Paradygmaty oceny behawioralnej w modelu zaburzenia ze spektrum autyzmu Drosophila

Zaburzenie ze spektrum autyzmu (ASD) obejmuje niejednorodną grupę zaburzeń neurologicznych. Obejmuje szereg złożonych zaburzeń neurorozwojowych charakteryzujących się wielokontekstowymi i uporczywymi deficytami w komunikacji społecznej i interakcjach społecznych oraz obecnością ograniczonych, powtarzających się wzorców zachowań i aktywności oraz zainteresowań¹. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) u 1 na 100 dzieci na całym świecie diagnozuje się ASD, a stosunek mężczyzn do kobiet wynosi 4,2². Choroba ujawnia się w drugim lub trzecim roku życia. Dzieci z ASD wykazują brak zainteresowania wzajemnością społeczno-emocjonalną, komunikacją niewerbalną i umiejętnościami relacyjnymi. Wykazują powtarzające się zachowania, takie jak stereotypowe ruchy motoryczne, nieelastyczne i zrytualizowane podążanie za rutyną oraz intensywne skupienie się na ograniczonych zainteresowaniach. Dzieci z ASD wykazują wysoki stopień reakcji na dotyk, zapach, dźwięk i smak, podczas gdy reakcja na ból i temperaturę jest stosunkowo niska¹. Penetracja tego zaburzenia jest również różna u różnych pacjentów cierpiących na ASD, a co za tym idzie, zmienność wzrasta.

Obecna diagnoza kliniczna ASD opiera się na ocenie behawioralnej osób, ponieważ nie ma potwierdzającego testu opartego na biomarkerach ani wspólnego testu genetycznego, który obejmowałby wszystkie formy ASD³. Rozszyfrowanie podstaw genetycznych i neurofizjologicznych byłoby pomocne w ukierunkowaniu strategii leczenia. W ciągu ostatniej dekady wiele badań zaowocowało identyfikacją setek genów, które są albo usunięte, albo zmutowane, albo których poziom ekspresji jest zmieniony u pacjentów z ASD. Trwające badania kładą nacisk na walidację wkładu tych genów kandydujących przy użyciu organizmów modelowych, takich jak mysz lub muszka owocowa, w których geny te są nokautowane lub powalane, a następnie przeprowadzane są testy na deficyty behawioralne podobne do ASD i wyjaśnienie podstawowych szlaków genetycznych i molekularnych powodujących anomalie. Model mysi rekapitulujący warianty liczby kopii (CNV) w ludzkich loci chromosomowych 16p11.2 pokazuje niektóre z wad behawioralnych ASD^4,5,6. Prenatalna ekspozycja na teratogenny lek kwas walproinowy (VPA) to kolejny model myszy przedstawiający cechy przypominające ludzkie ASD^7,8. Ponadto istnieje szereg modeli mysich, które wykazują autyzm związany z zespołem genetycznym, na przykład jednogenowe modele syndromiczne spowodowane mutacjami w Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c i jednogenowe modele niesyndromiczne spowodowane mutacjami w genach takich jak Geny Cntnap2, Shank, Neurexin lub Neuroligin⁵.

Muszka owocowa (Drosophila melanogaster) to kolejny ważny organizm modelowy do badania komórkowych, molekularnych i genetycznych podstaw wielu ludzkich zaburzeń⁹, w tym ASD. Drosophila i ludzie dzielą wysoce konserwatywne procesy biologiczne na poziomie molekularnym, komórkowym i synaptycznym. Muszki owocowe zostały z powodzeniem wykorzystane w badaniach nad ASD^10,11,12 do scharakteryzowania genów związanych z ASD i rozszyfrowania ich dokładnej roli w synaptogenezie, funkcji synaptycznej i plastyczności, tworzeniu obwodów nerwowych i dojrzewaniu; Stwierdzono, że homologi genów związanych z ASD odgrywają rolę w regulacji zachowań społecznych i/lub powtarzalnych^{11,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. Muszka owocowa sprawdziła się również jako model do badań przesiewowych genów ASD i ich wariantów^15,22,23. Największym wyzwaniem w badaniach nad ASD u much jest to, że w przeciwieństwie do innych modeli chorób, nie ma jednego modelu muchy ASD. Aby zrozumieć wpływ mutacji lub powalenia określonego genu ASD, badacz musi zweryfikować, czy fenotypy behawioralne wystarczająco naśladują objawy pacjentów z ASD, a następnie przejść do zrozumienia molekularnych lub fizjologicznych podstaw fenotypów.

Stąd, wykrywanie fenotypów podobnych do ASD jest niezbędne do badań nad ASD w modelu muchowym. Na przestrzeni lat pojawiło się kilka technik behawioralnych, które pozwalają nam wykryć nieprawidłowości, takie jak deficyty w zachowaniach / interakcjach społecznych, komunikacji, powtarzających się zachowaniach i reagowaniu na bodźce. Ponadto w różnych laboratoriach dokonano kilku modyfikacji i ulepszeń tych technik behawioralnych, aby spełnić określone wymagania, takie jak skalowanie, automatyzacja testów, odczyty, kwantyfikacja i metody porównawcze. W tym artykule wideo przedstawiono najbardziej podstawowe wersje pięciu paradygmatów behawioralnych, które w połączeniu można wykorzystać do wykrywania wyników behawioralnych podobnych do ASD w najprostszy sposób.

