse and their antioxidant activity in caco-2 cells. J Agric Food Chem. 64 (11), 2280-2288 (2016).
  19. Distler, U., et al. Drift time-specific collision energies enable deep-coverage data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 11 (2), 167-170 (2014).
  20. Sawada, Y., et al. Widely targeted metabolomics based on large-scale ms/ms data for elucidating metabolite accumulation patterns in plants. Plant Cell Physiol. 50 (1), 37-47 (2009).
  21. Zhang, X. M., et al. Data-dependent acquisition based high-resolution mass spectrum for trace alternaria mycotoxin analysis and sulfated metabolites identification. Food Chem. 364, 130450(2021).
  22. Downard, K. M. Indirect study of non-covalent protein complexes by maldi mass spectrometry: Origins, advantages, and applications of the "intensity-fading" approach. Mass Spectrom Rev. 35 (5), 559-573 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ultra-wysokosprawna chromatografia cieczowakwadrupolowy analizator czasu przelotuprzygotowanie próbekekstrakcja rozpuszczalnikiemkwasy fenoloweizomery flawonoidówtradycyjna medycyna chińska
Tandemowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości do badania składników chemicznych Gynura bicolor DC
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.