Przygotowanie mysiego modelu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki za pomocą kombinacji ceruleiny i lipopolisacharydu we wstrzyknięciu dootrzewnowym

Podsumowanie

Dootrzewnowe podawanie leków jest bezpiecznym i skutecznym nieinwazyjnym sposobem na wywołanie uszkodzenia trzustki. W badaniu tym porównano pięć różnych protokołów wstrzyknięć dootrzewnowych na myszach w celu wywołania różnego stopnia uszkodzenia trzustki i ustanowiono model ciężkiego uszkodzenia trzustki w celu zbadania zmian patologicznych i strategii leczenia ciężkiego ostrego zapalenia trzustki (SAP).

Streszczenie

Leczenie ciężkiego ostrego zapalenia trzustki (SAP), z wysoką śmiertelnością, stanowi poważne wyzwanie kliniczne. Badanie zmian patologicznych związanych z SAP przy użyciu modeli zwierzęcych może pomóc w identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych i odkrywaniu nowych podejść terapeutycznych. Wcześniejsze badania indukowały przede wszystkim uszkodzenie trzustki poprzez wsteczne wstrzyknięcie taviaurocholanu sodu do dróg żółciowych, ale wpływ uszkodzeń chirurgicznych na jakość modelu zwierzęcego pozostaje niejasny. W tym badaniu zastosowaliśmy różne częstotliwości dootrzewnowych wstrzyknięć ceruleiny w połączeniu z różnymi dawkami LPS w celu wywołania uszkodzenia trzustki u myszy C57BL / 6J i porównaliśmy zakres urazu w pięciu protokołach wstrzyknięć dootrzewnowych. Jeśli chodzi o wywoływanie ostrego zapalenia trzustki u myszy, proponuje się protokół wstrzyknięcia dootrzewnowego, który powoduje śmiertelność nawet 80% w ciągu 5 dni. W szczególności myszy otrzymywały dziesięć codziennych wstrzyknięć dootrzewnowych Caeruleiny (50 μg/kg), a następnie wstrzyknięcie LPS (15 mg/kg) godzinę po ostatnim podaniu Caeruleiny. Dostosowując częstotliwość i dawkę wstrzykiwanych leków, można skutecznie manipulować ciężkością uszkodzenia trzustki. Model ten wykazuje dużą sterowalność i ma krótki cykl replikacji, dzięki czemu jest możliwy do wykonania przez jednego badacza bez konieczności posiadania drogiego sprzętu. Wygodnie i dokładnie symuluje kluczowe cechy choroby obserwowane w ludzkim SAP, wykazując jednocześnie wysoki stopień odtwarzalności.

Wprowadzenie

Ciężkie ostre zapalenie trzustki charakteryzuje się szybkim początkiem, szybkim postępem i wysoką śmiertelnością w obrębie choroby układu pokarmowego¹. Jego wysoka śmiertelność zawsze była głównym przedmiotem badań klinicznych. Ze względu na nieprzewidywalne zmiany w warunkach klinicznych, niejednorodność objawów choroby i ograniczoną dostępność próbek ludzkich, tworzenie modeli zwierzęcych staje się coraz ważniejsze dla badań nad chorobami.

Wsteczne wstrzyknięcie taurocholanu sodu do wspólnego przewodu żółciowego jest powszechnie używane do stworzenia szczurzego modelu klasy SAP2. Symulując niedrożność trzustki i dróg żółciowych oraz wywołując refluks żółci i płynu trzustkowego, ta technika modelowania wykazuje wysoki wskaźnik sukcesu w replikacji modeli zwierzęcych SAP. Należy jednak zauważyć, że chirurgia inwazyjna ma wpływ na sam model zwierzęcy. Co więcej, metoda ta jest ograniczona do większych zwierząt, takich jak szczury i psy, które są wykorzystywane głównie jako obiekty eksperymentalne. Alternatywne techniki, w tym intubacja dwunastnicy³, bezpośrednie nakłucie dwunastnicy⁴ oraz bezpośrednie nakłucie przewodu żółciowego-trzustkowego⁵, są często wykorzystywane do celów modelowania.

Metody iniekcji dootrzewnowej i modelowania diety oferują nieinwazyjne korzyści, które można zastosować do zwierząt dowolnej wielkości. Mysi model SAP indukowany przez podawanie etyoniny z niedoborem choliny (CDE)⁶ przedstawia pewne komplikacje, takie jak słabo kontrolowana hiperglikemia i hipokalcemia, co czyni go nieodpowiednim do oceny nowych podejść diagnostycznych i terapeutycznych. Z drugiej strony, dootrzewnowe wstrzyknięcie ceruleiny w połączeniu z L-arginininą⁷ stanowi najczęściej stosowaną metodę wywoływania ostrego zapalenia trzustki u myszy. W szczególności, wielokrotne dootrzewnowe podawanie ceruleiny - analogu cholecystokininy - stanowi bardzo odpowiednie podejście do badania różnych aspektów związanych z tą destrukcyjną chorobą, w tym patogenezy, stanu zapalnego i procesów regeneracji. Ze względu na swoje strukturalne podobieństwo do cholecystokininy (CCK), ceruleina skutecznie stymuluje skurcz pęcherzyka żółciowego i wydzielanie enzymów trzustkowych, co prowadzi do zaburzenia równowagi w wydzielaniu enzymów, a następnie do samozniszczenia⁸. Lipopolisacharyd (LPS), wszechobecny i szeroko badany jako cząsteczka molekularna związana z patogenem, może być łączony z ceruleiną poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe w celu stworzenia skutecznego mysiego modelu SAP. Ta kombinacja szybko wyzwala i uwalnia znaczną liczbę cytokin zapalnych, co skutkuje nadmiernym stanem zapalnym miejscowym i ogólnoustrojowym. W kilku badaniach wykazano indukcję modeli SAP u myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ceruleiny w połączeniu z LPS. Można to przypisać faktowi, że dootrzewnowe wstrzyknięcie Caeruleiny może spowodować obrzęk trzustki i krwotok u myszy, podczas gdy dodanie LPS może natychmiast wywołać martwicę trzustki i zaostrzyć ogólnoustrojową odpowiedź zapalną, posocznicę, a nawet niewydolność narządów. Obecnie występują różnice w dawkowaniu i częstości dootrzewnowych wstrzyknięć ceruleiny, a także niespójność w dodatkowych dawkach LPS. Osiągnięcie spójności w mysich modelach SAP jest wyzwaniem^9,10,11,12; Dlatego konieczne jest ustalenie ustandaryzowanego protokołu w celu uzyskania idealnego modelu. W tym artykule opisujemy protokół wstrzykiwania dootrzewnowego u myszy i badamy optymalną częstotliwość wstrzykiwań i dodatkową dawkę LPS.

