Method Article

Poszukiwanie alternatywnych rozwiązań perfuzyjnych z wykorzystaniem spolimeryzowanych nośników tlenu na bazie hemoglobiny nowej generacji w modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów

DOI:

10.3791/66702

⸱

June 14th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1COPPER Laboratory, Department of Surgery, The Ohio State University Wexner Medical Center, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, The Ohio State University Wexner Medical Center, 3William G. Lowrie Department of Chemical and Biomolecular Engineering, College of Engineering, The Ohio State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy zastosowanie nośnika tlenu na bazie spolimeryzowanej ludzkiej hemoglobiny (PolyhHb) jako perfuzatu oraz protokół, w którym ten roztwór perfuzyjny może być testowany na modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczep płuc jest utrudniony z powodu braku odpowiednich dawców. Wcześniej dawcy, którzy byli uważani za marginalnych lub nieodpowiednich, byli odrzucani. Jednak nowa i ekscytująca technologia, taka jak perfuzja płuc ex vivo (EVLP), oferuje dostawcom przeszczepów płuc rozszerzoną ocenę alloprzeszczepów brzeżnych dawców. Ta dynamiczna platforma oceny doprowadziła do wzrostu liczby przeszczepów płuc i umożliwiła świadczeniodawcom korzystanie z dawców, którzy wcześniej byli odrzucani, rozszerzając w ten sposób pulę dawców. Obecne techniki perfuzji wykorzystują perfuzaty komórkowe lub bezkomórkowe i obie mają wyraźne zalety i wady. Skład perfuzyjny ma kluczowe znaczenie dla utrzymania środowiska homeostatycznego, zapewnienia odpowiedniego wsparcia metabolicznego, zmniejszenia stanu zapalnego i śmierci komórek, a ostatecznie poprawy funkcji narządów. Roztwory perfuzyjne muszą zawierać wystarczające stężenie białka, aby utrzymać odpowiednie ciśnienie onkotyczne. Jednak obecne roztwory perfuzyjne często prowadzą do wynaczynienia płynu przez śródbłonek płuc, co skutkuje niezamierzonym obrzękiem i uszkodzeniem płuc. W związku z tym konieczne jest opracowanie nowatorskich rozwiązań perfuzyjnych, które zapobiegają nadmiernym uszkodzeniom przy jednoczesnym zachowaniu prawidłowej homeostazy komórkowej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie spolimeryzowanego nośnika tlenu na bazie ludzkiej hemoglobiny (PolyhHb) jako perfuzatu oraz protokół, w którym ten roztwór perfuzyjny może być testowany w modelu EVLP szczura. Celem tego badania jest dostarczenie społeczności transplantacyjnej płuc kluczowych informacji w projektowaniu i opracowywaniu nowatorskich rozwiązań perfuzyjnych, a także odpowiednich protokołów do testowania ich w klinicznie istotnych translacyjnych modelach transplantacyjnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak każda dziedzina transplantacji narządów stałych, transplantacja płuc cierpi na niedobór organów dawców. Aby zwiększyć pulę dawców, przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad potencjałem przeszczepów allogennych, które kiedyś uważano za nienadające się do przeszczepu, tj. dawców o rozszerzonych kryteriach (ECD). Te przeszczepy allogeniczne mogą być uważane za ECD z wielu powodów, w tym wątpliwej jakości, słabego funkcjonowania, infekcji, urazu, przedłużającego się ciepłego lub zimnego niedokrwienia oraz zaawansowanego wieku1,2. W niektórych przypadkach, gdy płuca te nadają się do natychmiastowego przeszczepienia3, często korzystne jest zarówno dla świadczeniodawców, jak i biorców, aby ocenić te płuca przez dodatkowy czas w celu ustalenia, czy nadają się do przeszczepienia. Perfuzja płuc ex vivo (EVLP) to taka technologia, która pozwala na rozszerzoną ocenę potencjalnych alloprzeszczepów płuc w zamkniętym obiegu poza dawcą2,4,5,6,7, dając dostawcy przeszczepów możliwość określenia przydatności do przeszczepu. EVLP wykazał zdolność do odpowiedniej oceny narządów dawcy8,9,10,11, zmniejszać skutki niedokrwiennego uszkodzenia reperfuzyjnego (IRI)12,13 i zwiększyć pulę dawców14,15, dzięki czemu przeszczep płuc staje się bardziej dostępny dla wszystkich..

Ogólnie rzecz biorąc, system EVLP to zamknięty system z obwodem wentylacyjnym (osiągniętym przez podłączenie respiratora do tchawicy w celu wprowadzenia powietrza do systemu) i obwodem naczyniowym (osiągniętym przez połączenie lewego przedsionka (LA) z tętnicą płucną (PA) za pomocą rurki)7. Obwód naczyniowy ma perfuzat biegnący przez rurkę, aby dostarczyć płucom niezbędne składniki odżywcze i tlen, jednocześnie ograniczając czas niedokrwienia zimna (CIT)5,8,16,17. To rozwiązanie jest oparte na krwi (tj. poprzez dodanie upakowanych czerwonych krwinek (PRBC))16,17 lub acellular (tj. bez PRBC)4,5. Istnieje jednak kilka godnych uwagi wad korzystania z PRBC. W przypadku stosowania PRBC od dawców, którzy zmarli z powodu urazu lub dawców w stanie śmierci mózgowej (BDD), płyny te często zawierają duże ilości cytokin zapalnych, które mogą zwiększać uszkodzenia komórek podczas EVLP, a także zwiększać poziom hemoglobiny bezkomórkowej (Hb), hemu, żelaza i fragmentów komórek, które powodują dodatkowe uszkodzenia komórek18,19. Ponadto, ponieważ dawcy ci są często wielonarządowi, pobranie PRBC przed pobraniem może prowadzić do zmniejszenia objętości krwi u dawcy, a następnie do zwiększenia niedokrwienia wszystkich narządów. W przypadku korzystania z PRBC z innego źródła, dostawcy mogą stanąć w obliczu niedoborów krwi, ponieważ jest to materiał rzadki sam w sobie20,21. Wreszcie, PRBC są podatne na mechaniczną lizę obwodu EVLP niezależnie od ich źródła, uwalniając Hb i inne składniki, które przyczyniają się do uszkodzenia komórek.

Dlatego, z wielu powodów, korzystne może być użycie sztucznego substytutu czerwonych krwinek, tj. nośników tlenu na bazie hemoglobiny (HBOC), jako suplementu perfuzyjnego. Jednym ze szczególnie obiecujących HBOC jest spolimeryzowana hemoglobina ludzka (PolyhHb). PolyhHb jest syntetyzowany z Hb oczyszczonego z przeterminowanych PRBC, które zostały uznane za nieodpowiednie do natychmiastowej transfuzji22. Wykazano, że są one żywotnymi substytutami krwi we wstrząsie krwotocznym23 i transplantation24 i mogą być produkowane w dużych ilościach22. Jednak przyjęcie PolyhHb na dużą skalę nie powiodło się z powodu nieprzewidzianych komplikacji, takich jak zwężenie naczyń krwionośnych, wzrost ciśnienia krwi i zatrzymanie akcji serca23,25. Przyczyny tych odkryć były prawdopodobnie spowodowane obecnością bezkomórkowych polimerów Hb lub Hb o niskiej masie cząsteczkowej (< 500 kDa) w roztworze PolyhHb, ponieważ mają one skłonność do wynaczynienia do przestrzeni tkankowej, co skutkowało zmniejszoną dostępnością tlenku azotu, późniejszym zwężeniem naczyń krwionośnych, nadciśnieniem układowym i ostatecznie oksydacyjnym uszkodzeniem tkanki26,27. Aby rozwiązać te problemy, Laboratorium Palmera pracowało nad opracowaniem PolyhHb nowej generacji, który zawiera minimalną ilość gatunków o niskiej MW i Hb jest wolny od komórek, co wykazało lepsze właściwości biofizyczne i odpowiedzi in vivo22,28,29,30. Kilka badań transfuzji na zwierzętach wykazało, że jeśli polimery Hb o niskiej masie cząsteczkowej zostaną wyeliminowane z HBOC, można złagodzić zwężenie naczyń krwionośnych, nadciśnienie ogólnoustrojowe i uszkodzenia oksydacyjne28,29,31,32,33,34,35. W związku z tym, co czyni ten PolyhHb nowej generacji obiecującym kandydatem na perfuzyjny.

