Artykuł metodologiczny

Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66784

⸱

3 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Research Institute, AdventHealth, 2Steno Diabetes Center Copenhagen, 3Division of Endocrinology and Metabolism, University of Pittsburgh, 4Gerontology and Geriatric Medicine, Wake Forest University School of Medicine, 5Department of Internal Medicine - Rheumatology, Allergy, and Clinical Immunology, University of California Davis Health

W tym artykule

Podsumowanie

Biologia międzymięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) jest w dużej mierze niezbadana ze względu na ograniczoną dostępność tkanek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji jąder i przygotowania biblioteki zamrożonego ludzkiego IMAT do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w celu identyfikacji składu komórkowego tego unikalnego magazynu tłuszczu.

Streszczenie

Międzymięśniowa tkanka tłuszczowa (IMAT) to stosunkowo słabo zbadany magazyn tkanki tłuszczowej znajdujący się pomiędzy włóknami mięśniowymi. Zawartość IMAT wzrasta wraz z wiekiem i BMI i jest związana z chorobami metabolicznymi i zwyrodnieniowymi mięśni; jednak poważnie brakuje zrozumienia właściwości biologicznych IMAT i jego interakcji z otaczającymi włóknami mięśniowymi. W ostatnich latach sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i jąder dostarczyło nam atlasów specyficznych dla typu komórki kilku tkanek ludzkich. Jednak skład komórkowy ludzkiego IMAT pozostaje w dużej mierze niezbadany ze względu na nieodłączne wyzwania związane z jego dostępnością z biopsji pobranej u ludzi. Oprócz ograniczonej ilości pobranej tkanki, przetwarzanie ludzkiego IMAT jest skomplikowane ze względu na jego bliskość do tkanki mięśni szkieletowych i powięzi. Obciążony lipidami charakter adipocytów sprawia, że jest on niezgodny z izolacją pojedynczych komórek. W związku z tym sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder jest optymalne do uzyskania wielowymiarowej transkryptomiki w rozdzielczości pojedynczej komórki i zapewnia potencjał do odkrycia biologii tego magazynu, w tym dokładnego składu komórkowego IMAT. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowy protokół izolacji jąder i przygotowania biblioteki zamrożonego ludzkiego IMAT do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder. Protokół ten pozwala na profilowanie tysięcy jąder przy użyciu podejścia kropelkowego, zapewniając w ten sposób możliwość wykrywania rzadkich i mało obfitych typów komórek.

Wprowadzenie

Tkanka tłuszczowa wewnątrzmięśniowa (IMAT) jest ektopowym depotem tłuszczowym znajdującym się pomiędzy włóknami mięśniowymi i wokół nich1. Jak szczegółowo opisano w niedawnym przeglądzie Goodpaster i wsp., IMAT można wykryć za pomocą wysokorozdzielczej tomografii komputerowej (CT) oraz obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) (Rycina 1A,B) i występuje ona wokół oraz wewnątrz włókien mięśniowych w całym organizmie1. Ilość IMAT znacznie różni się między osobnikami i jest zależna od BMI, wieku, płci, rasy oraz siedzącego trybu życia2,3,4. Co więcej, odkładanie się IMAT jest powszechnie obserwowane w stanach patologicznych związanych z degeneracją mięśni5, a liczne badania udokumentowały zwiększoną masę IMAT u osób z otyłością, cukrzycą typu 2, zespołem metabolicznym i insulinoopornością6,7,8,9. Niemniej jednak, właściwości komórkowe i biologiczne IMAT są dopiero na początku procesu odkrywania. Ograniczona dostępność oraz zmienność lokalizacji i zawartości IMAT w całym organizmie utrudniały pobieranie próbek z tego unikalnego depotu tłuszczowego2. Ponadto próbki są łatwo „zanieczyszczane” mięśniami szkieletowymi (SM) podczas pobierania, co sprawia, że rozróżnienie wkładu biologicznego różnych tkanek jest trudne do ustalenia (Rycina 1C). W związku z tym sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder (snRNA-seq), które zyskało znaczną uwagę w ciągu ostatniej dekady, stanowi idealną metodologię pozwalającą na oddzielenie wzorców ekspresji genów pochodzących z IMAT i SM z rozdzielczością pojedynczej komórki. Co więcej, izolacja jąder jest szczególnie użyteczna w przypadku tkanki tłuszczowej ze względu na duże, wypełnione lipidami adipocyty, których nie da się rozdzielić do zawiesiny pojedynczych komórek bez naruszenia integralności komórek. Wreszcie, technologia ta daje potencjał do odkrycia nowych markerów adipocytów specyficznych dla IMAT i ujawnienia składu oraz obecności różnych populacji komórek progenitorowych, a także do badania zmienności składu komórkowego w warunkach patologicznych i normalnych.