Protokół

Ten protokół został sprawdzony i zatwierdzony przez Komisję Etyki w Pierwszym Szpitalu Stowarzyszonym Uniwersytetu Nauki i Technologii Anhui (Huainan, Chiny) (Kodeks Etyczny: 2023-KY-905-001). Badanie było zgodne z Polityką Publicznej Służby Zdrowia lub Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych oraz wykorzystywania gryzoni badawczych we wszystkich procedurach na zwierzętach. Do niniejszego badania wykorzystano dorosłe myszy C57BL/6J (6–8 tygodniowe, samce) o wadze 20-30 g. Myszy trzymano w laboratorium zwierzęcym przez tydzień w kontrolowanych warunkach (około 21 °C z 12-godzinnym naprzemiennym cyklem dnia i nocy). Myszy miały dostęp ad libitum do pożywienia i wody przez cały czas. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Przypisz 84 zdrowe myszy C57BL/6J do sześciu grup, w tym grupy kontrolnej, Uszkodzenie trzustki (PI) I, PI II, PI III, PI IV i PI V.
2. Przed rozpoczęciem procedury modelowania oznacz każdą grupę myszy nacięciami na uszy i pozwól im pościć przez 12 godzin.

2. Przygotowanie indukowanego rozcieńczalnika do leków

1. Rozpuścić ceruleinę (1 mg) w 1 ml PBS i przechowywać w lodówce w temperaturze -20 °C.
2. Zmierz i zapisz masę myszy doświadczalnych 1 godzinę przed dootrzewnowym wstrzyknięciem leku.
3. Ekstrahować całkowitą masę ceruleiny w stosunku 50 μg/kg, w oparciu o całkowitą masę wszystkich myszy.
4. Otrzymany lek Caeruleina należy ponownie rozcieńczyć PBS.
   UWAGA: Całkowita objętość rozcieńczenia PBS powinna być równa 5-krotności całkowitej wartości masy wszystkich myszy. Przed użyciem upewnij się, że zarówno LPS, jak i PBS są sterylne. Wykonaj wszystkie czynności przygotowawcze w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować sterylność. Przed wstrzyknięciem należy przechowywać roztwór w sterylnych, szczelnie zamkniętych pojemnikach, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

3. Wstrzyknięcie dootrzewnowe

UWAGA: Każdej grupie myszy podawano zastrzyki dootrzewnowe zgodnie z protokołem opisanym w Tabeli Uzupełniającej 1 w celu wywołania modelu. Dodatkowe 10 myszy pogrupowano i poddano leczeniu, aby obserwować 7-dniowe wskaźniki przeżycia. Przez cały czas trwania eksperymentu humanitarne punkty końcowe były dokładnie monitorowane, aby zapewnić zgodność z przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Eutanazja zostanie przeprowadzona, gdy spełnione zostaną określone kryteria, w tym zmniejszenie masy ciała o 30-50%, silny letarg lub znaczne upośledzenie ruchomości. Wskaźniki te posłużą jako podstawa humanitarnej interwencji w celu zminimalizowania cierpienia.

1. Chwyć i trzymaj myszy w taki sposób, aby brzuch myszy był skierowany do góry, a głowa znajdowała się niżej niż ogon, aby zapobiec uszkodzeniu narządów podczas wkładania strzykawki.
2. Zdezynfekuj brzuch myszy za pomocą wacików nasączonych alkoholem o stężeniu 75%.
3. Trzymać strzykawkę w prawej ręce (za pomocą igły o wymiarach ≤0,5/≥0,3) i wprowadzić igłę w skórę podskórną po lewej stronie białej linii na brzuchu.
   UWAGA: Zmienić na prawą stronę do następnego wstrzyknięcia.
4. Gdy igła dotrze do warstwy podskórnej, przesuń ją do przodu o około 3-5 mm, a następnie wprowadź igłę strzykawki do jamy brzusznej pod kątem 45°. W tym momencie należy poczuć pewien opór.
5. Trzymać igłę nieruchomo i powoli wstrzykiwać substancję.
   UWAGA: Maksymalna objętość nie przekracza 0,15 ml.
6. Po wstrzyknięciu należy wyciągnąć igłę i delikatnie wmasować oraz docisnąć miejsce wstrzyknięcia sterylnym wacikiem, aby całkowicie rozprowadzić lek do jamy brzusznej myszy.
7. Użyj nowej strzykawki, aby powtórzyć z następnymi eksperymentalnymi myszami.

4. Testy zdolności behawioralnych na otwartym polu

UWAGA: 12 godzin po ostatnim wstrzyknięciu dootrzewnowym przeprowadzono testy zdolności behawioralnych na otwartym polu, aby ocenić całkowity dystans aktywności i czas unieruchomienia myszy.

1. Umieść cztery identyczne białe pola bezpośrednio pod kamerą.
2. Podłącz aparat do komputera za pomocą wideo.
3. Przed rozpoczęciem eksperymentu upewnij się, że pudełko eksperymentalne jest czyste i wolne od wszelkich zapachów.
4. Umieść zwierzę na środku siatki, odwrócone tyłem do eksperymentatora i pozwól mu przystosować się do środowiska przez 10 minut.
5. Uruchom oprogramowanie do śledzenia wideo i kliknij menu Plik, aby utworzyć nowy eksperyment.
6. Skonfiguruj monitorowanie dla czterech jednoczesnych pól widzenia.
7. Zaznacz długość i szerokość obiektu eksperymentalnego, który może poruszać się w pudełku na ekranie monitorowania w czasie rzeczywistym (30 cm × 30 cm).
8. Po zakończeniu konfiguracji rozpocznij nadzór wideo i nagrywanie.
9. Rejestruj aktywność myszy przez 15 minut.
10. Po zakończeniu badania należy zdjąć zwierzę z siatki i umieścić je z powrotem w klatce. Dokładnie wyczyść kratkę za pomocą środka sterylizującego zawierającego dwutlenek chloru.