Tutaj opisujemy zastosowanie PolyhHb nowej generacji do użycia w perfuzacie oraz protokół, za pomocą którego ten roztwór perfuzyjny może być testowany na modelu EVLP szczura. Celem tego badania jest dostarczenie społeczności transplantacyjnej płuc kluczowych informacji w zakresie projektowania i opracowywania nowatorskich rozwiązań perfuzyjnych, a także dostarczenie protokołów do testowania ich w klinicznie istotnych translacyjnych modelach transplantacyjnych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczury Sprague-Dawley (300 g masy ciała) zostały komercyjnie pozyskane i trzymane w warunkach wolnych od patogenów w Ośrodku dla Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio w Wexner. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone w sposób humanitarny zgodnie z NIH i Przewodnikiem Narodowej Rady ds. Badań Naukowych dotyczącym humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz za zgodą Komitetu ds. Instytucjonalnej Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Ohio (Protokół IACUC 2023A00000071).

1. Synteza i oczyszczanie PolyhHb

UWAGA: Produkcja i synteza materiału PolyhHb, który został użyty do następujących eksperymentów EVLP, zostały początkowo opublikowane przez Cuddington et al. w 2020 roku22. Proszę zapoznać się z tą pracą, aby uzyskać szczegółowe schematy i analizę syntezy PolyhHb. Poniżej znajduje się podsumowanie syntezy i oczyszczania PolyhHb w skali pilotażowej, a następnie jego przygotowania w postaci perfuzatu.

  1. Mycie RBC, liza i oczyszczanie Hb
    1. Zaopatrz się w 18 jednostek przeterminowanych ludzkich PRBC i wlej je do 20-litrowego naczynia filtracyjnego, rozcieńcz 0,9% wag. soli fizjologicznej do końcowego hematokrytu 22% (Rysunek 1B, C).
    2. Wykonaj sześć wymian objętości systemu (diacykli) na module filtracji stycznego (TFF) modyfikowanego sulfonu etylenu (mPES) o średnicy 0,65 μm z 0,9% soli fizjologicznej na roztworze RBC. UWAGA: Celem tego etapu mycia jest usunięcie uszkodzonych erytrocytów, fragmentów błony i innych materiałów zewnątrzkomórkowych przed hemolizą (Rysunek 1B, C).
    3. Roztwór RBC poddać lizie 10 l buforu fosforanowego (PB, 3,75 mM, pH 7,4) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, ciągle mieszając.
    4. Usunąć zlizowane fragmenty membrany i inne agregaty, filtrując roztwór przez moduł TFF o mocy 500 kDa i zbierając permeat w 30-litrowym zbiorniku reaktora wsadowego (Rysunek 1A-C).
    5. Gdy 480 g Hb znajdzie się w reaktorze, dodaj sól, aby przekształcić PB w sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
    6. Recyrkulacja Hb przez kontaktor gazowy zasilany azotem, a także utrzymywanie przestrzeni nad azotem w reaktorze, w celu odtlenienia białka przez noc. Schłodzić do temperatury 14 °C, aby ograniczyć tworzenie się methemoglobiny (metHb).
  2. Polimeryzacja Hb
    1. Podgrzać roztwór Hb do temperatury fizjologicznej (37 °C), jednocześnie recyrkulując roztwór na pętli stycznika gazowego.
      UWAGA: Celem jest odtlenienie białka do pO2 w zakresie 0-10 mmHg, aby zapewnić, że większość Hb jest w napiętym stanie czwartorzędowym (Rysunek 1A).
    2. W razie potrzeby dodać 1 g ładunku ditionitu sodu, aby zapewnić skuteczne odtlenienie.
    3. Utrzymując pętlę recyrkulacyjną i odgazowując roztwór Hb, dodać stosunek molowy aldehydu glutarowego (GA) do Hb rozcieńczonego w 3 l odtlenionego PBS (pH 7,4) w stosunku molowym.
    4. Dodać roztwór do zbiornika reaktora przez 3 godziny z dodatkową godziną czasu reakcji.
    5. Ugasić reakcję sieciowania stosunkiem molowym cyjanoborowodorku sodu do GA, rozcieńczonym w 3 l PBS (pH 7,4) wynoszącym 7:1. Dodawać do reaktora przez ponad 10 minut.
    6. Schłodzić reaktor w temperaturze 14 °C przez noc.
  3. Oczyszczanie PolyhHb
    1. Przepompuj zawartość reaktora do 10-litrowego naczynia filtracyjnego i rozpocznij cyrkulację przez moduł TFF z sulfonu polietylenu (PES) o wielkości 0,2 μm (stopień 1). Ten krok usunie duże agregaty i niepożądane zanieczyszczenia.
    2. Wprowadzić permeat do wtórnego naczynia filtracyjnego o pojemności 10 litrów, które po napełnieniu będzie krążyć po module TFF polisulfonu (PS) o mocy 500 kDa (stopień 2). Kontynuuj, aż reaktor zostanie opróżniony (Rysunek 1B,D).
    3. Po opróżnieniu reaktora do obiegu oczyszczania należy rozpocząć wymianę substancji pomocniczej na etapie 1 ze zmodyfikowanym roztworem Ringera z mleczanami (pH 7,4). Po każdej pełnej wymianie objętości należy zmierzyć stężenie białka w permeacie etapu 1 za pomocą spektroskopii w zakresie widzialnym UV.
    4. Gdy stężenie permeatu etapu 1 jest mniejsze niż 1 mg Hb/ml, przenieś zmodyfikowany roztwór Ringera do etapu 2. Wszelkie przestoje na etapie 1 są odpadami i powinny być odpowiednio zutylizowane. W sumie upewnij się, że na obu etapach wykonano 12 pełnych wymian objętości zmodyfikowanego roztworu Ringera.
    5. Po zakończeniu diacykli skoncentrować zawartość etapu 2 do co najmniej 10 g/dl w module TFF o stężeniu 500 kDa.
    6. Zapakować stężony roztwór w stożkowe probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2. Preparat perfuzatu

  1. Przygotować perfuzat do końcowej objętości 165 ml. Rozcieńczyć PolyhHb do końcowego stężenia 3,7 g/dl za pomocą pożywki E Williama.
  2. Dodać albuminę surowicy ludzkiej (HSA) do końcowego stężenia 3% HSA wagowo. Dodać 1 ml heparyny do końcowego roztworu.

