Opracowanie biohybrydowej sondy mikroskopowej sił atomowych opartej na żądłach komarów

Podsumowanie

Ilościowe i kontrolowane badania zachowań związanych z gryzieniem owadów są kluczowe dla opracowania skutecznych strategii zwalczania chorób przenoszonych przez wektory. W tym kontekście przedstawiono metodę wytwarzania sondy do biohybrydowej mikroskopii sił atomowych (AFM).

Streszczenie

Komary, znane jako najbardziej śmiercionośne zwierzęta dla ludzi ze względu na ich zdolność do przenoszenia chorób, stanowią stałe wyzwanie dla zdrowia publicznego. Obecnie stosowana strategia profilaktyki pierwotnej obejmuje repelenty chemiczne, które często okazują się nieskuteczne, ponieważ komary szybko rozwijają odporność. W związku z tym kluczowe znaczenie ma wynalezienie nowych metod prewencyjnych. Taki rozwój opiera się na dokładnym zrozumieniu zachowań związanych z gryzieniem komarów, co wymaga eksperymentalnej konfiguracji, która dokładnie odwzorowuje rzeczywiste scenariusze gryzienia z kontrolowanymi parametrami testowymi i pomiarami ilościowymi. Aby wypełnić tę lukę, zaprojektowano biohybrydową sondę mikroskopii sił atomowych (AFM), której końcówką jest żądło biologiczne - a konkretnie obrąbek plamowy komara. Ta biohybrydowa sonda, kompatybilna ze standardowymi systemami AFM, umożliwia niemal autentyczną symulację zachowań związanych z penetracją komarów. Metoda ta stanowi krok naprzód w ilościowych badaniach mechanizmów gryzienia, potencjalnie prowadząc do stworzenia skutecznych barier przeciwko chorobom przenoszonym przez wektory (VBD) i otwierając nowe możliwości w walce z chorobami przenoszonymi przez komary.

Wprowadzenie

Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) poinformowała, że choroby przenoszone przez wektory (VBD) stanowią ponad 17% wszystkich chorób zakaźnych, które powodują ponad 7 000 000 zgonów rocznie na całym świecie. Na przykład, jako najbardziej śmiercionośne zwierzę na świecie, komary przenoszą liczne patogeny, takie jak denga, malaria i Zika, poprzez żywiące się krwią stawonogi, co powoduje 700 milionów infekcji każdego roku¹. Kluczowe znaczenie mają badania nad opracowaniem skutecznych środków zapobiegania VBD, w tym naśladowanie zachowań komarów związanych z penetracją w celu zbadania ich mechanizmów gryzienia oraz badania potencjalnych barier w celu udowodnienia ich skuteczności w zapobieganiu penetracji. Jednym z kluczowych wyzwań jest opracowanie odpowiednich podejść do przeprowadzania takich badań. Podjęto wysiłki w literaturze, w tym nad opracowaniem igieł w skali mikro, które przypominają geometrię żądła komarów; jednak wiele materiałów użytych do produkcji tych mikroigieł (tj. materiały lepkosprężyste2, krzem (Si), szkło, ceramika 3, itp.) ma inne właściwości mechaniczne niż materiał biologiczny trąbki komara. Materiały inżynieryjne mogą być kruche i podatne na pękanie i wyboczenie^3,4, podczas gdy trąbka komara lepiej znosi złamania lub wyboczenia⁴. Zaletą posiadania sondy biohybrydowej wykorzystującej obrąbek komara zamiast materiałów inżynieryjnych jest to, że może ona być dokładniejszym odwzorowaniem mechanizmu przekłuwania komarów. Ponadto specjalistyczne narzędzia muszą być zintegrowane z mikroigłami w celu wykonywania badań ilościowych, takich jak dokładny pomiar siły⁵, co nie jest łatwo osiągalne przy użyciu niestandardowych konfiguracji przy użyciu zaprojektowanych mikroigieł.

