Artykuł metodologiczny

Agregacja komórek w kapsułkach macierzy błony podstawnej do badania tworzenia mysiej tkanki śledziony

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66682

⸱

28 czerwca 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Clem Jones Centre for Regenerative Medicine, Faculty of Health Sciences and Medicine, Bond University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół agregacji i hermetyzacji komórek śledziony w półstałej macierzy błony podstawnej. Konstrukty macierzy błony podstawnej mogą być wykorzystywane w hodowli trójwymiarowej do badania rozwoju organoidów lub do badań nad przeszczepami in vivo i regeneracją tkanek.

Streszczenie

Śledziona jest organem odpornościowym, który odgrywa kluczową rolę w krwiopochodnych odpowiedziach immunologicznych. Anatomiczna lub funkcjonalna utrata tej tkanki zwiększa podatność na ciężkie infekcje krwi i sepsę. Autotransplantacja plastrów śledziony jest stosowana klinicznie w celu zastąpienia utraconej tkanki i przywrócenia funkcji immunologicznej. Jednak mechanizm napędzający solidną i immunologicznie funkcjonalną regenerację tkanki śledziony nie został w pełni wyjaśniony. W tym przypadku naszym celem jest opracowanie metody agregacji i hermetyzacji komórek śledziony w półstałej matrycy w celu zbadania wymagań komórkowych dotyczących tworzenia tkanki śledziony. Konstrukty komórkowe otoczone macierzą błony podstawnej są podatne zarówno na hodowlę tkankową trójwymiarowych organoidów in vitro, jak i na przeszczep pod torebkę nerkową w celu bezpośredniej oceny tworzenia tkanek in vivo. Manipulując komórkami wejściowymi do agregacji i enkapsulacji, wykazujemy, że komórki zrębu noworodków PDGFRβ + MAdCAM-1 pochodzące z przeszczepu są wymagane do regeneracji tkanki śledziony w modelach przeszczepu zwierząt.

Wprowadzenie

Urazowe pęknięcie śledziony i pojawienie się wielu guzków śledziony w ciele było jednym z pierwszych sygnałów, że tkanka śledziony posiada zdolność regeneracyjną1,2. Autotransplantacje śledziony zostały później wprowadzone do kliniki w celu zachowania tkanki śledziony u pacjentów wymagających pilnej splenektomii3. Jednak pomimo tego, że jest częścią praktyki klinicznej od dziesięcioleci, bardzo niewiele wiadomo o tym, jak śledziona się regeneruje. Modele przeszczepiania zwierząt dostarczyły informacji na temat wielu parametrów regeneracji śledziony i funkcji immunologicznej4,5. W szczególności eksperymentalne modyfikacje metody przygotowania przeszczepów pozwoliły na bardziej szczegółowe zbadanie regeneracji tkanek na poziomie komórkowym i molekularnym.

Przeszczepy obejmujące całe plastry śledziony przechodzą fazę masowej martwicy, zanim nowa struktura śledziony zostanie odbudowana6. Początkowa faza martwicy przeszczepu sugeruje, że większość przeszczepionej tkanki składa się w dużej mierze z czerwonych i białych krwinek i nie jest potrzebna do regeneracji śledziony. Zbadano to eksperymentalnie, wykluczając komórki krwiotwórcze z przeszczepów śledziony przed przeszczepem pod torebkę nerkową myszy. W tym przypadku wykazano, że frakcja nieleukocytowa/nieerytrocytowa śledziony, która obejmuje komórki zrębu i śródbłonka, jest wystarczająca do indukowania tworzenia tkanek de novo7. Tkanka zrębu śledziony może być dalej przetwarzana na zawiesinę jednokomórkową, co umożliwi wykorzystanie technologii sortowania komórek do manipulowania składem przeszczepu komórkowego. Poprzez selektywne usuwanie typów komórek kandydujących zidentyfikowano dwie populacje komórek zrębu CD45-TER-119, które były niezbędne do rozwoju przeszczepu: śródbłonkową populację komórek CD31 + CD105 + MAdCAM-1 + i szerzej zdefiniowaną populację komórek mezenchymalnych PDGFRβ + 8.

Budowa przeszczepów z komórek śledziony różni się pod względem materiałów podporowych i procesów ładowania komórek. Śledziony modyfikowane tkankowo były wcześniej przygotowywane przez ładowanie jednostek śledziony na rusztowanie polimerowe z kwasem poliglikolowym/poli-litrem kwasu mlekowego5,9. Co ciekawe, komórki zrębu śledziony wchłonięte przez gąbkę kolagenową nie zdołały się wszczepić, podczas gdy komórki zrębu zagregowane i załadowane na arkusz kolagenu ułatwiały regenerację śledziony8. Wykazano również, że ponowne zawieszenie komórek zrębu śledziony w matrycy Matrigel indukuje agregację komórek w warunkach hodowli trójwymiarowej10. Jednak metoda ta nie została przetestowana pod kątem stosowania w modelach transplantacyjnych. Ogólnym celem obecnego protokołu jest wymuszona agregacja i hermetyzacja komórek zrębu śledziony bezpośrednio w macierzy błony podstawnej, która następnie może zostać przeniesiona do trójwymiarowego systemu hodowli tkankowej in vitro lub wykorzystana jako nośnik do przeszczepów modeli zwierzęcych (rysunek uzupełniający 1).