3. Konfiguracja obwodu perfuzji płuc ex vivo

  1. Umieść perfuzat PolyhHb w zbiorniku obwodu EVLP i włącz ciepłą łaźnię wodną do 37 °C. Upewnij się, że perfuzat krąży w obwodzie, włączając pompy rolkowe.
  2. Podłącz gaz odtleniający (tj. 6% O2, 8% CO2, 84% N2) do natleniacza z pustych włókien, aby odtlenić perfuzat. Ma to na celu ocenę zdolności płuc do natleniania perfuzatu.
  3. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych na pobliskim komputerze. Upewnij się, że przetworniki ciśnienia w tętnicy płucnej, różnicy ciśnień w tchawicy, różnicy ciśnień w przepływie oddechowym, masy płuc i prędkości pompy są podłączone zarówno do obwodu, jak i do skrzynki konwertera danych.
  4. Upewnij się, że w całym systemie nie ma wycieków, dokładnie sprawdzając wszystkie połączenia rur i że ciepła woda krąży w całym systemie (Rysunek 2). Naciśnij Uruchom w oprogramowaniu do akwizycji danych, aby upewnić się, że wszystkie przetworniki ciśnienia działają. Gdy system działa prawidłowo, wyłącz pompy rolkowe.

4. Pobranie bloku płuc od dawcy szczura

  1. Ustaw stół chirurgiczny i ułóż narzędzia (Rysunek 3). Wszystkie narzędzia należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut.
  2. Przygotuj 1200 j./kg heparyny, mieszaninę ketaminy i ksylazyny do znieczulenia (60 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg), a także nici jedwabne o długości 5-10 cm (3-0 lub 4-0).
  3. Wstrzyknąć szczurowi dootrzewnowo roztwór ketaminy/ksylazyny. Odczekaj 5-10 minut, aż rozwinie się płaszczyzna znieczulająca. Aby zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia, uszczypnij szczura u nogi, aby wywołać reakcję. Jeśli nie ma reakcji, oznacza to, że został spełniony odpowiedni poziom znieczulenia.
  4. Ogol brzuch szczura i ułóż go w pozycji leżącej na desce operacyjnej. Oczyść brzuch jodonem powidonu i 70% etanolem. Umieść maść okulistyczną pod oczami szczura, aby zapobiec wysuszeniu.
  5. Przenieś szczura na deskę chirurgiczną i zabezpiecz go na miejscu (Rysunek 4A). Włącz oprogramowanie do akwizycji danych i rozpocznij nagrywanie. Włączyć wentylator przy 4 ml/kg i upewnić się, że dodatnie końcowe ciśnienie wydechowe (PEEP) wynosi około 2 cm/h2O.
    UWAGA: Te początkowe ustawienia są specyficzne dla eksperymentu. Do wszystkich badaczy należy określenie najlepszych strategii wentylacji dla poszczególnych eksperymentów.
  6. Po osiągnięciu odpowiedniej głębokości znieczulenia należy wykonać laparotomię w linii środkowej od wyrostka mieczykowatego do spojenia łonowego za pomocą nożyczek. Następnie wykonaj przyśrodkowo-boczną rotację trzewną i uwidocznij podwątrobową żyłę główną dolną za pomocą narzędzia (IVC)36,37,38 (Rysunek 4B). Wstrzyknąć heparynę do IVC za pomocą igły 20G (Ryc. 4C).
  7. Zwróć uwagę na szyję i odetnij skórę od wcięcia mostka do tuż poniżej kąta żuchwy za pomocą nożyczek. Następnie zacznij analizować w kierunku tchawicy (Rysunek 5A).
  8. W szyi tępo wyciąć niezbędne mięśnie paska, aby odsłonić tchawicę (Ryc. 5B). Wykonaj poprzeczne nacięcie nożyczkami na przedniej tchawicy między pierścieniami chrzęstnymi wystarczająco dużymi, aby zmieścić się w rurce dotchawiczej (ET) (kilka milimetrów), ale nie przecinaj tylnej części tchawicy. Umieść jedwabny szew 5-0 wokół tchawicy (Ryc. 5C).
  9. Włóż rurkę dotchawiczą i zabezpiecz ją na miejscu za pomocą wspomnianego jedwabnego szwu 5-0 (Rysunek 5D). Podłącz rurkę ET do respiratora i upewnij się, że klatka piersiowa jest prawidłowo uniesiona.
  10. Wykonaj sternotomię pośrodkową i ponownie wejdź do jamy klatki piersiowej za pomocą nożyczek. Umieść zwijacze ściany klatki piersiowej, aby odsłonić serce i płuca (Rysunek 6A). Unikaj przypadkowych manipulacji płucami, ponieważ są one niezwykle kruche.
  11. Usuń grasicę z przedniego śródpiersia za pomocą kombinacji ostrych (nożyczek) i rozwarstwienia. Uważaj, aby nie uszkodzić wielkich naczyń krwionośnych lub płuc.
  12. Zidentyfikuj tętnicę płucną (PA; Rysunek 6B) i umieść wokół niego jedwabny szew 5-0, aby przygotować się do kaniulacji (Rysunek 6C). Ze względu na mikroskopijną anatomię wielkich naczyń krwionośnych szczura, często łatwiej jest umieścić szew wokół PA i aorty w tym samym czasie.
  13. Wykonaj nacięcie 2-3 mm na ścieżce odpływu prawej komory (RVOT) za pomocą nożyczek (Rysunek 6D-E), aby umieścić kaniulę tętniczą w PA i zabezpieczyć ją na miejscu za pomocą szwu 5-0 opisanego krok wcześniej (Ryc. 6F).
  14. Wykonaj 5-milimetrowe nacięcie w lewej komorze (LV), a także IVC podwątrobowym za pomocą nożyczek, aby poddać szczura eutanazji. Szybko podłącz płyn zachowujący płuca do kaniuli tętniczej, aby grawitacyjnie przepłukać płuca około 20 ml (Rysunek 7A-B). Upewnij się, że płyn konserwujący płuca jest odpowietrzeny przed podłączeniem go do kaniuli tętniczej, ponieważ zatory powietrzne są bardzo szkodliwe dla płuc.
  15. Podłącz kaniulę tętniczą do obwodu EVLP. Włączyć pompę rolkową i pozwolić, aby niewielka ilość perfuzatu przepłynęła przez płuco i wydostała się z lewej komory do jamy klatki piersiowej. Gdy perfuzat zacznie wypływać z lewego przedsionka, wyłącz pompę rolkową (Rysunek 7C). Pozwalając na przepływ perfuzatu, upewnij się, że ciśnienie PA nie wzrasta - co wskazywałoby na zablokowanie lub nieprawidłowe umieszczenie.
  16. Umieść małe kleszcze w lewej komórce i delikatnie rozciągnij pierścień zastawki mitralnej, co pozwoli na wprowadzenie kaniuli lewego przedsionka (LA) (Rysunek 8A). Umieść jedwabny krawat 5-0 wokół serca i luźno zawiąż (Rysunek 8B).
  17. Włóż kaniulę LA do lewej komnaty i przesuń kaniulę LA, aż będzie widoczna w przedsionku. Zakończ zabezpieczanie LA za pomocą wstępnie zawiązanego szwu 5-0 (Rysunek 8C).
  18. Zidentyfikuj przełyk i zaciśnij go hemostatem jak najbliżej przepony. Przeciąć przełyk poniżej hemostatu, aby upewnić się, że nie dojdzie do rozlania się do jamy klatki piersiowej (Rysunek 9A).
  19. Używając kręgosłupa jako przewodnika, przetnij wszystkie przyczepy więzadłowe łączące blok płuco-serce z otaczającymi strukturami za pomocą nożyczek (Rysunek 9B). Gdy blok płuco-serce jest swobodnie ruchomy, wypreparuj tchawicę z szyi i na koniec przetnij tchawicę powyżej rurki ET za pomocą nożyczek, aby uwolnić blok płuco-serce (Rysunek 9C).
  20. Przenieś blok płuco-serce do kurtki piersiowej w obwodzie EVLP i przymocuj kaniulę LA do obwodu EVLP (Rysunek 9D). Włącz pompę rolkową i podłącz monitor wentylatora.
  21. Sprawdź pułapkę bąbelkową, aby upewnić się, że do systemu nie wprowadzają się zatory powietrzne.
  22. Powoli zmieniaj ustawienia wentylacji i perfuzji na żądane poziomy eksperymentalne podczas początkowych 15 minut36,37,38. Dodatkowo, podczas tej początkowej fazy rozruchu, zwiększ szybkość przepływu perfuzji do żądanej szybkości i/lub ciśnienia.
  23. W wyznaczonych przez eksperyment punktach czasowych sprawdź poziomy gazu perfuzyjnego, a także testy czynnościowe płuc.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Walidacja naszego perfugatu opartego na PolyhHb, a ponadto stabilność tego perfuzatu przez kilka godzin, jest pokazana w Rysunek 10. W ciągu pierwszej 1 godziny wszystkie badane perfuzaty (PolyhHb, Control (Williams Media + 5% HSA), na bazie RBC) wykazały niewielki spadek LA pO2 (Post pO2). Jednak perfuzat na bazie RBC wykazał znaczny spadek po 1 godzinie w porównaniu z PolyhHb (p < 0,05). Podczas testów w ciągu następnych kilku godzin, zarówno perfugaty PolyhHb, jak i Control miały stabilne LA pO2, podczas gdy PolyhHb miał nieistotny trend (p > 0,05) wyższego pO2 (Rysunek 10A). Delta pO2, tj. zmiana LA pO2 z PA pO2, ponownie znacznie zmniejszyła się po 1 godzinie w grupie perfuzjatów RBC (p < 0,05), podczas gdy pozostała stabilna w perfugatach PolyhHb i kontrolnych z nieistotnym trendem (p > 0,05) wyższego pO2 w grupie PolyhHb (Rysunek 10B). LA pCO2 był znacznie niższy w perfuzacie RBC i perfuzacie kontrolnym w porównaniu z perfuzatem PolyhHb po pierwszej godzinie (p < 0,05), i było to prawdą w ciągu następnych kilku godzin, gdy porównano perfuzat PolyhHb i Control (Rysunek 10C). Wreszcie, delta pCO2 (tj. zmiana LA pCO2 z PA pCO2) została znacznie zwiększona w perfuzacie RBC po 1 godzinie (p < 0,05), a po kilku godzinach pozostała stabilna zarówno w perfuzacie PolyhHb, jak i kontrolnym (Rysunek 10D).

