Agregacja komórek w kapsułkach macierzy błony podstawnej do badania tworzenia mysiej tkanki śledziony

Summary

Ten artykuł opisuje protokół agregacji i hermetyzacji komórek śledziony w półstałej macierzy błony podstawnej. Konstrukty macierzy błony podstawnej mogą być wykorzystywane w hodowli trójwymiarowej do badania rozwoju organoidów lub do badań nad przeszczepami in vivo i regeneracją tkanek.

Abstract

Śledziona jest organem odpornościowym, który odgrywa kluczową rolę w krwiopochodnych odpowiedziach immunologicznych. Anatomiczna lub funkcjonalna utrata tej tkanki zwiększa podatność na ciężkie infekcje krwi i sepsę. Autotransplantacja plastrów śledziony jest stosowana klinicznie w celu zastąpienia utraconej tkanki i przywrócenia funkcji immunologicznej. Jednak mechanizm napędzający solidną i immunologicznie funkcjonalną regenerację tkanki śledziony nie został w pełni wyjaśniony. W tym przypadku naszym celem jest opracowanie metody agregacji i hermetyzacji komórek śledziony w półstałej matrycy w celu zbadania wymagań komórkowych dotyczących tworzenia tkanki śledziony. Konstrukty komórkowe otoczone macierzą błony podstawnej są podatne zarówno na hodowlę tkankową trójwymiarowych organoidów in vitro, jak i na przeszczep pod torebkę nerkową w celu bezpośredniej oceny tworzenia tkanek in vivo. Manipulując komórkami wejściowymi do agregacji i enkapsulacji, wykazujemy, że komórki zrębu noworodków PDGFRβ ⁺ MAdCAM-1 ^pochodzące z przeszczepu są wymagane do regeneracji tkanki śledziony w modelach przeszczepu zwierząt.

Introduction

Urazowe pęknięcie śledziony i pojawienie się wielu guzków śledziony w ciele było jednym z pierwszych sygnałów, że tkanka śledziony posiada zdolność regeneracyjną^1,2. Autotransplantacje śledziony zostały później wprowadzone do kliniki w celu zachowania tkanki śledziony u pacjentów wymagających pilnej splenektomii³. Jednak pomimo tego, że jest częścią praktyki klinicznej od dziesięcioleci, bardzo niewiele wiadomo o tym, jak śledziona się regeneruje. Modele przeszczepiania zwierząt dostarczyły informacji na temat wielu parametrów regeneracji śledziony i funkcji immunologicznej^4,5. W szczególności eksperymentalne modyfikacje metody przygotowania przeszczepów pozwoliły na bardziej szczegółowe zbadanie regeneracji tkanek na poziomie komórkowym i molekularnym.

Przeszczepy obejmujące całe plastry śledziony przechodzą fazę masowej martwicy, zanim nowa struktura śledziony zostanie odbudowana⁶. Początkowa faza martwicy przeszczepu sugeruje, że większość przeszczepionej tkanki składa się w dużej mierze z czerwonych i białych krwinek i nie jest potrzebna do regeneracji śledziony. Zbadano to eksperymentalnie, wykluczając komórki krwiotwórcze z przeszczepów śledziony przed przeszczepem pod torebkę nerkową myszy. W tym przypadku wykazano, że frakcja nieleukocytowa/nieerytrocytowa śledziony, która obejmuje komórki zrębu i śródbłonka, jest wystarczająca do indukowania tworzenia tkanek de novo⁷. Tkanka zrębu śledziony może być dalej przetwarzana na zawiesinę jednokomórkową, co umożliwi wykorzystanie technologii sortowania komórek do manipulowania składem przeszczepu komórkowego. Poprzez selektywne usuwanie typów komórek kandydujących zidentyfikowano dwie populacje komórek zrębu CD45-TER-119^, które były niezbędne do rozwoju przeszczepu: śródbłonkową populację komórek CD31 ⁺ CD105 ⁺ MAdCAM-1 ⁺ i szerzej zdefiniowaną populację komórek mezenchymalnych PDGFRβ ^{+ 8}.