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami eksperymentalnymi zatwierdzonymi przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Queensland (UQBR/079/19).

1. Pobieranie tkanek i przygotowanie komórek zrębu

  1. Poddać eutanazji 0,5-1,5 dnia samca i/lub samicy nowonarodzonych myszy dawców BALB/c poprzez indukcję hipotermii poprzez owinięcie zwierząt w bibułkę i umieszczenie ich pod kruszonym lodem przez >10 min.
    UWAGA: Ten protokół można dostosować do różnych szczepów myszy, wieku i liczby zwierząt.
  2. Przygotuj sterylne narzędzia chirurgiczne.
  3. Połóż mysz w prawej pozycji bocznej. Przetrzyj skórę 80% etanolem i wykonaj 1 cm nacięcie nożyczkami chirurgicznymi Iris, aby odsłonić ścianę otrzewnej.
  4. Wykonaj drugie 0,5 cm nacięcie powyżej śledziony i użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie podnieść tkankę. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby przeciąć naczynia krwionośne i wyciąć tkankę. Przenieść tkankę na szalkę Petriego zawierającą lodowatą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Usuń pozostałą tkankę łączną przyczepioną do śledziony.
    UWAGA: Mikroskop stereoskopowy może wspomagać drobne ruchy motoryczne wymagane do manipulowania narzędziami chirurgicznymi.
  5. Aby oddzielić całe tkanki, przenieś śledziony noworodków (pule 10 lub mniej) do wewnętrznej krawędzi odwróconej stożkowej nasadki rurki o pojemności 14 ml. Mechanicznie rozerwać tkanki ruchem uciskającym za pomocą plastikowej końcówki tłoka strzykawki o pojemności 1 ml.
  6. Umieść i szczelnie zabezpiecz nakrętkę na stożkowej probówce o pojemności 14 ml zawierającej 10 ml zimnego PBS. Odwróć probówkę 5x, aby zmyć całą uszkodzoną tkankę z nakrętki do tuby.
  7. Powtórz krok 1.6 dla pozostałej tkanki.
  8. Pozostaw probówkę na lodzie na 1 minutę, aby tkanka osiadła na dnie tubki.
  9. Ostrożnie wyrzucić supernatant (zawierający komórki krwiotwórcze), przepuszczając roztwór przez odwracalne sitko do komórek o średnicy 70 μm.
  10. Odzyskaj nierozpuszczalną frakcję zrębu poprzez odwrócenie sitka i przemycie tkanki zrębu z powrotem do stożkowej probówki o pojemności 14 ml przy użyciu świeżo przygotowanych 2 ml uzupełnionej pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (sDMEM) zawierającej 1 mg/ml kolagenazy IV, 40 μg/ml DNazy I i 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    UWAGA: Kolagenaza IV i Kolagenaza D są substancjami niebezpiecznymi i muszą być obsługiwane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
  11. Aby przygotować zawiesinę jednokomórkową, należy enzymatycznie trawić zebraną tkankę (do 20) przez 10 minut w temperaturze 37 °C ze stałą rotacją.
  12. Dodaj 4 ml świeżo przygotowanego sDMEM zawierającego 1 mg/ml kolagenazy D, 40 μg/ml DNazy I i 2% FBS bezpośrednio do probówki zawierającej tkankę zrębu. Inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C przy stałej rotacji.
  13. Zatrzymaj trawienie, dodając 8 ml lodowatego PBS. Zebrać komórki, odwirowując przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  14. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć komórki, ponownie zawieszając w 1 ml zimnego PBS i odwirowując w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Utrzymać komórki na lodzie.
    UWAGA: Komórki można zliczać i dostosowywać do żądanego stężenia. Może to wymagać optymalizacji dla różnych populacji komórek. Korzystając z tego protokołu, 0,5 x 106- 1 x 106 komórek zrębu/śledziony jest zwykle odzyskiwanych, w zależności od wieku myszy dawcy. Na tym etapie komórki mogą być opcjonalnie barwione, a sortowane metodą FACS w celu określenia składu komórek.