5. Pobieranie i badanie krwi obwodowej myszy

1. Poddaj myszy eutanazji (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem).
   1. Przeprowadzić eutanazję na myszach doświadczalnych 36 godzin po wstrzyknięciu dootrzewnowym. Zmierz i zapisz masę ciała myszy przed eutanazją.
   2. Lewą ręką zabezpiecz myszy, a prawą ręką przytrzymaj nożyczki, aby przyciąć wąsy po jednej stronie myszy.
   3. Delikatnie uciskaj skórę wokół oka, aby wywołać przekrwienie i wysunięcie gałki ocznej.
   4. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby chwycić gałkę oczną i szybko ją usunąć, zbierając krew obwodową w probówce do mikrowirówki.
      UWAGA: Użyto dwóch różnych typów probówek do mikrowirówek, z których jedna zawierała antykoagulant, a druga bez.
   5. Jednocześnie lekko naciśnij obszar serca myszy środkowym palcem lewej ręki, aby zwiększyć prędkość pompowania serca.
2. Pozostawić krew obwodową bez antykoagulantu w temperaturze pokojowej na 30 minut.
3. Zmierzyć stężenia amylazy w surowicy (Amy) i lipazy (Lip) za pomocą automatycznego analizatora biochemicznego metodą szybkości enzymu i metodą krążenia enzymatycznego (zgodnie z instrukcjami producenta).
4. Określ poziomy wskaźników stanu zapalnego, takich jak prokalcytonina (PCT) w osoczu, stosując metodę chemiluminescencyjną przy użyciu komercyjnego imagera chemiluminescencyjnego (zgodnie z instrukcjami producenta).
5. Użyj zestawów ELISA do pomiaru poziomów HMGB-1, IL-6 i TNF-α w surowicy myszy (zgodnie z instrukcjami producenta).
6. Przeanalizuj krew obwodową leczoną antykoagulantem za pomocą w pełni automatycznego analizatora komórek krwi, aby ocenić odpowiednie parametry.

6. Pobieranie tkanki trzustki i przygotowanie wycinka parafiny

1. Umieść myszy w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz je na piankowej płytce.
2. Ogol i zdezynfekuj obszar, a następnie wykonaj środkowe nacięcie brzucha i odwróć rurkę jelita cienkiego w prawo, aby całkowicie odsłonić trzustkę.
3. Odłącz dwunastnicę i przewód odźwiernikowy i zlokalizuj jelito cienkie pod trzustką. Całkowicie uwolnij tkankę trzustki wzdłuż przewodu jelitowego.
4. Użyj bezzębnych kleszczy, aby zacisnąć śledzionę i delikatnie pociągnij do góry.
   UWAGA: Nie dotykaj bezpośrednio tkanki trzustki i unikaj używania nadmiernej siły podczas całego procesu dysocjacji.
5. Ostro wypreparuj tkankę więzadła trzustki tylnej aż do głowy trzustki i odłącz przewód żółciowy i naczynia krwionośne.
6. Usunąć tkankę trzustkową, osuszyć powierzchnię wilgocią papierem chłonnym, zważyć i zarejestrować.
7. Utrwalić połowę tkanki trzustki za pomocą 4% paraformaldehydu, a drugą połowę przechowywać w lodówce w temperaturze -80 °C.
8. Przygotuj skrawki parafiny trzustkowej, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
   1. Oczyść utrwaloną tkankę trzustki 75% alkoholem i przytnij ją do rozmiaru około 0,5 cm × 0,5 cm.
   2. Zanurz tkankę w 70% etanolu na 20 minut, 80% etanolu na kolejne 20 minut i 90% etanolu na 15 minut.
   3. Za każdym razem traktuj tkankę 95% etanolem przez 15 minut, a następnie dwa razy 100% etanolem przez 5 minut za każdym razem.
   4. Poddaj tkankę dwóm rundom 12-minutowych i 5-minutowych zabiegów roztworem ksylenu w celu uzyskania przezroczystości.
   5. Przezroczystą chusteczkę namoczyć w woskowym zbiorniku w temperaturze 65 °C na 1 godzinę.
   6. Zanurz tkankę w stopionej parafinie i pozwól jej ostygnąć. Skrawki parafiny trzustkowej uzyskać za pomocą krajalnicy (grubość: 5 μm).
   7. Otrzymane plastry parafiny spłaszczyć w wodzie o temperaturze 45 °C, uformować i wysuszyć (warunki pieczenia: 40 °C przez 14-16 h).

7. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

1. Skrawki parafiny trzustkowej umieścić w ksylenie I i II na 30 minut, następnie w bezwodnym, 95%, 85% i 75% alkoholu na 5 minut każdy, a ultraczystą wodę na 5 minut.
2. Barwić jądro komórkowe hematoksyliną przez 160 s, a następnie powoli spłukiwać bieżącą wodą.
3. Zastosuj roztwór alkoholu z kwasem solnym na 5-10 s, a następnie szybko spłucz bieżącą wodą.
4. Traktuj skrawki bezwodnym alkoholem przez 5 minut.
5. Inkubuj cytoplazmę z eozyną przez 30 s, a następnie spłucz bieżącą wodą.
6. Zanurz sekcje w 75%, 85%, 95% i 100% etanolu na 10 s każda, a następnie potraktuj ksylenem przez 5 minut w celu odwodnienia.
7. Na koniec uszczelnij sekcje neutralną żywicą i obserwuj pod mikroskopem.
8. Wykonaj ocenę patologiczną i standardy¹³.
   UWAGA: Określ nasilenie zapalenia trzustki na podstawie wskaźników, takich jak obrzęk, martwica zrazików, krwawienie, krwotok i martwica tłuszczu oraz zapalenie zapalne i okołonaczyniowe. Skorzystaj z wcześniej opublikowanych wytycznych dotyczących implementacji scoring¹³.

8. Barwienie immunohistochemiczne

1. Odparafinować zatopione w parafinie odcinki tkanki trzustki w ksylenie, a następnie ponownie je uwodnić w gradiencie roztworów etanolu.
2. Przeprowadzić endogenną blokadę enzymów za pomocą 3%_H2O2przez 20 minut po 30 minutowym zerwaniu błony.
3. Zablokować przeciwciało 5% surowicą bydlęcą w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z rozcieńczeniem królika anty-HMGB1 w stosunku 1:1500.
4. Przepłukać skrawki PBS, a następnie inkubować je w odpowiednich przeciwciałach drugorzędowych przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie przeprowadź opracowywanie koloru DAB, barwienie przeciwdziałające hematoksylinie i uszczelnij neutralną gumą.

