Artykuł metodologiczny

Paradygmaty oceny behawioralnej w modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu Drosophila

3.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66649

⸱

6 września 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioscience and Biotechnology, Indian Institute of Technology Kharagpur

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) wiąże się z zaburzeniami zachowań społecznych i komunikacyjnych oraz pojawieniem się powtarzających się zachowań. W celu zbadania wzajemnych relacji między genami ASD a deficytami behawioralnymi w modelu Drosophila, w tym artykule opisano pięć paradygmatów behawioralnych do oceny odstępów społecznych, agresji, zalotów, pielęgnacji i zachowań habituacyjnych.

Streszczenie

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) obejmuje niejednorodną grupę zaburzeń neurorozwojowych z typowymi objawami behawioralnymi, w tym deficytami w interakcjach społecznych i zdolnościach do komunikacji, wzmocnionymi ograniczeniami lub powtarzającymi się zachowaniami, a także, w niektórych przypadkach, trudnościami w uczeniu się i deficytem motorycznym. Drosophila posłużyła jako niezrównany organizm modelowy do modelowania wielu chorób ludzkich. Ponieważ wiele genów jest związanych z ASD, muszki owocowe stały się potężnym i skutecznym sposobem testowania genów przypuszczalnie związanych z tym zaburzeniem. Ponieważ setki genów o różnych rolach funkcjonalnych są zaangażowane w ASD, pojedynczy genetyczny model muchy ASD jest niewykonalny; zamiast tego indywidualne mutanty genetyczne, knockdowny genów lub badania oparte na nadekspresji homologii much genów związanych z ASD są powszechnymi sposobami uzyskania wglądu w szlaki molekularne leżące u podstaw tych produktów genowych. U Drosophila dostępnych jest wiele technik behawioralnych, które zapewniają łatwy odczyt deficytów w określonych komponentach behawioralnych. Wykazano, że test przestrzeni społecznej oraz testy agresji i zalotów u much są przydatne w ocenie wad w interakcjach społecznych lub komunikacji. Zachowanie pielęgnacyjne u much to doskonały odczyt powtarzających się zachowań. Test habituacji jest stosowany u much w celu oszacowania zdolności do uczenia się habituacji, która okazuje się być zaburzona u niektórych pacjentów z ASD. Połączenie tych paradygmatów behawioralnych można wykorzystać do dokładnej oceny stanu chorobowego podobnego do ASD u much. Używając zmutowanych much Fmr1, rekapitulując zespół Fragile-X u ludzi i knockdown rzędu homologu POGZ w neuronach much, wykazaliśmy wymierne deficyty w odstępach społecznych, agresji, zachowaniach godowych, zachowaniach pielęgnacyjnych i przyzwyczajeniu. Te paradygmaty behawioralne są tutaj demonstrowane w ich najprostszych i najprostszych formach z założeniem, że ułatwi to ich powszechne wykorzystanie w badaniach nad ASD i innymi zaburzeniami neurorozwojowymi w modelach much.

Wprowadzenie

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) obejmuje niejednorodną grupę zaburzeń neurologicznych. Obejmuje szereg złożonych zaburzeń neurorozwojowych charakteryzujących się wielokontekstowymi i uporczywymi deficytami w komunikacji społecznej i interakcjach społecznych oraz obecnością ograniczonych, powtarzających się wzorców zachowań i aktywności oraz zainteresowań1. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) u 1 na 100 dzieci na całym świecie diagnozuje się ASD, a stosunek mężczyzn do kobiet wynosi 4,22. Choroba ujawnia się w drugim lub trzecim roku życia. Dzieci z ASD wykazują brak zainteresowania wzajemnością społeczno-emocjonalną, komunikacją niewerbalną i umiejętnościami relacyjnymi. Wykazują powtarzające się zachowania, takie jak stereotypowe ruchy motoryczne, nieelastyczne i zrytualizowane podążanie za rutyną oraz intensywne skupienie się na ograniczonych zainteresowaniach. Dzieci z ASD wykazują wysoki stopień reakcji na dotyk, zapach, dźwięk i smak, podczas gdy reakcja na ból i temperaturę jest stosunkowo niska1. Penetracja tego zaburzenia jest również różna u różnych pacjentów cierpiących na ASD, a co za tym idzie, zmienność wzrasta.

Obecna diagnoza kliniczna ASD opiera się na ocenie behawioralnej osób, ponieważ nie ma potwierdzającego testu opartego na biomarkerach ani wspólnego testu genetycznego, który obejmowałby wszystkie formy ASD3. Rozszyfrowanie podstaw genetycznych i neurofizjologicznych byłoby pomocne w ukierunkowaniu strategii leczenia. W ciągu ostatniej dekady wiele badań zaowocowało identyfikacją setek genów, które są albo usunięte, albo zmutowane, albo których poziom ekspresji jest zmieniony u pacjentów z ASD. Trwające badania kładą nacisk na walidację wkładu tych genów kandydujących przy użyciu organizmów modelowych, takich jak mysz lub muszka owocowa, w których geny te są nokautowane lub powalane, a następnie przeprowadzane są testy na deficyty behawioralne podobne do ASD i wyjaśnienie podstawowych szlaków genetycznych i molekularnych powodujących anomalie. Model mysi rekapitulujący warianty liczby kopii (CNV) w ludzkich loci chromosomowych 16p11.2 pokazuje niektóre z wad behawioralnych ASD4,5,6. Prenatalna ekspozycja na teratogenny lek kwas walproinowy (VPA) to kolejny model myszy przedstawiający cechy przypominające ludzkie ASD7,8. Ponadto istnieje szereg modeli mysich, które wykazują autyzm związany z zespołem genetycznym, na przykład jednogenowe modele syndromiczne spowodowane mutacjami w Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c i jednogenowe modele niesyndromiczne spowodowane mutacjami w genach takich jak Geny Cntnap2, Shank, Neurexin lub Neuroligin5.

Muszka owocowa (Drosophila melanogaster) to kolejny ważny organizm modelowy do badania komórkowych, molekularnych i genetycznych podstaw wielu ludzkich zaburzeń9, w tym ASD. Drosophila i ludzie dzielą wysoce konserwatywne procesy biologiczne na poziomie molekularnym, komórkowym i synaptycznym. Muszki owocowe zostały z powodzeniem wykorzystane w badaniach nad ASD10,11,12 do scharakteryzowania genów związanych z ASD i rozszyfrowania ich dokładnej roli w synaptogenezie, funkcji synaptycznej i plastyczności, tworzeniu obwodów nerwowych i dojrzewaniu; Stwierdzono, że homologi genów związanych z ASD odgrywają rolę w regulacji zachowań społecznych i/lub powtarzalnych11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Muszka owocowa sprawdziła się również jako model do badań przesiewowych genów ASD i ich wariantów15,22,23. Największym wyzwaniem w badaniach nad ASD u much jest to, że w przeciwieństwie do innych modeli chorób, nie ma jednego modelu muchy ASD. Aby zrozumieć wpływ mutacji lub powalenia określonego genu ASD, badacz musi zweryfikować, czy fenotypy behawioralne wystarczająco naśladują objawy pacjentów z ASD, a następnie przejść do zrozumienia molekularnych lub fizjologicznych podstaw fenotypów.

Stąd, wykrywanie fenotypów podobnych do ASD jest niezbędne do badań nad ASD w modelu muchowym. Na przestrzeni lat pojawiło się kilka technik behawioralnych, które pozwalają nam wykryć nieprawidłowości, takie jak deficyty w zachowaniach / interakcjach społecznych, komunikacji, powtarzających się zachowaniach i reagowaniu na bodźce. Ponadto w różnych laboratoriach dokonano kilku modyfikacji i ulepszeń tych technik behawioralnych, aby spełnić określone wymagania, takie jak skalowanie, automatyzacja testów, odczyty, kwantyfikacja i metody porównawcze. W tym artykule wideo przedstawiono najbardziej podstawowe wersje pięciu paradygmatów behawioralnych, które w połączeniu można wykorzystać do wykrywania wyników behawioralnych podobnych do ASD w najprostszy sposób.

Agresja to ewolucyjnie zachowane wrodzone zachowanie wpływające na przetrwanie i reprodukcję24. Na agresywne zachowanie w stosunku do współplemieńców wpływa 'motywacja do socjalizacji'25,26 oraz 'communication'27, oba są zagrożone u osób dotkniętych ASD. Agresywne zachowanie jest dobrze opisane u Drosophila, a jego kwantyfikowalność dzięki solidnemu testowi agresji28,29,30 oraz dobrze poznane podstawy genetyczne i neurobiologiczne31 sprawia, że jest to odpowiedni paradygmat behawioralny32 do oceny fenotypu ASD w modelu muchy. Na agresję wpływa izolacja społeczna z dala od środowiska społecznego, co prowadzi do nasilenia agresji; To samo zaobserwowano, gdy samce much są trzymane w izolacji przez kilka dni33,34. Innym testem behawioralnym, który określa ilościowo towarzyskość u much, jest Social Space Assay35, który mierzy odległości między najbliższymi sąsiadami i odległości między muchami w małej grupie much, dzięki czemu doskonale nadaje się do testowania ról ortologów genu ASD w fly12,21,36,37, a także modeli muchy ASD wywołanych przez środowisko38,39.

