Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie mysiego modelu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki za pomocą kombinacji ceruleiny i lipopolisacharydu we wstrzyknięciu dootrzewnowym

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66780

⸱

10 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 2Medical College of Anhui University of Science & Technology, 3Endocrinology Department, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 4Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Dootrzewnowe podawanie leków jest bezpiecznym i skutecznym nieinwazyjnym sposobem na wywołanie uszkodzenia trzustki. W badaniu tym porównano pięć różnych protokołów wstrzyknięć dootrzewnowych na myszach w celu wywołania różnego stopnia uszkodzenia trzustki i ustanowiono model ciężkiego uszkodzenia trzustki w celu zbadania zmian patologicznych i strategii leczenia ciężkiego ostrego zapalenia trzustki (SAP).

Streszczenie

Leczenie ciężkiego ostrego zapalenia trzustki (SAP), z wysoką śmiertelnością, stanowi poważne wyzwanie kliniczne. Badanie zmian patologicznych związanych z SAP przy użyciu modeli zwierzęcych może pomóc w identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych i odkrywaniu nowych podejść terapeutycznych. Wcześniejsze badania indukowały przede wszystkim uszkodzenie trzustki poprzez wsteczne wstrzyknięcie taviaurocholanu sodu do dróg żółciowych, ale wpływ uszkodzeń chirurgicznych na jakość modelu zwierzęcego pozostaje niejasny. W tym badaniu zastosowaliśmy różne częstotliwości dootrzewnowych wstrzyknięć ceruleiny w połączeniu z różnymi dawkami LPS w celu wywołania uszkodzenia trzustki u myszy C57BL / 6J i porównaliśmy zakres urazu w pięciu protokołach wstrzyknięć dootrzewnowych. Jeśli chodzi o wywoływanie ostrego zapalenia trzustki u myszy, proponuje się protokół wstrzyknięcia dootrzewnowego, który powoduje śmiertelność nawet 80% w ciągu 5 dni. W szczególności myszy otrzymywały dziesięć codziennych wstrzyknięć dootrzewnowych Caeruleiny (50 μg/kg), a następnie wstrzyknięcie LPS (15 mg/kg) godzinę po ostatnim podaniu Caeruleiny. Dostosowując częstotliwość i dawkę wstrzykiwanych leków, można skutecznie manipulować ciężkością uszkodzenia trzustki. Model ten wykazuje dużą sterowalność i ma krótki cykl replikacji, dzięki czemu jest możliwy do wykonania przez jednego badacza bez konieczności posiadania drogiego sprzętu. Wygodnie i dokładnie symuluje kluczowe cechy choroby obserwowane w ludzkim SAP, wykazując jednocześnie wysoki stopień odtwarzalności.

Wprowadzenie

Ciężkie ostre zapalenie trzustki charakteryzuje się szybkim początkiem, szybkim postępem i wysoką śmiertelnością w obrębie choroby układu pokarmowego1. Jego wysoka śmiertelność zawsze była głównym przedmiotem badań klinicznych. Ze względu na nieprzewidywalne zmiany w warunkach klinicznych, niejednorodność objawów choroby i ograniczoną dostępność próbek ludzkich, tworzenie modeli zwierzęcych staje się coraz ważniejsze dla badań nad chorobami.

Wsteczne wstrzyknięcie taurocholanu sodu do wspólnego przewodu żółciowego jest powszechnie używane do stworzenia szczurzego modelu klasy SAP2. Symulując niedrożność trzustki i dróg żółciowych oraz wywołując refluks żółci i płynu trzustkowego, ta technika modelowania wykazuje wysoki wskaźnik sukcesu w replikacji modeli zwierzęcych SAP. Należy jednak zauważyć, że chirurgia inwazyjna ma wpływ na sam model zwierzęcy. Co więcej, metoda ta jest ograniczona do większych zwierząt, takich jak szczury i psy, które są wykorzystywane głównie jako obiekty eksperymentalne. Alternatywne techniki, w tym intubacja dwunastnicy3, bezpośrednie nakłucie dwunastnicy4 oraz bezpośrednie nakłucie przewodu żółciowego-trzustkowego5, są często wykorzystywane do celów modelowania.