Dane fizjologiczne płuc w czasie rzeczywistym zebrane przez oprogramowanie do akwizycji dostarczają informacji uzupełniających do poziomu gazu perfuzyjnego (Rysunek 11). Opór naczyniowy płuc (PVR) ponownie wykazał, że perfuzat RBC znacznie wzrósł w ciągu pierwszej godziny (p < 0,05). W ciągu kilku pozostałych godzin zarówno perfuzaty PolyhHb, jak i kontrolne miały stabilny i niski PVR (Rysunek 11A). Zmiana masy płuc również znacznie wzrosła w perfuzacie RBC w ciągu pierwszej godziny (p < 0,05) i zwiększyła się zarówno w perfuzacie PolyhHb, jak i kontrolnym w ciągu pozostałych godzin z nieco wyższą masą perfugatu PolyhHb (Figura 11B). Wreszcie, zgodność zmniejszyła się znacznie w grupie perfuzatu RBC w ciągu pierwszej godziny (p < 0,05), podczas gdy nastąpił nieistotny spadek perfugatu PolyhHb i perfugatu kontrolnego (p > 0,05), przy czym PolyhHb miał najwyższą zgodność po 4 godzinach (Rysunek 11C).

Jeśli chodzi o sukces techniczny i/lub porażkę (Rysunek 12), warto zwrócić uwagę na kilka rzeczy. W klasie Rysunek 12A, widzimy niepowodzenie przeszczepu allogenicznego spowodowane martwicą prawego górnego płata spowodowaną możliwym zakrzepem w obrębie układu krążenia płucnego. W Rysunek 12B, zauważamy również poważny obrzęk tkanek w prawym płacie, prowadzący do niepowodzenia eksperymentu. Rysunek 12C-E pokazuje prawidłowe zachowanie i wygląd tkanek w odpowiednich warunkach eksperymentalnych. Na koniec, w Rysunek 12F, możemy zobaczyć idealne zachowanie tkanek po przepłukaniu roztworem do konserwacji płuc.