Test zalotów Drosophila to kolejny paradygmat behawioralny często używany do testowania zmian w umiejętnościach społecznych i komunikacyjnych po obwodzie lub manipulacji genetycznej, w tym genów związanych z autyzmem18,19,21,40. Powtarzające się wzorce zachowań są powszechne u pacjentów z ASD, co jest rekapitulowane u much poprzez zachowanie pielęgnacyjne - serię odrębnych, stereotypowych czynności wykonywanych w celu czyszczenia i innych celów. Został z powodzeniem wykorzystany do badania wpływu mutacji genu ASD na muchy21,41, a także narażenia na chemikalia38,39. Wiele postępów i automatyzacji w teście zostało opisanych wcześniej16,41,42,43; Tutaj demonstrujemy najbardziej podstawowy wzór testu, który jest łatwy do przyjęcia i określenia ilościowego.

ASD jest znane z tego, że wpływa na zdolność do habituacji, uczenia się i pamięci u niektórych pacjentów44,45,46,47,48,49,50, organizmy modelowe ASD51,52 a także powoduje deficyty w różnych zachowaniach węchowych50. Habituacja Drosophila do lekkiego skoku była wcześniej używana do badań przesiewowych w kierunku genów ASD23. Habituację można ocenić za pomocą prostej metody testu habituacji węchowej53,54,55. Opisujemy metodę wywoływania habituacji węchowej i oznaczania wyniku za pomocą klasycznego binarnego testu wyboru zapachu opartego na labiryncie Y56, który można wykorzystać do wykrywania defektów habituacji w mutancie genu ASD lub stanie knockdown genu. Aby ocenić, czy wpływ mutacji (lub knock-downu genu) lub leczenia farmakologicznego na zachowanie muchy jest równoznaczny z fenotypem podobnym do ASD, można użyć kombinacji tych 5 opisanych tutaj testów.

Protokół

Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i odczynników używanych w tym protokole.

1. Test agresji

  1. Przygotowanie areny testów agresji
    1. Weź standardową 24-dołkową płytkę (Rysunek 1A) i użyj każdej studzienki płytki jako pojedynczej "areny" (Rysunek 1B) do agresji much. Napełnij połowę każdej studzienki zwykłym pokarmem na muchy i pozostaw do wyschnięcia na noc.
      UWAGA: Opcjonalnie na arenie może znajdować się ognisko agresji, takie jak kropka pasty drożdżowej lub ścięta samica, aby zapewnić męską agresję.
    2. Weź dowolny przezroczysty arkusz plastiku / akrylu, wystarczający do pokrycia powierzchni około trzech do czterech dołków. Wykonaj perforację arkusza, aby uzyskać mały otwór o średnicy ~2,5 mm do wkładania przez niego pojedynczych much do studzienek.
  2. Przygotowanie aspiratora muchowego
    1. Weź gumową/silikonową rurkę o długości 30-50 cm (Rysunek 1C1).
    2. Weź końcówkę do pipety o pojemności 200 μl (lub 1 000 μl) i odetnij ~1 cm od wąskiej końcówki. Włóż odcięty koniec na jednym końcu gumowej rurki; Ta końcówka będzie "końcem ustnym", używanym do aspiracji przez usta.
    3. Weź kolejną końcówkę pipety i odetnij wąski koniec tej końcówki, aby zrobić otwór wystarczający, aby mucha mogła przez nią wejść. Włóż podstawę końcówki pipety do tylnego końca rurki; będzie to "koniec muchy" aspiratora, z którego mucha zostanie zasysana (Rysunek 1C2).
    4. Włóż kawałek siatkowej tkaniny lub cienką warstwę bawełny na "rozporek" rurki - na styku rurki i końcówki. Upewnij się, że mucha zassana do końcówki pipety pozostaje uwięziona w końcówce przed siatką.
    5. Uszczelnij połączenia między rurką a końcówkami pipet za pomocą parafilmu.
  3. Przygotowanie probówek z pojedynczą obudową i fiolek z grupową obudową
    1. Przygotowanie rur jednoobudowaowych
      1. Dodaj prawie 500 μl świeżo przygotowanego pokarmu na muchy do probówki o pojemności 2 ml (Rysunek 1D). Użyj mini wirówki, aby ściągnąć żywność w dół do dolnej części probówki.
      2. Ustaw żywność tak, aby zestaliła się w temperaturze pokojowej, trzymając pokrywkę otwartą przez noc. Przykryj rurki cienkim kawałkiem szmatki, aby zapobiec przedostawaniu się zabłąkanych much do rurek.
      3. Przedziurawij pokrywki probówek do mikrofug igłami do cyrkulacji powietrza i zamknij pokrywki po zestaleniu się żywności.
    2. Przygotowanie fiolek do trzymania grupowego
      1. Weź zwykłe fiolki na muchy i napełnij je minimum świeżo przygotowanym jedzeniem (Rysunek 1D).
  4. Przygotowanie much przed eksperymentem
    1. Sznury muchowe o pożądanych genotypach należy utrzymywać w zwykłych szklanych/plastikowych butelkach zawierających standardowy pokarm dla much w inkubatorze w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności.
    2. Zebrać nowo zamknięte (od 0 do 24 h) muchy o pożądanym genotypie i rozdzielić je płciowo w znieczuleniu dwutlenkiem węgla za pomocą stereomikroskopu.
    3. Włóż połowę samców much pojedynczo do "rurek z pojedynczą obudową". Drugą połowę samców much należy trzymać w grupie po 10 osób, a samice much w zwykłych "fiolkach do trzymania grupowego", tworząc warunki społeczne. Wszystkie probówki i fiolki należy przechowywać w temperaturze 25 °C przez 5 dni.
      UWAGA: Utrzymuj temperaturę 24-25 °C i ~50% wilgotności w pomieszczeniu behawioralnym. Użytymi szczepami much były: w1118 i zmutowane muchy trans-heterozygotyczne FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Muchy Fmr1, które były trzymane w izolacji przez 5 dni, wykazują znacznie zmniejszone napady agresji w stosunku do innego samca (Rysunek 1E) .
  5. Przeprowadzanie eksperymentu z zachowaniem agresywnym
    1. Przeprowadź eksperyment z agresją w oknie czasowym ZT0-ZT3, ponieważ muchy wykazują szczytową aktywność o tej porze dnia.
      UWAGA: ZT=czas Zeitgebera w standardowym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność; ZT0 = świeci się, czyli początek fazy światła, ZT3 = 3 godziny po rozpoczęciu fazy światła i tak dalej. ZT12= światła wyłączone.
    2. Przenieść dwa samce much z komór jedno- lub grupowych metodą aspiracji pyskowej na arenę agresji przez otwór w pokrywie; natychmiast odsunąć otwór, aby upewnić się, że muchy nie mogą uciec.
    3. Pozwól muchom zaaklimatyzować się na arenie przez 1-2 minuty. Uruchom minutnik na 20 minut. Nagrywaj muchy przez całe 20 minut, umieszczając kamerę lub telefon komórkowy dokładnie pionowo nad areną za pomocą stojaka. Upewnij się, że rodzaje agresywnych ataków są widoczne na filmie.
      UWAGA: Upewnij się, że arena jest dobrze oświetlona i unikaj odblasków/odbić od pokrywy bezpośrednio spadających na obiektyw kamery.
    4. Powtórz eksperyment dla 15-20 par much dla każdego genotypu i każdego typu warunków mieszkaniowych.
      UWAGA: Nieświadome uprzedzenia można zniwelować poprzez podwójne zaślepienie muszek kontrolnych i testowych, a także plików wideo należących do wielu genotypów.
  6. Analiza danych z testu agresji
    1. Przenieś pliki wideo do komputera z wystarczająco dużym ekranem, aby widoczne były agresywne ataki.
    2. Odtwórz film i policz całkowitą liczbę agresywnych walk w przedziale czasowym 20 min58,59.
    3. Kompiluj i organizuj dane z każdego genotypu i każdego wzorca hodowli w arkuszu kalkulacyjnym i przeprowadzaj analizę danych za pomocą dowolnego oprogramowania statystycznego. Wykonaj dwustronny test t i wykreśl dane jako pudełko i wąsy.

2. Test przestrzeni społecznej

UWAGA: Opisany tutaj protokół testu, arena i analiza zostały opisane wcześniej60,61.