Metody iniekcji dootrzewnowej i modelowania diety oferują nieinwazyjne korzyści, które można zastosować do zwierząt dowolnej wielkości. Mysi model SAP indukowany przez podawanie etyoniny z niedoborem choliny (CDE)6 przedstawia pewne komplikacje, takie jak słabo kontrolowana hiperglikemia i hipokalcemia, co czyni go nieodpowiednim do oceny nowych podejść diagnostycznych i terapeutycznych. Z drugiej strony, dootrzewnowe wstrzyknięcie ceruleiny w połączeniu z L-arginininą7 stanowi najczęściej stosowaną metodę wywoływania ostrego zapalenia trzustki u myszy. W szczególności, wielokrotne dootrzewnowe podawanie ceruleiny - analogu cholecystokininy - stanowi bardzo odpowiednie podejście do badania różnych aspektów związanych z tą destrukcyjną chorobą, w tym patogenezy, stanu zapalnego i procesów regeneracji. Ze względu na swoje strukturalne podobieństwo do cholecystokininy (CCK), ceruleina skutecznie stymuluje skurcz pęcherzyka żółciowego i wydzielanie enzymów trzustkowych, co prowadzi do zaburzenia równowagi w wydzielaniu enzymów, a następnie do samozniszczenia8. Lipopolisacharyd (LPS), wszechobecny i szeroko badany jako cząsteczka molekularna związana z patogenem, może być łączony z ceruleiną poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe w celu stworzenia skutecznego mysiego modelu SAP. Ta kombinacja szybko wyzwala i uwalnia znaczną liczbę cytokin zapalnych, co skutkuje nadmiernym stanem zapalnym miejscowym i ogólnoustrojowym. W kilku badaniach wykazano indukcję modeli SAP u myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ceruleiny w połączeniu z LPS. Można to przypisać faktowi, że dootrzewnowe wstrzyknięcie Caeruleiny może spowodować obrzęk trzustki i krwotok u myszy, podczas gdy dodanie LPS może natychmiast wywołać martwicę trzustki i zaostrzyć ogólnoustrojową odpowiedź zapalną, posocznicę, a nawet niewydolność narządów. Obecnie występują różnice w dawkowaniu i częstości dootrzewnowych wstrzyknięć ceruleiny, a także niespójność w dodatkowych dawkach LPS. Osiągnięcie spójności w mysich modelach SAP jest wyzwaniem9,10,11,12; Dlatego konieczne jest ustalenie ustandaryzowanego protokołu w celu uzyskania idealnego modelu. W tym artykule opisujemy protokół wstrzykiwania dootrzewnowego u myszy i badamy optymalną częstotliwość wstrzykiwań i dodatkową dawkę LPS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół został sprawdzony i zatwierdzony przez Komisję Etyki w Pierwszym Szpitalu Stowarzyszonym Uniwersytetu Nauki i Technologii Anhui (Huainan, Chiny) (Kodeks Etyczny: 2023-KY-905-001). Badanie było zgodne z Polityką Publicznej Służby Zdrowia lub Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych oraz wykorzystywania gryzoni badawczych we wszystkich procedurach na zwierzętach. Do niniejszego badania wykorzystano dorosłe myszy C57BL/6J (6–8 tygodniowe, samce) o wadze 20-30 g. Myszy trzymano w laboratorium zwierzęcym przez tydzień w kontrolowanych warunkach (około 21 °C z 12-godzinnym naprzemiennym cyklem dnia i nocy). Myszy miały dostęp ad libitum do pożywienia i wody przez cały czas. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Przypisz 84 zdrowe myszy C57BL/6J do sześciu grup, w tym grupy kontrolnej, Uszkodzenie trzustki (PI) I, PI II, PI III, PI IV i PI V.
  2. Przed rozpoczęciem procedury modelowania oznacz każdą grupę myszy nacięciami na uszy i pozwól im pościć przez 12 godzin.

2. Przygotowanie indukowanego rozcieńczalnika do leków

  1. Rozpuścić ceruleinę (1 mg) w 1 ml PBS i przechowywać w lodówce w temperaturze -20 °C.
  2. Zmierz i zapisz masę myszy doświadczalnych 1 godzinę przed dootrzewnowym wstrzyknięciem leku.
  3. Ekstrahować całkowitą masę ceruleiny w stosunku 50 μg/kg, w oparciu o całkowitą masę wszystkich myszy.
  4. Otrzymany lek Caeruleina należy ponownie rozcieńczyć PBS.
    UWAGA: Całkowita objętość rozcieńczenia PBS powinna być równa 5-krotności całkowitej wartości masy wszystkich myszy. Przed użyciem upewnij się, że zarówno LPS, jak i PBS są sterylne. Wykonaj wszystkie czynności przygotowawcze w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować sterylność. Przed wstrzyknięciem należy przechowywać roztwór w sterylnych, szczelnie zamkniętych pojemnikach, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

3. Wstrzyknięcie dootrzewnowe

UWAGA: Każdej grupie myszy podawano zastrzyki dootrzewnowe zgodnie z protokołem opisanym w Tabeli Uzupełniającej 1 w celu wywołania modelu. Dodatkowe 10 myszy pogrupowano i poddano leczeniu, aby obserwować 7-dniowe wskaźniki przeżycia. Przez cały czas trwania eksperymentu humanitarne punkty końcowe były dokładnie monitorowane, aby zapewnić zgodność z przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Eutanazja zostanie przeprowadzona, gdy spełnione zostaną określone kryteria, w tym zmniejszenie masy ciała o 30-50%, silny letarg lub znaczne upośledzenie ruchomości. Wskaźniki te posłużą jako podstawa humanitarnej interwencji w celu zminimalizowania cierpienia.