2. Enkapsulacja macierzy agregatów komórkowych

  1. Sterylne końcówki pipet P200 należy wstępnie schłodzić w zamrażarce o temperaturze -20°C.
  2. Pokrój elastyczną folię laboratoryjną (np. Parafilm) na kawałki o wymiarach 1 cm x 2 cm i sterylizuj, zanurzając w 80% etanolu na 10 minut, a następnie PBS na 10 minut. Folię laboratoryjną można przygotować wcześniej i przechowywać w sterylnej formie.
  3. Przygotować 0,5 x 10 6-2,5 x 106 komórek, odwirowując przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając około 20 μl pozostałej objętości PBS. Trzymaj osad komórkowy na lodzie.
    UWAGA: Pozostały PBS można delikatnie zassać bez naruszania osadu komórkowego w celu potwierdzenia objętości.
  4. Odessać 2 μl lodowatej matrycy membrany podstawnej do wstępnie schłodzonej końcówki pipety P200 za pomocą pipetora P20.
    UWAGA: Wysoce skoncentrowana matryca błony podstawnej (np. Corning Matrigel Matrix High Concentration) pomaga w tworzeniu silnego, zestalonego czopu.
  5. Delikatnie przekręć, aby wysunąć końcówkę pipety. Rozciągnij wstępnie wysterylizowany pasek folii laboratoryjnej i umieść go na końcu końcówki pipety, uważając, aby nie przebić folii. Kontynuuj owijanie końcówki folią, aby uszczelnić końcówkę pipety. Ostrożnie umieść uszczelnioną końcówkę bezpośrednio na lodzie, uważając, aby nie rozerwać folii.
  6. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pozostałym PBS i delikatnie nałożyć roztwór na matrycę błony podstawnej. Trzymaj konstrukcję na lodzie.
  7. Przygotuj probówkę wirówkową, umieszczając probówkę zbiorczą o pojemności 1,2 ml w stożkowej probówce o pojemności 14 ml.
  8. Umieścić końcówkę pipety w zagnieżdżonej probówce i wirować w temperaturze 400 x g i 4 °C przez 5 minut.
  9. Ustawić probówkę stożkową o pojemności 14 ml w orientacji pionowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy błony podstawnej wewnątrz końcówki pipety.
    UWAGA: Probówkę stożkową o pojemności 14 ml można umieścić na lodzie, dopóki nie będzie potrzebna do dalszej aplikacji.

3. Trójwymiarowa hodowla organoidów

  1. Ostrożnie usuń folię laboratoryjną z końcówki pipety.
  2. Włożyć cienki tłok z drutu ze stali nierdzewnej przez większy otwór końcówki pipety.
  3. Wyrzuć czop matrycowy, aż zostanie uwolniony przez końcówkę, do jednego dołka niepoddanej działaniu substancji 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej 2 ml sDMEM uzupełnionego 10% FBS, 1x Glutamax, 1x Aminokwasy endogenne (NEAA), 10 μM inhibitor skał, 10 U/ml penicyliny/streptomycyny i 50 μM β-merkaptoetanolu.
    UWAGA: Naczynie do hodowli tkankowej i odpowiadającą mu objętość pożywki można regulować zgodnie z wymaganiami.
    UWAGA: NEAA, penicylina/streptomycyna i β-merkaptoetanol są substancjami niebezpiecznymi i muszą być obsługiwane w komorze bezpieczeństwa biologicznego z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
  4. Hoduj organoidy w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% przez 4-12 tygodni.
  5. Wymieniaj połowę podłoża co 5 dni.
    UWAGA: Jeśli organoidy zaczną przyczepiać się do płytki kultury tkankowej, przenieś do świeżej studzienki.