Podejście oparte na mikroskopii sił atomowych (AFM) jest obiecujące, ponieważ działa poprzez zastosowanie wspornika z ultracienką końcówką, która jest starannie umieszczona blisko powierzchni próbki. Końcówka może skanować w poprzek lub być dociskana w kierunku/w powierzchnię, doświadczając różnych sił przyciągania lub odpychania ze względu na jej interakcje z próbką⁶. Interakcje te prowadzą do odchylenia wspornika, które jest śledzone przez odbicie wiązki laserowej od szczytu wspornika do fotodetektora⁶. Wyjątkowa czułość systemu na ruch umożliwia AFM przeprowadzanie różnorodnych pomiarów, w tym między innymi mapowania morfologicznego z dokładnością pikometru, pomiarów siły w zakresie od pikonewtonów do mikroniutonów oraz kompleksowych badań multifizycznych⁷. Na przykład wgłębienia AFM można wykonać w celu precyzyjnej oceny reakcji na przyłożoną siłę próbki, a także w celu zmierzenia twardości, elastyczności i innych właściwości mechanicznych próbki poprzez sprzężenie z odpowiednimi modelami analitycznymi⁸. Sonda AFM jest najczęściej wykonana z krzemu (Si) lub azotku krzemu (Si₃N₄)⁸ o długości 20-300 μm⁹ i promieniu końcówki rzędu kilku do kilkudziesięciu nanometrów¹⁰. Promień końcówki w skali nanometrowej może być idealny do zastosowań takich jak obrazowanie w wysokiej rozdzielczości; Nie posiada jednak cech biologicznych żądeł do badań, które próbują naśladować zachowania penetracyjne pod względem sztywności, promienia, kształtu i proporcji. Na przykład struktura mikroigłowa komara to pęczek, który ma proporcje ~60¹¹ (długość ~1,5 mm do 2 mm; średnica ~30 μm)¹². Chociaż można założyć, że konwencjonalna sonda AFM przypomina biologiczne żądło, takie jak obrąbek, jej odrębne właściwości materiałowe i wymiary nie będą odzwierciedlać rzeczywistej sytuacji podczas ugryzienia.

Aby umożliwić ilościowe badania zachowań penetracyjnych naśladujących biologiczne ukąszenia owadów lub innych zwierząt za pomocą żądeł, tutaj rozwijany jest proces wytwarzania bio-hybrydowych wsporników AFM z biologicznym żądłem w miarę rozwoju ich końcówki. Jako studium przypadku z powodzeniem zademonstrowano wspornik AFM z przymocowaną końcówką obrąbka komara. Wykorzystując istniejące informacje z literatury na temat typowych sił wprowadzających, których komar używa, aby przebić się przez skórę ofiary^12,13, ten biohybrydowy wspornik AFM może potencjalnie umożliwić niemal rzeczywiste naśladowanie ukąszeń komarów pod zwykłym AFM. Protokół wykorzystania mikrobiologicznych żądeł do wytwarzania biohybrydowych wsporników AFM może być również zastosowany do opracowania innych biohybrydowych wsporników AFM opartych na ostrych żądłach do ilościowych badań różnych mechanizmów gryzienia.

Terminologie
Schemat trąbki i jej elementów zainteresowania jest pokazany w Rysunek 1, a ich definicje są następujące: (1) Trąba: część ciała z pyska komara, która pozwala komarowi się odżywiać, ze strukturą rdzenia-skorupy składającą się z pęczka (rdzenia) i wargi sromowej (muszli), (2) Labium: ciemna i zewnętrzna osłona trąby², (3) Pęczek: grupa smukłych igieł znajdujących się wewnątrz warg sromowych, w tym dwie szczęki, dwie żuchwy, gardło dolne i obrąbek stawowy², (4) Gardło dolne: odpowiedzialne za wydzielanie śliny do krwiobiegu gospodarza², (5) Szczęki: ząbkowany członek wspomagający mechanizm karmienia², (5) Żuchwy: podobne do szczęki, pomagają komarowi w mechanizmie żerowania i mają ostrą końcówkę², (6) Obrąbek: główny element do penetracji skóry ofiary, który jest znacznie większy niż szczęki, żuchwy i gardło dolne. Posiada również struktury sensoryczne, które pozwalają mu znaleźć naczynia krwionośne i kanały wewnętrzne pod skórą², (7) Manipulator: zespół z trzema stopniami swobody i dokładnością w skali mikronowej do pozycjonowania, umożliwiający ruch w kierunkach XYZ, (8) Zespół zaciskowy: wykonany na zamówienie 2-częściowy zacisk montowany na manipulatorze, używany do zaciskania bezkońcówkowego wspornika AFM podczas eksperymentu.