  1. Chwyć i trzymaj myszy w taki sposób, aby brzuch myszy był skierowany do góry, a głowa znajdowała się niżej niż ogon, aby zapobiec uszkodzeniu narządów podczas wkładania strzykawki.
  2. Zdezynfekuj brzuch myszy za pomocą wacików nasączonych alkoholem o stężeniu 75%.
  3. Trzymać strzykawkę w prawej ręce (za pomocą igły o wymiarach ≤0,5/≥0,3) i wprowadzić igłę w skórę podskórną po lewej stronie białej linii na brzuchu.
    UWAGA: Zmienić na prawą stronę do następnego wstrzyknięcia.
  4. Gdy igła dotrze do warstwy podskórnej, przesuń ją do przodu o około 3-5 mm, a następnie wprowadź igłę strzykawki do jamy brzusznej pod kątem 45°. W tym momencie należy poczuć pewien opór.
  5. Trzymać igłę nieruchomo i powoli wstrzykiwać substancję.
    UWAGA: Maksymalna objętość nie przekracza 0,15 ml.
  6. Po wstrzyknięciu należy wyciągnąć igłę i delikatnie wmasować oraz docisnąć miejsce wstrzyknięcia sterylnym wacikiem, aby całkowicie rozprowadzić lek do jamy brzusznej myszy.
  7. Użyj nowej strzykawki, aby powtórzyć z następnymi eksperymentalnymi myszami.

4. Testy zdolności behawioralnych na otwartym polu

UWAGA: 12 godzin po ostatnim wstrzyknięciu dootrzewnowym przeprowadzono testy zdolności behawioralnych na otwartym polu, aby ocenić całkowity dystans aktywności i czas unieruchomienia myszy.

  1. Umieść cztery identyczne białe pola bezpośrednio pod kamerą.
  2. Podłącz aparat do komputera za pomocą wideo.
  3. Przed rozpoczęciem eksperymentu upewnij się, że pudełko eksperymentalne jest czyste i wolne od wszelkich zapachów.
  4. Umieść zwierzę na środku siatki, odwrócone tyłem do eksperymentatora i pozwól mu przystosować się do środowiska przez 10 minut.
  5. Uruchom oprogramowanie do śledzenia wideo i kliknij menu Plik, aby utworzyć nowy eksperyment.
  6. Skonfiguruj monitorowanie dla czterech jednoczesnych pól widzenia.
  7. Zaznacz długość i szerokość obiektu eksperymentalnego, który może poruszać się w pudełku na ekranie monitorowania w czasie rzeczywistym (30 cm × 30 cm).
  8. Po zakończeniu konfiguracji rozpocznij nadzór wideo i nagrywanie.
  9. Rejestruj aktywność myszy przez 15 minut.
  10. Po zakończeniu badania należy zdjąć zwierzę z siatki i umieścić je z powrotem w klatce. Dokładnie wyczyść kratkę za pomocą środka sterylizującego zawierającego dwutlenek chloru.

5. Pobieranie i badanie krwi obwodowej myszy

  1. Poddaj myszy eutanazji (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem).
    1. Przeprowadzić eutanazję na myszach doświadczalnych 36 godzin po wstrzyknięciu dootrzewnowym. Zmierz i zapisz masę ciała myszy przed eutanazją.
    2. Lewą ręką zabezpiecz myszy, a prawą ręką przytrzymaj nożyczki, aby przyciąć wąsy po jednej stronie myszy.
    3. Delikatnie uciskaj skórę wokół oka, aby wywołać przekrwienie i wysunięcie gałki ocznej.
    4. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby chwycić gałkę oczną i szybko ją usunąć, zbierając krew obwodową w probówce do mikrowirówki.
      UWAGA: Użyto dwóch różnych typów probówek do mikrowirówek, z których jedna zawierała antykoagulant, a druga bez.
    5. Jednocześnie lekko naciśnij obszar serca myszy środkowym palcem lewej ręki, aby zwiększyć prędkość pompowania serca.
  2. Pozostawić krew obwodową bez antykoagulantu w temperaturze pokojowej na 30 minut.
  3. Zmierzyć stężenia amylazy w surowicy (Amy) i lipazy (Lip) za pomocą automatycznego analizatora biochemicznego metodą szybkości enzymu i metodą krążenia enzymatycznego (zgodnie z instrukcjami producenta).
  4. Określ poziomy wskaźników stanu zapalnego, takich jak prokalcytonina (PCT) w osoczu, stosując metodę chemiluminescencyjną przy użyciu komercyjnego imagera chemiluminescencyjnego (zgodnie z instrukcjami producenta).
  5. Użyj zestawów ELISA do pomiaru poziomów HMGB-1, IL-6 i TNF-α w surowicy myszy (zgodnie z instrukcjami producenta).
  6. Przeanalizuj krew obwodową leczoną antykoagulantem za pomocą w pełni automatycznego analizatora komórek krwi, aby ocenić odpowiednie parametry.