Budowa przeszczepów z komórek śledziony różni się pod względem materiałów podporowych i procesów ładowania komórek. Śledziony modyfikowane tkankowo były wcześniej przygotowywane przez ładowanie jednostek śledziony na rusztowanie polimerowe z kwasem poliglikolowym/poli-litrem kwasu mlekowego^5,9. Co ciekawe, komórki zrębu śledziony wchłonięte przez gąbkę kolagenową nie zdołały się wszczepić, podczas gdy komórki zrębu zagregowane i załadowane na arkusz kolagenu ułatwiały regenerację śledziony⁸. Wykazano również, że ponowne zawieszenie komórek zrębu śledziony w matrycy Matrigel indukuje agregację komórek w warunkach hodowli trójwymiarowej¹⁰. Jednak metoda ta nie została przetestowana pod kątem stosowania w modelach transplantacyjnych. Ogólnym celem obecnego protokołu jest wymuszona agregacja i hermetyzacja komórek zrębu śledziony bezpośrednio w macierzy błony podstawnej, która następnie może zostać przeniesiona do trójwymiarowego systemu hodowli tkankowej in vitro lub wykorzystana jako nośnik do przeszczepów modeli zwierzęcych (rysunek uzupełniający 1).

Protocol

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami eksperymentalnymi zatwierdzonymi przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Queensland (UQBR/079/19).

1. Pobieranie tkanek i przygotowanie komórek zrębu

1. Poddać eutanazji 0,5-1,5 dnia samca i/lub samicy nowonarodzonych myszy dawców BALB/c poprzez indukcję hipotermii poprzez owinięcie zwierząt w bibułkę i umieszczenie ich pod kruszonym lodem przez >10 min.
   UWAGA: Ten protokół można dostosować do różnych szczepów myszy, wieku i liczby zwierząt.
2. Przygotuj sterylne narzędzia chirurgiczne.
3. Połóż mysz w prawej pozycji bocznej. Przetrzyj skórę 80% etanolem i wykonaj 1 cm nacięcie nożyczkami chirurgicznymi Iris, aby odsłonić ścianę otrzewnej.
4. Wykonaj drugie 0,5 cm nacięcie powyżej śledziony i użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie podnieść tkankę. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć naczynia krwionośne i wyciąć tkankę. Przenieść tkankę na szalkę Petriego zawierającą lodowatą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Usuń pozostałą tkankę łączną przyczepioną do śledziony.
   UWAGA: Mikroskop stereoskopowy może wspomagać drobne ruchy motoryczne wymagane do manipulowania narzędziami chirurgicznymi.
5. Aby oddzielić całe tkanki, przenieś śledziony noworodków (pule 10 lub mniej) do wewnętrznej krawędzi odwróconej stożkowej nasadki rurki o pojemności 14 ml. Mechanicznie rozerwać tkanki ruchem uciskającym za pomocą plastikowej końcówki tłoka strzykawki o pojemności 1 ml.
6. Umieść i szczelnie zabezpiecz nakrętkę na stożkowej probówce o pojemności 14 ml zawierającej 10 ml zimnego PBS. Odwróć probówkę 5x, aby zmyć całą uszkodzoną tkankę z nakrętki do tuby.
7. Powtórz krok 1.6 dla pozostałej tkanki.
8. Pozostaw probówkę na lodzie na 1 minutę, aby tkanka osiadła na dnie tubki.
9. Ostrożnie wyrzucić supernatant (zawierający komórki krwiotwórcze), przepuszczając roztwór przez odwracalne sitko do komórek o średnicy 70 μm.
10. Odzyskaj nierozpuszczalną frakcję zrębu poprzez odwrócenie sitka i przemycie tkanki zrębu z powrotem do stożkowej probówki o pojemności 14 ml przy użyciu świeżo przygotowanych 2 ml uzupełnionej pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (sDMEM) zawierającej 1 mg/ml kolagenazy IV, 40 μg/ml DNazy I i 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    UWAGA: Kolagenaza IV i Kolagenaza D są substancjami niebezpiecznymi i muszą być obsługiwane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
11. Aby przygotować zawiesinę jednokomórkową, należy enzymatycznie trawić zebraną tkankę (do 20) przez 10 minut w temperaturze 37 °C ze stałą rotacją.
12. Dodaj 4 ml świeżo przygotowanego sDMEM zawierającego 1 mg/ml kolagenazy D, 40 μg/ml DNazy I i 2% FBS bezpośrednio do probówki zawierającej tkankę zrębu. Inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C przy stałej rotacji.
13. Zatrzymaj trawienie, dodając 8 ml lodowatego PBS. Zebrać komórki, odwirowując przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
14. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć komórki, ponownie zawieszając w 1 ml zimnego PBS i odwirowując w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Utrzymać komórki na lodzie.
    UWAGA: Komórki można zliczać i dostosowywać do żądanego stężenia. Może to wymagać optymalizacji dla różnych populacji komórek. Korzystając z tego protokołu, 0,5 x 10⁶- 1 x 10⁶ komórek zrębu/śledziony jest zwykle odzyskiwanych, w zależności od wieku myszy dawcy. Na tym etapie komórki mogą być opcjonalnie barwione, a sortowane metodą FACS w celu określenia składu komórek.