Agresja to ewolucyjnie zachowane wrodzone zachowanie wpływające na przetrwanie i reprodukcję²⁴. Na agresywne zachowanie w stosunku do współplemieńców wpływa 'motywacja do socjalizacji'^25,26 oraz 'communication'²⁷, oba są zagrożone u osób dotkniętych ASD. Agresywne zachowanie jest dobrze opisane u Drosophila, a jego kwantyfikowalność dzięki solidnemu testowi agresji^28,29,30 oraz dobrze poznane podstawy genetyczne i neurobiologiczne³¹ sprawia, że jest to odpowiedni paradygmat behawioralny³² do oceny fenotypu ASD w modelu muchy. Na agresję wpływa izolacja społeczna z dala od środowiska społecznego, co prowadzi do nasilenia agresji; To samo zaobserwowano, gdy samce much są trzymane w izolacji przez kilka dni^33,34. Innym testem behawioralnym, który określa ilościowo towarzyskość u much, jest Social Space Assay³⁵, który mierzy odległości między najbliższymi sąsiadami i odległości między muchami w małej grupie much, dzięki czemu doskonale nadaje się do testowania ról ortologów genu ASD w fly^12,21,36,37, a także modeli muchy ASD wywołanych przez środowisko^38,39.

Test zalotów Drosophila to kolejny paradygmat behawioralny często używany do testowania zmian w umiejętnościach społecznych i komunikacyjnych po obwodzie lub manipulacji genetycznej, w tym genów związanych z autyzmem^18,19,21,40. Powtarzające się wzorce zachowań są powszechne u pacjentów z ASD, co jest rekapitulowane u much poprzez zachowanie pielęgnacyjne - serię odrębnych, stereotypowych czynności wykonywanych w celu czyszczenia i innych celów. Został z powodzeniem wykorzystany do badania wpływu mutacji genu ASD na muchy^21,41, a także narażenia na chemikalia^38,39. Wiele postępów i automatyzacji w teście zostało opisanych wcześniej^16,41,42,43; Tutaj demonstrujemy najbardziej podstawowy wzór testu, który jest łatwy do przyjęcia i określenia ilościowego.

ASD jest znane z tego, że wpływa na zdolność do habituacji, uczenia się i pamięci u niektórych pacjentów^{44,45,46,47,48,49,50}, organizmy modelowe ASD^51,52 a także powoduje deficyty w różnych zachowaniach węchowych50. Habituacja Drosophila do lekkiego skoku była wcześniej używana do badań przesiewowych w kierunku genów ASD²³. Habituację można ocenić za pomocą prostej metody testu habituacji węchowej^53,54,55. Opisujemy metodę wywoływania habituacji węchowej i oznaczania wyniku za pomocą klasycznego binarnego testu wyboru zapachu opartego na labiryncie Y⁵⁶, który można wykorzystać do wykrywania defektów habituacji w mutancie genu ASD lub stanie knockdown genu. Aby ocenić, czy wpływ mutacji (lub knock-downu genu) lub leczenia farmakologicznego na zachowanie muchy jest równoznaczny z fenotypem podobnym do ASD, można użyć kombinacji tych 5 opisanych tutaj testów.

Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i odczynników używanych w tym protokole.