  1. Przygotowanie areny do oznaczania przestrzeni społecznej (SSA)
    1. Umieść obie trójkątne akrylowe przekładki (wysokość = 8,9 cm, podstawa = 6,7 cm i grubość = 0,3 cm) płasko na wierzchu prostokątnej tafli szkła (13,5 cm x 10,4 cm, grubość 0,3 cm) tak, aby kąty proste akrylowych przekładek były wyrównane z rogami tafli szkła (Rysunek 2A).
    2. Umieść dwie prostokątne przekładki akrylowe (6,7 cm x 1,5 cm, grubość = 0,3 cm) płasko na tafli szkła, wyrównane z podstawami dwóch trójkątnych przekładek. Po tym ułożeniu upewnij się, że cztery akrylowe przekładki otaczają trójkątną arenę (~2,16 cm2,16 cm2 kw. 61) na prostokątnej tafli szkła, która nie jest pokryta przekładkami (Rysunek 2A,B). Umieść naklejkę z linijką (Rysunek 2C) na jednej z trójkątnych przekładek i upewnij się, że jest ona widoczna od góry.
    3. Teraz umieść drugą prostokątną taflę szkła (13,5 cm x 10,4 cm, grubość 0,3 cm) na wierzchu akrylowych przekładek tak, aby zrównała się z taflą szkła na dole; akrylowe przekładki zostaną umieszczone między szklaną przestrzenią, pozostawiając trójkątną przestrzeń pośrodku między dwiema szklanymi taflami. Użyj czterech małych spinaczy do segregatorów, aby przytrzymać szyby i przekładki.
  2. Przygotowanie much do SSA
    1. Zebrać nowo zamknięte (od 0 do 24 h) muchy o pożądanym genotypie i oddzielić je pod względem płci w zimnym znieczuleniu za pomocą stereomikroskopu.
      UWAGA: Schłodzić zimny aparat znieczulający (można użyć szalki Petriego) w inkubatorze o temperaturze -20 °C. Umieść muchy w pustych fiolkach, zanurz te fiolki w lodzie (w wiadrze z lodem), aż muchy staną się nieruchome, umieść je na zimnej szalce Petriego i rozpocznij sortowanie.
    2. Samce i samice muszek należy przechowywać oddzielnie przez 24 godziny w fiolkach z pokarmem w inkubatorze w temperaturze 25 °C z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność.
      UWAGA: W przedstawionych tutaj eksperymentach użyto szczepów much w1118 i zmutowanych muchówek trans-heterozygoty FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Przeprowadzanie eksperymentu SSA
    1. Zachowaj te same warunki eksperymentalne, co w teście agresji (temperatura: 24-25°C, wilgotność ~ 50%) i przeprowadź eksperyment w oknie czasowym ZT0-ZT3.
    2. Zdejmij prawy dolny zacisk do segregatora i lekko przesuń tę prostokątną przekładkę na zewnątrz, tak aby między dwoma prostokątnymi przekładkami powstała szczelina (~0.5 cm).
    3. Przenieść muchy (zebrane poprzedniego dnia) z fiolki z pokarmem do pustej fiolki. Przenieś je na arenę przestrzeni społecznej (obszar trójkątny) poprzez delikatne zasysanie przez przestrzeń utworzoną między prostokątnymi przekładkami. Natychmiast zamknij przestrzeń, przesuwając prostokątną podkładkę dystansową i klips do segregatora z powrotem na ich pozycje i upewnij się, że nie ma miejsca na ucieczkę much.
    4. Trzymając komorę w pozycji pionowej, delikatnie uderz komorę 3 razy w miękką podkładkę, aby upewnić się, że wszystkie muchy znajdują się u podstawy komory na początku eksperymentu.
    5. Clamp komorę SSA w pozycji pionowej i uruchom timer. Zrób wyraźne zdjęcie areny po 20 minutach, gdy muchy osiądą na swoich pozycjach na arenie i pokażą minimalny ruch. Unikaj odblasków i nieregularnego oświetlenia.
    6. Powtórz eksperyment 3 razy dla tej samej populacji much, uderzając muchy i powtarzając kroki od kroków 2.3.5 do 2.3.7 (powtórzenia wewnętrzne). Powtórzyć 3x z inną populacją much o tym samym genotypie/stanie (niezależne powtórzenia).
      UWAGA: Zamroź komorę testową, aby wyrzucić muchy z komory. Przetrzyj szklane i plastikowe powierzchnie etanolem, aby usunąć wszystkie zapachy po jednej rundzie eksperymentu z jedną grupą much.
  4. Analiza danych z testów przestrzeni społecznej
    1. Przeanalizuj obrazy w oprogramowaniu ImageJ62 i wymień odległości między najbliższymi sąsiadami, jak opisano wcześniej61.
    2. Wykonuj analizy statystyczne i twórz wykresy za pomocą oprogramowania statystycznego.
      UWAGA: Szczepy much użyte do opisanego tutaj testu SSA to zmutowane muchy trans-heterozygotyczne w1118 i Fmr1 (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)57. Muchy Fmr1 wykazują znacznie zwiększoną odległość od najbliższych sąsiadów (Rysunek 2D).

3. Test zalotów

  1. Izba zalotów
    1. Złóż wszystkie cztery części komory zalotów (Rysunek 3A) w kolejności pokazanej w Rysunek 3B. Każda perforacja centralnego dysku, umieszczona między pokrywą a częściami podstawy, będzie działać jako "komora zalotów" (Rysunek 3C).
  2. Pozyskiwanie wstępnie pokrytych samic
    1. Uruchom i utrzymuj wiele butelek kulturowych much CS (Canton S, typ dziki) z ~ 60-100 samcami i samicami much w każdej butelce z jedzeniem.
    2. Kiedy pojawią się dorosłe osobniki, wyrzuć wszystkie dorosłe muchy i przenieś muchy wyłaniające się z tych butelek co 2-3 godziny do nowych fiolek z pokarmem uzupełnionych niewielką ilością pasty drożdżowej.
      UWAGA: Należy unikać przepełnienia fiolek. Należy uważać, aby nie przenieść starych much, larw lub poczwarek do fiolki godowej.
    3. Inkubuj te "fiolki godowe" przez 4 dni, aby upewnić się, że wszystkie samice zostały sparowane.
  3. Przygotowanie rur jednokomorowych dla samców
    1. Dodaj prawie 500 μl pokarmu na muchy do każdej probówki o pojemności 2 ml. Użyj miniwirówki, aby ściągnąć żywność w dół do dolnej części probówki.
    2. Pozostaw żywność do zestalenia się przez noc, odetnij pokrywkę rurki do mikrofuge, przykryj ją parafilmem i przebij parafilm igłą w celu cyrkulacji powietrza.
  4. Zbieranie i izolacja dziewiczych samców
    1. Ustaw krzyżówki z 10-15 samcami i 20-30 dziewiczymi samicami o pożądanych genotypach w oddzielnych fiolkach z pokarmem.
    2. Zebrać dziewicze samce o pożądanych genotypach od potomstwa i trzymać je pojedynczo w "probówkach z pojedynczą kurdą" za pomocą aspiratora. Kontynuuj zbieranie nowo zamkniętych samców co 5-6 godzin (do 40-50 samców dla każdego genotypu) i izoluj je w osobnych probówkach jednokomorowych.
    3. Ponownie uszczelnij wieczko tuby z parafilmem.
  5. Przeprowadzanie eksperymentu z testem zalotów
    1. Po 5 dniach izolacji badanych samców należy przeprowadzić test zalotów w oknie czasowym ZT0-ZT3.
    2. Skonfiguruj urządzenia rejestrujące wideo z dużym wyprzedzeniem, koncentrując się na obszarze roboczym testu.
    3. Za pomocą aspiratora zbierz jedną wstępnie pokrytą samicę (w wieku 6-10 dni) z fiolek godowych i włóż do komory godowej.
    4. Za pomocą aspiratora delikatnie przenieś samca muchy (kontrolnej/testowej) z rurki z pojedynczą obudową do komory godowej, w której znajduje się pojedyncza samica przed kryciem, przez otwór transferowy. Szybko obróć pokrywę, aby zamknąć komorę.
    5. Wideo nagrywa zachowanie much przez 15 minut.
  6. Analiza danych wideo i statystyki
    1. Przenieś pliki wideo do komputera; zwróć uwagę na czas spędzony przez mężczyznę na zalotach w ciągu 15 minut, ręcznie przeglądając wideo.
    2. Oblicz wskaźnik zalotów (CI) dla każdego samca muchy, który jest ułamkiem (lub procentem) czasu spędzonego przez samca na zalecaniu się do samicy w ciągu 15 minut.
    3. Policz łączną liczbę prób kopulacji w ciągu 15 minut.
    4. Zwróć uwagę na czas trwania opóźnienia wykazywany przez samca przed pierwszą próbą zalotów jako opóźnienie zalotów (CL).
      UWAGA: Zaleca się analizę 40-60 samców na stan/genotyp, aby uzyskać moc statystyczną i określić spójność wyników CI.