2. Enkapsulacja macierzy agregatów komórkowych

1. Sterylne końcówki pipet P200 należy wstępnie schłodzić w zamrażarce o temperaturze -20°C.
2. Pokrój elastyczną folię laboratoryjną (np. Parafilm) na kawałki o wymiarach 1 cm x 2 cm i sterylizuj, zanurzając w 80% etanolu na 10 minut, a następnie PBS na 10 minut. Folię laboratoryjną można przygotować wcześniej i przechowywać w sterylnej formie.
3. Przygotować 0,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ komórek, odwirowując przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około 20 μl pozostałej objętości PBS. Trzymaj osad komórkowy na lodzie.
   UWAGA: Pozostały PBS można delikatnie zassać bez naruszania osadu komórkowego w celu potwierdzenia objętości.
4. Odessać 2 μl lodowatej matrycy membrany podstawnej do wstępnie schłodzonej końcówki pipety P200 za pomocą pipetora P20.
   UWAGA: Wysoce skoncentrowana matryca błony podstawnej (np. Corning Matrigel Matrix High Concentration) pomaga w tworzeniu silnego, zestalonego czopu.
5. Delikatnie przekręć, aby wysunąć końcówkę pipety. Rozciągnij wstępnie wysterylizowany pasek folii laboratoryjnej i umieść go na końcu końcówki pipety, uważając, aby nie przebić folii. Kontynuuj owijanie końcówki folią, aby uszczelnić końcówkę pipety. Ostrożnie umieść uszczelnioną końcówkę bezpośrednio na lodzie, uważając, aby nie rozerwać folii.
6. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pozostałym PBS i delikatnie nałożyć roztwór na matrycę błony podstawnej. Trzymaj konstrukcję na lodzie.
7. Przygotuj probówkę wirówkową, umieszczając probówkę zbiorczą o pojemności 1,2 ml w stożkowej probówce o pojemności 14 ml.
8. Umieścić końcówkę pipety w zagnieżdżonej probówce i wirować w temperaturze 400 x g i 4 °C przez 5 minut.
9. Ustawić probówkę stożkową o pojemności 14 ml w orientacji pionowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy błony podstawnej wewnątrz końcówki pipety.
   UWAGA: Probówkę stożkową o pojemności 14 ml można umieścić na lodzie, dopóki nie będzie potrzebna do dalszej aplikacji.

3. Trójwymiarowa hodowla organoidów

1. Ostrożnie usuń folię laboratoryjną z końcówki pipety.
2. Włożyć cienki tłok z drutu ze stali nierdzewnej przez większy otwór końcówki pipety.
3. Wyrzuć czop matrycowy, aż zostanie uwolniony przez końcówkę, do jednego dołka niepoddanej działaniu substancji 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 2 ml sDMEM uzupełnionego 10% FBS, 1x Glutamax, 1x Aminokwasy endogenne (NEAA), 10 μM inhibitor skał, 10 U/ml penicyliny/streptomycyny i 50 μM β-merkaptoetanolu.
   UWAGA: Naczynie do hodowli tkankowej i odpowiadającą mu objętość pożywki można regulować zgodnie z wymaganiami.
   UWAGA: NEAA, penicylina/streptomycyna i β-merkaptoetanol są substancjami niebezpiecznymi i muszą być obsługiwane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
4. Hoduj organoidy w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotności 95% przez 4-12 tygodni.
5. Wymieniaj połowę podłoża co 5 dni.
   UWAGA: Jeśli organoidy zaczną przyczepiać się do płytki kultury tkankowej, przenieś do świeżej studzienki.