9. Metoda TUNEL do wykrywania apoptozy w odcinkach trzustki

1. Odparafinować skrawki parafiny trzustki w ksylenie przez 5 minut, powtórzyć dwukrotnie i przemyć gradientowym etanolem (100% przez 5 min, 90% przez 2 min, 70% przez 2 min i wodą destylowaną przez 2 min).
2. Nadmiar płynu otaczającego skrawki parafiny zmyć za pomocą PBS. Potraktuj każdą próbkę 100 μl proteinazy K, zapewniając całkowite pokrycie tkanki. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie namocz próbki w PBS 3 razy, za każdym razem przez 5 min.
   UWAGA: Roztwór proteinazy K przygotowano przez rozcieńczenie oryginalnego roztworu proteinazy K (200 μg/ml) PBS w stosunku 1:9 (objętość), co dało końcowe stężenie 20 μg/ml, z wyłączeniem DNazy. Dokładne mycie proteinazy K jest niezbędne, aby uniknąć zakłóceń w późniejszych reakcjach znakowania.
3. Dodać odpowiednią ilość 3% H₂O₂ (rozcieńczonego PBS) na tkankę, aby w pełni ją nacieknąć i inkubować przez 20 minut. Przepłukać tkankę PBS 3 razy po 5 minut.
   UWAGA: Skrawki parafiny powinny być wilgotne. Aby dezaktywować endogenne peroksydazy w tkance, czas inkubacji nie powinien być zbyt długi, aby zapobiec fałszywie dodatnim wynikom z powodu pęknięcia DNA spowodowanego przez 3%_H2O2.
4. Pokryć całą powierzchnię badanej próbki 50 μl buforu równoważącego i inkubować przez 10 minut.
5. Usuń jak najwięcej bufora równowagi. Następnie dodać 56 μl buforu do inkubacji TdT do każdej próbki tkanki i inkubować przez 1 godzinę (w temperaturze pokojowe).
   UWAGA: Nie należy dopuścić do wyschnięcia szkiełka i unikać ekspozycji na światło. Bufor do inkubacji TdT został przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta (Rekombinowany enzym TdT: Biotyna-dUTP Znakowanie Mix: Bufor równowagowy = 1 μL: 5 μL: 50 μL).
6. Próbki tkanek należy natychmiast przemyć PBS. Opłucz je 4 razy po 5 minut. Delikatnie usunąć nadmiar roztworu PBS wokół próbek za pomocą bibuły filtracyjnej.
7. Dodać 100 μl uprzednio rozcieńczonego roztworu reakcyjnego Streptawidyna-HRP (Streptawidyna-HRP: TBST = 1: 300) do każdej próbki tkanki do reakcji Streptawidyna-HRP. Inkubować przez 30 minut. Następnie umyj próbki PBS i przepłucz je 3 razy przez 5 minut każda.
8. Barwienie DAB należy przeprowadzić, dodając 50 μl DAB do każdej sekcji parafiny. Obserwuj barwienie pod mikroskopem w czasie rzeczywistym. Po pojawieniu się pozytywnego zabarwienia natychmiast umieść szkiełka w wilgotnym pudełku. Zatrzymaj reakcję, myjąc ją czystą wodą.
9. Zanurz szkiełka w roztworze barwiącym hematoksylinę na 3-5 minut, a następnie spłucz czystą wodą.
10. Różnicować w roztworze różnicowania hematoksyliny przez około 2 s, a następnie natychmiast spłukać czystą wodą.
11. Osiągnij niebieskie zabarwienie za pomocą roztworu do ponownego niebieszczenia hematoksyliny przez kilka sekund i spłucz szkiełka czystą wodą.
    UWAGA: Przeprowadź badanie mikroskopowe po barwieniu jądrowym. Jeśli zabarwienie jest zbyt ciemne, należy umieścić szkiełka z powrotem w roztworze różnicującym. Jeśli barwienie jest zbyt jasne, wznów proces barwienia od etapu barwienia jądrowego.
12. Odwodnić próbki za pomocą 4 rund świeżego bezwodnego etanolu przez 5 minut każdy. Następnie moczymy je w butanolu przez 5 minut, a w ksylenie przez 5 minut. Na koniec użyj świeżego ksylenu przez kolejne 5 minut.
13. Zamontuj prowadnice za pomocą neutralnej gumy. Pozostaw je do naturalnego wyschnięcia na powietrzu lub wysusz w piekarniku o temperaturze 60 °C.
14. Wykonaj badanie histologiczne przy użyciu mikroskopu światła białego. Jądra apoptotyczne będą brązowe.
15. Oblicz odpowiedni indeks apoptotyczny (AI).
    UWAGA: Obserwuj slajdy w sposób podwójnie ślepy. Na slajdach TUNEL-dodatnich losowo wybierz 5 dodatnich obszarów w dużym powiększeniu (400x) i policz co najmniej 100 komórek groniastych w każdym obszarze, aby określić procent komórek dodatnich. AI = (całkowita liczba komórek apoptotycznych/całkowita liczba komórek) × 100%.

10. Cytometria przepływowa

1. Pobrać świeże tkanki trzustki i dokładnie je umyć po perfuzji PBS.
2. Przygotuj 0,5% roztwór do wytrawiania kolagenazy dożylnie i użyj sterylnych nożyczek do tkanek, aby odpowiednio strawić tkanki trzustki.
3. Dodać 5% roztwór kończący trawienie BSA w zależności od stanu fragmentów trzustki i zmętnienia płynu, a następnie odwirować mieszaninę w niskiej temperaturze przez 5 minut (~300 x g, 4 °C).
4. Odrzucić sklarowany osad w celu zakończenia trawienia.
5. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej zawierającą fluorek fenylometanu sulfonylu (PMSF) i 2,5% zawiesinę płodowych komórek surowicy bydlęcej w celu ponownego zawieszenia komórek trzustki.
6. Przefiltruj zawiesiny komórek groniastych trzustki przez nylonową siatkę o oczkach 200, aby uzyskać zawiesiny komórek przez filtrowanie komórek.
7. Odwirować zawiesinę komórek groniastych trzustki w niskiej temperaturze (postępuj zgodnie z warunkami opisanymi w kroku 10.3).
8. Odrzucić supernatant.
9. Umyj komórki wstępnie schłodzonym PBS.
10. Delikatnie zawiesić komórki we wstępnie schłodzonym buforze wiążącym 1x poprzez odśrodkowe zawieszenie.
11. Oznaczyć komórki zrazikowane trzustki aneksyną V-FITC/PI zgodnie z instrukcjami producenta po dostosowaniu stężenia komórek.
12. Użyj cytometrii przepływowej w ciągu 1 godziny, aby wykryć apoptozę w komórkach groniastych trzustki.