figure-results-1
Rysunek 1: Synteza i oczyszczanie PolyhHb na skali pilotażowej. (A) Bioreaktor do polimeryzacji. (B) Procesy filtracji z przepływem stycznym (TFF) odbywają się w lodówce o temperaturze 4 °C. (C) Zbliżenie na równoległą konfigurację TFF do przemywania krwinek czerwonych (RBC) i oczyszczania hemoglobiny (Hb). (D) Zbliżenie dwustopniowego szeregowego systemu TFF do oczyszczania PolyhHb. Naczynia dla etapów pierwszego i drugiego znajdują się odpowiednio po lewej i prawej stronie filtrów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przegląd obwodu perfuzji płuc ex vivo (EVLP). (A) Schematyczny rysunek obwodu EVLP. (B) Umieszczenie in vivo kaniuli tętnicy płucnej i kaniuli lewego przedsionka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Narzędzia chirurgiczne używane do perfuzji płuc ex vivo. (A) Szew jedwabny. (B) Kleszcze z cienką końcówką (średniej długości). (C) Kleszcze z cienką końcówką (długie długości). (D) Zakrzywione kleszcze z cienką końcówką. (E) Nożyczki majonezowe. (F) Kaniula tchawicy. (G) Kaniula tętnicy płucnej (PA). (H) Kaniula lewego przedsionka (LA). (I) Zwijacze klatki piersiowej. (J) Nożyczki sprężynowe. (K) Kleszcze DeBakeya. (L) Hemostat. (M) Małe nożyczki. (N) Małe zakrzywione kleszcze z cienką końcówką. (O) Pick-upy Adson. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Chirurgiczne pozycjonowanie i odsłanianie żyły głównej dolnej (IVC). (A) Ułożenie szczura przy pobieraniu płuc. (B) Odsłonięcie IVC podwątrobowego. (C) Kaniulacja IVC i wstrzykiwanie heparyny za pomocą igły 27G. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Kaniulacja tchawicy rurką dotchawiczą (ET). (A) Zacznij od przecięcia skóry w okolicy szyi. (B) Wypreparuj mięśnie paska i tkankę łączną, aby odsłonić tchawicę. (C) Wykonanie poprzecznego nacięcia na przedniej tchawicy między pierścieniami chrzęstnymi wystarczająco dużymi, aby zmieścić się w nim rurka ET. (D) Włóż rurkę ET do tchawicy i zabezpiecz na miejscu jedwabnym szwem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Umieszczenie kaniuli w tętnicy płucnej. (A) Odsłonięcie klatki piersiowej w celu uwidocznienia serca i płuc. (B) Identyfikacja PA i jego izolacja. (C) Zakładanie szwów wokół PA. (D) Wycięcie małego otworu w drodze odpływu prawej komory (RVOT) dla kaniuli PA. (E) Prawidłowe umieszczenie kaniuli PA wewnątrz PA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Płukanie płuc roztworem konserwującym. (A) Połączenie kaniuli płucznej z kaniulą tętnicy płucnej (PA). (B) Z lewego przedsionka (LA) powinien wydostać się przezroczysty płyn. (C) Podłączenie kaniuli PA do obwodu perfuzji płuc ex vivo w celu zapewnienia prawidłowego przepływu i umieszczenia kaniuli PA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Umieszczanie kaniuli lewego przedsionka (LA). (A). Delikatnie rozszerzając pierścień zastawki mitralnej za pomocą kleszczy. (B) Luźno zakładając jedwabny szew wokół lewej komory (LV). Umieszczenie kaniuli LA w lewym przedsionku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 9: Ekstrakcja bloku płuco-serce. (A) Podwiązanie przełyku poniżej hemostatu. (B) Preparowanie uwalnia blok płuco-serce od kręgosłupa. (C) Wypreparowanie tchawicy. (D) Prawidłowe połączenia i umieszczenie kaniuli do perfuzji płuc ex vivo (EVLP). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 10. Poziomy gazu perfuzyjnego w czasie. (A) Post pO2, tj. lewy przedsionek (LA) pO2, przez 4 godziny perfuzji. (B) Delta pO2, tj. zmiana LA pO2 z pO2 w tętnicy płucnej (PA) w ciągu 4 godzin perfuzji. (C) Post pCO2 , tj. LA pO2 przez 4 godziny perfuzji. (D) Delta pCO2, tj. zmiana LA pO2 z PA pO2 w ciągu 4 godzin perfuzji. Niebieski reprezentuje perfuzat PolyhHb, reprezentuje perfuzat kontrolny (standardowe podłoże Williama), a czerwony reprezentuje perfuzat oparty na RBC. N=6 na grupę. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Istotność została przetestowana za pomocą testu T Studenta i jest oznaczona symbolem *, p < 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rysunek 11. Dane fizjologiczne płuc w czasie rzeczywistym. (A) Opór naczyniowy płuc (PVR) przez 4 godziny reperfuzji. (B) Zmiana (oznaczona przez Δ) masy płuc w czasie. (C) Zgodność po 4 godzinach reperfuzji. Niebieski reprezentuje perfuzat PolyhHb, reprezentuje perfuzat kontrolny (standardowe podłoże Williama), a czerwony reprezentuje perfuzat oparty na RBC. N=6 na grupę. Słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. Istotność została przetestowana za pomocą testu T Studenta i jest oznaczona symbolem *, p < 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-12
Rysunek 12: Reprezentatywne wyniki techniczne. (A) Niepowodzenie przeszczepu z powodu zawału prawego górnego płata. (B) Niepowodzenie przeszczepu z powodu ciężkiego obrzęku prawego płata. (C) Udana kanowacja i perfuzja alloprzeszczepu płuc z perfuzatem krwinek czerwonych. (D) Udana kanowacja i perfuzja alloprzeszczepu płuc z perfugatem PolyhHb. (E) Udana kaniulacja i perfuzja alloprzeszczepu płuc z użyciem standardowego perfuzatu. (F) Idealna konserwacja tkanek po przepłukaniu roztworem do konserwacji płuc. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowywanie i testowanie roztworów perfuzyjnych to nowatorskie przedsięwzięcie, które podejmuje wiele osób na całym świecie. Tradycyjnie, standardowe perfuzaty oferują możliwość zawieszenia czasu niedokrwienia i złagodzenia związanych z nim urazów związanych z niedokrwieniem, a także reperfuzją18. Jednak kolejną ewolucją EVLP jest ulepszenie obecnej technologii perfuzacji, a także włączenie terapii naprawczych i regeneracyjnych 39,40,41,42,43.

PolyhHb opisany w tej pracy jest umieszczony w nawiasie od 500 kDa do 0,2 μm, aby zapobiec wynaczynieniu materiału z obwodu do płuc, co zapobiegnie zwężeniu naczyń krwionośnych i wzrostowi ciśnienia PA30. Bardzo ważne jest, aby na wszystkich etapach polimeryzacji tej syntezy ciśnienie parcjalne tlenu (pO2) było utrzymywane na odpowiednim poziomie dla pożądanego iloczynu powinowactwa tlenowego PolyhHb. Obejmuje to wszystkie roztwory dodane w trakcie reakcji (tj. środek sieciujący, roztwór hartowniczy itp.) o dopasowanym pO2 do bioreaktora (tj. odgazowane azotem, natlenione itp.). Główną zaletą tej procedury syntezy jest to, że produkt końcowy ma modyfikowalną równowagę tlenową, co pozwala na różne zastosowania przy różnym zapotrzebowaniu na tlen (tj. niskie powinowactwo tlenowe PolyhHb do transfuzji, umiarkowane powinowactwo tlenowe do perfuzji płuc lub wysokie powinowactwo tlenowe do ukierunkowanego dostarczania tlenu). Ważne jest również, aby upewnić się, że w bioreaktorze znajduje się mechanizm grzewczy, który nie powoduje nadmiernego nagrzewania się punktów kontaktowych, co skutkuje powstawaniem uszkodzonych białek. Odkryliśmy, że miedziana cewka w całym zbiorniku zapewnia bardziej równomierne i mniej szkodliwe ogrzewanie/chłodzenie niż izolowany płaszcz grzewczy na zewnątrz statku (rysunek 1A).

Chociaż opracowanie modelu szczura EVLP nie jest niczym nowym37,38, zauważyliśmy kilka obszarów, które mogą prowadzić do poprawy wyników. Po pierwsze, konieczne jest wykonanie małych nacięć w IVC po złożeniu ofiary, aby upewnić się, że nie ma dodatkowego powietrza, które mogłoby dostać się do płuc przez krążenie. Podczas przepłukiwania alloprzeszczepu płuc roztworem do konserwacji płuc, jednolity bladobiały kolor płuc informuje mikrochirurga, że proces pobierania jest technicznie udany. Jeśli w miąższu nadal znajduje się płuco o różowym zabarwieniu, czasami zaleca się wyregulowanie kaniuli PA tak, aby całe płuco było równomiernie ukrwione. Podczas gdy kaniula PA jest często łatwiejszą częścią procedury do wykonania, wprowadzenie kaniuli LA jest nieco trudniejsze. Zawsze konieczne jest rozszerzenie pierścienia zastawki mitralnej, aby kaniula LA dotarła do LA. Należy to jednak zrobić z najwyższą ostrożnością, ponieważ łatwo jest przebić komorę lub przedsionki. Gdy końcówka kaniuli znajdzie się w przedsionkach, często może zostać zgubiona podczas zabezpieczania szwu wokół komory. Często konieczne jest wyregulowanie kąta stołu (bardziej poziomo) lub umieszczenie kawałka gazy na dnie kaniuli, aby pozostała na swoim miejscu.

Ograniczenia
Ten model ma pewne ograniczenia. Chociaż pomocna jest ocena skuteczności perfudatów i ich zdolności do poprawy potencjalnych przeszczepów allogenicznych, nie jest to model przeszczepu, który byłby w stanie dostarczyć nam wyników in vivo dotyczących różnych perfuzatów i technologii. Ponadto, chociaż PolyhHb jest ekscytującą nową technologią perfuzyjnym, jej zastosowanie, skuteczność i potencjalne ograniczenia będą musiały zostać dodatkowo uzasadnione w dodatkowych przedklinicznych i klinicznych eksperymentach perfuzyjnych, zanim będzie można rozważyć powszechne zastosowanie tej technologii.