Protokół

Gatunek komara użyty w tym protokole to niezainfekowana dorosła samica Aedes aegypti (A. aegypti), która została zamrożona i przechowywana w zamrażarce o temperaturze -20 °C. Gatunek został dostarczony przez NIH/NIAID Filariosis Research Reagent Resource Center do dystrybucji za pośrednictwem BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. Odczynniki i sprzęt używany do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Odcięcie wargi sromowej od trąbki

1. Za pomocą pęsety umieść martwego komara na szklanym szkiełku pod mikroskopem i upewnij się, że na końcu trąbki znajduje się zwężająca się końcówka (Rysunek 2A).
2. Trzymając komara na szkiełku, delikatnie przyłóż ostrze skalpela do warg sromowych w pobliżu głowy komara (Rysunek 2B).
3. Przystąp do wykonania nacięcia w poprzek całej górnej połowy wargi sromowej (cięcie około 80 μm) z płytką głębokością penetracji przez grubość wargi sromowej. Upewnij się, że lekko naciskasz na ostrze, aby przeciąć tylko wargę sromową, ale nie pęczek, który znajduje się pod spodem.
4. Za pomocą pęsety mocno przytrzymaj głowę komara, a drugą parą precyzyjnych pęset delikatnie ściśnij wargę sromową w dowolnym miejscu między zwężającą się końcówką a miejscem nacięcia (Rysunek 2B).
   1. Pociągnij pęsetę trzymającą wargę sromową w kierunku zwężającej się końcówki (Rysunek 2C). Kontynuuj ciągnięcie pęsety, aż warga sromowa oderwie się i zostanie całkowicie usunięta z pęczka.
5. Umieść komara pod mikroskopem i sprawdź, czy obecna jest końcówka obrąbka. Można to rozpoznać po obecności zwężającej się końcówki na pęczku (Rysunek 2D).

2. Oddzielenie wierzchołka obrąbka od innych elementów pęczka

1. Zaciśnij i zamknij końcówki zestawu precyzyjnych pęset i umieść końcówkę pęsety tuż obok obrąbka w pobliżu jego końcówki.
2. Użyj końcówki pęsety, aby przyłożyć delikatną siłę do obrąbka w kierunku prostopadłym do długości pęczka (Rysunek 3A).
3. Kontynuuj przesuwanie obrąbka po szkiełku szkiełkowym, aż do oddzielenia obrąbka od innych elementów pęczka.
4. Sprawdź próbkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że osiągnięto prawidłową separację między obrąbkiem a innymi elementami pęczka (Rysunek 3, po lewej). Jeśli separacja się nie powiedzie, wróć do kroku 2.1.

3. Przecinanie końcówki obrąbka

1. Gdy obrąbek jest nadal na szkiełku podstawowym, umieść ostrze skalpela nad obrąbkiem w odległości około ~200 μm od końcówki obrąbka (Rysunek 4A). Delikatnie dociśnij i przetnij końcówkę obrąbka na całej długości. Podczas gdy końcówka obrąbka powinna być jak najkrótsza, ~200 μm to najlepsze, z czym może sobie poradzić obecne podejście.
2. Zmierz długość wyciętego obrąbka, aby upewnić się, że nie jest dłuższa niż 300 μm (Rysunek 4B) za pomocą dowolnego cyfrowego oprogramowania pomiarowego. W tym protokole użyto ImageJ¹⁴.

4. Chwytanie czubka obrąbka

1. Za pomocą pęsety precyzyjnej zlokalizuj i odizoluj końcówkę obrąbka na szklanym szkiełku. Wyrzuć każdą część pozostałą na szkiełku podstawowym inną niż końcówka obrąbka.
2. Za pomocą tej samej precyzyjnej pęsety powoli i lekko ściśnij obrąbek, aby odcięty koniec był wolny i nie był zasłonięty pęsetą. Upewnij się również, że orientacja obrąbka jest równoległa do kierunku długości pęsety, a odcięty koniec obrąbka jest skierowany w stronę przeciwną do korpusu pęsety.
3. Gdy próbka zostanie mocno ściśnięta, usuń siłę zacisku trzymającą końcówki pęsety razem. Końcówka obrąbka przyklei się do jednej z końcówek pęsety.
4. Pod mikroskopem sprawdź końcówki pęsety i upewnij się, że końcówka obrąbka znajduje się na jednej z końcówek pęsety (Rysunek 5). Jeśli końcówka obrąbka nie znajduje się na pęsetie, wróć do kroku 4.2, a jeśli końcówka obrąbka nie znajduje się na pęsetie ani na szkiełku podstawowym, wróć do kroku 1.