6. Pobieranie tkanki trzustki i przygotowanie wycinka parafiny

  1. Umieść myszy w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz je na piankowej płytce.
  2. Ogol i zdezynfekuj obszar, a następnie wykonaj środkowe nacięcie brzucha i odwróć rurkę jelita cienkiego w prawo, aby całkowicie odsłonić trzustkę.
  3. Odłącz dwunastnicę i przewód odźwiernikowy i zlokalizuj jelito cienkie pod trzustką. Całkowicie uwolnij tkankę trzustki wzdłuż przewodu jelitowego.
  4. Użyj bezzębnych kleszczy, aby zacisnąć śledzionę i delikatnie pociągnij do góry.
    UWAGA: Nie dotykaj bezpośrednio tkanki trzustki i unikaj używania nadmiernej siły podczas całego procesu dysocjacji.
  5. Ostro wypreparuj tkankę więzadła trzustki tylnej aż do głowy trzustki i odłącz przewód żółciowy i naczynia krwionośne.
  6. Usunąć tkankę trzustkową, osuszyć powierzchnię wilgocią papierem chłonnym, zważyć i zarejestrować.
  7. Utrwalić połowę tkanki trzustki za pomocą 4% paraformaldehydu, a drugą połowę przechowywać w lodówce w temperaturze -80 °C.
  8. Przygotuj skrawki parafiny trzustkowej, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Oczyść utrwaloną tkankę trzustki 75% alkoholem i przytnij ją do rozmiaru około 0,5 cm × 0,5 cm.
    2. Zanurz tkankę w 70% etanolu na 20 minut, 80% etanolu na kolejne 20 minut i 90% etanolu na 15 minut.
    3. Za każdym razem traktuj tkankę 95% etanolem przez 15 minut, a następnie dwa razy 100% etanolem przez 5 minut za każdym razem.
    4. Poddaj tkankę dwóm rundom 12-minutowych i 5-minutowych zabiegów roztworem ksylenu w celu uzyskania przezroczystości.
    5. Przezroczystą chusteczkę namoczyć w woskowym zbiorniku w temperaturze 65 °C na 1 godzinę.
    6. Zanurz tkankę w stopionej parafinie i pozwól jej ostygnąć. Skrawki parafiny trzustkowej uzyskać za pomocą krajalnicy (grubość: 5 μm).
    7. Otrzymane plastry parafiny spłaszczyć w wodzie o temperaturze 45 °C, uformować i wysuszyć (warunki pieczenia: 40 °C przez 14-16 h).

7. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

  1. Skrawki parafiny trzustkowej umieścić w ksylenie I i II na 30 minut, następnie w bezwodnym, 95%, 85% i 75% alkoholu na 5 minut każdy, a ultraczystą wodę na 5 minut.
  2. Barwić jądro komórkowe hematoksyliną przez 160 s, a następnie powoli spłukiwać bieżącą wodą.
  3. Zastosuj roztwór alkoholu z kwasem solnym na 5-10 s, a następnie szybko spłucz bieżącą wodą.
  4. Traktuj skrawki bezwodnym alkoholem przez 5 minut.
  5. Inkubuj cytoplazmę z eozyną przez 30 s, a następnie spłucz bieżącą wodą.
  6. Zanurz sekcje w 75%, 85%, 95% i 100% etanolu na 10 s każda, a następnie potraktuj ksylenem przez 5 minut w celu odwodnienia.
  7. Na koniec uszczelnij sekcje neutralną żywicą i obserwuj pod mikroskopem.
  8. Wykonaj ocenę patologiczną i standardy13.
    UWAGA: Określ nasilenie zapalenia trzustki na podstawie wskaźników, takich jak obrzęk, martwica zrazików, krwawienie, krwotok i martwica tłuszczu oraz zapalenie zapalne i okołonaczyniowe. Skorzystaj z wcześniej opublikowanych wytycznych dotyczących implementacji scoring13.

8. Barwienie immunohistochemiczne

  1. Odparafinować zatopione w parafinie odcinki tkanki trzustki w ksylenie, a następnie ponownie je uwodnić w gradiencie roztworów etanolu.
  2. Przeprowadzić endogenną blokadę enzymów za pomocą 3%H2O2przez 20 minut po 30 minutowym zerwaniu błony.
  3. Zablokować przeciwciało 5% surowicą bydlęcą w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z rozcieńczeniem królika anty-HMGB1 w stosunku 1:1500.
  4. Przepłukać skrawki PBS, a następnie inkubować je w odpowiednich przeciwciałach drugorzędowych przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie przeprowadź opracowywanie koloru DAB, barwienie przeciwdziałające hematoksylinie i uszczelnij neutralną gumą.