Wnioski
W tym miejscu zademonstrowaliśmy zastosowanie perfuzatu PolyhHb nowej generacji oraz protokół, za pomocą którego ten roztwór perfuzyjny może być testowany w modelu EVLP szczura. Wraz z postępem technologii perfuzatu korzystne będzie zbadanie możliwości wykorzystania PolyhHb jako potencjalnego substytutu tradycyjnych perfuzatów30. Poprzednie generacje PolyhHb doprowadziły do szkodliwych skutków ubocznych w oparciu o ich skład; Jednak ulepszenia syntezy stworzyły polimer, który jest mniej podatny na wynaczynienie, prowadzenie do obrzęku, a tym samym powodowanie uszkodzenia komórek30. Dzięki PolyhHb możliwe jest wykonanie EVLP bez konieczności stosowania erytrocytów, przy jednoczesnym zaspokojeniu zapotrzebowania metabolicznego alloprzeszczepów płuc. Niewątpliwie pozwoli to na lepsze funkcjonowanie przeszczepu allogenicznego ex vivo. Konieczna jest jednak dalsza walidacja PolyhHb zarówno w warunkach przedklinicznych, jak i klinicznych. Mamy nadzieję, że ten protokół dostarczy społeczności transplantacyjnej płuc kluczowych informacji w projektowaniu i opracowywaniu nowatorskich rozwiązań perfuzyjnych, a także odpowiednich protokołów do testowania ich w klinicznie istotnych, translacyjnych modelach transplantacyjnych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przypadku materiału przedstawionego w tej pracy, A.F.P., A.G. i C.C. są wynalazcami w amerykańskim zgłoszeniu patentowym PCT/US2022/041743. A.F.P., C.C., B.A.W. i S.M.B. są wynalazcami w amerykańskim zgłoszeniu patentowym PCT/US2023/017765.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania były hojnie wspierane przez Jewel and Frank Benson Family Endowment oraz Jewel and Frank Benson Research Professorship. B.A.W. jest częściowo wspierany przez grant National Institutes of Health (NIH) R01HL143000. A.F.P. jest wspierany przez granty NIH R01HL126945, R01EB021926, R01HL131720 i R01HL138116 oraz grant US Army Medical Research and Materiel Command W81XWH1810059. S.M.B. jest wspierany przez NIH R01 DK123475.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Strzykawka insulinowa 10 ml Igła 29 G x 1/2"BD309301
30 L Szklany bioreaktor wsadowyAce Glass
30gIgły medyczneBD-305106
Baytril (enrofloksacyna) Tabletki antybakteryjneElancoNA
Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2.2H2O)Sigma Aldrich10035-04-8Do zmodyfikowanego wzmacniacza
mostka nośnego mleczanu Ringera CFBA typ 672ZestawApparatus 731747
Connect D150Cole-Parmer  VK 73-3763
Kleszcze Dumont #5Narzędzia do nauki11252-50
Kleszcze Dumont Medical #5/45 - kątowe 45°Narzędzia Fine Science11253-25
Ecoline Star Edition 003, E100 Podgrzewacz wodyLaudaLCK 1879
Przeterminowana ludzka leukozredukowana, zapakowane jednostki RBCCentrum Medyczne Wexner
Kanadyjska Służba Krwi
Zen-Bio Inc
Fiberoxygenator D150Hugo Sachs ElektronikPY2 73-3762
KleszczeNarzędziado nauki11027-12
Aldehyd glutarowy (C5H8O2 70 % wag%)Sigma Aldrich111-30-8 (G7776)
Halsted-Mosquito HemostatRoboz SurgicalRS-7112
Heparyna 30 000 jednostek na 30 mlAPP Pharmaceuticals Albumina
surowicy ludzkiej (HSA)OctaPharma OsoczeDodatek do perfuzatu
IL2 Zestaw probówek do perfuzacjiAparat Harvard733842
IPL-2 Podstawowy system perfuzji płucAparat Harvarda Ketamina
500 mg na 5 mlJHP Pharmaceuticals
Kaniula lewego przedsionkaAparat Harvarda730712
Stycznik membranowy Liqui-Cel serii EXF G4203MG420stycznik gazowy
Roztwór glukozy o niskiej zawartości dekstranu potasu (Perfadex)XVIVOprzepłukujący płuca
Rurki pokryte platyną Masterflex (Rozmiar: 73,17,16,24)Cole'a-Palmera
(NALC, C5H9NO3S)Sigma Aldrich616-91-1 (A7250)Do zmodyfikowanych naczyń mleczanowych Ringera
Nalgene ( 10L, 20L)Naczynia filtracyjneNalgene
Pompa perystaltyczna  Ismatec  ISM 827B
PES, 0,65 &mikro; m Moduł TFFRepligenN02-E65U-07-N
PhysioSuiteKent Scientific CorporationPS-MSTAT-RT
polieterosulfosulfon (PES), 0,2 i mikro; m Moduł TFFRepligenN02-S20U-05-N
Polisulfon (PS), moduł TFF 500 kDaRepligenN02-P500-05-N
Chlorek potasu (KCl)Fisher Scientific7447-40-7Dla PBS
PowerLab 8/35  ADInstruments730045
Kaniula tętnicy płucnejAparat Harvard730710
Rurka głowicy pompy (rozmiar: 73,17,16,24)PharMed BPT
Puralube  Maść okulistycznaDechraNA
NożyczkiNarzędzia do nauki14090-11
SCP Kontroler serwo do perfuzji typu 704Aparat Harvarda732806
Respirator dla małych zwierząt model 683Aparat Harvarda55-000
Chlorek sodu (NaCl)Fisher Scientific7647-14-5 (S271-10)Do PBS i soli fizjologicznej
Sicyjanoborowodorek sodu (NaCNBH3)Sigma Aldrich25895-60-7
Ditionian sodu (Na2S2O4)Sigma Aldrich7775-14-6
Wodorotlenek sodu (NaOH)Fisher Scientific1310-73-2Do modyfikowanego mleczanu
RingeraMleczan sodu (NaC3H5O3)Sigma Aldrich867-56-1Do modyfikowanego mleczanu Ringera
Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Fisher Scientific7558-79-4Do PBS
Fosforan sodu jednozasadowy (NaH2PO4< / sub>)Fisher Scientific7558-80-7Do
systemu znieczulenia małych zwierząt PBS SomnoSuiteKent Scientific CorporationModuł
Szczury Sprague-DawleyEnvigo
TAM-A typ 705/1Aparatura Harvarda73-0065
Wzmacniacz przetwornika TAM-D typ 705/2Aparatura Harvarda  73-1793
Moduł kontroli czasu TCM typ 686Aparat Harvard731750
Kaniula tchawicyAparat Harvard733557
Zestaw rurek do komory wilgotnejAparat Harvard  73V83157
Kaseta z rurkamiCole-ParmerIS 0649
Pęseta #5 DumostarKent Scientific Corporation  INS500085-A
Rurka Tygon E-3603 2,4 mm IDHarvard Apparatus721017linia perfuzacyjna wchodząca do płuc
Tygon E-3603 Rurka 3,2 mm IDHarvard Apparatus721019linia perfuzacyjna opuszczająca płuco
Vannas-Tubingen Spring ScissorsFine Science Tools15008-08
Moduł sterujący respiratorem VCM typ 681Harvard Apparatus731741
William's E MediaGibco, ThermoFisher ScientificA12176-01Dodatek perfuzatu
Ksylazyna 100 mg na 1 mlAkorn
Harvard Roztwór C-acetylo-L-cysteina SS-MVG Moduł wzmacniacza przetwornika Pęseta #5 ze stali nierdzewnej, zakrzywiona Kent Scientific Corporation IND500232 Pęseta #7 Tytan Kent Scientific Corporation INS600187

