Opracowanie biohybrydowej sondy mikroskopowej sił atomowych opartej na żądłach komarów

Podsumowanie

Ilościowe i kontrolowane badania zachowań związanych z gryzieniem owadów są kluczowe dla opracowania skutecznych strategii zwalczania chorób przenoszonych przez wektory. W tym kontekście przedstawiono metodę wytwarzania sondy do biohybrydowej mikroskopii sił atomowych (AFM).

Streszczenie

Komary, znane jako najbardziej śmiercionośne zwierzęta dla ludzi ze względu na ich zdolność do przenoszenia chorób, stanowią stałe wyzwanie dla zdrowia publicznego. Obecnie stosowana strategia profilaktyki pierwotnej obejmuje repelenty chemiczne, które często okazują się nieskuteczne, ponieważ komary szybko rozwijają odporność. W związku z tym kluczowe znaczenie ma wynalezienie nowych metod prewencyjnych. Taki rozwój opiera się na dokładnym zrozumieniu zachowań związanych z gryzieniem komarów, co wymaga eksperymentalnej konfiguracji, która dokładnie odwzorowuje rzeczywiste scenariusze gryzienia z kontrolowanymi parametrami testowymi i pomiarami ilościowymi. Aby wypełnić tę lukę, zaprojektowano biohybrydową sondę mikroskopii sił atomowych (AFM), której końcówką jest żądło biologiczne - a konkretnie obrąbek plamowy komara. Ta biohybrydowa sonda, kompatybilna ze standardowymi systemami AFM, umożliwia niemal autentyczną symulację zachowań związanych z penetracją komarów. Metoda ta stanowi krok naprzód w ilościowych badaniach mechanizmów gryzienia, potencjalnie prowadząc do stworzenia skutecznych barier przeciwko chorobom przenoszonym przez wektory (VBD) i otwierając nowe możliwości w walce z chorobami przenoszonymi przez komary.

Wprowadzenie

Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) poinformowała, że choroby przenoszone przez wektory (VBD) stanowią ponad 17% wszystkich chorób zakaźnych, które powodują ponad 7 000 000 zgonów rocznie na całym świecie. Na przykład, jako najbardziej śmiercionośne zwierzę na świecie, komary przenoszą liczne patogeny, takie jak denga, malaria i Zika, poprzez żywiące się krwią stawonogi, co powoduje 700 milionów infekcji każdego roku¹. Kluczowe znaczenie mają badania nad opracowaniem skutecznych środków zapobiegania VBD, w tym naśladowanie zachowań komarów związanych z penetracją w celu zbadania ich mechanizmów gryzienia oraz badania potencjalnych barier w celu udowodnienia ich skuteczności w zapobieganiu penetracji. Jednym z kluczowych wyzwań jest opracowanie odpowiednich podejść do przeprowadzania takich badań. Podjęto wysiłki w literaturze, w tym nad opracowaniem igieł w skali mikro, które przypominają geometrię żądła komarów; jednak wiele materiałów użytych do produkcji tych mikroigieł (tj. materiały lepkosprężyste2, krzem (Si), szkło, ceramika 3, itp.) ma inne właściwości mechaniczne niż materiał biologiczny trąbki komara. Materiały inżynieryjne mogą być kruche i podatne na pękanie i wyboczenie^3,4, podczas gdy trąbka komara lepiej znosi złamania lub wyboczenia⁴. Zaletą posiadania sondy biohybrydowej wykorzystującej obrąbek komara zamiast materiałów inżynieryjnych jest to, że może ona być dokładniejszym odwzorowaniem mechanizmu przekłuwania komarów. Ponadto specjalistyczne narzędzia muszą być zintegrowane z mikroigłami w celu wykonywania badań ilościowych, takich jak dokładny pomiar siły⁵, co nie jest łatwo osiągalne przy użyciu niestandardowych konfiguracji przy użyciu zaprojektowanych mikroigieł.