4. Test zachowania pielęgnacyjnego

  1. Arena testowania zachowań związanych z uwodzeniem
    1. Użyj małej okrągłej komory o objętości ~0,4cm3 jako areny do rejestrowania zachowań związanych z pielęgnacją.
      UWAGA: Ta sama arena zalotów opisana w sekcji 3 może być używana do testowania zachowań związanych z uwodzeniem.
    2. Ponieważ zachowanie związane z pielęgnacją obejmuje rejestrowanie ruchu drobniejszych narządów, takich jak nogi, użyj nagrywania wideo w wysokiej rozdzielczości lub o wysokim kontraście. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj rozproszonego panelu LED pokrytego szkłem jako równomiernie oświetlonej powierzchni o wymiarach 20 cm x 20 cm. Umieść komorę zalotów na górze panelu, aby światło przechodziło od dołu przez komorę.
  2. Przygotowanie much przed eksperymentem
    1. Utrzymuj eksperymentalne muchy genotypowe w butelkach z żywnością w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność.
    2. Zebrać nowo zamknięte (od 0 do 24 h) muchy o pożądanym genotypie i oddzielić je pod względem płci w zimnym znieczuleniu za pomocą stereomikroskopu, jak opisano w teście przestrzeni społecznej.
    3. Izolować samce much w probówkach z pojedynczą obudową (stosowanych w teście agresji) przez 24 godziny
      UWAGA: W przedstawionym tutaj eksperymencie użyto szczepów much: W1118 i zmutowanych much trans-heterozygoty FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
  3. Wykonywanie testu zachowań związanych z pielęgnacją
    1. Utrzymuj temperaturę 24-25 °C i wilgotność ~ 50%; przeprowadź eksperyment podczas okna czasowego ZT0-ZT316.
    2. Przenieś samca muchy trzymanego w jednej kurniku z rurki z pojedynczą obudową na arenę do pielęgnacji za pomocą aspiratora. Natychmiast odsuń otwór w pokrywie, aby upewnić się, że muchy nie mogą uciec.
    3. Umieść arenę groomingową na rozproszonym panelu LED i pozwól muszce zaaklimatyzować się na arenie przez 1 minutę. Wideo nagrywaj muchę przez 10 minut, umieszczając kamerę dokładnie pionowo nad areną zamontowaną na stojaku. Upewnij się, że rodzaje napadów pielęgnacyjnych są widoczne i wymierne na filmie.
      UWAGA: Zachowanie pielęgnacyjne obejmuje pocieranie głowy, oczu, czułków, trąbki, klatki piersiowej, brzucha, genitaliów i skrzydeł z nogami (pierwsza para: T1, druga para: T2 lub trzecia para nóg: T3). Parametry behawioralne związane z pielęgnacją, które zostały wzięte pod uwagę w tym badaniu, są opisane w Andrew et al. 41 i pokazane w Rysunek 4.
    4. Powtórz eksperyment dla każdego genotypu.
    5. Analizowanie danych behawioralnych dotyczących pielęgnacji
      1. Przeanalizuj filmy i oblicz następujące cztery parametry: wskaźnik pielęgnacji (procent czasu spędzonego na pielęgnacji); opóźnienie pielęgnacji (czas do pierwszego ataku pielęgnacji); numer ataku pielęgnacyjnego; i średni czas trwania ataku pielęgnacyjnego (całkowity czas trwania/numer ataku).
      2. Oznacz pojedynczy atak pielęgnacji jako zakończony, gdy mucha albo przestanie pokazywać którykolwiek z parametrów i pozostanie w bezruchu przez 2 sekundy, albo przerwie atak i przejdzie co najmniej 4 kroki.

5. Test do habituacji węchowej

UWAGA: Jak pokazano w Rysunek 5, końcowy montaż musi być wykonany w dniu testu Y-maze54,56.

  1. Przygotowanie much do przyzwyczajenia
    1. Do wszystkich doświadczeń należy wyhodować muchy o pożądanych genotypach w inkubatorze o temperaturze otoczenia 25 oC i wilgotności 70% w standardowym cyklu 12 h światła i 12 godzin ciemności (LD).
    2. Zbierz 0-12 h, nowo zamknięte muchy i przenieś ~30-40 much w świeżej pożywce z zaciśniętym bawełnianym korkiem.
    3. Przypisz kody do każdej butelki, aby eksperymentator nie wiedział o genotypach poddawanych eksperymentom.
  2. Indukcja habituacji węchowej
    1. Umieść 1 ml preferowanego środka zapachowego rozcieńczonego płynem parafinowym (światłem) w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Do kontroli wystarczy użyć 1 ml ciekłej parafiny w świetle w probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Wiruj zawartość w tubie przez 10 minut, aby zapewnić równomierne wymieszanie, a następnie przykryj ją równomiernie perforowaną folią.
      UWAGA: W filmie zostanie użyty 20% maślanu etylu.
    2. Użyj drutu, aby zawiesić rurki zawierające rozcieńczony środek zapachowy lub tylko rozcieńczalnik w oddzielnych butelkach z pożywkami zawierającymi muchy.
    3. Dobrze przykryj butelki bawełną, a następnie owiń papierem pakowym, aby zapobiec dyfuzji oparów środka zapachowego. Oznacz butelki kontrolne i zawierające zapach odpowiednio jako naiwne i narażone na zapach (przyzwyczajone). Przechowuj te butelki indukcyjne przez 3 dni w inkubatorze z wyżej wymienionymi warunkami.
  3. Przygotowanie much i aparat Y-labirynt
    1. Przenieść muchy z butelek indukcyjnych do fiolek zawierających tylko bibułę filtracyjną nasączoną wodą.
    2. Głodź je przez około 16-18 godzin w temperaturze pokojowej przed eksperymentem, aby zwiększyć motywację.
    3. Upewnij się, że elementy aparatu Y-labirynt są czyste i wolne od zapachu; zmontuj cztery części w pozycji pionowej. Przymocuj komory wspinaczkowe do labiryntu Y, który jest następnie połączony z górną częścią adaptera. Mocno przymocuj spód labiryntu Y do fiolki wejściowej, która służy jako centralna łodyga na dole, jak pokazano na Rysunek 5.
    4. Połącz zwężający się koniec każdej komory wspinaczkowej z butelkami z odczynnikami zawierającymi nawaniacz (rozcieńczenie 10-3 z wodą destylowaną) za pomocą bezwonnych silikonowych rurek.
    5. Pompuj nawaniacz z równym natężeniem przepływu (~120 ml/min) z butli gazowych do dwóch ramion Y za pomocą pompy próżniowej i pozwól mu nasycić się przez 15 minut, aby uzyskać konsystencję.
  4. Wykonywanie klasycznego testu labiryntu Y
    1. Delikatnie wprowadź wygłodzone muchy z każdej fiolki do fiolki wejściowej zestawu Y-maze.
    2. Pozwól im się zaaklimatyzować przez krótki czas; połącz fiolkę wejściową z adapterem labiryntu Y, aby rozpocząć test; i pozwól muchom wspiąć się na ramiona labiryntu Y i zostać uwięzionymi w dwóch komorach zbiorczych. Ustaw czas trwania każdego testu na 1 minutę.
    3. Po zakończeniu postukaj muchami na dno fiolki wejściowej i zmień pozycję ramion labiryntu Y, aby uniknąć stronniczości bocznej. Wykonaj cztery odczyty dla tego samego zestawu much.
    4. Zapisz liczbę much wspinających się na każde z dwóch ramion labiryntu Y w czasie trwania eksperymentu.
    5. Powtórz test dla co najmniej 8 partii, aby uzyskać reprezentatywny zestaw danych.
  5. Analiza i interpretacja zebranych danych
    1. Określ ilościowo wyniki, obliczając wskaźnik wydajności (PI), który można przedstawić jako różnicę między liczbą much wybierających ramię powietrzne (A) a liczbą much wybierających ramię zapachowe (O) jako ułamek całkowitej liczby much uczestniczących w badaniu.
    2. Użyj testów statystycznych (niesparowany test t-Studenta), aby sprawdzić, czy PI much naiwnych i narażonych na zapach jest znaczący.

Wyniki

Test agresji
Jako model muchy w ASD, Fmr1 wykorzystano muchy mutanty63,64. W1118 samce wykorzystano jako grupę kontrolną i Fmr1 trans-heterozygota Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 samce much jako much doświadczalnych; dorosłe samce przetrzymywano w probówkach izolacyjnych przez 5 dni. Samce homotypowe (ten sam genotyp, te same warunki utrzymania) wprowadzono do areny agresji, a ich zachowanie rejestrowano przez 20 min. Dla każdego genotypu policzono całkowitą liczbę epizodów agresji w ciągu 20 min. Stwierdzono, że liczba epizodów agresji w ciągu 20 min była istotnie niższa w przypadku samców mutantów niż u samców kontrolnych (Rysunek 1E). Ta zmniejszona agresywność w Fmr1 muchy mogą wynikać ze zmniejszonego zainteresowania interakcją społeczną z inną muchą. W przeciwieństwie do tego, w przypadku osobników utrzymywanych w grupach/warunkach społecznych Fmr1 mutant męskie muchy wykazują liczbę starć agresywnych porównywalną do liczby starć u osobników utrzymywanych w grupach społecznych Wskazówka: Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.1118 muchy (dane nie przedstawiono), co prawdopodobnie wskazuje na pozycyjną rolę środowiska społecznego w indukcji zachowań społecznych.

Analiza przestrzeni społecznej
Analizę przestrzeni społecznej przeprowadzono u much w1118 oraz w modelu ASD (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). Dla każdej muchy obliczono dystans do najbliższego sąsiada, a dla każdego genotypu wykonano 10 powtórzeń biologicznych. Muchy mutanty wykazują znacząco większe odległości od najbliższego sąsiada niż osobniki kontrolne (Rysunek 2D), co wskazuje na preferencję do zachowania większego dystansu od innych much.