4. Przeszczep torebki nerkowej

1. Przygotuj sterylne narzędzia chirurgiczne.
2. Wykonaj podtorebkowy przeszczep nerki czopa macierzy błony podstawnej:
   1. Znieczulić 8-tygodniową samicę myszy biorcy BALB/c izofluranem zgodnie z Instytucjonalnymi Wytycznymi Etycznymi Zwierząt.
      UWAGA: Izofluran jest substancją niebezpieczną. Gaz odlotowy musi zostać usunięty, aby zapobiec przedostawaniu się do środowiska pracy.
   2. Połóż mysz w prawej pozycji bocznej.
   3. Ogolić włosy w miejscu operacji i zdezynfekować skórę zgodnie z wytycznymi instytucji.
      UWAGA: Zaleca się trzykrotną dezynfekcję pola operacyjnego ruchami okrężnymi za pomocą naprzemiennego peelingu na bazie jodu lub chlorheksydyny i alkoholu.
   4. Wykonaj 2 cm nacięcie w skórze prostopadłej do kręgosłupa, aby odsłonić ścianę otrzewnej.
      UWAGA: Do nacinania skóry można użyć cienkich nożyczek chirurgicznych lub ostrza skalpela. Użytkownicy powinni postępować zgodnie z Instytucjonalnymi Wytycznymi Etycznymi Zwierząt lub Standardowymi Procedurami Operacyjnymi.
   5. Wykonaj mniejsze 0,5 cm nacięcie w ścianie otrzewnej nad nerką.
      UWAGA: Nacięcie powinno być zbliżone do szerokości nerki, aby zapewnić, że nerka pozostanie zewnętrzna podczas przeszczepu.
   6. Zewnętrznie nerkę należy wyprowadzić przez otwór otrzewnej, wywierając nacisk w dół za pomocą kciuka i palca wskazującego. Para pęset pierścieniowych może być użyta do pomocy w eksterioryzacji. Upewnij się, że nerka jest wilgotna przez cały czas trwania zabiegu, regularnie nakładając sterylny PBS za pomocą bawełnianego wacika.
   7. Pod mikroskopem stereoskopowym uszczypnij tłuszcz okołonerkowy torebki nerkowej za pomocą pary zgiętych ultracienkich kleszczyków w jednym biegunie nerki. Użyj drugiej pary zgiętych, bardzo cienkich kleszczyków, aby delikatnie rozerwać błonę torebki nerkowej w przeciwnym kierunku, tworząc mały otwór.
   8. Ostrożnie włóż bolec jednego kleszcza pod membranę kapsułki. Użyj powolnego, zamaszystego ruchu, aby oddzielić błonę torebki od miąższu nerki.
   9. Przygotować zatyczkę macierzy błony podstawnej do przeszczepu, usuwając film laboratoryjny z końcówki pipety.
   10. Podnieś torebkę nerkową za pomocą jednego bolca kleszczy i włóż końcówkę pipety przez otwór, popychając ją w kierunku przeciwległego bieguna nerki.
   11. Włożyć druciany tłok do końcówki pipety i usunąć zatyczkę matrycową, jednocześnie wyjmując końcówkę pipety z nerki.
   12. Zwilż nerkę PBS i ponownie zinternalizuj.
   13. Zamknij ścianę otrzewnej jednym szwem 5-0 Vicryl i zamknij skórę dwoma automatycznymi klipsami.
   14. Podawać leki przeciwbólowe (buprenorfina w dawce 0,05-0,1 mg/kg podskórnie lub zgodnie z Instytucjonalnymi Wytycznymi Etyki Zwierząt).
       UWAGA: Buprenorfina jest substancją niebezpieczną i należy się z nią obchodzić przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.
3. Wyłącz przepływ izofluranu, ale utrzymuj przepływ tlenu włączony, aby mysz mogła oddychać czystym tlenem, dopóki nie zacznie odzyskiwać przytomności.
4. Umieść mysz z powrotem w klatce. Utrzymuj zwierzę w cieple podczas rekonwalescencji, częściowo umieszczając klatkę na poduszce grzewczej lub pod lampą grzewczą i monitoruj, aż mysz w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.
5. Monitoruj rekonwalescencję pooperacyjną przez pierwsze dwa tygodnie lub zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