4. Przeszczep torebki nerkowej

  1. Przygotuj sterylne narzędzia chirurgiczne.
  2. Wykonaj podtorebkowy przeszczep nerki czopa macierzy błony podstawnej:
    1. Znieczulić 8-tygodniową samicę myszy biorcy BALB/c izofluranem zgodnie z Instytucjonalnymi Wytycznymi Etycznymi Zwierząt.
      UWAGA: Izofluran jest substancją niebezpieczną. Gaz odlotowy musi zostać usunięty, aby zapobiec przedostawaniu się do środowiska pracy.
    2. Połóż mysz w prawej pozycji bocznej.
    3. Ogolić włosy w miejscu operacji i zdezynfekować skórę zgodnie z wytycznymi instytucji.
      UWAGA: Zaleca się trzykrotną dezynfekcję pola operacyjnego ruchami okrężnymi za pomocą naprzemiennego peelingu na bazie jodu lub chlorheksydyny i alkoholu.
    4. Wykonaj 2 cm nacięcie w skórze prostopadłej do kręgosłupa, aby odsłonić ścianę otrzewnej.
      UWAGA: Do nacinania skóry można użyć cienkich nożyczek chirurgicznych lub ostrza skalpela. Użytkownicy powinni postępować zgodnie z Instytucjonalnymi Wytycznymi Etycznymi Zwierząt lub Standardowymi Procedurami Operacyjnymi.
    5. Wykonaj mniejsze 0,5 cm nacięcie w ścianie otrzewnej nad nerką.
      UWAGA: Nacięcie powinno być zbliżone do szerokości nerki, aby zapewnić, że nerka pozostanie zewnętrzna podczas przeszczepu.
    6. Zewnętrznie nerkę należy wyprowadzić przez otwór otrzewnej, wywierając nacisk w dół za pomocą kciuka i palca wskazującego. Para pęset pierścieniowych może być użyta do pomocy w eksterioryzacji. Upewnij się, że nerka jest wilgotna przez cały czas trwania zabiegu, regularnie nakładając sterylny PBS za pomocą bawełnianego wacika.
    7. Pod mikroskopem stereoskopowym uszczypnij tłuszcz okołonerkowy torebki nerkowej za pomocą pary zgiętych ultracienkich kleszczyków w jednym biegunie nerki. Użyj drugiej pary zgiętych, bardzo cienkich kleszczyków, aby delikatnie rozerwać błonę torebki nerkowej w przeciwnym kierunku, tworząc mały otwór.
    8. Ostrożnie włóż bolec jednego kleszcza pod membranę kapsułki. Użyj powolnego, zamaszystego ruchu, aby oddzielić błonę torebki od miąższu nerki.
    9. Przygotować zatyczkę macierzy błony podstawnej do przeszczepu, usuwając film laboratoryjny z końcówki pipety.
    10. Podnieś torebkę nerkową za pomocą jednego bolca kleszczy i włóż końcówkę pipety przez otwór, popychając ją w kierunku przeciwległego bieguna nerki.
    11. Włożyć druciany tłok do końcówki pipety i usunąć zatyczkę matrycową, jednocześnie wyjmując końcówkę pipety z nerki.
    12. Zwilż nerkę PBS i ponownie zinternalizuj.
    13. Zamknij ścianę otrzewnej jednym szwem 5-0 Vicryl i zamknij skórę dwoma automatycznymi klipsami.
    14. Podawać leki przeciwbólowe (buprenorfina w dawce 0,05-0,1 mg/kg podskórnie lub zgodnie z Instytucjonalnymi Wytycznymi Etyki Zwierząt).
      UWAGA: Buprenorfina jest substancją niebezpieczną i należy się z nią obchodzić przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej.
  3. Wyłącz przepływ izofluranu, ale utrzymuj przepływ tlenu włączony, aby mysz mogła oddychać czystym tlenem, dopóki nie zacznie odzyskiwać przytomności.
  4. Umieść mysz z powrotem w klatce. Utrzymuj zwierzę w cieple podczas rekonwalescencji, częściowo umieszczając klatkę na poduszce grzewczej lub pod lampą grzewczą i monitoruj, aż mysz w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.
  5. Monitoruj rekonwalescencję pooperacyjną przez pierwsze dwa tygodnie lub zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

Wyniki

Agregacja komórek jest istotna dla promowania kontaktu i sygnalizacji międzykomórkowej. Zamknięcie agregatów komórkowych w macierzy błony podstawnej wspierało zarówno hodowle trójwymiarowe do tworzenia organoidów tkankowych in vitro, jak i ułatwiało mechaniczne dostarczanie komórek do torebki nerki w celu transplantacji przeszczepu. Aby stworzyć te konstrukty, macierz błony podstawnej była najpierw utrzymywana w stanie płynnym w warunkach niskiej temperatury (na lodzie). Agregację komórek osiągano następnie poprzez nałożenie skoncentrowanej zawiesiny komórek na wierzch i wykorzystanie siły odśrodkowej do przepchnięcia komórek przez gęstą macierz. Optymalizacja prędkości wirowania (200-2000 x g) była niezbędna do uzyskania pozycjonowania komórek w środkowej warstwie (Rycina 1A), co było również zależne od liczby komórek. Wyższe siły odśrodkowe (>500 x g) przesuwały komórki na samą końcówkę pipety (Rycina 1B); należy zachować ostrożność przy mniejszej liczbie komórek (t.j. <5 x 105), które mogą zostać utracone podczas usuwania elastycznej folii laboratoryjnej. I odwrotnie, komórki mogą nie przenikać odpowiednio przez macierz błony podstawnej, jeśli siły g są zbyt niskie (≤200 x g) (Rycina 1C). Prędkość wirowania dla liczby komórek <1 x 105 lub >2,5 x 106 może wymagać dalszej optymalizacji. Po wirowaniu komórki zostawały utrwalone w macierzy błony podstawnej poprzez ogrzewanie konstruktu w temperaturze 37 °C przez 15 min. Ten proces krzepnięcia umożliwił całkowite wysunięcie „czopa” macierzy (Rycina 1D) za pomocą cienkiego drucianego tłoka.