5. Nakładanie żywicy epoksydowej na belkę wspornikową bez końcówki

1. Umieść kroplę (~0,05 ml) żywicy epoksydowej na krawędzi nowego szkiełka podstawowego, bezpośrednio odlewając klej z oryginalnej butelki/pojemnika. Umieść szkiełko ze szkła epoksydowego pod stacją sondy i skup się na niej.
2. Zamontuj wspornik AFM bez końcówki do zespołu zacisku, zabezpieczając podstawę (tj. większy koniec), pozostawiając koniec wspornika wolny i zawieszony w przestrzeni. Upewnij się, że spód wspornika AFM jest skierowany w dół.
3. Zamontuj manipulator na stacji pomiarowej.
4. Podnieś oś Z manipulatora do pozycji, w której wspornik bez końcówki znajduje się kilka milimetrów nad szklanym suwakiem zawierającym żywicę epoksydową.
5. Ręcznie przesunąć manipulator tak, aby wspornik bez końcówki był widoczny w polu view kamery na stacji pomiarowej.
6. Za pomocą manipulatora przesuń wspornik AFM wzdłuż kierunków X i Y, aż końcówka wspornika będzie spoczywać bezpośrednio nad żywicą epoksydową na krawędzi szkiełka podstawowego.
7. Używając ponownie manipulatora, powoli opuść wspornik bez końcówki w kierunku Z przez krawędź szklanego suwaka.
8. Gdy wspornik jest opuszczany i zbliża się do szklanego zjeżdżalni, opuszczaj wspornik bardzo powoli, aż po raz pierwszy dotknie żywicy epoksydowej. Nie opuszczaj dalej wspornika.
9. Ostrożnie włącz manipulator, aby powoli przesuwać wspornik w kierunku X lub Y i wyjmij wspornik z puli żywicy epoksydowej, ciągle przesuwając wspornik w wybranym kierunku, aż wspornik zostanie całkowicie oddzielony od żywicy epoksydowej na szkiełku szkiełkowym. Wspornik bez końcówki powinien mieć na końcu miniaturową bańkę żywicy epoksydowej, widoczną pod stacją sondy.
10. Podnieś wspornik w kierunku Z za pomocą manipulatora.

6. Łączenie końcówki obrąbka z belką wspornikową bez końcówki

1. Obróć manipulator wokół długiej osi wspornika o 90 stopni i oprzyj manipulator na stacji pomiarowej na boku urządzenia. W tej konfiguracji grubości na całej długości wspornika AFM są w kierunku pionowym.
2. Umieść precyzyjną pęsetę, która zawiera końcówkę obrąbka, pod kamerą stacji sondy tak, aby cała długość końcówki obrąbka była widoczna na monitorze komputera.
3. Umieść zespół manipulatora trzymającego zacisk i wspornik bez końcówki pod kamerą stacji pomiarowej tak, aby cała długość wspornika bez końcówki była widoczna na monitorze komputera.
4. Ustaw ostrość mikroskop stacji pomiarowej na końcówce obrąbka i wsporniku bez końcówki.
5. Ustaw wspornik prostopadle do końcówki obrąbka, ostrożnie i ręcznie obracając manipulator (Rysunek 6A).
6. Korzystając ze stopni swobody manipulatora, powoli przesuwaj wspornik bez końcówki w kierunkach XY, tak aby klej na wsporniku stykał się z odciętym końcem końcówki obrąbka (Rysunek 6B).
7. Utwardź żywicę epoksydową, utrwalając skrzyżowanie między wspornikiem a obrąbkiem komara.
8. Po utwardzeniu żywicy epoksydowej delikatnie włącz manipulator w kierunkach XY i odsuń wspornik od pęsety, sprawdzając, czy końcówka obrąbka stoi teraz na belce wspornikowej bez końcówki (Rysunek 6C).