11. Wykrywanie Western blot kaspazy-3 i HMGB-1

1. Wyekstrahuj białko trzustki.
   1. Wyekstrahuj 50 mg tkanki trzustki i pokrój ją na małe fragmenty.
   2. Dodać 1 ml buforu do lizy RIPA (zawierającego PMSF i fosforylowany inhibitor proteazy).
   3. Homogenizuj tkankę trzustki na lodzie przez 5 minut za pomocą młynka elektrycznego.
   4. Inkubować homogenizowaną tkankę na lodzie, delikatnie wstrząsając przez 2 godziny.
   5. Odwirować homogenat w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 4 500 x g.
   6. Zebrać roztwór sklarowanego osadu i przechowywać go w temperaturze -80 °C.
2. Przeprowadzić kwantyfikację białka.
   1. Rozcieńczyć pewną objętość próbki wzorcowej BSA (25 mg/ml) do stężenia 0,5 mg/ml.
   2. Przygotuj określoną ilość roztworu roboczego BCA, mieszając 50 objętości roztworu BCA A z 1 objętością roztworu BCA B, zapewniając dokładne i równomierne wymieszanie.
   3. Umieścić próbkę wzorcową BSA w standardowych otworach na próbkę na płytce 96-dołkowej w kolejności 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 i 20 μl. Zrównoważyć objętość każdego otworu wodą destylowaną, tak aby całkowita objętość wynosiła 20 μl.
   4. Dodać 2 μl próbek do otworów na próbki, a następnie kolejno dodać 18 μl wody destylowanej do rozcieńczenia (1:9).
   5. Napełnij każdą studzienkę 200 μl roztworu roboczego BCA i pozostaw w temperaturze 37 °C na około 20-30 minut.
   6. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 562 nm. Obliczyć stężenie białka w próbkach na podstawie krzywej wzorcowej.
   7. Dodać określoną objętość roztworu do krakingu RIPA i buforu rozcieńczającego w celu rozcieńczenia próbek, aż stężenie osiągnie 5-10 μg/μl, co uważa się za właściwe.
   8. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C po denaturacji białka (100 °C; 10 min).
3. Wykonaj Western blot.
   1. Przygotuj się na SDS-PAGE.
      1. Zamontuj formy do produkcji kleju i sprawdź ich szczelność.
      2. Dodaj TEMED do 10% kleju separacyjnego i równomiernie wymieszaj.
      3. Wstrzyknij mieszaninę do formy, stanowiąc około dwóch trzecich objętości, unikając pęcherzyków.
      4. Dodaj izopropanol do formy i dociskaj klej przez około 40 min.
      5. Użyj tego samego programu, aby skonfigurować 5% skoncentrowany klej.
      6. Wylej izopropanol i natychmiast dodaj klej.
      7. Umieść grzebień pionowo, aż klej całkowicie się spolimeryzuje.
   2. Wykonaj operację elektroforezy.
      1. Dodać próbkę, która ma być badana, w oczekiwanej eksperymentalnej kolejności kontrolnej, w odwrotnej kolejności, do otworów do pobierania próbek kleju SDS-PAGE.
      2. Jednocześnie dodaj Znacznik Białka, aby określić lokalizację białka docelowego i wewnętrznego białka odniesienia.
      3. Umieścić próbkę w zbiorniku do elektroforezy po zakończeniu dodawania próbki.
      4. Początkowo uruchom przy napięciu 80 V przez 30 minut, a następnie uruchom żel, aby oddzielić białko pod napięciem 100 V przez 60 minut
         UWAGA: Należy zwrócić uwagę na położenie błękitu bromofenolowego, aby uniknąć nadmiernej elektroforezy.
   3. Wykonaj transfer białka.
      1. Wytnij folię PVDF w prawym górnym rogu, aby służyła jako znak.
      2. Umieść folię PVDF w roztworze metanolu na 5-10 sekund w celu aktywacji.
      3. Namocz folię PVDF w buforze do elektroforezy na około 15 minut.
      4. Ostrożnie usuń żel po elektroforezie i odetnij nadmiar żelu, upewniając się, że żel pozostaje mokry przez cały proces.
      5. Zamontuj szynę w następującej kolejności: płyta ujemna → gąbka → trzy warstwy bibuły filtracyjnej → żelu → folii PVDF → trzy warstwy bibuły filtracyjnej → gąbki → płytą dodatnią.
         UWAGA: Upewnij się, że między żelem a folią PVDF nie ma pęcherzyków powietrza.
      6. Umieść zmontowany zacisk w mokrym rowku obrotowym (od czarnego do czarnego) z kostkami lodu umieszczonymi wokół niego.
      7. Włącz zasilanie i rozpocznij przesyłanie filmu pod ciśnieniem 400 mA przez 100 minut.
   4. Wykonaj uszczelnianie folii PVDF i inkubację przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.
      1. Po przeniesieniu delikatnie usuń folię PVDF i płucz TBST przez 10 minut, powtarzając proces 3-5 razy.
      2. Zgrzej folię PVDF w 5% odtłuszczonym mleku na 2 godziny.
      3. Usuń folię PVDF i płucz TBST przez 10 minut, powtarzając proces 4 razy.
      4. Umieścić folię PVDF i rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe w lodówce w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając, i inkubować przez noc.
      5. Następnego dnia usuń folię PVDF i płucz TBST przez 10 minut, powtarzając proces 4 razy.
      6. Inkubować folię PVDF w rozcieńczalniku przeciwciał wtórnych znakowanym HRP przez około 2 godziny.
      7. Płucz folię PVDF TBST przez 10 minut, powtarzając proces 4 razy.
   5. Naświetl film i przeanalizuj go.
      1. Przygotowany roztwór ECL nanieść równomiernie na folię.
      2. Naświetl film w ciemnym pomieszczeniu za pomocą światłomierza przez około 2-3 minuty, a następnie przechowuj go.
      3. Przeprowadź analizę za pomocą oprogramowania do obrazowania J.

Wyniki

Proces eksperymentalnego modelowania myszy jest zilustrowany w Rysunek 1. Po 12 godzinach od zakończenia wstrzykiwania, rejestrator wideo w otwartym polu został użyty do monitorowania odległości ruchu i czasu unieruchomienia różnych eksperymentalnych grup myszy przez 5 cykli (Rysunek 2A). Podczas 5 cykli myszy z grupy PI V utrzymywały niski poziom odległości ruchu w ciągu 3 minut, podczas gdy współczynnik bezruchu w ciągu 3 minut zwiększał się z każdym kolejnym cyklem (Rysunek 2B, C). Dodatkowo przeprowadzono analizę statystyczną całkowitej odległości przemieszczania się myszy z różnych grup eksperymentalnych podczas 5 cykli. Grupa PI V wykazała najmniejszą całkowitą odległość ruchu w porównaniu z innymi grupami eksperymentalnymi, a różnica była istotna statystycznie (p < 0,001) (Rysunek 2D, E). Z wyjątkiem grupy kontrolnej i grupy PI I, myszy w innych grupach eksperymentalnych wykazywały ujemny wzrost wagi wartości D. Wśród nich grupa PI V wykazała największą zmianę masy, a różnica w zmianie masy ciała w porównaniu z innymi grupami eksperymentalnymi była statystycznie istotna (Rysunek 2F). Po ocenie przeżywalności dodatkowych 10 myszy w każdej grupie eksperymentalnej, wyniki wykazały, że śmiertelność myszy w grupie PI V osiągnęła 80% w 5^dniu. Nie stwierdzono jednak statystycznie istotnej różnicy we wskaźniku śmiertelności między pozostałymi czterema grupami eksperymentalnymi a myszami z grupy kontrolnej (Rysunek 2G).