Test zalotów
Test zalotów u samców much utrzymywanych pojedynczo przeprowadzono w celu ilościowego określenia wrodzonego zachowania godowego u dwóch oddzielnych modeli much ASD. Po pierwsze, zachowanie godowe much transheterozygotycznych Fmr1 porównano z zachowaniem much w1118; muchy Fmr1 wykazały znacznie niższy indeks zalotów, a także zmniejszoną liczbę prób kopulacji (Rysunek 3E1). W drugim eksperymencie wyciszono ekspresję row, ortologa genu POGZ u ludzi u Drosophila (genu o wysokim ryzyku wystąpienia ASD20), poprzez ekspresję krótkiego mikroRNA w formie spinki (shRNA) przeciwko row w neuronach ciał grzybowatych przy użyciu linii drivera MB247-GAL4. Te modelowe muchy ASD z wyciszonym genem row przebadano pod kątem wszelkich defektów wrodzonego wzorca zalotów; indeks zalotów oraz liczbę prób kopulacji obliczono na podstawie 15-minutowych nagrań wideo. Muchy z wyciszonym genem row wykazały znacznie obniżony indeks zalotów oraz mniejszą liczbę prób kopulacji (Rysunek 3E2), co wskazuje na zaburzenia w komunikacji z samicami.

Zachowanie pielęgnacyjne
Zachowanie pielęgnacyjne jest wykorzystywane jako wskaźnik zachowań powtarzalnych u Drosophila16,42,43. Zachowanie pielęgnacyjne zostało ilościowo określone u much transheterozygot Fmr1 i porównane z zachowaniem much w1118. Czas oczekiwania do pierwszego aktu pielęgnacyjnego jest znacznie skrócony u much Fmr1, natomiast średni czas trwania jednego aktu pielęgnacyjnego oraz indeks pielęgnacji są znacznie zwiększone u much Fmr1 (Rycina 4C), co wskazuje na nasilone zachowania pielęgnacyjne (lub powtarzalne) u much w modelu ASD. Z kolei całkowita liczba aktów pielęgnacyjnych u much mutantów nie wykazuje istotnych zmian w porównaniu z muchami kontrolnymi.

Test habituacji węchowej
Wykazano, że habituacja jest upośledzona u wielu osób z autyzmem, co pozwala wykorzystać ją jako test w przypadku Drosophila23. W niniejszej pracy habituację węchową w modelu ASD testowano poprzez wyciszenie ekspresji genu row w lokalnych interneuronach węchowych sterowanych przez LN1-GAL4. W eksperymentach tych, w celu wywołania habituacji u much, zastosowano awersyjny substancję zapachową – 20% maślan etylu. Wyniki pokazują, że muchy z wyciszonym genem row nie uległy habituacji po 3-dniowej ekspozycji na zapach (ostatnie dwa słupki na wykresie na Rysunku 5E nie wykazują istotnej różnicy między muchami naiwnymi a habituowanymi) w porównaniu do much typu dzikiego, które wykazały typową habituację po 3-dniowej ekspozycji na maślan etylu (muchy eksponowane wykazały istotny spadek indeksu wydajności w porównaniu do much naiwnych). Wskazuje to, że muchy z wyciszonym genem row nie ulegają habituacji po 3-dniowej ekspozycji na maślan etylu i są odpychane przez ten awersyjny zapach, co dowodzi, że te muchy w modelu ASD wykazują deficyt habituacji.

Test agresji u Drosophila: ustawienie, etapy, wyniki; rurka silikonowa, pipeta, wykres zachowań, graf.
Rysunek 1: Arena agresji i reprezentatywne wzorce behawioralne. (A) Ustawienie areny agresji w płytce 24-dołkowej z perforowaną pokrywką umożliwiającą wprowadzenie much. Wstawka: Wymiary pojedynczej areny z pożywką dla much. (B) Zdjęcie rurki do indywidualnego utrzymywania zawierającej pojedynczą, izolowaną samca muchy oraz fiolki do zbiorowego utrzymywania zawierającej muchy płci męskiej i żeńskiej, odtwarzającej środowisko społeczne. (C) Aspirator do przenoszenia much za pomocą aspiracji ustnej. Elementy wymagane do złożenia aspiratora do much z zaznaczeniem strony rurki służącej do pobierania much (koniec dla much) oraz strony wkładanej do ust (koniec ustny) (C1) oraz złożony aspirator do much (C2). (D) Reprezentatywne wzorce agresywnych zachowań samców: podejście, groźba skrzydłami, szermierka, trzymanie, wypad, boksowanie i przepychanie się. (E) Samce much z mutacją Fmr1 wykazują zmniejszoną agresję wobec innych samców w porównaniu do grupy kontrolnej. Wykres pudełkowy przedstawiający liczbę epizodów agresji dla izolowanych społecznie samców w1118 (kontrola) w porównaniu do trans-heterozygotycznych much Fmr1 (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ustawienie i wyniki eksperymentu dotyczącego dystansu społecznego much; trójkątna konstrukcja komory; naklejka z linijką; wykres danych.
Rycina 2: Konfiguracja areny do testu przestrzeni społecznej. (A) Schemat przedstawiający wymiary oraz rozmieszczenie szklanych tafli i akrylowych dystansowników. (B) Końcowy układ elementów areny, w którym dystansowniki akrylowe są umieszczone pomiędzy szklanymi elementami, pozostawiając na dole małą szczelinę umożliwiającą wejście much. Trójkątna przestrzeń utworzona między szkłem a dystansownikami stanowi arenę SSA dla much; w tej konfiguracji muchy mogą poruszać się tylko w dwóch wymiarach. (C) Zdjęcie końcowej konfiguracji areny SSA z muchami wewnątrz komory. Skrót: SSA = social space array (układ przestrzeni społecznej). (D) Muchy w modelu ASD (Fmr1 transheterozygotyczne) wykazują zwiększony dystans między sobą w teście przestrzeni społecznej w porównaniu do w1118. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Analiza zachowań godowych u much; układ doświadczalny, etapy obserwacji, wykresy behawioralne.
Rysunek 3: Arena godowa i reprezentatywne wzorce behawioralne.Schematy przedstawiające (A) projekt i (B) rozmieszczenie dysków w arenie do testów godowych. (C) Zdjęcie areny godowej po końcowym rozmieszczeniu. (D) Reprezentatywne obrazy przedstawiające wzorce zachowań godowych naiwnego samca wobec sparowanej samicy: pościg, orientacja, drganie skrzydeł, lizanie, próba kopulacji oraz kopulacja. (E) Wykresy przedstawiające indeks godowy i liczbę prób kopulacji w dwóch modelach ASD: (E1) muchy mutanty Fmr1 wykazujące znaczną redukcję indeksu godowego i prób kopulacji w porównaniu z kontrolą w1118. (E2) muchy z wyciszeniem genu row użyte jako kolejny model ASD, w których row-shRNA był wyrażany w neuronach ciał grzybowych (MB247-GAL4); po wyciszeniu genu row zaobserwowano znaczną redukcję zachowań godowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Zachowania pielęgnacyjne u Drosophila; układ eksperymentalny, etapy zachowań much oraz wykresy analizy danych.
Rysunek 4Konfiguracja areny i reprezentatywne wzorce zachowań pielęgnacyjnych. (A) Arena w kształcie tarczy lub koła (ta sama arena do zalotów pokazana w Rysunek 3) ustawiono na panelu LED z dyfuzorem w celu zapewnienia równomiernego oświetlenia od dołu, a obraz wideo rejestrowano z góry. Zapewnia to wyższy kontrast, niezbędny do zidentyfikowania subtelnych ruchów wyrostków podczas pielęgnacji. (B) Fotografie wzorców zachowań pielęgnacyjnych obserwowanych u dorosłych samców much. T1 = 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. para nóg, T2 = 2nd para nóg, T3 = trzecia para nóg. W odniesieniu do wzorców pielęgnacji (grooming patterns) zastosowano intuicyjną nomenklaturę skróconą w B: T1-head = pocieranie głowy pierwszą parą nóg; T1-T1 = pocieranie o siebie pierwszej pary nóg i tak dalej. Skrót: LED = dioda emitująca światło. (C) Wykresy przedstawiające wyniki testu pielęgnacyjnego przeprowadzonego w Fmr1 muchy trans-heterozygotyczne i porównano je z w1118. Fmr1 muchy mutanty wykazały znacznie krótszy czas utajenia do pierwszej serii pielęgnacji, co wskazuje na wcześniejsze rozpoczęcie pielęgnacji w porównaniu z grupą kontrolną. Ponadto średni czas trwania serii pielęgnacji oraz indeks pielęgnacji były znacznie zwiększone w Fmr1 mutantów, co wskazuje na nasilenie zachowań repetytywnych u much w modelu ASD. W przeciwieństwie do tego, całkowita liczba epizodów pielęgnacji (grooming) nie uległa istotnej zmianie u much mutantów w porównaniu z grupą kontrolną. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ i wyniki testu węchowego w labiryncie Y; ekspozycja much na substancję zapachową, analiza habituacji, wykres wyników.
Rysunek 5Indukcja i przygotowanie badania do testu habituacji węchowej oraz reprezentatywny wynik po przeprowadzeniu badania. (A) Elementy układu do testu binarnego wyboru zapachowego: (A1) labirynt w kształcie litery Y, (A2) adapter, (A3) układ tych dwóch, (A4) para probówek zbiorczych do zamocowania na końcach ramion labiryntu w kształcie litery Y, (A5) szklana butelka i szklane rurki służące do przechowywania roztworu substancji zapachowej lub wody, przez którą przepływa powietrze przed przedostaniem się do labiryntu w kształcie litery Y. (B) Przygotowanie butelek z pożywką dla muszek w celu indukcji habituacji węchowej; schemat (B1) przedstawia sposób zawieszenia probówki do wirówki zawierającej substancję zapachową na miedzianym drucie w połowie wysokości wnętrza butelki; (B2na koniec otwór butelki zostaje przykryty watą i zabezpieczony brązową kopertą papierową.C) Zdjęcie całkowitego układu zestawu labiryntu w kształcie litery Y. (D) Fotografie przedstawiające rozmieszczenie much w komorach zbierających po zakończeniu eksperymentu. (D1) Muchy naiwne (eksponowane wyłącznie na bezwonny parafinię, grupa kontrolna) wykazują odrazę do awersyjnego substancji zapachowej (w niniejszym badaniu do indukcji habituacji użyto 20% maślanu etylu) i wybierają ramię labiryntu w kształcie litery Y wypełnione zwykłym powietrzem, podczas gdy (D2) wystawione (oswojone) muchy rozmieszczają się równomiernie w obu ramionach. Skrót: ID = średnica wewnętrzna. (E) wyniki testu habituacji węchowej u rzęd-muchy z wyciszonym ekspresją genu wykazywały deficyt habituacji. Muchy typu dzikiego (Canton S), po 3-dniowej ekspozycji na maślan etylu, wykazały istotny spadek indeksu wydajności w porównaniu z muchami naiwnymi, co wskazuje na habituację. Gdy potomstwo LN1-GAL4 x rowMuchy shRNA poddano ekspozycji przez 3 dni; nie stwierdzono istotnych różnic w indeksie wydajności w porównaniu z muchami naiwnymi; dowodzi to, że muchy z wyciszeniem genu row nie uległy habituacji podczas 3-dniowej ekspozycji na substancję zapachową, co odzwierciedla objaw przypominający ludzkie ASD. Skróty: ASD = zaburzenia spektrum autyzmu; shRNA = krótkie kręcone RNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Drosophila jest wykorzystywana jako doskonały organizm modelowy do badań nad zaburzeniami neurologicznymi człowieka ze względu na wysoki stopień zachowania sekwencji genów między genami chorób muchowychi ludzkich 9. Liczne solidne paradygmaty behawioralne sprawiają, że jest to atrakcyjny model do badania fenotypów manifestujących się w mutantach rekapitulujących ludzkie choroby. Ponieważ setki genów są zaangażowane w zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD), nie istnieje żaden wspólny model ASD w żadnym organizmie modelowym. Dlatego dla każdego mutanta naukowcy muszą najpierw ustalić fenotypy podobne do ASD u muchy. W tym artykule staraliśmy się usprawnić ten proces, proponując zastosowanie pięciu paradygmatów behawioralnych much w połączeniu do takiej oceny. Paradygmaty te są stosowane u much do oceny głównych i powszechnie występujących deficytów behawioralnych u pacjentów z ASD: deficytów społecznych i komunikacyjnych, wzmocnienia powtarzających się zachowań i wady przyzwyczajenia. Jeśli mutacja genu muchy wykazuje defekty we wszystkich lub większości z tych pięciu paradygmatów, może to być silnym wskaźnikiem scenariusza podobnego do ASD.