9. Metoda TUNEL do wykrywania apoptozy w odcinkach trzustki

  1. Odparafinować skrawki parafiny trzustki w ksylenie przez 5 minut, powtórzyć dwukrotnie i przemyć gradientowym etanolem (100% przez 5 min, 90% przez 2 min, 70% przez 2 min i wodą destylowaną przez 2 min).
  2. Nadmiar płynu otaczającego skrawki parafiny zmyć za pomocą PBS. Potraktuj każdą próbkę 100 μl proteinazy K, zapewniając całkowite pokrycie tkanki. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie namocz próbki w PBS 3 razy, za każdym razem przez 5 min.
    UWAGA: Roztwór proteinazy K przygotowano przez rozcieńczenie oryginalnego roztworu proteinazy K (200 μg/ml) PBS w stosunku 1:9 (objętość), co dało końcowe stężenie 20 μg/ml, z wyłączeniem DNazy. Dokładne mycie proteinazy K jest niezbędne, aby uniknąć zakłóceń w późniejszych reakcjach znakowania.
  3. Dodać odpowiednią ilość 3% H2O2 (rozcieńczonego PBS) na tkankę, aby w pełni ją nacieknąć i inkubować przez 20 minut. Przepłukać tkankę PBS 3 razy po 5 minut.
    UWAGA: Skrawki parafiny powinny być wilgotne. Aby dezaktywować endogenne peroksydazy w tkance, czas inkubacji nie powinien być zbyt długi, aby zapobiec fałszywie dodatnim wynikom z powodu pęknięcia DNA spowodowanego przez 3%H2O2.
  4. Pokryć całą powierzchnię badanej próbki 50 μl buforu równoważącego i inkubować przez 10 minut.
  5. Usuń jak najwięcej bufora równowagi. Następnie dodać 56 μl buforu do inkubacji TdT do każdej próbki tkanki i inkubować przez 1 godzinę (w temperaturze pokojowe).
    UWAGA: Nie należy dopuścić do wyschnięcia szkiełka i unikać ekspozycji na światło. Bufor do inkubacji TdT został przygotowany zgodnie z instrukcjami producenta (Rekombinowany enzym TdT: Biotyna-dUTP Znakowanie Mix: Bufor równowagowy = 1 μL: 5 μL: 50 μL).
  6. Próbki tkanek należy natychmiast przemyć PBS. Opłucz je 4 razy po 5 minut. Delikatnie usunąć nadmiar roztworu PBS wokół próbek za pomocą bibuły filtracyjnej.
  7. Dodać 100 μl uprzednio rozcieńczonego roztworu reakcyjnego Streptawidyna-HRP (Streptawidyna-HRP: TBST = 1: 300) do każdej próbki tkanki do reakcji Streptawidyna-HRP. Inkubować przez 30 minut. Następnie umyj próbki PBS i przepłucz je 3 razy przez 5 minut każda.
  8. Barwienie DAB należy przeprowadzić, dodając 50 μl DAB do każdej sekcji parafiny. Obserwuj barwienie pod mikroskopem w czasie rzeczywistym. Po pojawieniu się pozytywnego zabarwienia natychmiast umieść szkiełka w wilgotnym pudełku. Zatrzymaj reakcję, myjąc ją czystą wodą.
  9. Zanurz szkiełka w roztworze barwiącym hematoksylinę na 3-5 minut, a następnie spłucz czystą wodą.
  10. Różnicować w roztworze różnicowania hematoksyliny przez około 2 s, a następnie natychmiast spłukać czystą wodą.
  11. Osiągnij niebieskie zabarwienie za pomocą roztworu do ponownego niebieszczenia hematoksyliny przez kilka sekund i spłucz szkiełka czystą wodą.
    UWAGA: Przeprowadź badanie mikroskopowe po barwieniu jądrowym. Jeśli zabarwienie jest zbyt ciemne, należy umieścić szkiełka z powrotem w roztworze różnicującym. Jeśli barwienie jest zbyt jasne, wznów proces barwienia od etapu barwienia jądrowego.
  12. Odwodnić próbki za pomocą 4 rund świeżego bezwodnego etanolu przez 5 minut każdy. Następnie moczymy je w butanolu przez 5 minut, a w ksylenie przez 5 minut. Na koniec użyj świeżego ksylenu przez kolejne 5 minut.
  13. Zamontuj prowadnice za pomocą neutralnej gumy. Pozostaw je do naturalnego wyschnięcia na powietrzu lub wysusz w piekarniku o temperaturze 60 °C.
  14. Wykonaj badanie histologiczne przy użyciu mikroskopu światła białego. Jądra apoptotyczne będą brązowe.
  15. Oblicz odpowiedni indeks apoptotyczny (AI).
    UWAGA: Obserwuj slajdy w sposób podwójnie ślepy. Na slajdach TUNEL-dodatnich losowo wybierz 5 dodatnich obszarów w dużym powiększeniu (400x) i policz co najmniej 100 komórek groniastych w każdym obszarze, aby określić procent komórek dodatnich. AI = (całkowita liczba komórek apoptotycznych/całkowita liczba komórek) × 100%.

10. Cytometria przepływowa

  1. Pobrać świeże tkanki trzustki i dokładnie je umyć po perfuzji PBS.
  2. Przygotuj 0,5% roztwór do wytrawiania kolagenazy dożylnie i użyj sterylnych nożyczek do tkanek, aby odpowiednio strawić tkanki trzustki.
  3. Dodać 5% roztwór kończący trawienie BSA w zależności od stanu fragmentów trzustki i zmętnienia płynu, a następnie odwirować mieszaninę w niskiej temperaturze przez 5 minut (~300 x g, 4 °C).
  4. Odrzucić sklarowany osad w celu zakończenia trawienia.
  5. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej zawierającą fluorek fenylometanu sulfonylu (PMSF) i 2,5% zawiesinę płodowych komórek surowicy bydlęcej w celu ponownego zawieszenia komórek trzustki.
  6. Przefiltruj zawiesiny komórek groniastych trzustki przez nylonową siatkę o oczkach 200, aby uzyskać zawiesiny komórek przez filtrowanie komórek.
  7. Odwirować zawiesinę komórek groniastych trzustki w niskiej temperaturze (postępuj zgodnie z warunkami opisanymi w kroku 10.3).
  8. Odrzucić supernatant.
  9. Umyj komórki wstępnie schłodzonym PBS.
  10. Delikatnie zawiesić komórki we wstępnie schłodzonym buforze wiążącym 1x poprzez odśrodkowe zawieszenie.
  11. Oznaczyć komórki zrazikowane trzustki aneksyną V-FITC/PI zgodnie z instrukcjami producenta po dostosowaniu stężenia komórek.
  12. Użyj cytometrii przepływowej w ciągu 1 godziny, aby wykryć apoptozę w komórkach groniastych trzustki.