Podejście oparte na mikroskopii sił atomowych (AFM) jest obiecujące, ponieważ działa poprzez zastosowanie wspornika z ultracienką końcówką, która jest starannie umieszczona blisko powierzchni próbki. Końcówka może skanować w poprzek lub być dociskana w kierunku/w powierzchnię, doświadczając różnych sił przyciągania lub odpychania ze względu na jej interakcje z próbką⁶. Interakcje te prowadzą do odchylenia wspornika, które jest śledzone przez odbicie wiązki laserowej od szczytu wspornika do fotodetektora⁶. Wyjątkowa czułość systemu na ruch umożliwia AFM przeprowadzanie różnorodnych pomiarów, w tym między innymi mapowania morfologicznego z dokładnością pikometru, pomiarów siły w zakresie od pikonewtonów do mikroniutonów oraz kompleksowych badań multifizycznych⁷. Na przykład wgłębienia AFM można wykonać w celu precyzyjnej oceny reakcji na przyłożoną siłę próbki, a także w celu zmierzenia twardości, elastyczności i innych właściwości mechanicznych próbki poprzez sprzężenie z odpowiednimi modelami analitycznymi⁸. Sonda AFM jest najczęściej wykonana z krzemu (Si) lub azotku krzemu (Si₃N₄)⁸ o długości 20-300 μm⁹ i promieniu końcówki rzędu kilku do kilkudziesięciu nanometrów¹⁰. Promień końcówki w skali nanometrowej może być idealny do zastosowań takich jak obrazowanie w wysokiej rozdzielczości; Nie posiada jednak cech biologicznych żądeł do badań, które próbują naśladować zachowania penetracyjne pod względem sztywności, promienia, kształtu i proporcji. Na przykład struktura mikroigłowa komara to pęczek, który ma proporcje ~60¹¹ (długość ~1,5 mm do 2 mm; średnica ~30 μm)¹². Chociaż można założyć, że konwencjonalna sonda AFM przypomina biologiczne żądło, takie jak obrąbek, jej odrębne właściwości materiałowe i wymiary nie będą odzwierciedlać rzeczywistej sytuacji podczas ugryzienia.

Aby umożliwić ilościowe badania zachowań penetracyjnych naśladujących biologiczne ukąszenia owadów lub innych zwierząt za pomocą żądeł, tutaj rozwijany jest proces wytwarzania bio-hybrydowych wsporników AFM z biologicznym żądłem w miarę rozwoju ich końcówki. Jako studium przypadku z powodzeniem zademonstrowano wspornik AFM z przymocowaną końcówką obrąbka komara. Wykorzystując istniejące informacje z literatury na temat typowych sił wprowadzających, których komar używa, aby przebić się przez skórę ofiary^12,13, ten biohybrydowy wspornik AFM może potencjalnie umożliwić niemal rzeczywiste naśladowanie ukąszeń komarów pod zwykłym AFM. Protokół wykorzystania mikrobiologicznych żądeł do wytwarzania biohybrydowych wsporników AFM może być również zastosowany do opracowania innych biohybrydowych wsporników AFM opartych na ostrych żądłach do ilościowych badań różnych mechanizmów gryzienia.

Terminologie
Schemat trąbki i jej elementów zainteresowania jest pokazany w Rysunek 1, a ich definicje są następujące: (1) Trąba: część ciała z pyska komara, która pozwala komarowi się odżywiać, ze strukturą rdzenia-skorupy składającą się z pęczka (rdzenia) i wargi sromowej (muszli), (2) Labium: ciemna i zewnętrzna osłona trąby², (3) Pęczek: grupa smukłych igieł znajdujących się wewnątrz warg sromowych, w tym dwie szczęki, dwie żuchwy, gardło dolne i obrąbek stawowy², (4) Gardło dolne: odpowiedzialne za wydzielanie śliny do krwiobiegu gospodarza², (5) Szczęki: ząbkowany członek wspomagający mechanizm karmienia², (5) Żuchwy: podobne do szczęki, pomagają komarowi w mechanizmie żerowania i mają ostrą końcówkę², (6) Obrąbek: główny element do penetracji skóry ofiary, który jest znacznie większy niż szczęki, żuchwy i gardło dolne. Posiada również struktury sensoryczne, które pozwalają mu znaleźć naczynia krwionośne i kanały wewnętrzne pod skórą², (7) Manipulator: zespół z trzema stopniami swobody i dokładnością w skali mikronowej do pozycjonowania, umożliwiający ruch w kierunkach XYZ, (8) Zespół zaciskowy: wykonany na zamówienie 2-częściowy zacisk montowany na manipulatorze, używany do zaciskania bezkońcówkowego wspornika AFM podczas eksperymentu.

Protokół

Gatunek komara użyty w tym protokole to niezainfekowana dorosła samica Aedes aegypti (A. aegypti), która została zamrożona i przechowywana w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Gatunek został dostarczony przez NIH/NIAID Filariosis Research Reagent Resource Center do dystrybucji za pośrednictwem BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. Odczynniki i sprzęt używany do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Odcięcie wargi sromowej od trąbki