Większość opisanych tu paradygmatów behawioralnych była wielokrotnie wykorzystywana w dotychczasowej literaturze do rozwiązywania różnorodnych pytań badawczych. Nierzadko zdarza się, że w różnych badaniach można znaleźć różnice w technikach. Poprawki w technikach zostały wprowadzone w celu dopasowania do potrzeb badawczych i wymagań konkretnego pytania, które jest rozwiązywane. Na przykład w teście zalotów wrodzone i wyuczone zachowania związane z zalotami można określić ilościowo w stosunku do muchy testowej, którą może być niedojrzały samiec65, dziewicza samica 66,67, samica w wieku 68,69,70, zamrożona dziewicza samica 65, a nawet samica pozbawiona głowy19. W metodzie opisanej w tym artykule, wstępnie kryte samice typu dzikiego zostały użyte jako tester do sprawdzenia wzorca zalotów samca muchy modelowej z ASD. Receptywność wysiękowa samicy przed kryciem jest stosunkowo niższa niż u dziewiczej muchy71. W rezultacie liczba męskich zalotów i czas ich trwania są bardziej w kierunku pokrytej samicy niż dziewicy; Podobnie, opóźnienie do kopulacji jest również dłuższe niż u dziewiczych samic testujących, w którym to przypadku wczesna kopulacja prowadzi do zmniejszonego wskaźnika zalotów, zmniejszając zakres skutecznego porównania genotypów. W związku z tym użycie premated samicy jako testera zapewnia lepszą analizę porównawczą zachowań godowych muchy ASD w porównaniu z muchą typu dzikiego. Z drugiej strony, wykorzystanie dziewiczych samic może dostarczyć dodatkowych informacji, które mogą być zamaskowane, gdy wykorzystywane są kryte samice. Wykorzystanie krytych samic może również wpływać i zmieniać zachowania samców związane z zalotami. Podsumowując, sugeruje się, aby badacze wybrali strategię i szczegóły eksperymentu w zależności od konieczności konkretnego eksperymentu.

Należy być ostrożnym przed zastosowaniem tej techniki na którymkolwiek lub wszystkich homologach genów ASD u much. Wszystkie te paradygmaty behawioralne są regulowane przez specyficzną i niewielką liczbę neuronów. Ekspresja określonego genu musi zostać najpierw ustalona przed przejściem do określonego paradygmatu behawioralnego. Na przykład, jeśli homolog muchy genu związanego z ASD nie ulega ekspresji w neuronach ciała grzyba lub neuronach glutaminergicznym, to zachowanie związane z zalotami i pielęgnacją może nie być zakłócone w jego mutancie.

Kolejną kwestią, na którą naukowcy muszą uważać, jest to, że brak defektu nie zawsze oznacza, że mutacja nie odgrywa żadnej roli. Na przykład w eksperymentach z zachowaniem uwodzenia z mutantami Fmr1 całkowita liczba napadów uwodzenia nie jest znacząco niższa u mutantów niż u grupy kontrolnej, podczas gdy inne parametry, takie jak wskaźnik pielęgnacji itp., wykazują defekt w zachowaniu pielęgnacyjnym. Można to wytłumaczyć przedłużeniem każdego ataku uwodzenia u mutantów Fmr1 , co skutkuje niską liczbą całkowitych ataków, mimo że całkowity czas trwania ataku jest znacznie dłuższy. Podkreśla to potrzebę kwantyfikacji wielu parametrów dla każdego wzorca zachowania. Ponadto należy pamiętać, że termin ASD obejmuje szeroki zakres chorób spowodowanych zmianami w jednym z setek genów, co skutkuje niejednorodnymi fenotypami o różnym stopniu penetracji wśród dotkniętych nimi osób. Na przykład deficyt habituacji obserwuje się u niektórych pacjentów, ale nie u wszystkich. Tego samego można się spodziewać w modelach muchowych choroby.

Do analizy zachowań agresywnych w tym badaniu wzięto pod uwagę różne rodzaje parametrów agresywnych: rzucanie się, zagrożenie skrzydłami, szarpanie się itp. (Ryc. 1)30. Każda walka musi być zidentyfikowana i liczona albo jako indywidualny typ walki, albo jako całkowita liczba walk. Ważne jest, aby najpierw zapoznać się z wzorcami agresji samców much, które są opisane w 59,72 i pokazane na rysunku 1. Podczas liczenia liczby agresywnych ataków, punkty początkowe i końcowe pojedynczego zdarzenia agresji muszą być wyraźnie określone; Wiele rodzajów wzorców agresji może być pokazanych w jednym ataku, po którym następuje koniec walki. Atak agresji uważa się za zakończony, gdy mucha albo przestaje wykazywać jakiekolwiek agresywne zachowania lub ruchy na 2 sekundy, albo przerywa atak i zaczyna odchodzić.