11. Wykrywanie Western blot kaspazy-3 i HMGB-1

  1. Wyekstrahuj białko trzustki.
    1. Wyekstrahuj 50 mg tkanki trzustki i pokrój ją na małe fragmenty.
    2. Dodać 1 ml buforu do lizy RIPA (zawierającego PMSF i fosforylowany inhibitor proteazy).
    3. Homogenizuj tkankę trzustki na lodzie przez 5 minut za pomocą młynka elektrycznego.
    4. Inkubować homogenizowaną tkankę na lodzie, delikatnie wstrząsając przez 2 godziny.
    5. Odwirować homogenat w temperaturze 4 °C przez 10 minut przy 4 500 x g.
    6. Zebrać roztwór sklarowanego osadu i przechowywać go w temperaturze -80 °C.
  2. Przeprowadzić kwantyfikację białka.
    1. Rozcieńczyć pewną objętość próbki wzorcowej BSA (25 mg/ml) do stężenia 0,5 mg/ml.
    2. Przygotuj określoną ilość roztworu roboczego BCA, mieszając 50 objętości roztworu BCA A z 1 objętością roztworu BCA B, zapewniając dokładne i równomierne wymieszanie.
    3. Umieścić próbkę wzorcową BSA w standardowych otworach na próbkę na płytce 96-dołkowej w kolejności 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 i 20 μl. Zrównoważyć objętość każdego otworu wodą destylowaną, tak aby całkowita objętość wynosiła 20 μl.
    4. Dodać 2 μl próbek do otworów na próbki, a następnie kolejno dodać 18 μl wody destylowanej do rozcieńczenia (1:9).
    5. Napełnij każdą studzienkę 200 μl roztworu roboczego BCA i pozostaw w temperaturze 37 °C na około 20-30 minut.
    6. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 562 nm. Obliczyć stężenie białka w próbkach na podstawie krzywej wzorcowej.
    7. Dodać określoną objętość roztworu do krakingu RIPA i buforu rozcieńczającego w celu rozcieńczenia próbek, aż stężenie osiągnie 5-10 μg/μl, co uważa się za właściwe.
    8. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C po denaturacji białka (100 °C; 10 min).
  3. Wykonaj Western blot.
    1. Przygotuj się na SDS-PAGE.
      1. Zamontuj formy do produkcji kleju i sprawdź ich szczelność.
      2. Dodaj TEMED do 10% kleju separacyjnego i równomiernie wymieszaj.
      3. Wstrzyknij mieszaninę do formy, stanowiąc około dwóch trzecich objętości, unikając pęcherzyków.
      4. Dodaj izopropanol do formy i dociskaj klej przez około 40 min.
      5. Użyj tego samego programu, aby skonfigurować 5% skoncentrowany klej.
      6. Wylej izopropanol i natychmiast dodaj klej.
      7. Umieść grzebień pionowo, aż klej całkowicie się spolimeryzuje.
    2. Wykonaj operację elektroforezy.
      1. Dodać próbkę, która ma być badana, w oczekiwanej eksperymentalnej kolejności kontrolnej, w odwrotnej kolejności, do otworów do pobierania próbek kleju SDS-PAGE.
      2. Jednocześnie dodaj Znacznik Białka, aby określić lokalizację białka docelowego i wewnętrznego białka odniesienia.
      3. Umieścić próbkę w zbiorniku do elektroforezy po zakończeniu dodawania próbki.
      4. Początkowo uruchom przy napięciu 80 V przez 30 minut, a następnie uruchom żel, aby oddzielić białko pod napięciem 100 V przez 60 minut
        UWAGA: Należy zwrócić uwagę na położenie błękitu bromofenolowego, aby uniknąć nadmiernej elektroforezy.
    3. Wykonaj transfer białka.
      1. Wytnij folię PVDF w prawym górnym rogu, aby służyła jako znak.
      2. Umieść folię PVDF w roztworze metanolu na 5-10 sekund w celu aktywacji.
      3. Namocz folię PVDF w buforze do elektroforezy na około 15 minut.
      4. Ostrożnie usuń żel po elektroforezie i odetnij nadmiar żelu, upewniając się, że żel pozostaje mokry przez cały proces.
      5. Zamontuj szynę w następującej kolejności: płyta ujemna → gąbka → trzy warstwy bibuły filtracyjnej → żelu → folii PVDF → trzy warstwy bibuły filtracyjnej → gąbki → płytą dodatnią.
        UWAGA: Upewnij się, że między żelem a folią PVDF nie ma pęcherzyków powietrza.
      6. Umieść zmontowany zacisk w mokrym rowku obrotowym (od czarnego do czarnego) z kostkami lodu umieszczonymi wokół niego.
      7. Włącz zasilanie i rozpocznij przesyłanie filmu pod ciśnieniem 400 mA przez 100 minut.
    4. Wykonaj uszczelnianie folii PVDF i inkubację przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.
      1. Po przeniesieniu delikatnie usuń folię PVDF i płucz TBST przez 10 minut, powtarzając proces 3-5 razy.
      2. Zgrzej folię PVDF w 5% odtłuszczonym mleku na 2 godziny.
      3. Usuń folię PVDF i płucz TBST przez 10 minut, powtarzając proces 4 razy.
      4. Umieścić folię PVDF i rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe w lodówce w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając, i inkubować przez noc.
      5. Następnego dnia usuń folię PVDF i płucz TBST przez 10 minut, powtarzając proces 4 razy.
      6. Inkubować folię PVDF w rozcieńczalniku przeciwciał wtórnych znakowanym HRP przez około 2 godziny.
      7. Płucz folię PVDF TBST przez 10 minut, powtarzając proces 4 razy.
    5. Naświetl film i przeanalizuj go.
      1. Przygotowany roztwór ECL nanieść równomiernie na folię.
      2. Naświetl film w ciemnym pomieszczeniu za pomocą światłomierza przez około 2-3 minuty, a następnie przechowuj go.