1. Test agresji

1. Przygotowanie areny testów agresji
   1. Weź standardową 24-dołkową płytkę (Rysunek 1A) i użyj każdej studzienki płytki jako pojedynczej "areny" (Rysunek 1B) do agresji much. Napełnij połowę każdej studzienki zwykłym pokarmem na muchy i pozostaw do wyschnięcia na noc.
      UWAGA: Opcjonalnie na arenie może znajdować się ognisko agresji, takie jak kropka pasty drożdżowej lub ścięta samica, aby zapewnić męską agresję.
   2. Weź dowolny przezroczysty arkusz plastiku / akrylu, wystarczający do pokrycia powierzchni około trzech do czterech dołków. Wykonaj perforację arkusza, aby uzyskać mały otwór o średnicy ~2,5 mm do wkładania przez niego pojedynczych much do studzienek.
2. Przygotowanie aspiratora muchowego
   1. Weź gumową/silikonową rurkę o długości 30-50 cm (Rysunek 1C1).
   2. Weź końcówkę do pipety o pojemności 200 μl (lub 1 000 μl) i odetnij ~1 cm od wąskiej końcówki. Włóż odcięty koniec na jednym końcu gumowej rurki; Ta końcówka będzie "końcem ustnym", używanym do aspiracji przez usta.
   3. Weź kolejną końcówkę pipety i odetnij wąski koniec tej końcówki, aby zrobić otwór wystarczający, aby mucha mogła przez nią wejść. Włóż podstawę końcówki pipety do tylnego końca rurki; będzie to "koniec muchy" aspiratora, z którego mucha zostanie zasysana (Rysunek 1C2).
   4. Włóż kawałek siatkowej tkaniny lub cienką warstwę bawełny na "rozporek" rurki - na styku rurki i końcówki. Upewnij się, że mucha zassana do końcówki pipety pozostaje uwięziona w końcówce przed siatką.
   5. Uszczelnij połączenia między rurką a końcówkami pipet za pomocą parafilmu.
3. Przygotowanie probówek z pojedynczą obudową i fiolek z grupową obudową
   1. Przygotowanie rur jednoobudowaowych
      1. Dodaj prawie 500 μl świeżo przygotowanego pokarmu na muchy do probówki o pojemności 2 ml (Rysunek 1D). Użyj mini wirówki, aby ściągnąć żywność w dół do dolnej części probówki.
      2. Ustaw żywność tak, aby zestaliła się w temperaturze pokojowej, trzymając pokrywkę otwartą przez noc. Przykryj rurki cienkim kawałkiem szmatki, aby zapobiec przedostawaniu się zabłąkanych much do rurek.
      3. Przedziurawij pokrywki probówek do mikrofug igłami do cyrkulacji powietrza i zamknij pokrywki po zestaleniu się żywności.
   2. Przygotowanie fiolek do trzymania grupowego
      1. Weź zwykłe fiolki na muchy i napełnij je minimum świeżo przygotowanym jedzeniem (Rysunek 1D).
4. Przygotowanie much przed eksperymentem
   1. Sznury muchowe o pożądanych genotypach należy utrzymywać w zwykłych szklanych/plastikowych butelkach zawierających standardowy pokarm dla much w inkubatorze w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności.
   2. Zebrać nowo zamknięte (od 0 do 24 h) muchy o pożądanym genotypie i rozdzielić je płciowo w znieczuleniu dwutlenkiem węgla za pomocą stereomikroskopu.
   3. Włóż połowę samców much pojedynczo do "rurek z pojedynczą obudową". Drugą połowę samców much należy trzymać w grupie po 10 osób, a samice much w zwykłych "fiolkach do trzymania grupowego", tworząc warunki społeczne. Wszystkie probówki i fiolki należy przechowywać w temperaturze 25 °C przez 5 dni.
      UWAGA: Utrzymuj temperaturę 24-25 °C i ~50% wilgotności w pomieszczeniu behawioralnym. Użytymi szczepami much były: w¹¹¹⁸ i zmutowane muchy trans-heterozygotyczne FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)⁵⁷. Muchy Fmr1, które były trzymane w izolacji przez 5 dni, wykazują znacznie zmniejszone napady agresji w stosunku do innego samca (Rysunek 1E) .
5. Przeprowadzanie eksperymentu z zachowaniem agresywnym
   1. Przeprowadź eksperyment z agresją w oknie czasowym ZT0-ZT3, ponieważ muchy wykazują szczytową aktywność o tej porze dnia.
      UWAGA: ZT=czas Zeitgebera w standardowym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność; ZT0 = świeci się, czyli początek fazy światła, ZT3 = 3 godziny po rozpoczęciu fazy światła i tak dalej. ZT12= światła wyłączone.
   2. Przenieść dwa samce much z komór jedno- lub grupowych metodą aspiracji pyskowej na arenę agresji przez otwór w pokrywie; natychmiast odsunąć otwór, aby upewnić się, że muchy nie mogą uciec.
   3. Pozwól muchom zaaklimatyzować się na arenie przez 1-2 minuty. Uruchom minutnik na 20 minut. Nagrywaj muchy przez całe 20 minut, umieszczając kamerę lub telefon komórkowy dokładnie pionowo nad areną za pomocą stojaka. Upewnij się, że rodzaje agresywnych ataków są widoczne na filmie.
      UWAGA: Upewnij się, że arena jest dobrze oświetlona i unikaj odblasków/odbić od pokrywy bezpośrednio spadających na obiektyw kamery.
   4. Powtórz eksperyment dla 15-20 par much dla każdego genotypu i każdego typu warunków mieszkaniowych.
      UWAGA: Nieświadome uprzedzenia można zniwelować poprzez podwójne zaślepienie muszek kontrolnych i testowych, a także plików wideo należących do wielu genotypów.
6. Analiza danych z testu agresji
   1. Przenieś pliki wideo do komputera z wystarczająco dużym ekranem, aby widoczne były agresywne ataki.
   2. Odtwórz film i policz całkowitą liczbę agresywnych walk w przedziale czasowym 20 min^58,59.
   3. Kompiluj i organizuj dane z każdego genotypu i każdego wzorca hodowli w arkuszu kalkulacyjnym i przeprowadzaj analizę danych za pomocą dowolnego oprogramowania statystycznego. Wykonaj dwustronny test t i wykreśl dane jako pudełko i wąsy.

2. Test przestrzeni społecznej

UWAGA: Opisany tutaj protokół testu, arena i analiza zostały opisane wcześniej^60,61.