In vitro tworzenie organoidów śledziony
Wtyki z macierzy błony podstawnej wyrzucone do odpowiedniego naczynia do hodowli tkanek w sposób powtarzalny tworzyły trójwymiarowe struktury przypominające organoidy, które można było utrzymywać zgodnie ze standardowymi technikami i warunkami hodowli tkanek (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności)11. W hodowli wspierający substrat macierzy błony podstawnej stopniowo zanikał między dniem 0 a 14 (Rysunek 2A, i-iii) i nie był już widoczny w 21. dniu, pozostawiając nienaruszoną, sferyczną masę komórkową przypominającą organoid (Rysunek 2A, vi) o średnicy około 545 µm (s.d. = 120 µm, n = 6)11. Struktury organoidalne te były utrzymywane w hodowli powyżej 30 dni, lecz nie zwiększały swojej wielkości w czasie (Rysunek 2B). Organoidy śledziony składały się z komórek zrębowych CD45-TER-119-, erytrocytów CD45-TER-119+ oraz komórek limfoidalnych CD45+TER-119- (Rysunek 2C), jednak częstotliwość występowania każdej z populacji była zmienna w poszczególnych organoidach (n = 4; Tabela 1). Aby ocenić ogólną strukturę organoidów śledziony, przygotowano i zwizualizowano krioprzekroje tkanki o grubości 50 µm. Organoidy posiadały strukturę pełną, z komórkami obecnymi w całym przekroju tkanki (Rysunek 2D). Ocena przekrojów organoidów przy grubości pojedynczej warstwy komórkowej 7 µm wykazała, że komórki były rozmieszczone w strukturach przypominających sznury, bez wyraźnej orientacji przestrzennej (Rysunek 2D), z obszarami pozbawionymi jąder między pasmami komórek. Barwienie przeciwciałami CD45 potwierdziło obecność jądrzastych komórek hematopoetycznych, które gęsto otaczały obszary obwodowe organoidu (Rysunek 2E). Dodatkowo w bardziej centralnych obszarach organoidu zaobserwowano komórki CD45+ o wyraźnej, wrzecionowatej morfologii. Ogólny brak barwienia przeciwciałami CD90.2 (limfocyty T) i CD19 (limfocyty B), przy jednoczesnym pozytywnym barwieniu CD11b, wykazał specyficzną obecność komórek mieloidalnych (Rysunek 2F). W wielu organoidach wykryto również niehematopoetyczne komórki śródbłonka CD105+ i CD31+11.

In vivo transplantacja przeszczepu śledziony
Enkapsulacja zagregowanych komórek zialnych śledziony w macierzy półstałej ułatwia prowadzenie badań nad transplantacją u zwierząt. Technikę tę zastosowano w celu osadzenia niefrakcjonowanych lub sortowanych metodą FACS preparatów neonatalnych komórek zialnych śledziony CD45-TER-119- wewnątrz zatyczki z macierzy błony podstawnej, służącej jako nośnik do transplantacji pod torebkę nerki myszy. Zgodnie z podobnymi protokołami agregacji komórek8, konstrukty komórkowe enkapsulowane w macierzy błony podstawnej (MECC) z sukcesem zregenerowały tkankę śledziony w 4/5 niezależnych transplantacji zwierzęcych, potwierdzając tym samym żywotność tej techniki konstrukcji przeszczepu. Aby przetestować użyteczność MECC w określaniu typów komórek wymaganych do regeneracji śledziony, konstrukty MECC przygotowano z neonatalnych komórek śledziony, z których specyficznie usunięto komórki zialne (CD45-) PDGFRβ+MAdCAM-1+ lub PDGFRβ+MAdCAM-1-11. Przeszczepy pozbawione komórek PDGFRβ+MAdCAM-1+ zachowały zdolność do makroskopowej regeneracji tkanki (4/4 przeszczepów; Rysunek 3A)11. Trzy z czterech zregenerowanych tkanek wykazywały prawidłowy skład i strukturę komórkową śledziony, wykazując obecność tętniczek centralnych, pęcherzyków miazgi białej, odseparowanych przedziałów limfocytów T i B, komórek dendrytycznych pęcherzykowych, komórek retikularnych strefy marginalnej i metalofilnych makrofagów strefy marginalnej, zatok miazgi czerwonej, komórek mieloidalnych oraz makrofagów (Rysunek 3B)11. W przeciwieństwie do nich, przeszczepy pozbawione komórek PDGFRβ+MAdCAM-1- w dużej mierze nie zregenerowały tkanki śledziony (1/4 przeszczepów)11. Dane te potwierdzają znaczenie pochodzących z przeszczepu komórek PDGFRβ+ w regeneracji tkanki śledziony8 oraz wskazują na konkretny wymóg obecności komórek zialnych PDGFRβ+MAdCAM-1-.