Używając mikroskopu o dużej mocy, zaobserwowano znaczny obrzęk komórek, martwicę i infiltrację komórek zapalnych w grupach myszy PI IV i PI V (Rysunek 3A,B). Korzystając z kryteriów oceny przedstawionych w tabeli uzupełniającej 2, oceniono patologię trzustki różnych eksperymentalnych grup myszy i zaobserwowano znaczące różnice w wyniku patologii trzustki w porównaniu z myszami z grupy kontrolnej (p < 0,001) (Rysunek 3C; Rysunek uzupełniający 1). Ponadto, w porównaniu z grupą kontrolną, poziomy amylazy i lipazy w surowicy u mierzonych myszy były istotnie wyższe w grupach eksperymentalnych od PI II do PI V, a różnice były istotne statystycznie. Co ciekawe, nie było statystycznie istotnej różnicy u myszy z grupy PI I (Rysunek 3D,E). Metodę ELISA zastosowano do oceny poziomów markerów stanu zapalnego¹⁴, w tym TNF-α i IL-6, w surowicy myszy. Wyniki ujawniły, że poziomy TNF-α i IL-6 u myszy z grupy PI V były znacznie wyższe niż w innych grupach eksperymentalnych, a różnice były statystycznie istotne (Rysunek 3F, G). W porównaniu z grupą kontrolną, poziomy PCT wzrosły we wszystkich czterech grupach eksperymentalnych, ale tylko różnica w grupie PI V była statystycznie istotna (p < 0,05) (Rysunek 3H).

Apoptotyczny stan tkanek trzustki w różnych eksperymentalnych grupach myszy
Wykonując barwienie TUNEL na tkankach trzustki każdej grupy myszy, zaobserwowano stan martwicy komórkowej w tkankach trzustki różnych grup eksperymentalnych (Figura 4A). Wartości w skali szarości (OD) na jednostkę powierzchni skrawków tkanki trzustki oraz dodatni wskaźnik martwicy komórkowej analizowano półilościowo za pomocą oprogramowania Image J. Wyniki wykazały, że w porównaniu z innymi grupami eksperymentalnymi, poziom martwicy komórek w tkankach trzustki w grupie myszy PI V był znacznie podwyższony, a różnica była istotna statystycznie (p < 0,001) (Rysunek 4B,C). Eksperymenty immunoblottingu białkowego przeprowadzono w celu oceny poziomów ekspresji specyficznej dla cysteinyloasparaginianu proteinazy-3 (kaspazy-3), markera martwicy komórkowej, w tkankach trzustki myszy z różnych grup eksperymentalnych (Figura 4D). Kwantyfikacja ekspresji kaspazy-3 wykazała, że poziom ekspresji białka kaspazy-3 w tkankach trzustki w grupie PI V był istotnie zwiększony, a różnica była istotna statystycznie (p < 0,001). Poziomy ekspresji białek zostały określone ilościowo i znormalizowane do kontroli wewnętrznej GapDH (Rysunek 4E). Dodatkowo świeże zawiesiny komórek groniastych trzustki oznaczono aneksyną V-FITC/PI i przeanalizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Stwierdzono, że w porównaniu z innymi eksperymentalnymi grupami myszy, grupa PI V miała znacznie wyższy dodatni wskaźnik śmierci komórki, co było statystycznie istotne (p < 0,001) (Rysunek 4F,G).

Zawartość HMGB-1 w surowicy obwodowej i poziom ekspresji HMGB-1 w tkance trzustki
W celu zbadania związku między białkiem HMGB-1 a uszkodzeniem trzustki, przeprowadzono barwienie immunohistochemiczne i kwantyfikację tkanek trzustki myszy w każdej grupie eksperymentalnej. Stwierdzono istotną statystycznie różnicę między grupą eksperymentalną a kontrolną (p < 0,001) (Ryc. 5A,B). Test ELISA zastosowano do pomiaru poziomu HMGB-1 w surowicy myszy z różnych grup eksperymentalnych. Wyniki wykazały, że w porównaniu z grupą kontrolną, poziomy HMGB-1 w surowicy były znacznie wyższe we wszystkich grupach eksperymentalnych, przy czym najwyższy poziom zaobserwowano w grupie PI V, a różnica była statystycznie istotna (p < 0,001) (Figura 5C). Ponadto analiza Western blot wykryła podwyższoną ekspresję białka HMGB-1 w tkankach trzustki myszy we wszystkich grupach eksperymentalnych, ze statystycznie istotnymi różnicami w porównaniu z grupą kontrolną (p < 0,001) (Figura 5D, E).