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. OPTN/SRTR 2021 annual data report: Lung. Am J Transplant. 23, 2 Suppl 1 S379-S442 (2023).">Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2021 annual data report: Lung. Am J Transplant. 23, 2 Suppl 1 S379-S442 (2023).
  2. Ex vivo lung perfusion in donation after circulatory death: A post hoc analysis of the normothermic Ex Vivo lung perfusion as an assessment of extended/marginal donors lungs trial. J Thorac Cardiovasc Surg. , 10.1016/j.jtcvs.2024.03.011 (2024).">Gouchoe, D. A., et al. Ex vivo lung perfusion in donation after circulatory death: A post hoc analysis of the normothermic Ex Vivo lung perfusion as an assessment of extended/marginal donors lungs trial. J Thorac Cardiovasc Surg. , 10.1016/j.jtcvs.2024.03.011 (2024).
  3. Trends in donation after circulatory death in lung transplantation in the United States: Impact of era. Transpl Int. 35, 10172(2022).">Bobba, C. M., et al. Trends in donation after circulatory death in lung transplantation in the United States: Impact of era. Transpl Int. 35, 10172(2022).
  4. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).">Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. Lancet. 357 (9259), 825-829 (2001).
  5. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. N Engl J Med. 364 (15), 1431-1440 (2011).">Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. N Engl J Med. 364 (15), 1431-1440 (2011).
  6. Ex vivo perfusion techniques: state of the art and potential applications. Intens Care Med. 45 (3), 354-356 (2019).">Cypel, M., Neyrinck, A., Machuca, T. N. Ex vivo perfusion techniques: state of the art and potential applications. Intens Care Med. 45 (3), 354-356 (2019).
  7. XPS™ Jensen lung as a low-cost, high-fidelity training adjunct to ex-vivo lung perfusion. Artif Organs. , 10.1111/aor.14623 (2023).">Gouchoe, D. A., et al. XPS™ Jensen lung as a low-cost, high-fidelity training adjunct to ex-vivo lung perfusion. Artif Organs. , 10.1111/aor.14623 (2023).
  8. Machine perfusion of thoracic organs. J Thorac Dis. 10, Suppl 8 S910-S923 (2018).">Van Raemdonck, D., Rega, F., Rex, S., Neyrinck, A. Machine perfusion of thoracic organs. J Thorac Dis. 10, Suppl 8 S910-S923 (2018).
  9. Ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation--state of the art. Eur J Cardiothorac Surg. 46 (5), 779-788 (2014).">Andreasson, A. S., Dark, J. H., Fisher, A. J. Ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation--state of the art. Eur J Cardiothorac Surg. 46 (5), 779-788 (2014).
  10. Ex vivo lung perfusion: A review of current and future application in lung transplantation. Pulm Ther. 8 (2), 149-165 (2022).">Ahmad, K., Pluhacek, J. L., Brown, A. W. Ex vivo lung perfusion: A review of current and future application in lung transplantation. Pulm Ther. 8 (2), 149-165 (2022).
  11. Biometric profiling to quantify lung injury through ex vivo lung perfusion following warm ischemia. Asaio j. 69 (8), e368-e375 (2023).">Kim, J. L., et al. Biometric profiling to quantify lung injury through ex vivo lung perfusion following warm ischemia. Asaio j. 69 (8), e368-e375 (2023).
  12. Acellular ex vivo lung perfusate silences pro-inflammatory signaling in human lung endothelial and epithelial cells. J Transl Med. 21 (1), 729(2023).">Jeon, J. E., et al. Acellular ex vivo lung perfusate silences pro-inflammatory signaling in human lung endothelial and epithelial cells. J Transl Med. 21 (1), 729(2023).
  13. Altered purine metabolism at reperfusion affects clinical outcome in lung transplantation. Thorax. 78 (3), 249-257 (2023).">Baciu, C., et al. Altered purine metabolism at reperfusion affects clinical outcome in lung transplantation. Thorax. 78 (3), 249-257 (2023).
  14. Evaluating the impact of ex vivo lung perfusion on organ transplantation: A retrospective cohort study. Ann Surg. 278 (2), 288-296 (2023).">Peel, J. K., et al. Evaluating the impact of ex vivo lung perfusion on organ transplantation: A retrospective cohort study. Ann Surg. 278 (2), 288-296 (2023).
  15. Determining the impact of ex vivo lung perfusion on hospital costs for lung transplantation: A retrospective cohort study. J Heart Lung Transpl. 42 (3), 356-367 (2023).">Peel, J. K., et al. Determining the impact of ex vivo lung perfusion on hospital costs for lung transplantation: A retrospective cohort study. J Heart Lung Transpl. 42 (3), 356-367 (2023).
  16. Normothermic ex vivo preservation with the portable Organ Care System Lung device for bilateral lung transplantation (INSPIRE): a randomised, open-label, non-inferiority, phase 3 study. Lancet Respir Med. 6 (5), 357-367 (2018).">Warnecke, G., et al. Normothermic ex vivo preservation with the portable Organ Care System Lung device for bilateral lung transplantation (INSPIRE): a randomised, open-label, non-inferiority, phase 3 study. Lancet Respir Med. 6 (5), 357-367 (2018).
  17. Portable normothermic ex vivo lung perfusion, ventilation, and functional assessment with the Organ Care System on donor lung use for transplantation from extended-criteria donors (EXPAND): a single-arm, pivotal trial. Lancet Resp Med. 7 (11), 975-984 (2019).">Loor, G., et al. Portable normothermic ex vivo lung perfusion, ventilation, and functional assessment with the Organ Care System on donor lung use for transplantation from extended-criteria donors (EXPAND): a single-arm, pivotal trial. Lancet Resp Med. 7 (11), 975-984 (2019).
  18. Prolonged EVLP using OCS lung: Cellular and acellular perfusates. Transplantation. 101 (10), 2303-2311 (2017).">Loor, G., et al. Prolonged EVLP using OCS lung: Cellular and acellular perfusates. Transplantation. 101 (10), 2303-2311 (2017).
  19. Mitochondria-targeted heme oxygenase-1 induces oxidative stress and mitochondrial dysfunction in macrophages, kidney fibroblasts and in chronic alcohol hepatotoxicity. Redox Biol. 2, 273-283 (2014).">Bansal, S., Biswas, G., Avadhani, N. G. Mitochondria-targeted heme oxygenase-1 induces oxidative stress and mitochondrial dysfunction in macrophages, kidney fibroblasts and in chronic alcohol hepatotoxicity. Redox Biol. 2, 273-283 (2014).
  20. Initial investigation on the feasibility of porcine red blood cells from genetically modified pigs as an alternative to human red blood cells for transfusion. Front Immunol. 14, 1298035(2023).">Park, S., et al. Initial investigation on the feasibility of porcine red blood cells from genetically modified pigs as an alternative to human red blood cells for transfusion. Front Immunol. 14, 1298035(2023).
  21. Continued decline in blood collection and transfusion in the United States-2015. Transfusion. 57, Suppl 2 1588-1598 (2017).">Ellingson, K. D., et al. Continued decline in blood collection and transfusion in the United States-2015. Transfusion. 57, Suppl 2 1588-1598 (2017).
  22. Pilot scale production and characterization of next generation high molecular weight and tense quaternary state polymerized human hemoglobin. Biotechnol Bioeng. 119 (12), 3447-3461 (2022).">Cuddington, C. T., et al. Pilot scale production and characterization of next generation high molecular weight and tense quaternary state polymerized human hemoglobin. Biotechnol Bioeng. 119 (12), 3447-3461 (2022).