Wyniki

Obrazy skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) sfabrykowanej biohybrydowej sondy AFM można znaleźć w Rysunek 7. Koniec obrąbka został pomyślnie przyklejony do bezkońcówkowej belki wspornikowej. Ze względu na naturalną krzywiznę żądeł komarów i ręczną obsługę przedstawionego protokołu, niezwykle trudno jest uzyskać wspornik z końcówką żądła idealnie prostopadłą do wspornika. Kąt przesunięcia między żądłem a wyimaginowaną linią środkową prostopadłą do wspornika wynosi zwykle ~10 stopni. Chociaż wydaje się, że jest to częsty problem podczas montażu sondy na wsporniku AFM cvolever¹⁵, niezamierzone nachylenie musi być uwzględnione podczas przeprowadzania analizy siły/naprężenia. Interesujące byłoby, aby przyszłe badania koncentrowały się na ulepszeniu protokołu wytwarzania i przeprowadzaniu badań z wykorzystaniem sondy biohybrydowej. Jest to pierwsza próba stworzenia biohybrydowej sondy AFM przy użyciu żądła owada.

Rysunek 1: Schemat trąby komara. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Usunięcie warg sromowych trąbki komara. (A) Komar z pełną trąbką wskazującą na obecność nienaruszonej, zwężającej się końcówki. (B) Miejsce nacięcia wargi sromowej i umieszczenie pęsety na wargach sromowych podczas procesu usuwania warg sromowych. (C) Kierunek ciągnięcia pęsety podczas usuwania warg sromowych. (D) Ostatni wypreparowany pęczek z nienaruszonym końcem po usunięciu warg sromowych, ze zwężającą się końcówką obrąbka nadal obecną i nienaruszoną. Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Oddzielenie obrąbka od niechcianych elementów pęczkuł. (A) Umiejscowienie pęsety i kierunek pchania pęczków jako technika oddzielania elementów pęczka trąbki. (B) Trąba po manipulacji w celu oddzielenia obrąbka od innych członków pęczka. Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Izolacja pożądanej końcówki obrąbka do montażu na wsporniku AFM. (A) Miejsce nacięcia obrąbka w celu usunięcia końcówki obrąbka. Podziałka: 200 μm. (B) Końcówka obrąbka, po odcięciu od korpusu obrąbka, ma około 200-300 μm długości. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Montaż końcówki obrąbka na pęsetie przed procesem klejenia. Końcówka obrąbka przykleiła się do jednej z końcówek pęsety, przy czym nieodcięty koniec obrąbka był wolny i skierowany na zewnątrz korpusu pęsety. Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Sekwencja montażu końcówki obrąbka do wspornika bez końcówki. (A) Ustawienie wspornika bez końcówki w pozycji prostopadłej w stosunku do obrąbka. (B) Połączenie wspornika bez końcówki z obrąbkiem i utwardzenie kleju epoksydowego używanego do zestalania połączenia między dwoma składnikami. (C) Końcowa utwardzona biohybrydowa sonda AFM bez podparcia obrąbka pęsetą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Obrazy SEM bio-hybrydowej sondy AFM. (A) Globalny widok końcówki obrąbka i wspornika bez końcówki. Podziałka liniowa: 200 μm. (B) Powiększony widok końcówki obrąbka. Podziałka skali: 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Krok 1 protokołu ma na celu oczyszczenie próbki biologicznej z niechcianego warg sromowych. Aby to osiągnąć, wykonuje się nacięcie na wargach sromowych, ale nie na pęczku, który spoczywa bezpośrednio pod wargą sromową (ryc. 1). Ponieważ pęczek i warga sromowa nie są ze sobą połączone na ich styku (tj. warga sromowa może swobodnie przesuwać się wzdłuż pęczka i jest utrzymywana na miejscu tylko przez jego przymocowanie do głowy komara), wykonane nacięcie ma na celu oddzielenie części wargi sromowej od głowy komara, ułatwiając w ten sposób usunięcie zewnętrznej osłony. Podczas wyciągania wargi sromowej z próbki technik powinien odczuwać lekki opór spowodowany przez dolną połowę wargi sromowej nadal przyczepioną do komara. Oczekuje się, że ta siła oporu zwolni się stosunkowo łatwo, ponieważ nacięcie będzie sprzyjać propagacji pęknięć materiału biologicznego, indukując w ten sposób nieprzecięty segment wargi sromowej do rozerwania i powodując zsunięcie się całego warga sromowego z pęczka podczas ciągnięcia. Jeśli zostanie wykonane niewystarczające nacięcie, technik może odczuwać nadmierny opór podczas ciągnięcia i jest zachęcany do podjęcia próby kolejnego nacięcia przed kontynuowaniem protokołu.