1. Przygotowanie areny do oznaczania przestrzeni społecznej (SSA)
   1. Umieść obie trójkątne akrylowe przekładki (wysokość = 8,9 cm, podstawa = 6,7 cm i grubość = 0,3 cm) płasko na wierzchu prostokątnej tafli szkła (13,5 cm x 10,4 cm, grubość 0,3 cm) tak, aby kąty proste akrylowych przekładek były wyrównane z rogami tafli szkła (Rysunek 2A).
   2. Umieść dwie prostokątne przekładki akrylowe (6,7 cm x 1,5 cm, grubość = 0,3 cm) płasko na tafli szkła, wyrównane z podstawami dwóch trójkątnych przekładek. Po tym ułożeniu upewnij się, że cztery akrylowe przekładki otaczają trójkątną arenę (~2,16 cm2,16 cm2 kw. ⁶¹) na prostokątnej tafli szkła, która nie jest pokryta przekładkami (Rysunek 2A,B). Umieść naklejkę z linijką (Rysunek 2C) na jednej z trójkątnych przekładek i upewnij się, że jest ona widoczna od góry.
   3. Teraz umieść drugą prostokątną taflę szkła (13,5 cm x 10,4 cm, grubość 0,3 cm) na wierzchu akrylowych przekładek tak, aby zrównała się z taflą szkła na dole; akrylowe przekładki zostaną umieszczone między szklaną przestrzenią, pozostawiając trójkątną przestrzeń pośrodku między dwiema szklanymi taflami. Użyj czterech małych spinaczy do segregatorów, aby przytrzymać szyby i przekładki.
2. Przygotowanie much do SSA
   1. Zebrać nowo zamknięte (od 0 do 24 h) muchy o pożądanym genotypie i oddzielić je pod względem płci w zimnym znieczuleniu za pomocą stereomikroskopu.
      UWAGA: Schłodzić zimny aparat znieczulający (można użyć szalki Petriego) w inkubatorze o temperaturze -20 °C. Umieść muchy w pustych fiolkach, zanurz te fiolki w lodzie (w wiadrze z lodem), aż muchy staną się nieruchome, umieść je na zimnej szalce Petriego i rozpocznij sortowanie.
   2. Samce i samice muszek należy przechowywać oddzielnie przez 24 godziny w fiolkach z pokarmem w inkubatorze w temperaturze 25 °C z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność.
      UWAGA: W przedstawionych tutaj eksperymentach użyto szczepów much w¹¹¹⁸ i zmutowanych muchówek trans-heterozygoty FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
3. Przeprowadzanie eksperymentu SSA
   1. Zachowaj te same warunki eksperymentalne, co w teście agresji (temperatura: 24-25°C, wilgotność ~ 50%) i przeprowadź eksperyment w oknie czasowym ZT0-ZT3.
   2. Zdejmij prawy dolny zacisk do segregatora i lekko przesuń tę prostokątną przekładkę na zewnątrz, tak aby między dwoma prostokątnymi przekładkami powstała szczelina (~0.5 cm).
   3. Przenieść muchy (zebrane poprzedniego dnia) z fiolki z pokarmem do pustej fiolki. Przenieś je na arenę przestrzeni społecznej (obszar trójkątny) poprzez delikatne zasysanie przez przestrzeń utworzoną między prostokątnymi przekładkami. Natychmiast zamknij przestrzeń, przesuwając prostokątną podkładkę dystansową i klips do segregatora z powrotem na ich pozycje i upewnij się, że nie ma miejsca na ucieczkę much.
   4. Trzymając komorę w pozycji pionowej, delikatnie uderz komorę 3 razy w miękką podkładkę, aby upewnić się, że wszystkie muchy znajdują się u podstawy komory na początku eksperymentu.
   5. Clamp komorę SSA w pozycji pionowej i uruchom timer. Zrób wyraźne zdjęcie areny po 20 minutach, gdy muchy osiądą na swoich pozycjach na arenie i pokażą minimalny ruch. Unikaj odblasków i nieregularnego oświetlenia.
   6. Powtórz eksperyment 3 razy dla tej samej populacji much, uderzając muchy i powtarzając kroki od kroków 2.3.5 do 2.3.7 (powtórzenia wewnętrzne). Powtórzyć 3x z inną populacją much o tym samym genotypie/stanie (niezależne powtórzenia).
      UWAGA: Zamroź komorę testową, aby wyrzucić muchy z komory. Przetrzyj szklane i plastikowe powierzchnie etanolem, aby usunąć wszystkie zapachy po jednej rundzie eksperymentu z jedną grupą much.
4. Analiza danych z testów przestrzeni społecznej
   1. Przeanalizuj obrazy w oprogramowaniu ImageJ⁶² i wymień odległości między najbliższymi sąsiadami, jak opisano wcześniej⁶¹.
   2. Wykonuj analizy statystyczne i twórz wykresy za pomocą oprogramowania statystycznego.
      UWAGA: Szczepy much użyte do opisanego tutaj testu SSA to zmutowane muchy trans-heterozygotyczne w¹¹¹⁸ i Fmr1 (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M)⁵⁷. Muchy Fmr1 wykazują znacznie zwiększoną odległość od najbliższych sąsiadów (Rysunek 2D).

3. Test zalotów

1. Izba zalotów
   1. Złóż wszystkie cztery części komory zalotów (Rysunek 3A) w kolejności pokazanej w Rysunek 3B. Każda perforacja centralnego dysku, umieszczona między pokrywą a częściami podstawy, będzie działać jako "komora zalotów" (Rysunek 3C).
2. Pozyskiwanie wstępnie pokrytych samic
   1. Uruchom i utrzymuj wiele butelek kulturowych much CS (Canton S, typ dziki) z ~ 60-100 samcami i samicami much w każdej butelce z jedzeniem.
   2. Kiedy pojawią się dorosłe osobniki, wyrzuć wszystkie dorosłe muchy i przenieś muchy wyłaniające się z tych butelek co 2-3 godziny do nowych fiolek z pokarmem uzupełnionych niewielką ilością pasty drożdżowej.
      UWAGA: Należy unikać przepełnienia fiolek. Należy uważać, aby nie przenieść starych much, larw lub poczwarek do fiolki godowej.
   3. Inkubuj te "fiolki godowe" przez 4 dni, aby upewnić się, że wszystkie samice zostały sparowane.
3. Przygotowanie rur jednokomorowych dla samców
   1. Dodaj prawie 500 μl pokarmu na muchy do każdej probówki o pojemności 2 ml. Użyj miniwirówki, aby ściągnąć żywność w dół do dolnej części probówki.
   2. Pozostaw żywność do zestalenia się przez noc, odetnij pokrywkę rurki do mikrofuge, przykryj ją parafilmem i przebij parafilm igłą w celu cyrkulacji powietrza.
4. Zbieranie i izolacja dziewiczych samców
   1. Ustaw krzyżówki z 10-15 samcami i 20-30 dziewiczymi samicami o pożądanych genotypach w oddzielnych fiolkach z pokarmem.
   2. Zebrać dziewicze samce o pożądanych genotypach od potomstwa i trzymać je pojedynczo w "probówkach z pojedynczą kurdą" za pomocą aspiratora. Kontynuuj zbieranie nowo zamkniętych samców co 5-6 godzin (do 40-50 samców dla każdego genotypu) i izoluj je w osobnych probówkach jednokomorowych.
   3. Ponownie uszczelnij wieczko tuby z parafilmem.
5. Przeprowadzanie eksperymentu z testem zalotów
   1. Po 5 dniach izolacji badanych samców należy przeprowadzić test zalotów w oknie czasowym ZT0-ZT3.
   2. Skonfiguruj urządzenia rejestrujące wideo z dużym wyprzedzeniem, koncentrując się na obszarze roboczym testu.
   3. Za pomocą aspiratora zbierz jedną wstępnie pokrytą samicę (w wieku 6-10 dni) z fiolek godowych i włóż do komory godowej.
   4. Za pomocą aspiratora delikatnie przenieś samca muchy (kontrolnej/testowej) z rurki z pojedynczą obudową do komory godowej, w której znajduje się pojedyncza samica przed kryciem, przez otwór transferowy. Szybko obróć pokrywę, aby zamknąć komorę.
   5. Wideo nagrywa zachowanie much przez 15 minut.
6. Analiza danych wideo i statystyki
   1. Przenieś pliki wideo do komputera; zwróć uwagę na czas spędzony przez mężczyznę na zalotach w ciągu 15 minut, ręcznie przeglądając wideo.
   2. Oblicz wskaźnik zalotów (CI) dla każdego samca muchy, który jest ułamkiem (lub procentem) czasu spędzonego przez samca na zalecaniu się do samicy w ciągu 15 minut.
   3. Policz łączną liczbę prób kopulacji w ciągu 15 minut.
   4. Zwróć uwagę na czas trwania opóźnienia wykazywany przez samca przed pierwszą próbą zalotów jako opóźnienie zalotów (CL).
      UWAGA: Zaleca się analizę 40-60 samców na stan/genotyp, aby uzyskać moc statystyczną i określić spójność wyników CI.