Results

Agregacja komórek jest ważna dla promowania kontaktu między komórkami i sygnalizacji. Zamknięcie agregatów komórkowych wewnątrz macierzy błony podstawnej umożliwiło zarówno trójwymiarowe hodowle do tworzenia organoidów tkankowych in vitro, jak i ułatwiło mechaniczne dostarczanie komórek do torebki nerkowej w celu przeszczepu. Aby ustalić te konstrukty, matryca błony podstawnej była najpierw utrzymywana w stanie fluidycznym w lodowatych warunkach. Agregację komórek osiągnięto następnie poprzez nałożenie na siebie skoncentrowanej zawiesiny komórek i wykorzystanie siły odśrodkowej do przepchnięcia komórek przez matrycę o dużej gęstości. Optymalizacja prędkości wirowania (200-2000 x g) była konieczna, aby osiągnąć umiejscowienie komórek w warstwie środkowej (Rysunek 1A), które było również zależne od liczby komórek. Większe siły odśrodkowe (>500 x g) napędzają komórki do samej końcówki pipety (Rysunek 1B), a w przypadku mniejszych komórek (tj. <5 x 10⁵), które mogą zostać utracone podczas zdejmowania elastycznej folii laboratoryjnej, należy zachować ostrożność. I odwrotnie, komórki mogą nie przemieszczać się odpowiednio przez macierz błony podstawnej, jeśli siły G są zbyt niskie (≤200 x g) (Rysunek 1C). Szybkość wirowania dla komórek o numerach <1 x 10⁵ lub >2,5 x 10⁶ może wymagać dalszej optymalizacji. Po odwirowaniu komórki umieszczono w matrycy błony podstawnej, ogrzewając konstrukcję w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Ten proces krzepnięcia umożliwił całkowite wyrzucenie "korka" matrycy (Rysunek 1D) za pomocą tłoka z cienkiego drutu.

Tworzenie organoidów śledziony in vitro
Zatyczki macierzy błony podstawnej wyrzucone do odpowiedniego naczynia do hodowli tkankowej odtwarzalnie tworzyły trójwymiarowe struktury podobne do organoidów, które można było utrzymać zgodnie ze standardowymi technikami i warunkami hodowli tkanek (37 °C, 5% CO₂, 95% wilgotności)¹¹. W hodowli substrat macierzy błony podstawnej stopniowo rozpraszał się między 0 a 14 dniem (Figura 2A, i-iii) i nie można było go już zaobserwować do 21 dnia, pozostawiając nienaruszoną sferyczną masę komórkową przypominającą organoid (Rysunek 2A, vi) o wymiarach około 545 μm (s.d. = 120 μm, n = 6)11 w średnicy. Te struktury organoidowe były wspierane w hodowli dłużej niż 30 dni, ale nie zwiększały się z czasem (Ryc. 2B). Organoidy śledziony składały się z komórek limfatycznych CD45-TER-119-zrębu, CD45-TER-119⁺ erytrocytów i CD45⁺TER-119^- limfoidalnych (Figura 2C), jednak częstość występowania każdej populacji była zmienna w poszczególnych organoidach (n = 4; Tabela 1). Aby ocenić ogólną strukturę organoidów śledziony, przygotowano i zwizualizowano kriosekcje tkankowe o grubości 50 μm. Organoidy składały się z niepustej struktury, z komórkami obecnymi na całej średnicy tkanki (Ryc. 2D). Ocena skrawków organoidów przy grubości warstwy pojedynczej komórki 7 μm wykazała, że komórki były ułożone w struktury przypominające sznur bez wyraźnej orientacji przestrzennej (Ryc. 2D), z obszarami pozbawionymi jąder między strunami komórek. Barwienie przeciwciałami CD45 potwierdziło obecność jądrzastych komórek krwiotwórczych, które gęsto otaczały obwodowe regiony organoidu (Figura 2E). Ponadto zaobserwowano komórki CD45 ⁺ o wyraźnej, wrzecionowatej morfologii w bardziej centralnych regionach organoidów. Ogólny brak barwienia przeciwciałami CD90.2 (limfocyty T) i CD19 (limfocyty B), ale dodatnie barwienie CD11b, wykazał specyficzną obecność komórek szpikowych (Figura 2F). Niehematopoetyczne komórki śródbłonka CD105⁺ i CD31⁺ wykryto również w wielu organoidach¹¹.