Ważne jest, aby ćwiczyć miękki dotyk i cierpliwość w kroku 1 i kroku 4 podczas manipulowania obrąbkiem poprzez szczypanie pęsetą. Chociaż obrąbek jest stosunkowo sprężysty, nadal może ulec uszkodzeniu, jeśli zostanie zbyt agresywnie ściśnięty pęsetą. Technik jest prowadzony, aby lekko uszczypnąć wargę sromową/obrąbek, co oznacza, że powinien przyłożyć minimalną siłę potrzebną do przytrzymania wargi sromowej/obrąbka. Ocenę obecności uszkodzeń można przeprowadzić na końcu kroku 1 i kroku 4 podczas badania próbki pod mikroskopem. Zaleca się sprawdzenie trąbki pod kątem wszelkich nieprawidłowości na jej długości (tj. wgniecenia, rozdarcia, separacje w segmentach). Jeśli istnieje podejrzenie, że próbka jest uszkodzona na końcu obrąbka, wyrzuć ją i uruchom ponownie protokół.

Kluczowe etapy procesu protokołu, takie jak krok 3 i krok 6, wymagają szczególnej ostrożności. Aby wykonać krok 3, końcówkę obrąbka należy przyciąć ręcznie skalpelem. Zbyt krótkie cięcie sprawi, że reszta eksperymentu będzie wykładniczo trudniejsza, ponieważ może być zbyt mała, aby nią manipulować. Wręcz przeciwnie, jeśli końcówka przekracza 300 μm długości, staje się zbyt długa, aby można ją było zamontować na wsporniku AFM z powodu nadmiernego prostopadłego przesunięcia, które jest wprowadzane między końcówką obrąbka a wspornikiem AFM. Przesunięcie to jest spowodowane niedoskonałościami w procesie montażu i/lub krzywizną, które mogą występować w próbce, które stają się problematyczne przy większych długościach obrąbka. Również wsporniki z bardzo długimi końcówkami będą bardzo trudne w użyciu pod AFM. Podczas kroku 3 ważne jest, aby pamiętać, że wszystkie stylety pęczkowe (obrąbek, szczęki, żuchwy i gardło dolne) zostaną prawdopodobnie przecięte w tej procedurze. Obrąbek można łatwo zlokalizować i odizolować od pozostałych słupków w kroku 4 dzięki ręcznemu oddzielaniu, które zostało wykonane w kroku 2. W kroku 6, mimo że prawie niemożliwe jest upewnienie się, że końcówka jest idealnie normalna do wspornika pod mikroskopem optycznym, nadal konieczne jest zminimalizowanie kąta nachylenia, aby uniknąć niepożądanych warunków obciążenia w przyszłości.

Ważne jest również, aby wybrać odpowiednią żywicę epoksydową do mocowania żądła do wspornika AFM. Przetestowano różne wolno utwardzalne dwuskładnikowe żywice epoksydowe, które później okazały się nieidealne, ponieważ każde niewielkie drgania podłogi laboratoryjnej podczas procesu utwardzania może spowodować niepowodzenie eksperymentu. W związku z tym ostatecznie zdecydowano się na żywicę epoksydową utwardzaną promieniami UV. Zastosowany klej to szybkoutwardzalna żywica epoksydowa o niskiej lepkości, która jest w stanie utwardzić się w ciągu 5 sekund od ekspozycji na promieniowanie UV. Po zestaleniu klej staje się bardzo sztywny i ma doskonałą wytrzymałość, co powoduje, że wyprodukowana sonda kantylowa obrąbka zachowuje się jak pojedynczy korpus i nie ulega uszkodzeniu ani nie odkształca się w miejscu przylegania. Ta opcja zapewniła wystarczająco dużo czasu przed utwardzeniem, aby skonfigurować konfigurację we właściwej pozycji do przylegania żądła do wspornika AFM (krok 6.3), jednocześnie eliminując wszelkie problemy związane z wibracjami otoczenia ze względu na jego utwardzanie na polecenie.