      3. Przeprowadź analizę za pomocą oprogramowania do obrazowania J.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Proces eksperymentalnego modelowania na myszach przedstawiono na Rysunku 1. Po 12 h od zakończenia wstrzykiwania użyto rejestratora wideo w polu otwartym (open-field), aby monitorować dystans ruchu i czas unieruchomienia różnych grup eksperymentalnych myszy przez 5 cykli (Rysunek 2A). W ciągu 5 cykli myszy w grupie PI V utrzymywały niski poziom dystansu ruchu w ciągu 3 min, podczas gdy stosunek unieruchomienia w ciągu 3 min zwiększał się z każd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecnie brakuje skutecznych środków poprawiających wysoką śmiertelność u pacjentów z ciężkim ostrym zapaleniem trzustki. Kluczowe znaczenie ma zbadanie skuteczności leków we wzmacnianiu mechanizmów stabilności immunologicznej. Istnieje pilna potrzeba stworzenia idealnego modelu zwierzęcego dla ciężkiego ostrego zapalenia trzustki. Myszy z pochodzeniem genetycznym C57BL/6J są szeroko stosowane w badaniach biomedycznych, w tym w badaniach nad patofizjologią SAP. Ponad 70 lat różnicowania genetycznego u myszy B6J spowodował...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Projekty Badawcze w Dziedzinie Zdrowia i Nauk Medycznych w mieście Huainan (No. HNWJ2023005); Miejski program przewodnickiego planu naukowo-technologicznego w mieście Huainan (nr 2023151); Program szkoleniowy dla studentów Innowacyjności i Przedsiębiorczości Kolegium Prowincji Anhui (nr S202310361254); dziewiąta partia zespołów innowacyjnych "50·Stars of Science and Technology" w mieście Huainan i projekcie budowy kluczowej specjalizacji klinicznej prowincji Anhui. Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność Działowi Laboratoryjnemu Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Nauki i Technologii w Anhui za dostarczenie odpowiednich danych testowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20 i razy; Roztwór naprawczy antygenu kwasu cytrynowego (pH 6,0)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyG1202-250 ml
AmylaseMindray, Chiny
Aneksin V-FITC/PIWuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny  G1511  rozcieńczony w stosunku 1:20
Anty-HMGB1 Rabbit pABWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyGB11103  rozcieńczony w stosunku 1:1800
zestaw do ilościowego wykrywania białka BCAWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyG2026-200T
BD FACSCanto II Cytometr przepływowyBD Life Sciences, San Jose, CA, 95131, USABD FACSCanto II
BSAWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyGC305010-100g
C57BL/6JCavion Experimental Animal Co., Changzhou, Chinynumer licencji SCXY (Su) 2011– 0003
Ceruletide  MCE, New Jersey, Stany Zjednoczone17650-98-5 50 &mikro; g/kg
Chemiluminescencyjny aparatdo obrazowania Cytiva CO., LTD.; USA
Roztwór naprawczy antygenu kwasu cytrynowego (suchy proszek pH 6,0)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyG1201-5 L
Kolagenaza IVWuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny  GC3050140,5 mg/mL
DAB (SA-HRP) Zestaw do wykrywania apoptozy komórek tunelowychWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyG1507-100 T
Dimension EXL ze zintegrowanym systemem chemicznym LMSiemens Healthcare Diagnostics Inc. Brookfield, USAYZB/USA 8311-2014
Deweloper ECLWuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny
Barwnik eozyny (rozpuszczalny w alkoholu)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyG1001-100 ml
EthoVision XT  Noldus, Holandia
IgG przeciw królikom z oznaczeniem FITCWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyGB22303  rozcieńczony w stosunku 1:50
W pełni automatyczny analizator komórek krwiZybio Inc. Chiny  Zybio-Z3 CRP
GapDHWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyGB11103  rozcieńczony w stosunku 1:1500
Niebieski roztwór powrotny HematoksylinyWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyG1040-500 ml
roztwór różnicujący hematoksylinęWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyG1039-500 ml
Barwnik hematoksylinyWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyG1004-100 ml
Zestawy HMGB-1 ELISAnjjcbio Co., Ltd, Chiny
HOMOGENIZATORWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyKZ-III-F;
IgG kozy przeciw królikom znakowanym przez HRPWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyGB23303  rozcieńczone w stosunku 1:1500
Zestawy IL-6 ELISAWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyGEM0001
Lipase Mindray,Chiny
Lipopolisacharyd Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyGC20500915 mg / kg
Wirówka wysokoobrotowa o niskiej temperaturzeChangsha Pingfan Apparatus & Instrument Co., Ltd., ChinyTGL-20M
Płyn do łamania membranyWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyG1204
mikrotomJinhua Craftek Instrument Co., Ltd.; ChinyCR-601ST
Siatka nylonowaWuhan servicebio Technology Co., Ltd, Chiny200-mesh
Jednoetapowy zestaw do wykrywania apoptozy komórek TUNEL (metoda barwienia DAB)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyG1507-100T
Maszyna do zatapiania tkanek parafinowychPRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; Changzhou, ChinyPBM-A
Patologiczny aparat do suszenia tkanekPRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; Changzhou, ChinyPHY-III
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyG4202-100ML
PMSFWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyG2008-1 ml
Mikroskop fluorescencji dodatniejOlympus Corporation, Tokio, JaponiaBX53
Pro KalcytoninaMindray, Chiny
Membrana PVDFMillipore, USA0,22 &mikro; m
RIPAWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyG2002-100 ml
SDS-PAGEBeyotime Biotechnology, ChinyP0012A
TNF-α Zestawy ELISAWuhan servicebio Technology Co., Ltd, ChinyGEM0004
Ultradźwiękowa kąpiel wodnaDONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO., LTD.; ChinyKQ-200KDE
Western BlotBio-Rad Laboratories, Inc., USA
Western blot imaging SystemGlobal Life Sciences IP Holdco LLC, JAPONIAAmersham ImageQuant 800 
Mikser WhirlpoolSCILOGEX; USA
IC111150 100222