  23. Human polymerized hemoglobin for the treatment of hemorrhagic shock when blood is unavailable: the USA multicenter trial. J Am Coll Surg. 208 (1), 1-13 (2009).">Moore, E. E., et al. Human polymerized hemoglobin for the treatment of hemorrhagic shock when blood is unavailable: the USA multicenter trial. J Am Coll Surg. 208 (1), 1-13 (2009).
  24. Impact of human-derived hemoglobin based oxygen vesicles as a machine perfusion solution for liver donation after cardiac death in a pig model. PLoS One. 14 (12), e0226183(2019).">Shonaka, T., et al. Impact of human-derived hemoglobin based oxygen vesicles as a machine perfusion solution for liver donation after cardiac death in a pig model. PLoS One. 14 (12), e0226183(2019).
  25. Hemoglobin-based oxygen carrier and convection enhanced oxygen transport in a hollow fiber bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102 (6), 1603-1612 (2009).">Chen, G., Palmer, A. F. Hemoglobin-based oxygen carrier and convection enhanced oxygen transport in a hollow fiber bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102 (6), 1603-1612 (2009).
  26. Development of zero-link polymers of hemoglobin, which do not extravasate and do not induce pressure increases upon infusion. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 35 (1), 11-18 (2007).">Bucci, E., Kwansa, H., Koehler, R. C., Matheson, B. Development of zero-link polymers of hemoglobin, which do not extravasate and do not induce pressure increases upon infusion. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 35 (1), 11-18 (2007).
  27. Haptoglobin preserves vascular nitric oxide signaling during hemolysis. Am J Respir Crit Care Med. 193 (10), 1111-1122 (2016).">Schaer, C. A., et al. Haptoglobin preserves vascular nitric oxide signaling during hemolysis. Am J Respir Crit Care Med. 193 (10), 1111-1122 (2016).
  28. Safety and efficacy of human polymerized hemoglobin on guinea pig resuscitation from hemorrhagic shock. Sci Rep. 12 (1), 20480(2022).">Muller, C. R., et al. Safety and efficacy of human polymerized hemoglobin on guinea pig resuscitation from hemorrhagic shock. Sci Rep. 12 (1), 20480(2022).
  29. Biophysical analysis and preclinical pharmacokinetics-pharmacodynamics of tangential flow filtration fractionated polymerized human hemoglobin as a red blood cell substitute. Biomacromolecules. 24 (4), 1855-1870 (2023).">Greenfield, A., et al. Biophysical analysis and preclinical pharmacokinetics-pharmacodynamics of tangential flow filtration fractionated polymerized human hemoglobin as a red blood cell substitute. Biomacromolecules. 24 (4), 1855-1870 (2023).
  30. Polymerized human hemoglobin-based oxygen carrier preserves lung allograft function during normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. , 10.1097/mat.0000000000002118 (2024).">Cuddington, C., et al. Polymerized human hemoglobin-based oxygen carrier preserves lung allograft function during normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. , 10.1097/mat.0000000000002118 (2024).
  31. Effects of the molecular mass of tense-state polymerized bovine hemoglobin on blood pressure and vasoconstriction. J Appl Physiol. 107 (5), 1548-1558 (2009).">Cabrales, P., et al. Effects of the molecular mass of tense-state polymerized bovine hemoglobin on blood pressure and vasoconstriction. J Appl Physiol. 107 (5), 1548-1558 (2009).
  32. Down selection of polymerized bovine hemoglobins for use as oxygen releasing therapeutics in a guinea pig model. Toxicol Sci. 127 (2), 567-581 (2012).">Baek, J. H., et al. Down selection of polymerized bovine hemoglobins for use as oxygen releasing therapeutics in a guinea pig model. Toxicol Sci. 127 (2), 567-581 (2012).
  33. Resuscitation from hemorrhagic shock with fresh and stored blood and polymerized hemoglobin. Shock. 54 (4), 464-473 (2020).">Williams, A. T., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock with fresh and stored blood and polymerized hemoglobin. Shock. 54 (4), 464-473 (2020).
  34. Resuscitation from hemorrhagic shock after traumatic brain injury with polymerized hemoglobin. Sci Rep. 11 (1), 2509(2021).">Muller, C. R., et al. Resuscitation from hemorrhagic shock after traumatic brain injury with polymerized hemoglobin. Sci Rep. 11 (1), 2509(2021).
  35. The molecular size of bioengineered oxygen carriers determines tissue oxygenation in a hypercholesterolemia guinea pig model of hemorrhagic shock and resuscitation. Mol Pharm. 20 (11), 5739-5752 (2023).">Lamb, D. R., et al. The molecular size of bioengineered oxygen carriers determines tissue oxygenation in a hypercholesterolemia guinea pig model of hemorrhagic shock and resuscitation. Mol Pharm. 20 (11), 5739-5752 (2023).
  36. A novel negative pressure-flow waveform to ventilate lungs for normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. 67 (1), 96-103 (2021).">Bobba, C. M., et al. A novel negative pressure-flow waveform to ventilate lungs for normothermic ex vivo lung perfusion. Asaio j. 67 (1), 96-103 (2021).
  37. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. J Vis Exp. (96), e52309(2015).">Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. J Vis Exp. (96), e52309(2015).
  38. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), 7-15 (2014).">Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), 7-15 (2014).
  39. Potential therapeutic targets for lung repair during human ex vivo lung perfusion. Eur Respir J. 55 (4), 1902222(2020).">Wong, A., et al. Potential therapeutic targets for lung repair during human ex vivo lung perfusion. Eur Respir J. 55 (4), 1902222(2020).
  40. The role of the endothelin-1 pathway as a biomarker for donor lung assessment in clinical ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transpl. 34 (6), 849-857 (2015).">Machuca, T. N., et al. The role of the endothelin-1 pathway as a biomarker for donor lung assessment in clinical ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transpl. 34 (6), 849-857 (2015).
  41. Mitsugumin 53 Mitigation of ischemia reperfusion injury in a mouse model. J Thorac Cardiovasc Surg. 10, 10.1016/j.jtcvs.2023.08.005 (2023).">Gouchoe, D. A., et al. Mitsugumin 53 Mitigation of ischemia reperfusion injury in a mouse model. J Thorac Cardiovasc Surg. 10, 10.1016/j.jtcvs.2023.08.005 (2023).
  42. The next frontier in lung transplantation: Protecting the endothelium and repairing organs for transplant utilizing MG53. Clin Transl Dis. 3 (6), e255(2023).">Gouchoe, D. A., Whitson, B. A., Zhu, H. The next frontier in lung transplantation: Protecting the endothelium and repairing organs for transplant utilizing MG53. Clin Transl Dis. 3 (6), e255(2023).
  43. MG53 mitigates warm ischemic lung injury in a murine model of transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg. , 10.1016/j.jtcvs.2023.10.056 (2023).">Gouchoe, D. A., et al. MG53 mitigates warm ischemic lung injury in a murine model of transplantation. J Thorac Cardiovasc Surg. , 10.1016/j.jtcvs.2023.10.056 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ex Vivo Lung PerfusionPolymerized HemoglobinOxygen CarrierLung TransplantationPerfusion SolutionPulmonary EdemaRat EVLP ModelPulmonary Vascular ResistanceLung ComplianceHemoglobin Based Perfusate

Related Articles