Obrazowanie przekrojowe MRI; segmentacja tkanki tłuszczowej i mięśniowej; schemat anatomiczny.
Rycina 1: Obrazy IMAT. Reprezentatywny obraz rezonansu magnetycznego (MRI) IMAT u (A) szczupłej kobiety w średnim wieku oraz (B) mężczyzny w średnim wieku z otyłością. Kolor czerwony: tkanka tłuszczowa podskórna, żółty: tkanka tłuszczowa śródmięśniowa, zielony: mięsień szkieletowy, niebieski: kość. Obraz courtesy of Heather Cornnell, AdventHealth Translational Research Institute. (C) Świeża próbka tkanki z IMAT (otoczona przerywaną czarną linią). Obraz courtesy of Meghan Hopf, AdventHealth Translational Research Institute oraz Bryan Bergman, University of Colorado. Rycina została zmodyfikowana za zgodą Goodpaster i wsp.1. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

W przemyśle hodowlanym opublikowano szereg badań dotyczących marmurkowatości mięsa (w szczególności IMAT) u świń, kurczaków i bydła z wykorzystaniem sekwencjonowania pojedynczych komórek (sc) oraz jąder komórkowych (snRNA-seq)10. Badania te zidentyfikowały kilka subpopulacji adipocytów oraz markery potencjalnych komórek progenitorowych IMAT11,12,13; jednak nie wiadomo, czy skład komórkowy ten przekłada się na ludzką tkankę IMAT. Z naszej wiedzy tylko jedna praca analizowała heterogeniczność komórkową ludzkiego mięśnia z naciekiem tłuszczowym, pobranego od pacjentów płci męskiej z chorobą zwyrodnieniową stawu biodrowego, przy użyciu snRNA-seq14. Badacze zgłosili obecność niewielkiej populacji adipocytów oraz kilku subpopulacji fibro-adipogennych komórek progenitorowych (FAP) w obrębie licznej populacji jąder mięśniowych14. Nasze badanie jest pierwszym, w którym opracowano metodę bezpośredniej analizy składu komórkowego IMAT, wypreparowanego manualnie z ludzkiego mięśnia, z wykorzystaniem snRNA-seq.

Co ważne, protokoły snRNA-seq wymagają dostosowania do badanej tkanki, ponieważ ilość dostępnego materiału oraz właściwości fizyczne konkretnej tkanki determinują optymalne etapy przetwarzania. Wydajność tkankowa w przypadku IMAT jest zazwyczaj niewielka i często nie przekracza 50 mg, nawet przy wykonywaniu biopsji pod kontrolą USG. W związku z tym prawidłowe przetwarzanie tej rzadkiej tkanki jest niezbędne. Wierzymy, że niniejszy protokół będzie stanowił cenny zasób dla badaczy zajmujących się ludzkim IMAT.

Protokół

Próbka wykorzystana w tym protokole stanowiła część badania Study of Muscle, Mobility, and Aging (SOMMA)15, które zostało zatwierdzone przez komisję Institutional Review Board Western IRB-Copernicus Group (WCG) i przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu.

UWAGA: Niniejszy protokół został zaadaptowany z wcześniejszego protokołu wykorzystującego 100 mg ludzkiej tkanki tłuszczowej podskórnej z okolic brzucha na platformie opartej na nanodołkach16. Obecny protokół został zoptymalizowany dla 50 mg ludzkiej IMAT i przygotowania biblioteki przy użyciu platformy opartej na kropelkach. Może być wymagana dalsza optymalizacja tego protokołu w celu izolacji jąder z nie-ludzkiej IMAT lub innych depotów tłuszczowych.

1. Przygotowanie buforów i odczynników (Tabela 1 i Tabela 2)

UWAGA: Bufor należy przygotować na świeżo w dniu eksperymentu i nie używać ponownie.