Bibliografia

  1. Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. Management of severe acute pancreatitis: An update. Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).
  2. Duan, F., et al. GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis through modulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the TGFbetaR1/SMAD-2 pathway. Int Immunopharmacol. 108, 108777(2022).
  3. Zhang, X. P., et al. Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 13 (34), 4566-4573 (2007).
  4. Bluth, M. H., Patel, S. A., Dieckgraefe, B. K., Okamoto, H., Zenilman, M. E. Pancreatic regenerating protein (reg I) and reg I receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 12 (28), 4511-4516 (2006).
  5. Qiu, F., Lu, X. S., Huang, Y. K. Effect of low molecular weight heparin on pancreatic micro-circulation in severe acute pancreatitis in a rodent model. Chin Med J (Engl). 120 (24), 2260-2263 (2007).
  6. Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet. Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).
  7. Liu, Y., et al. Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity. Cell Death Dis. 8 (3), e2685(2017).
  8. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88, 5 Pt 1 1192-1204 (1985).
  9. Zhou, X., et al. DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling. Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754(2019).
  10. Yang, J., et al. Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages. Polymers (Basel). 14 (12), 2470(2022).
  11. Kong, L., et al. Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury. Cell Death Dis. 12 (10), 928(2021).
  12. Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
  13. Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).
  14. Luo, C., et al. Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway. Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).
  15. Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium. Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).
  16. Wan, J., et al. Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice. JCI Insight. 6 (17), e132585(2021).
  17. Sah, R. P., et al. Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice. Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).
  18. Wang, K., et al. Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models. Cell Death Discov. 9 (1), 363(2023).
  19. Jin, C., Li, J. C. Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism. Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).
  20. Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
  21. Roy, R. V., et al. Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis. Cancer Lett. 578, 216455(2023).
  22. Chen, R., Kang, R., Tang, D. The mechanism of HMGB1 secretion and release. Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).
  23. Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. Release mechanisms of major DAMPs. Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).
  24. Liu, T., et al. Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis. Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).
  25. Li, N., Wang, B. M., Cai, S., Liu, P. L. The role of serum high mobility Group Box 1 and Interleukin-6 levels in acute pancreatitis: A meta-analysis. J Cell Biochem. 119 (1), 616-624 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Iniekcja caeruleinyiniekcja lipopolisacharyduuszkodzenie trzustkibarwienie TUNELcytometria przepłyewowaekspresja kaspazy-3badanie histologiczne
Przygotowanie mysiego modelu ciężkiego ostrego zapalenia trzustki za pomocą kombinacji ceruleiny i lipopolisacharydu we wstrzyknięciu dootrzewnowym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.