Mikroskopia zarodka w probówce; proces umieszczania i wyjmowania zarodka; badanie biologiczne.
Rysunek 1Enkapsulacja agregatów komórek zrębu śledziony w macierzy błony podstawnej. A 200 µL końcówka pipety jest wykorzystywana w celu ułatwienia agregacji komórek wewnątrz macierzy błony podstawnej. Najpierw tworzy się warstwę macierzy fluidalnej poprzez aspirację 2 µL lodowatej macierzy błony podstawnej do schłodzonej końcówki pipety. Zawiesinę komórek nanosi się na warstwę macierzy, a następnie stosuje siłę odśrodkową, aby przemieścić i zagregować komórki w obrębie macierzy błony podstawnej. (AUstawienia prędkości wirówki są zoptymalizowane tak, aby agregaty komórkowe znajdowały się w połowie grubości warstwy macierzy.BZbyt wysoka prędkość wirowania powoduje agregację komórek na końcówce pipety.C) Niewystarczająca prędkość uniemożliwia przemieszczanie się komórek przez macierz. (D) Po inkubacji w temperaturze z końcówki pipety zostaje wypchnięty półstały korek matrycy 37 °C przez 15 minut. Groty strzałek wskazują rozmieszczenie agregatów komórkowych w obrębie macierzy. Pasek skali, 100 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wzrost i analiza organoidów; obrazy mikroskopowe, wykres średnicy, cytometria przepływowa, immunofluorescencja.
Rysunek 2. In vitro hodowla agregatów śledziony enkapsulowanych w macierzy błony podstawnej i formowanie trójwymiarowych struktur organoidowych. (A) Rozwój organoidów śledziony w ciągu 35 dni. Panele (i-vi) odpowiadają dniom 0, 7, 14, 21, 28 i 35 hodowli. Obrazy wykonano za pomocą odwróconego mikroskopu fazowego Nikon TS2. Pasek skali, 500 µm. (B) Średnica organoidów śledziony w dłuższych okresach hodowli. Każda linia reprezentuje pojedynczy organoid. (C) Charakterystyka populacji komórek zrębowych (CD45-TER-119-), limfoidalnych (CD45+TER-119-) i erytroidalnych (CD45-TER-119+) przy użyciu cytometrii przepływowej po 53 dniach hodowli. Panel górny: Tkanka kontrolna przygotowana ze zrębu śledziony noworodka. Panel dolny: Organoid śledziony, dzień 52. (D) Makroskopowa morfologia tkanki organoidu przy grubości cięć 50 µm (panele górne) i 7 µm (panele dolne) po 22 dniach hodowli. (E) Lokalizacja i morfologia komórek krwiotwórczych CD45+ po 34 dniach hodowli. Powiększony obszar pokazano na panelach po prawej stronie. Grubość cięć wynosi 7 µm. (F) Ocena komórek mieloidalnych (CD11b), T (CD90.2) i B (CD19) po 34 dniach hodowli. Powiększony obszar pokazano na wstawce. Grubość cięć wynosi 7 µm. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu do żywych komórek Nikon Eclipse Ti2-E. Paski skali (D, E, F), 100 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat analizy histologicznej z multipleksową immunofluorescencją przedstawiający przekroje tkanek i nakładkę markerów.
Rysunek 3. Analiza tkanki przeszczepionej macierzy błony podstawnej. Przeszczepy wykonano ze zwojów śledziony noworodka pozbawionych komórek PDGFRβ+MAdCAM-1+ (n = 4). Dodatkowe dane dostępne online11. (A) Wygląd makroskopowy zregenerowanego przeszczepu śledziony w 4 tygodniu po transplantacji pod torebkę nerki. Żółta obramowana область wskazuje zregenerowaną tkankę śledziony. Obraz wykonano za pomocą stereomikroskopu Leica M60 wyposażonego w adapter Snap zoom i Apple iPhone 6S. Pasek skali, 1000 µm. (B) Złożone wielokolorowe obrazy immunofluorescencyjne tkanek przeszczepu o grubości 30 µm, przeciętych w płaszczyźnie czołowej. Barwienie przeciwciałami wykonano z użyciem wskazanych markerów w celu wizualizacji mikroarchitektury tkanki śledziony. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu do żywych komórek Nikon Eclipse Ti2-E. Obramowane obszary pokazują regiony w większym powiększeniu. Pasek skali, 1000 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nr organoiduKomórki zręboweErytrocytyLimfocyty
1627.731
2222455
33.60.196
4107612

Tabela 1. Procentowy udział populacji komórek zrębowych, erytroidalnych i limfoidalnych w poszczególnych organoidach śledziony.