4. Test zachowania pielęgnacyjnego

1. Arena testowania zachowań związanych z uwodzeniem
   1. Użyj małej okrągłej komory o objętości ~0,4^cm3 jako areny do rejestrowania zachowań związanych z pielęgnacją.
      UWAGA: Ta sama arena zalotów opisana w sekcji 3 może być używana do testowania zachowań związanych z uwodzeniem.
   2. Ponieważ zachowanie związane z pielęgnacją obejmuje rejestrowanie ruchu drobniejszych narządów, takich jak nogi, użyj nagrywania wideo w wysokiej rozdzielczości lub o wysokim kontraście. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj rozproszonego panelu LED pokrytego szkłem jako równomiernie oświetlonej powierzchni o wymiarach 20 cm x 20 cm. Umieść komorę zalotów na górze panelu, aby światło przechodziło od dołu przez komorę.
2. Przygotowanie much przed eksperymentem
   1. Utrzymuj eksperymentalne muchy genotypowe w butelkach z żywnością w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność.
   2. Zebrać nowo zamknięte (od 0 do 24 h) muchy o pożądanym genotypie i oddzielić je pod względem płci w zimnym znieczuleniu za pomocą stereomikroskopu, jak opisano w teście przestrzeni społecznej.
   3. Izolować samce much w probówkach z pojedynczą obudową (stosowanych w teście agresji) przez 24 godziny
      UWAGA: W przedstawionym tutaj eksperymencie użyto szczepów much: W¹¹¹⁸ i zmutowanych much trans-heterozygoty FMR (Fmr1Δ50M/Fmr1Δ113M).
3. Wykonywanie testu zachowań związanych z pielęgnacją
   1. Utrzymuj temperaturę 24-25 °C i wilgotność ~ 50%; przeprowadź eksperyment podczas okna czasowego ZT0-ZT3¹⁶.
   2. Przenieś samca muchy trzymanego w jednej kurniku z rurki z pojedynczą obudową na arenę do pielęgnacji za pomocą aspiratora. Natychmiast odsuń otwór w pokrywie, aby upewnić się, że muchy nie mogą uciec.
   3. Umieść arenę groomingową na rozproszonym panelu LED i pozwól muszce zaaklimatyzować się na arenie przez 1 minutę. Wideo nagrywaj muchę przez 10 minut, umieszczając kamerę dokładnie pionowo nad areną zamontowaną na stojaku. Upewnij się, że rodzaje napadów pielęgnacyjnych są widoczne i wymierne na filmie.
      UWAGA: Zachowanie pielęgnacyjne obejmuje pocieranie głowy, oczu, czułków, trąbki, klatki piersiowej, brzucha, genitaliów i skrzydeł z nogami (pierwsza para: T1, druga para: T2 lub trzecia para nóg: T3). Parametry behawioralne związane z pielęgnacją, które zostały wzięte pod uwagę w tym badaniu, są opisane w Andrew et al. ⁴¹ i pokazane w Rysunek 4.
   4. Powtórz eksperyment dla każdego genotypu.
   5. Analizowanie danych behawioralnych dotyczących pielęgnacji
      1. Przeanalizuj filmy i oblicz następujące cztery parametry: wskaźnik pielęgnacji (procent czasu spędzonego na pielęgnacji); opóźnienie pielęgnacji (czas do pierwszego ataku pielęgnacji); numer ataku pielęgnacyjnego; i średni czas trwania ataku pielęgnacyjnego (całkowity czas trwania/numer ataku).
      2. Oznacz pojedynczy atak pielęgnacji jako zakończony, gdy mucha albo przestanie pokazywać którykolwiek z parametrów i pozostanie w bezruchu przez 2 sekundy, albo przerwie atak i przejdzie co najmniej 4 kroki.

5. Test do habituacji węchowej

UWAGA: Jak pokazano w Rysunek 5, końcowy montaż musi być wykonany w dniu testu Y-maze^54,56.