1. Za pomocą pęsety umieść martwego komara na szklanym szkiełku pod mikroskopem i upewnij się, że na końcu trąbki znajduje się zwężająca się końcówka (Rysunek 2A).
2. Trzymając komara na szkiełku, delikatnie przyłóż ostrze skalpela do warg sromowych w pobliżu głowy komara (Rysunek 2B).
3. Przystąp do wykonania nacięcia w poprzek całej górnej połowy wargi sromowej (cięcie około 80 μm) z płytką głębokością penetracji przez grubość wargi sromowej. Upewnij się, że lekko naciskasz na ostrze, aby przeciąć tylko wargę sromową, ale nie pęczek, który znajduje się pod spodem.
4. Za pomocą pęsety mocno przytrzymaj głowę komara, a drugą parą precyzyjnych pęset delikatnie ściśnij wargę sromową w dowolnym miejscu między zwężającą się końcówką a miejscem nacięcia (Rysunek 2B).
   1. Pociągnij pęsetę trzymającą wargę sromową w kierunku zwężającej się końcówki (Rysunek 2C). Kontynuuj ciągnięcie pęsety, aż warga sromowa oderwie się i zostanie całkowicie usunięta z pęczka.
5. Umieść komara pod mikroskopem i sprawdź, czy obecna jest końcówka obrąbka. Można to rozpoznać po obecności zwężającej się końcówki na pęczku (Rysunek 2D).

2. Oddzielenie wierzchołka obrąbka od innych elementów pęczka

1. Zaciśnij i zamknij końcówki zestawu precyzyjnych pęset i umieść końcówkę pęsety tuż obok obrąbka w pobliżu jego końcówki.
2. Użyj końcówki pęsety, aby przyłożyć delikatną siłę do obrąbka w kierunku prostopadłym do długości pęczka (Rysunek 3A).
3. Kontynuuj przesuwanie obrąbka po szkiełku szkiełkowym, aż do oddzielenia obrąbka od innych elementów pęczka.
4. Sprawdź próbkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że osiągnięto prawidłową separację między obrąbkiem a innymi elementami pęczka (Rysunek 3, po lewej). Jeśli separacja się nie powiedzie, wróć do kroku 2.1.

3. Przecinanie końcówki obrąbka

1. Gdy obrąbek jest nadal na szkiełku podstawowym, umieść ostrze skalpela nad obrąbkiem w odległości około ~200 μm od końcówki obrąbka (Rysunek 4A). Delikatnie dociśnij i przetnij końcówkę obrąbka na całej długości. Podczas gdy końcówka obrąbka powinna być jak najkrótsza, ~200 μm to najlepsze, z czym może sobie poradzić obecne podejście.
2. Zmierz długość wyciętego obrąbka, aby upewnić się, że nie jest dłuższa niż 300 μm (Rysunek 4B) za pomocą dowolnego cyfrowego oprogramowania pomiarowego. W tym protokole użyto ImageJ¹⁴.

4. Chwytanie czubka obrąbka

1. Za pomocą pęsety precyzyjnej zlokalizuj i odizoluj końcówkę obrąbka na szklanym szkiełku. Wyrzuć każdą część pozostałą na szkiełku podstawowym inną niż końcówka obrąbka.
2. Za pomocą tej samej precyzyjnej pęsety powoli i lekko ściśnij obrąbek, aby odcięty koniec był wolny i nie był zasłonięty pęsetą. Upewnij się również, że orientacja obrąbka jest równoległa do kierunku długości pęsety, a odcięty koniec obrąbka jest skierowany w stronę przeciwną do korpusu pęsety.
3. Gdy próbka zostanie mocno ściśnięta, usuń siłę zacisku trzymającą końcówki pęsety razem. Końcówka obrąbka przyklei się do jednej z końcówek pęsety.
4. Pod mikroskopem sprawdź końcówki pęsety i upewnij się, że końcówka obrąbka znajduje się na jednej z końcówek pęsety (Rysunek 5). Jeśli końcówka obrąbka nie znajduje się na pęsetie, wróć do kroku 4.2, a jeśli końcówka obrąbka nie znajduje się na pęsetie ani na szkiełku podstawowym, wróć do kroku 1.

5. Nakładanie żywicy epoksydowej na belkę wspornikową bez końcówki

1. Umieść kroplę (~0,05 ml) żywicy epoksydowej na krawędzi nowego szkiełka podstawowego, bezpośrednio odlewając klej z oryginalnej butelki/pojemnika. Umieść szkiełko ze szkła epoksydowego pod stacją sondy i skup się na niej.
2. Zamontuj wspornik AFM bez końcówki do zespołu zacisku, zabezpieczając podstawę (tj. większy koniec), pozostawiając koniec wspornika wolny i zawieszony w przestrzeni. Upewnij się, że spód wspornika AFM jest skierowany w dół.
3. Zamontuj manipulator na stacji pomiarowej.
4. Podnieś oś Z manipulatora do pozycji, w której wspornik bez końcówki znajduje się kilka milimetrów nad szklanym suwakiem zawierającym żywicę epoksydową.
5. Ręcznie przesunąć manipulator tak, aby wspornik bez końcówki był widoczny w polu view kamery na stacji pomiarowej.
6. Za pomocą manipulatora przesuń wspornik AFM wzdłuż kierunków X i Y, aż końcówka wspornika będzie spoczywać bezpośrednio nad żywicą epoksydową na krawędzi szkiełka podstawowego.
7. Używając ponownie manipulatora, powoli opuść wspornik bez końcówki w kierunku Z przez krawędź szklanego suwaka.
8. Gdy wspornik jest opuszczany i zbliża się do szklanego zjeżdżalni, opuszczaj wspornik bardzo powoli, aż po raz pierwszy dotknie żywicy epoksydowej. Nie opuszczaj dalej wspornika.
9. Ostrożnie włącz manipulator, aby powoli przesuwać wspornik w kierunku X lub Y i wyjmij wspornik z puli żywicy epoksydowej, ciągle przesuwając wspornik w wybranym kierunku, aż wspornik zostanie całkowicie oddzielony od żywicy epoksydowej na szkiełku szkiełkowym. Wspornik bez końcówki powinien mieć na końcu miniaturową bańkę żywicy epoksydowej, widoczną pod stacją sondy.
10. Podnieś wspornik w kierunku Z za pomocą manipulatora.