Rycina uzupełniająca 1. Schematyczny przegląd protokołu z wyróżnieniem głównych etapów tworzenia konstruktów komórkowych zatopionych w macierzy do badań in vitro oraz in vivo. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Agregacja noworodkowych komórek śledziony w półstałym podłożu stanowi realną metodę generowania konstruktów śledziony. Podobne protokoły oparte na macierzy błony podstawnej zostały wykorzystane do zainicjowania trójwymiarowych kultur śledziony10. W tym miejscu pokazujemy, że konstrukty śledziony są równie podatne na systemy hodowli organoidów in vitro , jak i na modele przeszczepów in vivo . Warto zauważyć, że przeszczepianie organoidów śledziony hodowanych in vitro nie zostało jeszcze przetestowane, ale interesujące byłoby określenie zdolności do pełnej lub częściowej regeneracji tkanki śledziony. Protokół ten dziedziczy również techniki agregacji komórek opisane w poprzednich badaniach dotyczących przeszczepiania śledziony8. Badania te polegały na załadowaniu agregatów komórkowych na arkusz kolagenu, a następnie przeszczepie pod torebkę nerkową. Zamknięcie agregatów komórkowych w macierzy błony podstawnej daje wyraźną przewagę pod względem orientacji przeszczepu, gdzie eliminowane są różnice związane z przeszczepem kolagenu stroną do dołu w porównaniu z przeszczepem komórkowym zagregowaną stroną do dołu.

Metodologia przygotowania konstrukcji matrycy membrany podstawnej jest stosunkowo prosta. Zastosowanie matrycy błony podstawnej o wysokim stężeniu zapewnia, że komórki są początkowo podtrzymywane w stanie zagregowanym, zanim matryca rozproszy się w ciągu kilku dni. Z naszego doświadczenia wynika, że po starannym warstwowaniu (krok 2.6) i odwirowaniu (krok 2.8) roztworu komórkowego zawieszonego PBS następuje minimalne mieszanie i rozcieńczanie matrycy błony podstawnej. Większość optymalizacji koncentruje się na umieszczeniu osadu ogniwa w korku matrycy (rysunek 1). Można temu zaradzić, testując kilka zmiennych, takich jak prędkość wirowania, czas, skład objętościowy matrycy błony podstawnej, objętość roztworu komórek zawieszonych w PBS i rozmiar końcówki pipety. Liczba komórek i charakterystyka (rozmiar, gęstość) mogą również wpływać na ustawienia, a każde przygotowanie komórek powinno być zoptymalizowane indywidualnie.

Należy zwrócić uwagę na kilka ograniczeń. Matryca membrany podstawnej może być produktem wrażliwym na temperaturę i należy zachować ostrożność, aby działać szybko, aby odczynniki były zimne. Zapobiega to przedwczesnemu krzepnięciu macierzy i zapewnia prawidłowe zamknięcie komórek. Podczas gdy wszystkie istotne materiały są przechowywane, przygotowywane lub konserwowane w chłodnym środowisku, czynności związane z ręczną obsługą (np. wyrzucanie końcówki pipety, uszczelnianie elastyczną folią laboratoryjną [Krok 2.5]) mogą w różny sposób wprowadzać ciepło zewnętrzne od użytkownika, zmieniając lepkość matrycy i wpływając na charakterystykę migracji komórek podczas wirowania. Powtarzalność w ramach eksperymentów i pomiędzy nimi może być zatem trudna do osiągnięcia w sposób konsekwentny.

Drugim ograniczeniem jest wymóg doświadczenia i biegłości użytkownika. Niektóre techniki manualne mogą wymagać przedłużonego treningu, aby działać wydajnie i skutecznie. Na przykład uszczelnienie końcówki pipety folią laboratoryjną (krok 2.5) może początkowo skutkować niskimi wskaźnikami sukcesu, ale nieuchronnie poprawi się to wraz z praktyką. Kompetencje w zakresie technik mikrochirurgicznych na zwierzętach uzyskuje się również poprzez powtarzanie. W przypadku przeszczepów należy zachować ostrożność, zwłaszcza podczas wkładania końcówki pipety pod torebkę nerkową (krok 4.2.10), wkładania drucianego tłoka w celu wysunięcia zatyczki (krok 4.2.11) i wyjmowania końcówki z nerki. Ważne jest, aby korek był delikatnie i równomiernie wysuwany, podczas gdy końcówka pipety jest jednocześnie wyjmowana. Nadmierny ruch może spowodować perforację torebki nerkowej lub uszkodzenie miąższu, co prowadzi do nadmiernego krwawienia.

Podsumowując, opisano tutaj proces zamykania komórek w półstałej matrycy, koncentrując się na zrozumieniu tworzenia tkanki śledziony. System ten może być również stosowany do szerokiej gamy typów komórek, z potencjałem do wielu zastosowań in vitro lub in vivo .