1. Przygotowanie much do przyzwyczajenia
   1. Do wszystkich doświadczeń należy wyhodować muchy o pożądanych genotypach w inkubatorze o temperaturze otoczenia 25 ^oC i wilgotności 70% w standardowym cyklu 12 h światła i 12 godzin ciemności (LD).
   2. Zbierz 0-12 h, nowo zamknięte muchy i przenieś ~30-40 much w świeżej pożywce z zaciśniętym bawełnianym korkiem.
   3. Przypisz kody do każdej butelki, aby eksperymentator nie wiedział o genotypach poddawanych eksperymentom.
2. Indukcja habituacji węchowej
   1. Umieść 1 ml preferowanego środka zapachowego rozcieńczonego płynem parafinowym (światłem) w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Do kontroli wystarczy użyć 1 ml ciekłej parafiny w świetle w probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Wiruj zawartość w tubie przez 10 minut, aby zapewnić równomierne wymieszanie, a następnie przykryj ją równomiernie perforowaną folią.
      UWAGA: W filmie zostanie użyty 20% maślanu etylu.
   2. Użyj drutu, aby zawiesić rurki zawierające rozcieńczony środek zapachowy lub tylko rozcieńczalnik w oddzielnych butelkach z pożywkami zawierającymi muchy.
   3. Dobrze przykryj butelki bawełną, a następnie owiń papierem pakowym, aby zapobiec dyfuzji oparów środka zapachowego. Oznacz butelki kontrolne i zawierające zapach odpowiednio jako naiwne i narażone na zapach (przyzwyczajone). Przechowuj te butelki indukcyjne przez 3 dni w inkubatorze z wyżej wymienionymi warunkami.
3. Przygotowanie much i aparat Y-labirynt
   1. Przenieść muchy z butelek indukcyjnych do fiolek zawierających tylko bibułę filtracyjną nasączoną wodą.
   2. Głodź je przez około 16-18 godzin w temperaturze pokojowej przed eksperymentem, aby zwiększyć motywację.
   3. Upewnij się, że elementy aparatu Y-labirynt są czyste i wolne od zapachu; zmontuj cztery części w pozycji pionowej. Przymocuj komory wspinaczkowe do labiryntu Y, który jest następnie połączony z górną częścią adaptera. Mocno przymocuj spód labiryntu Y do fiolki wejściowej, która służy jako centralna łodyga na dole, jak pokazano na Rysunek 5.
   4. Połącz zwężający się koniec każdej komory wspinaczkowej z butelkami z odczynnikami zawierającymi nawaniacz (rozcieńczenie ^10-3 z wodą destylowaną) za pomocą bezwonnych silikonowych rurek.
   5. Pompuj nawaniacz z równym natężeniem przepływu (~120 ml/min) z butli gazowych do dwóch ramion Y za pomocą pompy próżniowej i pozwól mu nasycić się przez 15 minut, aby uzyskać konsystencję.
4. Wykonywanie klasycznego testu labiryntu Y
   1. Delikatnie wprowadź wygłodzone muchy z każdej fiolki do fiolki wejściowej zestawu Y-maze.
   2. Pozwól im się zaaklimatyzować przez krótki czas; połącz fiolkę wejściową z adapterem labiryntu Y, aby rozpocząć test; i pozwól muchom wspiąć się na ramiona labiryntu Y i zostać uwięzionymi w dwóch komorach zbiorczych. Ustaw czas trwania każdego testu na 1 minutę.
   3. Po zakończeniu postukaj muchami na dno fiolki wejściowej i zmień pozycję ramion labiryntu Y, aby uniknąć stronniczości bocznej. Wykonaj cztery odczyty dla tego samego zestawu much.
   4. Zapisz liczbę much wspinających się na każde z dwóch ramion labiryntu Y w czasie trwania eksperymentu.
   5. Powtórz test dla co najmniej 8 partii, aby uzyskać reprezentatywny zestaw danych.
5. Analiza i interpretacja zebranych danych
   1. Określ ilościowo wyniki, obliczając wskaźnik wydajności (PI), który można przedstawić jako różnicę między liczbą much wybierających ramię powietrzne (A) a liczbą much wybierających ramię zapachowe (O) jako ułamek całkowitej liczby much uczestniczących w badaniu.
   2. Użyj testów statystycznych (niesparowany test t-Studenta), aby sprawdzić, czy PI much naiwnych i narażonych na zapach jest znaczący.

Test agresji
Jako model muchy ASD użyto zmutowanych much Fmr163,64. w1118 samców użyto jako kontroli, a trans-heterozygota Fmr1 Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 samców much jako muszki eksperymentalne; Dorosłe samce trzymano w probówkach izolacyjnych przez 5 dni. Homotypowe samce (ten sam genotyp, te same warunki bytowe) zostały wprowadzone na arenę agresji i ich zachowanie rejestrowano przez 20 minut. Dla każdego genotypu policzono całkowitą liczbę agresywnych ataków w ciągu 20 minut. Stwierdzono, że liczba agresywnych ataków w ciągu 20 minut była znacznie zmniejszona w przypadku zmutowanych samców niż u samców kontrolnych (Ryc. 1E). Ta zmniejszona agresywność u much Fmr1 może być spowodowana zmniejszonym zainteresowaniem interakcją społeczną z inną muchą. W przeciwieństwie do tego, zmutowane samce muchy Fmr1 w grupie/społecznie wykazują porównywalną liczbę agresji w walkach jak u 1118 much trzymanych społecznie (dane nie pokazane), co prawdopodobnie wskazuje na pozytywną rolę środowiska społecznego w indukcji zachowań społecznych.