Rysunek 1: Eksperymentalny schemat blokowy. Dzień 2 i Dzień 3: Wstrzyknięcie dootrzewnowe. Dzień 4: Eksperyment w terenie otwartym rozpoczęto po 12 godzinach od ostatniego wstrzyknięcia dootrzewnowego. Dzień 5: Eutanazja 36 godzin po wstrzyknięciu dootrzewnowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Makroskopowe zmiany w modelu myszy PI. (A) Przedstawiono wykres trajektorii ruchu myszy w czasie rzeczywistym. (B) Całkowita odległość przemieszczania się w każdym okresie monitorowania dla różnych grup doświadczalnych myszy. (C) Procent czasu bezruchu w każdym okresie monitorowania dla różnych grup doświadczalnych myszy. (D,E) Przeanalizowano całkowitą odległość ruchu i procent czasu bezruchu w ciągu 15 minut dla myszy w różnych grupach eksperymentalnych. (F) Pokazana jest wartość D reprezentująca masę myszy przed procesem modelowania i po nim. (G) Przeżycie 10 myszy w każdej grupie obserwowano przez 7 dni po wstrzyknięciu dootrzewnowym. Dane są wyrażone jako średnia ± SEM, n = 4. "ns" oznacza nieistotne, *P < 0,05, ****P < 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Patologiczne zmiany w zapaleniu trzustki u myszy w różnych grupach eksperymentalnych. (A) Wybarwione H&E histologiczne skrawki tkanki trzustkowej myszy w różnych grupach eksperymentalnych (skrawki tkanki trzustki zatopione w parafinie barwione hematoksyliną i eozyną, powiększenia 100-krotne i podziałki skali 200 μm, oraz 400-krotne i podziałki odpowiednio 50 μm. Żółte długie strzałki wskazują wysepki; czerwone długie strzałki wskazują komórki groniaste; brązowe długie strzałki wskazują naczynia krwionośne; niebieskie długie strzałki wskazują kanały). (B) Obliczanie stosunku masy trzustki do masy ciała u myszy. (C) Patologiczna ocena trzustki myszy. (D,E) Wykrywanie poziomów amylazy i lipazy w surowicy u myszy. (F-G) Pomiar ELISA poziomów TNF-α i IL-6 w surowicy u myszy. (H) Ocena poziomu PCT. Dane są wyrażone jako średnia ± SEM, n = 4. "ns" oznacza nieistotne, *P < 0,05, ****P < 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Apoptoza tkanki trzustkowej u myszy. (A) Reprezentatywne obrazy barwienia TUNEL uzyskano z wycinków parafiny trzustkowej myszy i obrazów powiększonego obszaru. (400x, podziałka 50 μm, brązowawo-żółte to komórki dodatnie). (B,C) Analiza ilościowa wartości skali szarości na jednostkę powierzchni wybarwionych TUNEL odcinków tkanki trzustki myszy oraz procentu dodatnio barwionych martwych komórek. (D) Poziom ekspresji kaspazy-3 w tkance trzustki został wykryty przez Western blot. (E) Kwantyfikacja ekspresji kaspazy-3 w tkance trzustki. (F) Cytometria przepływowa została wykorzystana do oceny zakresu śmierci komórek w komórkach groniastych trzustki myszy. (G) Wyliczanie martwych komórek w późnym stadium w komórkach groniastych trzustki myszy. Dane są wyrażone jako średnia ± SEM, n = 4. "ns" oznacza nieistotne, *P < 0,05, ****P < 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Ekspresja HMGB-1 w tkance trzustki myszy. (A) Reprezentatywne obrazy i powiększone obrazy (x400, skala 50 μm) immunohistochemicznego barwienia HMGB-1 na odcinkach trzustki. Brązowo-żółty kolor oznacza komórki dodatnie (n = 4). (B) Procent komórek HMGB-1 dodatnich w skrawkach tkanki trzustki (n = 24). (C) Poziom HMGB-1 w surowicy myszy (n = 4). (D,E) Przeprowadzono Western blot w celu wykrycia poziomu ekspresji HMGB-1 w tkance trzustki i uzyskania wyników kwantyfikacji (n = 4). Dane są wyrażone jako średnie ± SEM, "ns" oznacza nieistotne, *P < 0,05, ****P < 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Uszkodzenie wielonarządowe w modelu myszy grupy PI V. (A) Reprezentatywne obrazy zmian histologicznych w tkankach trzustki, płuc, wątroby i nerek pobrane od myszy z grupy CON i PI V zostały przeanalizowane za pomocą barwienia H&E (powiększenie 200x, podziałka 50 μm). Zmiany patologiczne związane z martwicą komórek groniastych są oznaczone czarnymi strzałkami. Żółte strzałki wskazują zmiany patologiczne charakteryzujące się krwotokiem śródmiąższowym i obrzękiem pęcherzyków płucnych. Obrzęk i martwica hepatocytów są oznaczone zielonymi strzałkami. Zmiany patologiczne związane z krwotokiem kłębuszkowym są oznaczone czerwonymi strzałkami. (B) Obliczenia wyników histologicznych przeprowadzono na tkankach trzustki, płuc, wątroby i nerek uzyskanych od myszy z grupy CON i PI V. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Protokół iniekcji dootrzewnowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Patologiczne kryteria punktacji dla ciężkości zapalenia trzustki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Obecnie brakuje skutecznych środków poprawiających wysoką śmiertelność u pacjentów z ciężkim ostrym zapaleniem trzustki. Kluczowe znaczenie ma zbadanie skuteczności leków we wzmacnianiu mechanizmów stabilności immunologicznej. Istnieje pilna potrzeba stworzenia idealnego modelu zwierzęcego dla ciężkiego ostrego zapalenia trzustki. Myszy z pochodzeniem genetycznym C57BL/6J są szeroko stosowane w badaniach biomedycznych, w tym w badaniach nad patofizjologią SAP. Ponad 70 lat różnicowania genetycznego u myszy B6J spowodowało spontaniczną delecję kilku eksonów¹⁵, co prowadzi do zmniejszenia wrażliwości na uszkodzenie trzustki wywołane przez ceruleinę¹⁶. Ponadto istniejące modele zwierzęce ostrego zapalenia trzustki mają ograniczenia, takie jak uraz chirurgiczny lub możliwość zastosowania tylko do większych zwierząt, co utrudnia badania naukowe z wykorzystaniem tych modeli. Dlatego bardzo cenne jest stworzenie stabilnego, wydajnego i wygodnego modelu zwierzęcego przy użyciu tego specyficznego szczepu genu.

Ceruleina jest analogiem cholecystokininy, który indukuje uszkodzenie tkanki trzustki, powodując względną niedrożność płynu trawiennego w trzustce i wydzielanie enzymów poprzez wstrzyknięcia o wysokiej częstotliwości w krótkim czasie, gdy myszy poszczą i zmagazynują wystarczającą ilość płynu trawiennego^. LPS jest głównym składnikiem znajdującym się w ścianach komórkowych bakterii i może powodować MODS i SIRS u myszy¹⁸. Poprzednie badanie wykazało, że połączenie iniekcji Caeruleiny z różną częstotliwością z różnymi dawkami LPS podawanymi w iniekcji dootrzewnowej wywołało podobne zmiany patologiczne obserwowane u człowieka SAP^19,20. W badaniu tym zastosowano nieinwazyjne podejście w celu wywołania różnego stopnia uszkodzenia trzustki poprzez połączenie różnych częstotliwości wstrzyknięć ceruleiny z różnymi dawkami LPS podawanymi dootrzewnowo myszom. Zapewnienie równomiernego wchłaniania przez otrzewną miało kluczowe znaczenie podczas opracowywania protokołu. Aby spełnić ten wymóg, konieczne jest ścisłe przestrzeganie etapów iniekcji dootrzewnowej, aby zapewnić precyzyjną kontrolę nad każdym podawaniem leku. Dodatkowo, delikatne pocieranie i wywieranie odpowiedniego nacisku na miejsce wstrzyknięcia sterylnym wacikiem po każdym wstrzyknięciu leku jest niezbędne do równomiernego rozprowadzenia leku w całej jamie otrzewnej. Ponadto niezwykle ważne jest dokładne i precyzyjne umieszczenie główki szpilki w jamie otrzewnej, z igłą skierowaną w stronę środkowej części górnej części brzucha. Należy przeprowadzić wcześniejsze szkolenie, aby umożliwić operatorom dokładne dostrzeżenie braku oporu podczas wprowadzania igły do jamy brzusznej. Zastosowanie mikroilościowej pompy infuzyjnej zamiast obsługi ręcznej może potencjalnie poprawić jakość wstrzykiwanych leków; Niestety, nie zostało to zrealizowane w tym badaniu. Niemniej jednak, stosując różne schematy wstrzykiwań, wywołaliśmy różne stopnie uszkodzenia trzustki i skutecznie zaobserwowaliśmy różnice w uszkodzeniu trzustki spowodowane różnymi częstotliwościami i dawkami w identycznych warunkach technicznych wywołanych przez ceruleinę w połączeniu z iniekcjami LPS. Dostarcza to cennych informacji na temat przyszłego stosowania ceruleiny w nieinwazyjnych modelach zwierzęcych w leczeniu indukcji ciężkiego ostrego zapalenia trzustki.