Pozostałym kluczowym wyposażeniem w tym protokole jest stacja sondy, ostra pęseta i wspornik. Zastosowana stacja sondy wyposażona jest w obiektyw 5x zamontowany do kamery; Jednak dla tego protokołu nie jest konieczne używanie dokładnie tego modelu stacji pomiarowej. Przy wyborze stacji pomiarowej jedynym priorytetem jest zapewnienie wyraźnej i łatwej widoczności wspornika AFM i obrąbka. Używane ostre pęsety miały rozmiar końcówki 0,5 mm na 0,1 mm. Konieczne jest użycie pęsety o tym wymiarze końcówki lub podobnym, ponieważ używanie kleszczy o mniejszej drobności może prowadzić do trudności podczas manipulacji obrąbkiem. Wspornik użyty w tym protokole jest pozyskiwany ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Ten model wspornikowy został wybrany ze względu na jego wysoką sztywność, ponieważ duża siła musi zostać przeniesiona na końcówkę sondy przeciw komarom, aby naśladować rzeczywistą penetrację skóry. Ogólnie rzecz biorąc, w przypadku wszystkich sond opartych na żądle, wspornik AFM nie może być zbyt miękki, ponieważ brak sztywności doprowadzi do wygięcia wspornika podczas testów AFM, co z kolei doprowadzi do braku rozwoju ciśnienia na końcówce sondy żądło. Spowoduje to, że sonda będzie niedokładnie naśladować proces pieczenia, co sprawi, że bardzo sztywne wsporniki AFM bez końcówek staną się wymogiem dla tego protokołu.

Podsumowując, zastosowanie biohybrydowej sondy AFM na bazie żądła do ilościowych badań penetracji/gryzienia mechanicznego ma wyjątkowe zalety w porównaniu z innymi metodami, które wymagają żywych komarów i ochotników ^4,11,12 do przeprowadzenia podobnych badań. Ultrawysoka rozdzielczość wykrywania AFM może umożliwić pomiar z niespotykaną dotąd dokładnością, a sonda biohybrydowa umożliwia niemal realistyczną emulację rzeczywistych scenariuszy gryzienia, obejmując statystycznie istotną liczbę pomiarów bez konieczności angażowania ochotników ^4,11,12. Ponadto materiały używane do produkcji mikroigieł są zazwyczaj podatne na pękanie lub wyboczenie ^3,4, co nie jest reprezentatywne dla trąbki komara. Używanie samych części komara bardziej przypomina prawdziwy scenariusz gryzienia. Protokół ten może być potencjalnie dalej rozwijany i zautomatyzowany w celu uzyskania wysokiej przepustowości produkcji. Wreszcie, opracowany protokół może być potencjalnie wykorzystany do produkcji innych biohybrydowych sond AFM wykorzystujących żądła różnych zwierząt do badań ilościowych różnych zachowań związanych z gryzieniem/penetracją.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-SA-SE Prosta, stożkowa, ultra drobno spiczasta pęseta	Excelta	N/A	Do manipulowania/preparowania trąbki.
Stacja pomiarowa C-4D	Everbeing Int' l Korporacja	Nie dotyczy	Używany do montażu AFM.
Bezkońcówkowy kątownik w trybie gwintowania	NanoAndMore USA	Wspornik TL-NCH	AFM używany do montażu obrąbka. Specyfikacje są pokazane tutaj: Kształt< / mocny>: Belka Stała siły< / mocna>: 42 N / m (10 - 130 N / m): Częstotliwość rezonansowa< / silny>: 330 kHz (204 - 497 kHz) długość: 125 &mikro; m (115 - 135 &mikro; m) Szerokość: 30 &mikro; m (22,5 - 37,5 i mikro; m) < mocny> grubość< / mocny>: 4 i mikro; m ( 3 - 5 & mikro; m)
UV Expoxy	Let's żywica	ALR00146	Do mocowania żądeł.