Przeszczep śledziony in vivo
Enkapsulacja zagregowanych komórek zrębu śledziony w półstałej matrycy ułatwia badania nad przeszczepami zwierząt. Technikę tę zastosowano do osadzenia niefrakcjonowanych lub sortowanych CD45-TER-119-FACS preparatów komórek zrębu śledziony noworodków w zaporze macierzy błony podstawnej, służąc jako nośnik do przeszczepu pod torebką nerki myszy. Zgodnie z podobnymi protokołami agregacji komórek⁸, konstrukty komórkowe kapsułkowane macierzą podstawną (MECCs) z powodzeniem zregenerowały tkankę śledziony w 4/5 niezależnych przeszczepach zwierząt, potwierdzając w ten sposób wykonalność tej techniki budowy przeszczepu. Aby przetestować przydatność MECC w definiowaniu typów komórek wymaganych do regeneracji śledziony, przeszczepy MECC zostały skonstruowane z komórek śledziony noworodków, które były specjalnie pozbawione PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ lub PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- komórek zrębu (CD45^-)¹¹. Przeszczepy pozbawione komórek PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ zachowały zdolność do regeneracji tkanek brutto (4/4 przeszczepy; Rysunek 3A)¹¹. Trzy z czterech zregenerowanych tkanek wykazywały prawidłowy skład i strukturę komórek śledziony, wykazując centralne tętniczki, białe mieszki miazgi, segregowane przedziały komórek T i B, pęcherzykowe komórki dendrytyczne, komórki siatkowate strefy brzeżnej i marginalne makrofagi metalofilowe, sinusoidy czerwonej miazgi, komórki szpikowe i makrofagi (Rysunek 3B)¹¹. W przeciwieństwie do tego, przeszczepy, które nie miały komórek PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- w dużej mierze nie regenerowały tkanki śledziony (1/4 przeszczepów)¹¹. Dane te potwierdzają znaczenie komórek PDGFRβ+ pochodzących z przeszczepu w regeneracji tkanki śledziony⁸ i wskazują konkretne wymagania dla komórek zrębu PDGFRβ⁺MAdCAM-1^-.

Rysunek 1. Obudowa macierzy błony podstawnej zagregowanych komórek zrębu śledziony. Końcówka pipety o pojemności 200 μl służy do ułatwienia agregacji komórek wewnątrz macierzy błony podstawnej. Warstwa matrycy fluidycznej jest najpierw tworzona przez zassanie 2 μl lodowatej matrycy membrany podstawowej do wstępnie schłodzonej końcówki pipety. Zawiesina komórkowa jest osadzana powyżej warstwy matrycy, a siła odśrodkowa jest przykładana do mobilizacji i agregacji komórek w macierzy błony podstawnej. (A) Ustawienia prędkości wirówki są zoptymalizowane pod kątem pozycjonowania agregatów komórek w połowie warstwy matrycy. (B) Nadmierna prędkość odśrodkowa powoduje powstawanie komórek, które agregują się na końcu pipety. (C) Niewystarczająca prędkość uniemożliwia przemieszczanie się komórek przez matrycę. (D) Po inkubacji w temperaturze 37 °C przez 15 minut z końcówki pipety wyrzuca się półstałą zatyczkę matrycową. Groty strzałek wskazują rozmieszczenie agregatów komórek w macierzy. Podziałka skali, 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Hodowla in vitro agregatów śledziony otoczonych macierzą błony podstawnej i tworzenie trójwymiarowych struktur organoidowych. (A) Rozwój organoidów śledziony w ciągu 35 dni. Panele (i-vi) odpowiadają dniom 0, 7, 14, 21, 28 i 35 w kulturze. Obrazy zostały wykonane za pomocą mikroskopu kontrastowego z odwróconą fazą firmy Nikon TS2. Podziałka, 500 μm. (B) Średnica organoidu śledziony w dłuższych okresach hodowli. Każda linia reprezentuje indywidualny organoid. (C) Charakterystyka cytometrii przepływowej populacji komórek zrębu (CD45-TER-119^-), limfoidalnych (CD45⁺TER-119^-) i erytroidalnych (CD45-TER-119⁺) po 53 dniach hodowli. Panel górny: Tkanka kontrolna przygotowana ze zrębu śledziony noworodka. Dolny panel: organoid śledziony, dzień 52. (D) Ogólna morfologia tkanki organoidowej przy grubości przekroju 50 μm (górne panele) i 7 μm (dolne panele) po 22 dniach hodowli. (E) Lokalizacja i morfologia komórek krwiotwórczych CD45⁺ po 34 dniach w hodowli. Powiększony obszar jest pokazany w prawych panelach. Skrawki mają 7 μm. (F) Ocena komórek szpikowych (CD11b), T (CD90.2) i B (CD19) po 34 dniach hodowli. Powiększony obszar jest pokazany we wstawieniu. Sekcje wynoszą 7 μm. Zdjęcia zostały wykonane za pomocą mikroskopu komórkowego Nikon Eclipse Ti2-E. Podziałka skali (D, E, F), 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Analiza tkanki przeszczepu macierzy błony podstawnej. Przeszczepy wykonano ze zrębu śledziony noworodka pozbawionego komórek PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ (n = 4). Dodatkowe dane dostępne online¹¹. (A) Makroskopowy obraz zregenerowanego przeszczepu śledziony po 4 tygodniach od przeszczepienia pod torebką nerkową. Żółty obszar w ramce oznacza zregenerowaną tkankę śledziony. Obraz został wykonany za pomocą mikroskopu stereoskopowego Leica M60 wyposażonego w adapter zoomu Snap oraz Apple iPhone 6S. Pasek skali, 1000 μm. (B) Złożone, wielokolorowe, immunofluorescencyjne obrazy tkanek przeszczepu o grubości 30 μm poddanych kriosekcji na płaszczyźnie koronalnej. Barwienie przeciwciał wykonano za pomocą wskazanych markerów w celu uwidocznienia mikroarchitektury tkanki śledziony. Zdjęcia zostały wykonane za pomocą mikroskopu komórkowego Nikon Eclipse Ti2-E. Obszary ramkowe pokazują obszary o większym powiększeniu. Podziałka skali, 1000 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