Test przestrzeni społecznej
Test przestrzeni społecznej przeprowadzono u much wmodelu 1118 i ASD (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). Dla każdej muchy obliczono odległość do najbliższego sąsiada i wykonano 10 powtórzeń biologicznych dla każdego genotypu. Zmutowane muchy wykazują znacznie większe odległości między najbliższymi sąsiadami niż ich odpowiedniki kontrolne (Rysunek 2D), co wskazuje na preferencję dla większej odległości od innych much.

Test zalotów
Test zalotów samców much trzymanych w jednym pomieszczeniu przeprowadzono w celu ilościowego określenia wrodzonego zachowania godowego dwóch oddzielnych muchówek modelowych z ASD. Po pierwsze, porównano zachowanie godowe transheterozygotycznych much Fmr1 z w1118 r.; Muchy Fmr1 wykazały znacznie niższy wskaźnik zalotów, a także zmniejszoną liczbę prób kopulacji (Ryc. 3E1). W drugim eksperymencie, rzędowym, ortolog Drosophila ludzkiego genu POGZ (bardzo rozpowszechniony gen ryzyka ASD20, został powalony przez ekspresję krótkiego mikroRNA spinki do włosów w stosunku do rzędu w neuronach ciała grzyba przy użyciu linii sterownika MB247-GAL4. Te muchy z ASD z powaleniem na łopatki zostały przetestowane pod kątem wszelkich wad wrodzonego wzorca zalotów; Wskaźnik zalotów i liczbę prób kopulacji obliczono na podstawie 15-minutowych filmów. Muchy powalające, które powalały rzędy, wykazywały znacznie obniżony wskaźnik zalotów, a także liczbę prób kopulacji (Ryc. 3E2), co wskazuje na ich wadliwą komunikację z samicami.

Zachowanie pielęgnacyjne
Zachowanie pielęgnacyjne jest używane jako odczyt dla powtarzających się zachowań w Drosophila16,42,43. Zachowanie pielęgnacyjne określono ilościowo u muszek transheterozygoty Fmr1 i porównano z w1118. Opóźnienie do pierwszej pielęgnacji jest znacznie zmniejszone u much Fmr1, podczas gdy średni czas trwania ataku pielęgnacji i wskaźnik pielęgnacji są znacznie zwiększone u much Fmr1 (Rysunek 4C), co wskazuje na wzmocnione zachowanie pielęgnacyjne (lub powtarzalne) u much z modelem ASD. W przeciwieństwie do tego, nie stwierdzono, aby całkowita liczba napadów pielęgnacji u zmutowanych much uległa znaczącej zmianie w porównaniu z muchami kontrolnymi.

Test habituacji węchowej
Stwierdzono, że habituacja jest wadliwa u dużej liczby osób z autyzmem i może być używana jako test dla tego samego w Drosophila23. W tym przypadku habituacja węchowa została przetestowana w modelu ASD poprzez strącenie rzędu w lokalnych interneuronach węchowych sterowanych przez LN1-GAL4. Awersyjny środek zapachowy, 20% maślan etylu, został użyty w tych eksperymentach w celu wywołania przyzwyczajenia u tych muszek. Wyniki pokazują, że muchy z rzędem nie przyzwyczaiły się po 3-dniowej ekspozycji na zapach (ostatnie dwa słupki na wykresie w Rysunek 5E nie pokazują znaczącej różnicy między muchami naiwnymi a przyzwyczajonymi) w porównaniu z typem dzikim, muchami, które wykazują typowe przyzwyczajenie po ekspozycji na maślan etylu przez 3 dni (muchy narażone wykazują znaczny spadek wskaźnika wydajności w porównaniu z muchami naiwnymi). Oznacza to, że muchy z nokautacją nie przyzwyczajają się po ekspozycji na maślan etylu przez 3 dni i są odstraszane przez odpychający zapach, co dowodzi, że te muchy z ASD mają niedobór przyzwyczajenia.