Większość z tych paradygmatów behawioralnych ma wiele odmian i postępów opisanych przez wiele laboratoriów. Każda z konkretnych modyfikacji została stworzona z myślą o zaspokojeniu potrzeb konkretnego celu. Podobnie, zautomatyzowane i oparte na algorytmach techniki kwantyfikacji lub analizy uwolniły te techniki od ryzyka błędów ręcznych. W tym artykule zademonstrowano najbardziej podstawowe techniki przy najmniejszych wymaganiach materiałowych, w nadziei, że techniki te mogą być łatwo przyjęte i wykorzystane przez maksymalną liczbę badaczy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Jesteśmy niezmiernie wdzięczni Mani Ramaswamiemu (NCBS, Bangalore) i Baskarowi Bakthavachalu (IIT Mandi) za przygotowanie testu habituacji i wyboru zapachu, Pavanowi Agrawalowi (MAHE) za cenne sugestie dotyczące testu agresji, Amitava Majumdar (NCCS, Pune) za podzielenie się swoim prototypem komory testowej do zalotów i linii mutantów Fmr1 oraz Gaurav Das (NCCS, Pune) za udostępnienie linii MB247-GAL4. Dziękujemy Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana, USA), National Institute of Genetics (NIG, Kioto, Japonia), Banaras Hindu University (BHU, Varanasi, Indie) i National Center for Biological Science (NCBS, Bangalore, Indie) za linie Drosophila. Prace w laboratorium były wspierane przez granty z SERB-DST (ECR/2017/002963) dla AD, stypendium DBT Ramalingaswami przyznane AD (BT/RLF/Re-entry/11/2016) oraz wsparcie instytucjonalne z IIT Kharagpur z Indii. SD i SM otrzymują stypendia doktoranckie w ramach CSIR-Senior Research Fellowship; PM otrzymuje stypendium doktoranckie w MHRD w Indiach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
< silna>Arena agresji:
Standardowa 24-dołkowa płytka wykonana z przezroczystego polistyrenu12 cm x 8 cm x 2 cm. Średnica pojedynczego dołka = 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; głębokość = 1 cm
Przezroczysty arkuszAlternatywnie: perforowana pokrywa płytki do hodowli komórkowej
Test przestrzeni społecznej:
Spinki do segregatorów19 mm
Arkusze szkła i arkusze akrylowe o niestandardowych rozmiarachGrubość = 5 mm
Test zalotów:
Nakrętka i śruba z gwintem
Arkusze pleksiglasu o niestandardowych kształtachi) Pokrywka: Wykonana na zamówienie okrągła przezroczysta tarcza z pleksiglasu (grubość 2-3 mm, średnica 70 mm) z jednym otworem załadowczym w obszarze obwodowym i drugim otworem na pośrodku (średnica ~ 3 mm dla każdego); ii) Drugi przezroczysty, grubszy krążek z pleksiglasu (grubość 3-4 mm, średnica 70 mm), z 6-8 perforacjami o średnicy 15 mm, w równej odległości od środka; iii) Podstawa: taka sama jak pokrywa, z wyjątkiem braku otworu załadowczego
< mocny> Test pielęgnacji: < / mocny>
Rozproszony panel10 & ndash; 15-watowy panel LED do montażu na suficie
Habituacja i test labiryntu Y< / strong>
Komory wspinaczkowex2, Adapter ze szkła borokrzemianowego
do podłączenia labiryntu Y z fiolką wejściowąPerspex, wykonany na zamówienie, wymiary w Rysunek 5A< / strong>
Przezroczyste butelki z odczynnikamiBorosil #1500017
do płukania gazemBorosil #1761021
Fiolka szklanaOD= 25 mm x Wysokość= 85 mm; Środek zapachowy ze szkła borokrzemianowego
(maślan etylu)Merck #E15701
Wosk parafinowy (płynny) lekkiSRL #18211
Zaciski rolkowePolymed #14098
Rurki silikonoweOD = 0,6 cm, ID = 0,3 cm; zaciski rolkowe do kontroli przepływu
PompaHana #HN-648 (Dowolna pompa akwariowa z kierunkiem przepływu odwrócone ręcznie)
Y-mazeSzkło borokrzemianowe
Szklana rurka w kształcie litery Y (szkło borokrzemianowe)Wykonane na zamówienie, pomiary w Rysunek 5A< / mocny>
Typowe elementy:
Dowolne oprogramowanie do odtwarzania wideo (np. Odtwarzacz multimedialny VLC)https://www.videolan.org/vlc/
Komputer do analizy
Butelki na muchyOD= 60 mm x Wysokość= 140 mm; szkło/polipropylen
Fiolki na muchyOD= 25 mm x Wysokość= 85 mm; Szkło borokrzemianowe
Graph-pad Prism oprogramowaniehttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/
ImageJ oprogramowaniehttps://imagej.net/downloads
Timer
Kamera wideo z konfiguracjąKamera lub kamera w telefonie komórkowym będzie działać
< mocny> Do aspiratora much: < / mocny>
bawełnianychłonny, autoklawowany
ParafilmSigma-aldrich #P7793
Końcówki200 i mikro; L lub 1000 &mikro; L, wybierz depensację na zewnętrznej średnicy rurki silikonowej
rurki= 30-50 cm. Tuba powinna być bezwonna
Skład pokarmu dla much:
Składniki (ilość na 1 L karmy)
Agar (8 g)SRL # 19661 (CAS: 9002-18-0)
Mąka kukurydziana (80 g)Organiczna, lokalnie pozyskiwana
D-glukoza (20 g)SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)
Kwas propionowy (4 g)SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)
Sacharoza (40 g)SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)
Tego (Hydroksybenzoesan metylu) (1,25 g)SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)
Drożdże w proszku (10 g)HIMEDIA # RM027
Fly linki używane w eksperymentach w tym badaniu:
Typ dziki (Canton S lub CS)BDSC # 64349
w1118BDSC # 3605
w[1118]; Fmr1[Δ 50M]/TM6B, Tb[+]BDSC # 6930
w[*]; Fmr1[Δ 113M]/TM6B, Tb[1]BDSC # 67403
MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, Indie)BDSC # 50742
LN1-GAL4NP1227, konsorcjum NP, Japonia
row-shRNABDSC # 25971
z tworzywa sztucznego/akrylu LED pokryty szkłem Korek próżniowa danych wideo nagrywania wideo do pipet Długość silikonowej / gumowej