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych Australii (#GNT1078247).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96 Well Polipropylenowe probówki klastrowe 1,2 mlCorningCLS4401Do umieszczenia w stożkowej probówce o pojemności 14 ml
B-merkaptoetanoluGibco21985023Stock 55 mM, stosować przy 50 uM
Kolagenaza DRoche11088858001
Kolagenaza IVSigma-AldrichC5138Z Clostridium histolyticum
Deoksyrybonukleaza I (DNaza I)Sigma-AldrichD4513Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej, typ II-S, liofilizowany proszek, białko ≥ 80 % ≥ 2 000 jednostek/mg białka
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)Sigma-AldrichD57964500 mg / L Glukoza, L-glutamina i wodorowęglan sodu, bez pirogronianu sodu, płyn. Sterylne z filtrem.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537Bez chlorku wapnia i chlorku magnezu, sterylnie filtrowana
Eclipse 200 μ l Końcówki do pipetLabcon1030-260-000Bevel Point
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco26140-079Lot# 1382243
GlutaMAXGibco35050061Stock 100X, użyj przy 1X
MatrigelCorning354263Matrigel matrix membrana podstawna Wysokie stężenie, Lot# 7330186
MEM Aminokwasy endogenneGibco11140076Zapas 100X, użyj przy 1X
Penicylina/StreptomycynaGibco15140122Zapas 10 000 jednostek/ml Penicyliny, 10 000 ug/ml Streptomycyna
Odwracalny sitko komórkoweSTEMCELL Technologies2721670 μ
m Pęseta pierścieniowaNAPOXA-26Rozmiar pierścienia: 3 mm
Inhibitor skały (Y-27632)MedChemExpresHY-10071
Wirówka Thermofisher Heraeus Megafuge 40RThermofisherPrędkości przyspieszenia i zwalniania zostały ustawione na 8
Ultra Fine PęsetaEMS78340-51SStyl 51S. Pęseta z antymagnetycznej/przeciwkwasowej SA ze stali austenitycznej o niskiej zawartości węgla jest odporna na korozję. Satynowe wykończenie z powłoką przeciwodblaskową.
Vicryl 5/0 Szew Ligapak KołowrotekEthiconJ283G
Wiretrol II Długi drutTłok Drummond5-000-2002-Lze stali nierdzewnej, 25 i 50 μ L/WRTL II, Długie 
Klips do nawijaniaMikRon427630
Klips do nawijaniaran MikRon4276319 mm

Bibliografia

  1. Jarcho, S., Andersen, D. Traumatic autotransplantation of splenic tissue. American Journal of Pathology. 15 (5), 527-546 (1939).
  2. Storsteen, K. A., ReMine, W. Rupture of the spleen with splenic implants: splenosis. Annals of Surgery. 137 (4), 551-557 (1953).
  3. Mizrahi, S. Posttraumatic autotransplantation of spleen tissue. Archives of Surgery. 124 (7), 863(1989).
  4. Miko, I., et al. Spleen autotransplantation. Morphological and functional follow-up after spleen autotransplantation in mice: A research summary. Microsurgery. 27 (4), 312-316 (2007).
  5. Grikscheit, T. C., et al. Tissue-engineered spleen protects against overwhelming Pneumococcal sepsis in a rodent model. Journal of Surgical Research. 149 (2), 214-218 (2008).
  6. Pabst, R., Westermann, J., Rothkotter, H. Immunoarchitecture of regenerated splenic and lymph node transplants. International Review of Cytology. 128, 215-260 (1991).
  7. Tan, J. K. H., Watanabe, T. Murine spleen tissue regeneration from neonatal spleen capsule requires lymphotoxin priming of stromal cells. The Journal of Immunology. 193 (3), 1194-1203 (2014).
  8. Tan, J. K. H., Watanabe, T. Stromal cell subsets directing neonatal spleen regeneration. Scientific Reports. 7 (1), 40401(2017).
  9. Gee, K., et al. Spleen organoid units generate functional human and mouse tissue-engineered spleen in a murine model. Tissue Engineering Part A. 26 (7-8), 411-418 (2020).
  10. Ueno, Y., et al. Transcription factor Tlx1 marks a subset of lymphoid tissue organizer-like mesenchymal progenitor cells in the neonatal spleen. Scientific Reports. 9 (1), 20408(2019).
  11. Tourle, K., Rucinski, A., Grainger, A., Limnios, I. J., Gonzalez Ruiz, M., Tan, J. K. H. Online data repository: Matrigel encapsulated cell aggregation for investigating murine spleen tissue formation. , Available from: https://osf.io/ehrbw/?view_only=7d6a8e05c84144d3a12d36ffe7f94f01 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hodowla organoidówtransplantacja do torebki nerkowejagregacja komórek zrębowychenkapsulacja w Matrigeluregeneracja tkanekkomórki PDGFR Beta
Agregacja komórek w kapsułkach macierzy błony podstawnej do badania tworzenia mysiej tkanki śledziony
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.