TGLI Rozdział

Nr organoidu	Komórki zrębu	Erytrocytów	Limfocytów
1	62	7,7	Rozdział 31
cyfra arabska	22 Rozdział 22	24	55
3	3.6	0,1	96 Rozdział 96
4	10	76 Rozdział 76	12

Tabela 1. Odsetek populacji komórek zrębowych, erytroidalnych i limfoidalnych wśród poszczególnych organoidów śledziony.

Rysunek uzupełniający 1. Schematyczny przegląd protokołu przedstawiający główne etapy generowania konstruktów komórkowych z wbudowaną matrycą do badań in vitro i in vivo. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Agregacja noworodkowych komórek śledziony w półstałym podłożu stanowi realną metodę generowania konstruktów śledziony. Podobne protokoły oparte na macierzy błony podstawnej zostały wykorzystane do zainicjowania trójwymiarowych kultur śledziony¹⁰. W tym miejscu pokazujemy, że konstrukty śledziony są równie podatne na systemy hodowli organoidów in vitro , jak i na modele przeszczepów in vivo . Warto zauważyć, że przeszczepianie organoidów śledziony hodowanych in vitro nie zostało jeszcze przetestowane, ale interesujące byłoby określenie zdolności do pełnej lub częściowej regeneracji tkanki śledziony. Protokół ten dziedziczy również techniki agregacji komórek opisane w poprzednich badaniach dotyczących przeszczepiania śledziony⁸. Badania te polegały na załadowaniu agregatów komórkowych na arkusz kolagenu, a następnie przeszczepie pod torebkę nerkową. Zamknięcie agregatów komórkowych w macierzy błony podstawnej daje wyraźną przewagę pod względem orientacji przeszczepu, gdzie eliminowane są różnice związane z przeszczepem kolagenu stroną do dołu w porównaniu z przeszczepem komórkowym zagregowaną stroną do dołu.

Metodologia przygotowania konstrukcji matrycy membrany podstawnej jest stosunkowo prosta. Zastosowanie matrycy błony podstawnej o wysokim stężeniu zapewnia, że komórki są początkowo podtrzymywane w stanie zagregowanym, zanim matryca rozproszy się w ciągu kilku dni. Z naszego doświadczenia wynika, że po starannym warstwowaniu (krok 2.6) i odwirowaniu (krok 2.8) roztworu komórkowego zawieszonego PBS następuje minimalne mieszanie i rozcieńczanie matrycy błony podstawnej. Większość optymalizacji koncentruje się na umieszczeniu osadu ogniwa w korku matrycy (rysunek 1). Można temu zaradzić, testując kilka zmiennych, takich jak prędkość wirowania, czas, skład objętościowy matrycy błony podstawnej, objętość roztworu komórek zawieszonych w PBS i rozmiar końcówki pipety. Liczba komórek i charakterystyka (rozmiar, gęstość) mogą również wpływać na ustawienia, a każde przygotowanie komórek powinno być zoptymalizowane indywidualnie.