Bibliografia

  1. American Psychiatric Association. American Psychiatric Association DSM-5 Task Force Diagnostic and statistical manual of mental disorders: DSM-5TM, 5th ed. , Am. Psychiatr. Publ. Inc. (2013).
  2. Zeidan, J., et al. Global prevalence of autism: A systematic review update. Autism Res. 15 (5), 778(2022).
  3. Lordan, R., Storni, C., De Benedictis, C. A. Autism spectrum disorders: diagnosis and treatment. Autism Spectr Disord. , Exon Publications. (2021).
  4. Horev, G., et al. Dosage-dependent phenotypes in models of 16p11.2 lesions found in autism. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 17076-17081 (2011).
  5. Bey, A. L., Jiang, Y. Overview of mouse models of autism spectrum disorders. Curr Protoc Pharmacol. 66 (1), 1(2014).
  6. Fetit, R., Price, D. J., Lawrie, S. M., Johnstone, M. Understanding the clinical manifestations of 16p11.2 deletion syndrome: a series of developmental case reports in children. Psychiatr Genet. 30 (5), 136-140 (2020).
  7. Nicolini, C., Fahnestock, M. The valproic acid-induced rodent model of autism. Exp Neurol. 299, 217-227 (2018).
  8. Tartaglione, A. M., Schiavi, S., Calamandrei, G., Trezza, V. Prenatal valproate in rodents as a tool to understand the neural underpinnings of social dysfunctions in autism spectrum disorder. Neuropharmacology. 159, 107477(2019).
  9. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophilamelanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
  10. Coll-Tane, M., Krebbers, A., Castells-Nobau, A., Zweier, C., Schenck, A. Intellectual disability and autism spectrum disorders "on the fly": Insights from Drosophila. DMM Dis Model Mech. 12 (5), 1-16 (2019).
  11. Tian, Y., Zhang, Z. C., Han, J. Drosophila studies on autism spectrum disorders. Neurosci Bull. 33 (6), 737-746 (2017).
  12. Ueoka, I., Pham, H. T. N., Matsumoto, K., Yamaguchi, M. Autism spectrum disorder-related syndromes: Modeling with Drosophila and rodents. Int J Mol Sci. 20 (17), 1-24 (2019).
  13. Yost, R. T., et al. Abnormal social interactions in a Drosophila mutant of an autism candidate gene: Neuroligin 3. Int J Mol Sci. 21 (13), 1-20 (2020).
  14. Wise, A., et al. Drosophila mutants of the autism candidate gene neurobeachin (rugose) exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, impaired adult social behavior and activity patterns. J Neurogenet. 29 (2-3), 135-143 (2015).
  15. Koemans, T. S., et al. Functional convergence of histone methyltransferases EHMT1 and KMT2C involved in intellectual disability and autism spectrum disorder. PLoS Genet. 13 (10), e1006864(2017).
  16. Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated levels of the vesicular monoamine transporter and a novel repetitive behavior in the Drosophila model of fragile X syndrome. PLoS One. 6 (11), e27100(2011).
  17. Iyer, J., et al. Pervasive genetic interactions modulate neurodevelopmental defects of the autism-associated 16p11.2 deletion in Drosophilamelanogaster. Nat Commun. 9 (1), 1-19 (2018).
  18. Palacios-Muñoz, A., et al. Mutations in trpγ, the homologue of TRPC6 autism candidate gene, causes autism-like behavioral deficits in Drosophila. Mol Psychiatry. 27 (8), 3328-3342 (2022).
  19. Hahn, N., et al. Monogenic heritable autism gene neuroligin impacts Drosophila social behaviour. Behav Brain Res. 252, 450-457 (2013).
  20. Stessman, H. A. F., et al. Disruption of POGZ is associated with intellectual disability and autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 98 (3), 541-552 (2016).
  21. Hope, K. A., et al. The Drosophila gene sulfateless modulates autism-like behaviors. Front Genet. 10, 574(2019).
  22. Stessman, H. A. F., et al. Targeted sequencing identifies 91 neurodevelopmental-disorder risk genes with autism and developmental-disability biases. Nat Genet. 49 (4), 515-526 (2017).
  23. Fenckova, M., et al. Habituation learning is a widely affected mechanism in Drosophila models of intellectual disability and autism spectrum disorders. Biol Psychiatry. 86 (4), 294-305 (2019).
  24. Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and "loser" effect formation in Drosophilamelanogaster. Learn Mem. 22 (2), 64-68 (2015).
  25. Anderson, D. J. Circuit modules linking internal states and social behaviour in flies and mice. Nat Rev Neurosci. 17 (11), 692-704 (2016).
  26. Flanigan, M. E., Russo, S. J. Recent advances in the study of aggression. Neuropsychopharmacology. 44 (2), 241-244 (2018).
  27. Sun, Y., et al. Social attraction in Drosophila is regulated by the mushroom body and serotonergic system. Nat Commun. 11 (1), 1-14 (2020).
  28. Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophilamelanogaster. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12342-12347 (2004).
  29. Kravitz, E. A., Fernandez, M. delaP. Aggression in Drosophila. Behav Neurosci. 129 (5), 549-563 (2015).
  30. Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (8), 5664-5668 (2002).
  31. Zwarts, L., Versteven, M., Callaerts, P. Genetics and neurobiology of aggression in Drosophila. Fly (Austin). 6 (1), 35-48 (2012).
  32. Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J Vis Exp. (2), e155(2007).
  33. Agrawal, P., Kao, D., Chung, P., Looger, L. L. The neuropeptide Drosulfakinin regulates social isolation-induced aggression in Drosophila. J Exp Biol. 223 (2), 207407(2020).
  34. Wang, L., Dankert, H., Perona, P., Anderson, D. J. A common genetic target for environmental and heritable influences on aggressiveness in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5657-5663 (2008).
  35. Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila: Measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11 (2), 243-252 (2012).
  36. Corthals, K., et al. Neuroligins Nlg2 and Nlg4 affect social behavior in Drosophilamelanogaster. Front Psychiatry. 8, 113(2017).
  37. Cao, H., Tang, J., Liu, Q., Huang, J., Xu, R. Autism-like behaviors regulated by the serotonin receptor 5-HT2B in the dorsal fan-shaped body neurons of Drosophilamelanogaster. Eur J Med Res. 27 (1), 1-15 (2022).
  38. Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophilamelanogaster behavior - A new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
  39. Shilpa, O., Anupama, K. P., Antony, A., Gurushankara, H. P. Lead (Pb)-induced oxidative stress mediates sex-specific autistic-like behaviour in Drosophilamelanogaster. Mol Neurobiol. 58 (12), 6378-6393 (2021).
  40. Dockendorff, T. C., et al. Drosophila lacking dfmr1 activity show defects in crcadian output and fail to maintain courtship interest. Neuron. 34 (6), 973-984 (2002).
  41. Andrew, D. R., et al. Spontaneous motor-behavior abnormalities in two Drosophila models of neurodevelopmental disorders. J Neurogenet. 35 (1), 1-22 (2021).
  42. Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. J Vis Exp. (125), e55231(2017).
  43. Qiao, B., Li, C., Allen, V. W., Shirasu-Hiza, M., Syed, S. Automated analysis of long-term grooming behavior in Drosophila using a k-nearest neighbors classifier. Elife. 7, e34497(2018).
  44. Webb, S. J., et al. Toddlers with elevated autism symptoms show slowed habituation to faces. Child Neuropsychol. 16 (3), 255-278 (2010).
  45. Kleinhans, N. M., et al. Reduced neural habituation in the amygdala and social impairments in autism spectrum disorders. Am J Psychiatry. 166 (4), 467-475 (2009).
  46. Ethridge, L. E., et al. Reduced habituation of auditory evoked potentials indicate cortical hyper-excitability in Fragile X Syndrome. Transl Psychiatry. 6 (4), e787-e787 (2016).
  47. McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis. Neurosci Biobehav Rev. 80, 286-305 (2017).
  48. Kuiper, M. W. M., Verhoeven, E. W. M., Geurts, H. M. Stop making noise! Auditory sensitivity in adults with an autism spectrum disorder diagnosis: physiological habituation and subjective detection thresholds. J Autism Dev Disord. 49 (5), 2116-2128 (2019).
  49. McDiarmid, T. A., et al. Systematic phenomics analysis of autism-associated genes reveals parallel networks underlying reversible impairments in habituation. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (1), 656-667 (2020).
  50. Lyons-Warren, A. M., Herman, I., Hunt, P. J., Arenkiel, B. A systematic-review of olfactory deficits in neurodevelopmental disorders: From mouse to human. Neurosci Biobehav Rev. 125, 110-121 (2021).
  51. Kepler, L. D., McDiarmid, T. A., Rankin, C. H. Habituation in high-throughput genetic model organisms as a tool to investigate the mechanisms of neurodevelopmental disorders. Neurobiol Learn Mem. 171, 107208(2020).
  52. Huang, T. N., Yen, T. L., Qiu, L. R., Chuang, H. C., Lerch, J. P., Hsueh, Y. P. Haploinsufficiency of autism causative gene Tbr1 impairs olfactory discrimination and neuronal activation of the olfactory system in mice. Mol Autism. 10 (1), 1-16 (2019).
  53. Twick, I., Lee, J. A., Ramaswami, M. Chapter 1 - Olfactory habituation in Drosophila-odor encoding and its plasticity in the antennal lobe. Prog Brain Res. 208, 3-38 (2014).
  54. Das, S., et al. Plasticity of local GABAergic interneurons drives olfactory habituation. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (36), E646-E654 (2011).
  55. Devaud, J. M., Acebes, A., Ferrús, A. Odor exposure causes central adaptation and morphological changes in selected olfactory glomeruli in Drosophila. J Neurosci. 21 (16), 6274-6282 (2001).
  56. Ayyub, C., Paranjape, J., Rodrigues, V., Siddiqi, O. Genetics of olfactory behavior in Drosophilamelanogaster. J Neurogenet. 6 (4), 243-262 (1990).
  57. Michel, C. I., Kraft, R., Restifo, L. L. Defective neuronal development in the mushroom bodies of Drosophila fragile X mental retardation 1 mutants. J Neurosci. 24 (25), 5798-5809 (2004).
  58. Fernandez, M. P., Trannoy, S., Certel, S. J. Fighting flies: quantifying and analyzing Drosophila aggression. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 107985(2023).
  59. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  60. Simon, A. F., et al. Drosophila vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181 (2), 525-541 (2008).
  61. McNeil, A. R., et al. Conditions affecting social space in Drosophilamelanogaster. J Vis Exp. (105), e53242(2015).
  62. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  63. Drozd, M., Bardoni, B., Capovilla, M. Modeling Fragile X Syndrome in Drosophila. Front Mol Neurosci. 11, 124(2018).
  64. Trajković, J., et al. Drosophilamelanogaster as a model to study Fragile X-associated disorders. Genes (Basel). 14 (1), 87(2022).
  65. Gailey, D. A., Jackson, F. R., Siegel, R. W. Male courtship in Drosophila: the conditioned response to immature males and its genetic control. Genetics. 102 (4), 771-782 (1982).
  66. Cannon, R. J. C. Drosophila courtship behaviour. Courtship and Mate-finding Insects. , 1-13 (2023).
  67. von Philipsborn, A. C., Shohat-Ophir, G., Rezaval, C. Single-pair courtship and competition assays in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (7), 450-459 (2023).
  68. Keleman, K., Krüttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nat Neurosci. 10 (12), 1587-1593 (2007).
  69. Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. J Vis Exp. (124), e55808(2017).
  70. Fitzsimons, H. L., Scott, M. J. Genetic modulation of Rpd3 expression impairs long-term courtship memory in Drosophila. PLoS One. 6 (12), e29171(2011).
  71. Kubli, E. My favorite molecule. The sex-peptide. BioEssays. 14 (11), 779-784 (1992).
  72. Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophilamelanogaster. Nat Protoc. 2 (11), 2712-2718 (2007).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model autyzmu u Drosophilaparadygmaty behawioralnetest przestrzeni spo ecznejtest agresjizachowania godowezachowania piel gnacyjnetest habituacjizaburzenia neurorozwojowewyciszanie gen wzachowania powtarzalne
Paradygmaty oceny behawioralnej w modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.