Skojarzenie ceruleiny i LPS powodowało znacznie podwyższone poziomy amylazy i lipazy w surowicy, zwiększenie masy trzustki i zmiany histologiczne, w tym rozległy naciek komórek zapalnych, obrzęk komórek groniastych trzustki, martwicę i krwotok, jak wykazano za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (HE). Co więcej, wraz ze wzrostem dawki LPS zmiany patologiczne w trzustce stały się bardziej wyraźne. Warto jednak zauważyć, że nie było zauważalnych różnic w wynikach patologii trzustki między grupami PI IV i PI V, podczas gdy zakres martwicy komórek tkanki trzustki był bardziej wyraźny w grupie PI III w porównaniu z grupą PI IV. Obserwacja ta sugeruje, że częstotliwość dawkowania ceruleiny może służyć jako główny czynnik przyczyniający się do uszkodzenia trzustki, podczas gdy LPS nasila jego progresję, prowadząc do ogólnoustrojowego uszkodzenia stanu zapalnego^18,21. HMGB-1 jest białkiem, które funkcjonuje w zależności od swojego położenia²². Zewnątrzkomórkowy HMGB-1 działa jako białko biorące udział w sygnałach ostrzegawczych stanu zapalnego i jest ściśle związane z nasileniem ostrego zapalenia trzustki 23,24,25. W tym badaniu poziomy HMGB-1 w surowicy u myszy ze wszystkich grup eksperymentalnych były znacznie wyższe w porównaniu z grupą kontrolną, przy czym grupa PI V wykazała najbardziej znaczący wzrost. Eksperymenty immunohistochemiczne i elektroforeza białek również potwierdziły wysoką ekspresję HMGB-1 w tkance trzustki. To ważne białko może służyć jako cel terapeutyczny do hamowania burzy zapalnej w ciężkim ostrym zapaleniu trzustki.

Podsumowując, kluczowe jest opracowanie nieinwazyjnego, prostego i łatwego do wykonania modelu SAP u myszy. W tym protokole eksperymentalnym indukcja uszkodzenia trzustki za pomocą ceruleiny w połączeniu z LPS jest niezawodna i skuteczna. Podając Caeruleinę dootrzewnowo przez dziesięć kolejnych dni w dawce 50 μg/kg, a następnie pojedyncze wstrzyknięcie dootrzewnowe 15 mg/kg LPS, można ustalić stabilny, niezawodny, opłacalny i wydajny model zwierzęcy SAP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
20 i razy; Roztwór naprawczy antygenu kwasu cytrynowego (pH 6,0)	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G1202-250 ml
Amylase	Mindray, Chiny
Aneksin V-FITC/PI	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G1511	rozcieńczony w stosunku 1:20
Anty-HMGB1 Rabbit pAB	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	GB11103	rozcieńczony w stosunku 1:1800
zestaw do ilościowego wykrywania białka BCA	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G2026-200T
BD FACSCanto II Cytometr przepływowy	BD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USA	BD FACSCanto II
BSA	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	GC305010-100g
C57BL/6J	Cavion Experimental Animal Co., Changzhou, Chiny		numer licencji SCXY (Su) 2011– 0003
Ceruletide	MCE, New Jersey, Stany Zjednoczone	17650-98-5	50 &mikro; g/kg
Chemiluminescencyjny aparat	do obrazowania Cytiva CO., LTD.; USA
Roztwór naprawczy antygenu kwasu cytrynowego (suchy proszek pH 6,0)	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G1201-5 L
Kolagenaza IV	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	GC305014	0,5 mg/mL
DAB (SA-HRP) Zestaw do wykrywania apoptozy komórek tunelowych	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G1507-100 T
Dimension EXL ze zintegrowanym systemem chemicznym LM	Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Brookfield, USA	YZB/USA 8311-2014
Deweloper ECL	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny
Barwnik eozyny (rozpuszczalny w alkoholu)	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G1001-100 ml
EthoVision XT	Noldus, Holandia
IgG przeciw królikom z oznaczeniem FITC	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	GB22303	rozcieńczony w stosunku 1:50
W pełni automatyczny analizator komórek krwi	Zybio Inc. Chiny	Zybio-Z3 CRP
GapDH	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	GB11103	rozcieńczony w stosunku 1:1500
Niebieski roztwór powrotny Hematoksyliny	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G1040-500 ml
roztwór różnicujący hematoksylinę	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G1039-500 ml
Barwnik hematoksyliny	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G1004-100 ml
Zestawy HMGB-1 ELISA	njjcbio Co., Ltd, Chiny
HOMOGENIZATOR	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	KZ-III-F;
IgG kozy przeciw królikom znakowanym przez HRP	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	GB23303	rozcieńczone w stosunku 1:1500
Zestawy IL-6 ELISA	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	GEM0001
Lipase	Mindray,Chiny
Lipopolisacharyd	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	GC205009	15 mg / kg
Wirówka wysokoobrotowa o niskiej temperaturze	Changsha Pingfan Apparatus & Instrument Co., Ltd., Chiny	TGL-20M
Płyn do łamania membrany	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G1204
mikrotom	Jinhua Craftek Instrument Co., Ltd.; Chiny	CR-601ST
Siatka nylonowa	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny		200-mesh
Jednoetapowy zestaw do wykrywania apoptozy komórek TUNEL (metoda barwienia DAB)	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G1507-100T
Maszyna do zatapiania tkanek parafinowych	PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; Changzhou, Chiny	PBM-A
Patologiczny aparat do suszenia tkanek	PRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; Changzhou, Chiny	PHY-III
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G4202-100ML
PMSF	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G2008-1 ml
Mikroskop fluorescencji dodatniej	Olympus Corporation, Tokio, Japonia	BX53
Pro Kalcytonina	Mindray, Chiny
Membrana PVDF	Millipore, USA		0,22 &mikro; m
RIPA	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	G2002-100 ml
SDS-PAGE	Beyotime Biotechnology, Chiny	P0012A
TNF-α Zestawy ELISA	Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny	GEM0004
Ultradźwiękowa kąpiel wodna	DONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO., LTD.; Chiny	KQ-200KDE
Western Blot	Bio-Rad Laboratories, Inc., USA
Western blot imaging System	Global Life Sciences IP Holdco LLC, JAPONIA	Amersham ImageQuant 800
Mikser Whirlpool	SCILOGEX; USA