Należy zwrócić uwagę na kilka ograniczeń. Matryca membrany podstawnej może być produktem wrażliwym na temperaturę i należy zachować ostrożność, aby działać szybko, aby odczynniki były zimne. Zapobiega to przedwczesnemu krzepnięciu macierzy i zapewnia prawidłowe zamknięcie komórek. Podczas gdy wszystkie istotne materiały są przechowywane, przygotowywane lub konserwowane w chłodnym środowisku, czynności związane z ręczną obsługą (np. wyrzucanie końcówki pipety, uszczelnianie elastyczną folią laboratoryjną [Krok 2.5]) mogą w różny sposób wprowadzać ciepło zewnętrzne od użytkownika, zmieniając lepkość matrycy i wpływając na charakterystykę migracji komórek podczas wirowania. Powtarzalność w ramach eksperymentów i pomiędzy nimi może być zatem trudna do osiągnięcia w sposób konsekwentny.

Drugim ograniczeniem jest wymóg doświadczenia i biegłości użytkownika. Niektóre techniki manualne mogą wymagać przedłużonego treningu, aby działać wydajnie i skutecznie. Na przykład uszczelnienie końcówki pipety folią laboratoryjną (krok 2.5) może początkowo skutkować niskimi wskaźnikami sukcesu, ale nieuchronnie poprawi się to wraz z praktyką. Kompetencje w zakresie technik mikrochirurgicznych na zwierzętach uzyskuje się również poprzez powtarzanie. W przypadku przeszczepów należy zachować ostrożność, zwłaszcza podczas wkładania końcówki pipety pod torebkę nerkową (krok 4.2.10), wkładania drucianego tłoka w celu wysunięcia zatyczki (krok 4.2.11) i wyjmowania końcówki z nerki. Ważne jest, aby korek był delikatnie i równomiernie wysuwany, podczas gdy końcówka pipety jest jednocześnie wyjmowana. Nadmierny ruch może spowodować perforację torebki nerkowej lub uszkodzenie miąższu, co prowadzi do nadmiernego krwawienia.

Podsumowując, opisano tutaj proces zamykania komórek w półstałej matrycy, koncentrując się na zrozumieniu tworzenia tkanki śledziony. System ten może być również stosowany do szerokiej gamy typów komórek, z potencjałem do wielu zastosowań in vitro lub in vivo .

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polipropylenowe probówki klastrowe 1,2 ml	Corning	CLS4401	Do umieszczenia w stożkowej probówce o pojemności 14 ml
B-merkaptoetanolu	Gibco	21985023	Stock 55 mM, stosować przy 50 uM
Kolagenaza D	Roche	11088858001
Kolagenaza IV	Sigma-Aldrich	C5138	Z Clostridium histolyticum
Deoksyrybonukleaza I (DNaza I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej, typ II-S, liofilizowany proszek, białko ≥ 80 % ≥ 2 000 jednostek/mg białka
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg / L Glukoza, L-glutamina i wodorowęglan sodu, bez pirogronianu sodu, płyn. Sterylne z filtrem.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, sterylnie filtrowana
Eclipse 200 μ l Końcówki do pipet	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, użyj przy 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix membrana podstawna Wysokie stężenie, Lot# 7330186
MEM Aminokwasy endogenne	Gibco	11140076	Zapas 100X, użyj przy 1X
Penicylina/Streptomycyna	Gibco	15140122	Zapas 10 000 jednostek/ml Penicyliny, 10 000 ug/ml Streptomycyna
Odwracalny sitko komórkowe	STEMCELL Technologies	27216	70 μ
m Pęseta pierścieniowa	NAPOX	A-26	Rozmiar pierścienia: 3 mm
Inhibitor skały (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Wirówka Thermofisher Heraeus Megafuge 40R	Thermofisher		Prędkości przyspieszenia i zwalniania zostały ustawione na 8
Ultra Fine Pęseta	EMS	78340-51S	Styl 51S. Pęseta z antymagnetycznej/przeciwkwasowej SA ze stali austenitycznej o niskiej zawartości węgla jest odporna na korozję. Satynowe wykończenie z powłoką przeciwodblaskową.
Vicryl 5/0 Szew Ligapak Kołowrotek	Ethicon	J283G
Wiretrol II Długi drut	Tłok Drummond	5-000-2002-L	ze stali nierdzewnej, 25 i 50 μ L/WRTL II, Długie
Klips do nawijania	MikRon	427630
Klips do nawijania	ran MikRon	427631	9 mm