6. Łączenie końcówki obrąbka z belką wspornikową bez końcówki

1. Obróć manipulator wokół długiej osi wspornika o 90 stopni i oprzyj manipulator na stacji pomiarowej na boku urządzenia. W tej konfiguracji grubości na całej długości wspornika AFM są w kierunku pionowym.
2. Umieść precyzyjną pęsetę, która zawiera końcówkę obrąbka, pod kamerą stacji sondy tak, aby cała długość końcówki obrąbka była widoczna na monitorze komputera.
3. Umieść zespół manipulatora trzymającego zacisk i wspornik bez końcówki pod kamerą stacji pomiarowej tak, aby cała długość wspornika bez końcówki była widoczna na monitorze komputera.
4. Ustaw ostrość mikroskop stacji pomiarowej na końcówce obrąbka i wsporniku bez końcówki.
5. Ustaw wspornik prostopadle do końcówki obrąbka, ostrożnie i ręcznie obracając manipulator (Rysunek 6A).
6. Korzystając ze stopni swobody manipulatora, powoli przesuwaj wspornik bez końcówki w kierunkach XY, tak aby klej na wsporniku stykał się z odciętym końcem końcówki obrąbka (Rysunek 6B).
7. Utwardź żywicę epoksydową, utrwalając skrzyżowanie między wspornikiem a obrąbkiem komara.
8. Po utwardzeniu żywicy epoksydowej delikatnie włącz manipulator w kierunkach XY i odsuń wspornik od pęsety, sprawdzając, czy końcówka obrąbka stoi teraz na belce wspornikowej bez końcówki (Rysunek 6C).

Wyniki

Obrazy z pomiarów za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) wykonanej biohybrydowej sondy AFM znajdują się na Rysunku 7. Końcówka labrum została pomyślnie przyklejona do belek wspornika pozbawionego końcówki. Ze względu na naturalną krzywiznę żądeł komarów oraz manualny charakter przedstawionego protokołu, niezwykle trudno jest uzyskać wspornik z końcówką żądła ustawioną idealnie prostopadle do belki. Kąt odchylenia między żądłem a wyimaginowaną linią środkową prostopadłą do wspor...

Dyskusja

Krok 1 protokołu ma na celu oczyszczenie próbki biologicznej z niechcianego warg sromowych. Aby to osiągnąć, wykonuje się nacięcie na wargach sromowych, ale nie na pęczku, który spoczywa bezpośrednio pod wargą sromową (ryc. 1). Ponieważ pęczek i warga sromowa nie są ze sobą połączone na ich styku (tj. warga sromowa może swobodnie przesuwać się wzdłuż pęczka i jest utrzymywana na miejscu tylko przez jego przymocowanie do głowy komara), wykonane nacięcie ma na celu oddzielenie części wargi sro...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-SA-SE Prosta, stożkowa, ultra drobno spiczasta pęseta	Excelta	N/A	Do manipulowania/preparowania trąbki.
Stacja pomiarowa C-4D	Everbeing Int' l Korporacja	Nie dotyczy	Używany do montażu AFM.
Bezkońcówkowy kątownik w trybie gwintowania	NanoAndMore USA	Wspornik TL-NCH	AFM używany do montażu obrąbka. Specyfikacje są pokazane tutaj: Kształt< / mocny>: Belka Stała siły< / mocna>: 42 N / m (10 - 130 N / m): Częstotliwość rezonansowa< / silny>: 330 kHz (204 - 497 kHz) długość: 125 &mikro; m (115 - 135 &mikro; m) Szerokość: 30 &mikro; m (22,5 - 37,5 i mikro; m) < mocny> grubość< / mocny>: 4 i mikro; m ( 3 - 5 & mikro; m)
UV Expoxy	Let's żywica	ALR00146	Do mocowania żądeł.