Rysunek 1: Arena agresji i reprezentatywne wzorce zachowań. (A) Arena agresji umieszczona w 24-dołkowej płytce z perforowaną pokrywą do wchodzenia much. Wstawka: Wymiary pojedynczej areny, na której znajduje się pokarm dla much. (B) Fotografia probówki z pojedynczą kurnikiem zawierającej pojedynczego, odizolowanego samca muchy oraz fiolki z bańką w trzymaniu grupowym zawierającą samce i samice much, podsumowujące środowisko społeczne. (C) Aspirator do przenoszenia much w oparciu o aspirację ustną. Elementy wymagane do montażu aspiratora much, wskazujące boki rurki do wprowadzania muchy (końcówka muchowa) oraz stronę, która zostanie włożona do ust (końcówka muchy) (C1) oraz zmontowany aspirator muchowy (C2). (D) Reprezentatywne agresywne wzorce zachowań męsko-męskich: podejście, zagrożenie skrzydłami, szermierka, trzymanie, rzucanie się, boks i szarpanina. (E) Samce much ze mutacją Fmr1 wykazują zmniejszone agresywne zachowanie w stosunku do innych samców w porównaniu z grupą kontrolną. Wykres pudełkowy przedstawiający liczbę agresywnych ataków u społecznie izolowanych samców w1118 (kontrola) w porównaniu z trans-heterozygoycznymi muchami Fmr1 (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ustawienie areny do testowania przestrzeni społecznej. (A) Schemat przedstawiający wymiary i rozmieszczenie tafli szkła i akrylowych ramek dystansowych. (B) Ostateczne ułożenie elementów areny, w którym akrylowe przekładki są umieszczone między kawałkami szkła, pozostawiając niewielką szczelinę na wejście muchy na dole. Trójkątna przestrzeń utworzona między kawałkami szkła i przekładkami jest areną SSA dla much, tutaj muchy są w stanie poruszać się tylko w dwóch wymiarach. (C) Fotografia końcowego ustawienia areny SSA z muchami wewnątrz komory. Skrót: SSA = tablica przestrzeni społecznej. (D) Muchy w modelu ASD (transheterozygotyczne Fmr1) wykazują zwiększoną odległość od siebie w teście przestrzeni społecznej w porównaniu z w1118. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Arena zalotów i reprezentatywne wzorce zachowań. Schematy przedstawiające (A) konstrukcję i (B) rozmieszczenie dysków na arenie do prób zalotów. (C) Zdjęcie areny zalotów po ostatecznym ustaleniu. (D) Reprezentatywne obrazy pokazujące wzorce zachowań godowych naiwnego samca w stosunku do pokrytej samicy: pogoń, orientacja, migotanie skrzydeł, lizanie, próba kopulacji i kopulacja. (E) Wykresy przedstawiające indeks zalotów i liczbę prób kopulacji w dwóch modelach ASD: (E1) Zmutowane muchy Fmr1 wykazujące znaczne zmniejszenie wskaźnika zalotów i prób kopulacji w porównaniu z kontrolą w1118. (E2) Muchy knockdown row zostały wykorzystane jako kolejny model ASD, w którym rzęd-shRNA ulegało ekspresji wneuronach grzyba (MB247-GAL4); Znaczne zmniejszenie zachowań związanych z zalotami zaobserwowano po powaleniu w rzęd. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Ustawienie areny i reprezentatywne wzorce zachowań związanych z pielęgnacją. (A) Arena w kształcie dysku lub koła (ta sama arena zalotów pokazana na Rysunek 3) jest ustawiona na panelu LED z dyfuzorem dla równomiernego oświetlenia od dołu, a wideo zostało nagrane od góry. Zapewnia to wyższy kontrast wymagany do identyfikacji delikatnych ruchów przydatków podczas pielęgnacji. (B) Fotografie wzorców zachowań pielęgnacyjnych obserwowanych u dorosłych samców much. T1 = 1pierwsza para nóg, T2 =2 para nóg, T3 = trzecia para nóg. Intuicyjna skrócona nomenklatura jest używana dla wzorów pielęgnacji w B: T1-głowa = głowa pocierana pierwszymi nogami; T1-T1 = pierwsza para nóg otarta o siebie i tak dalej. Skrót: LED = dioda elektroluminescencyjna. (C) Wykresy przedstawiające wyniki testów pielęgnacyjnych przeprowadzonych na muchach transheterozygotycznych Fmr1 i porównane z w1118. Muchy ze zmutowanym Fmr1 wykazały znacznie zmniejszone opóźnienie podczas pierwszego ataku pielęgnacji, co wskazuje na wczesne rozpoczęcie pielęgnacji w porównaniu z kontrolą. Co więcej, średni czas trwania napadu pielęgnacji i wskaźnik pielęgnacji były znacznie zwiększone u mutantów Fmr1, co wskazuje na zwiększone powtarzalne zachowania u muszek modelowych ASD. W przeciwieństwie do tego, całkowita liczba napadów pielęgnacyjnych nie uległa znaczącym zmianom u zmutowanych much w porównaniu z kontrolą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Konfiguracja indukcji i testu do przyzwyczajenia węchu i reprezentatywnego wyniku po teście. (A) Elementy binarnego testu wyboru zapachu: (A1) labirynt Y, (A2) adapter, (A3) układ tych dwóch, (A4) para probówek do mocowania na górze ramion labiryntu Y, (A5) szklaną butelkę i szklane rurki do przechowywania roztworu środka zapachowego lub wody, przez które powietrze będzie bulgotać przed przekazaniem do labiryntu Y. (B) Ustawienie butelki z jedzeniem dla much w celu indukcji przyzwyczajenia węchowego; rysunek (B1) pokazuje, jak rurka zawierająca mikrodymkę zawierającą środek zapachowy jest zawieszona na miedzianym drucie w połowie wnętrza butelki; (B2) na koniec, otwór butelki jest przykryty bawełnianą i zapieczętowany kopertami z brązowego papieru. (C) Zdjęcie całkowitego układu układu labiryntu Y. (D) Fotografie pokazujące rozmieszczenie much w komorach zbiorczych po zakończeniu eksperymentu. (D1) Muchy naiwne (wystawione tylko na bezwonną parafinę, kontrola) wykazują wstręt do awersyjnego środka zapachowego (20% maślanu etylu użytego do indukcji habituacji w tym badaniu) i wybierają w ramieniu labiryntu Y wypełnionego zwykłym powietrzem, podczas gdy (D2) odsłonięte (przyzwyczajone) muchy rozprowadzają się równomiernie w obu ramionach. Skrót: ID = średnica wewnętrzna. (E) Wyniki testów habituacji węchowej much z nokautacją rzędową wykazały wadę habituacji. Muchy typu dzikiego (Canton S), po 3-dniowej ekspozycji na maślan etylu, wykazały znaczne obniżenie wskaźnika wydajności w porównaniu z muchami niedoświadczonymi, co wskazuje na przyzwyczajenie. Gdy potomstwo muszek LN1-GAL4 x rzędowo-shRNA było wystawione na działanie przez 3 dni, nie stwierdzono, aby wskaźnik wydajności różnił się znacząco od wskaźnika u much naiwnych; Pokazuje to, że te muchy nie przyzwyczaiły się po 3-dniowej ekspozycji na środek zapachowy, co stanowi objaw podobny do ludzkiego ASD. Skróty: ASD = zaburzenie ze spektrum autyzmu; shRNA = RNA z krótką spinką do włosów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.