  1. Wstępnie schłodzić wirówkę do 4 °C.
  2. Przygotować bufor do homogenizacji oraz medium do izolacji jąder.
    1. Przygotować dwa pojemniki z lodem i wstępnie schłodzić 2 x 15 mL probówki stożkowe.
    2. Wymieszać wszystkie odczynniki do buforu do homogenizacji (HB) w probówce stożkowej 15 mL w kolejności wymienionej w Tabeli 1. Przechowywać w lodzie. Wymieszać za pomocą wierzchołka (vortex).
    3. Wymieszać wszystkie odczynniki do medium do izolacji jąder (NIM) w probówce stożkowej 15 mL zgodnie z listą w Tabeli 2. Przechowywać w lodzie. Wymieszać za pomocą wierzchołka (vortex).
    4. Przygotować 10% Triton-X, dodając 100 µL Triton X-100 do 900 µL wody wolnej od nukleaz. Wymieszać za pomocą wierzchołka (vortex), aby zapewnić odpowiednie połączenie składników. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).

OdczynnikObjętość (μL)Stężenie końcowe (mM)
1x2x
1 M MgCl2210205
Bufor Tris 1 M, pH 8,0204010
2 M KCl255025
1,5 M sacharoza (-4oC)334668250
1 mM DTT240.001 (~1 µM)
inhibitor proteaz 100x20401x
Superasin 20 U/µL40800,4 U/µL
Woda wolna od nukleaz15493098-
Objętość całkowita20004000-

Tabela 1: Bufor do homogenizacji (HB). Przechowywać w lodzie. Mieszać za pomocą wortexa.

OdczynnikObjętość (μL)Stężenie końcowe (mM)
1x2x
EDTA 0.40.80.1
Inhibitor RNazy Ribolock (40U/µL)40800.8 U/µL
1% BSA-PBS (-/-)1959.6 3919.2-
Objętość całkowita20004000-

Tabela 2: Medium do izolacji jąder (NIM). Przechowywać w lodzie. Mieszać za pomocą wortexa.

2. Pulweryzacja zamrożonej tkanki ( Rysunek 2A)

  1. Przygotuj stanowisko do homogenizacji.
    1. Napełnij pojemnik ciekłym azotem (LN2).
      OSTROŻNIE: podczas pracy z LN2 zawsze należy nosić gogle i rękawice kriogeniczne.
    2. Przygotuj 2 moździerze, 1 tłuczek, 1 szpatułkę mikro-czerpak, 1 szklany homogenizator Dounce oraz 1 stalowy tłuczek do automatycznego homogenizatora.
    3. Uruchom automatyczny homogenizator.
    4. Wypełnij zlew lodu i schłodź w nim szklany homogenizator.
  2. Wypełnij 2 moździerze (zawierające tłuczek i szpatułkę) LN2, aby schłodzić narzędzia. Odczekaj do odparowania LN2 i powtórz czynność.
  3. Podczas chłodzenia narzędzi, dodaj 1 mL buforu HB do szklanego homogenizatora.
  4. Wypełnij oba moździerze LN2 po raz ostatni i wsyp 50 mg próbki IMAT do jednego z moździerzy.
  5. Rozdrobnij IMAT za pomocą tłuczka, delikatnie naciskając na fragment tkanki, aby rozbić go na małe kawałki. Upewnij się, że wszystkie fragmenty zostały sproszkowane.
  6. LN2 będzie powoli odparowywać podczas rozdrabniania tkanki. Gdy tkanka zostanie odpowiednio sproszkowana, a w moździerzu pozostanie jeszcze ¼ - ½ objętości LN2, przechyl moździerz w stronę krawędzi, aby zebrać sproszkowaną tkankę przy brzegu. Pozostaw LN2 do całkowitego odparowania.
  7. Natychmiast po odparowaniu resztek LN2, przełóż sproszkowaną tkankę do szklanego homogenizatora zawierającego 1 mL HB.

3. Homogenizacja sproszkowanej tkanki

  1. Zhomogenizować sproszkowaną tkankę za pomocą automatycznego homogenizatora typu dounce. Przesuwać szklany tłuczek w górę i w dół stalowego pestle, wykonując 10 ruchów w kierunku przednim, a następnie 10 ruchów w kierunku odwrotnym.
  2. Upewnić się, że po homogenizacji roztwór jest mętny i nie zawiera widocznych fragmentów tkanki. Ze względu na zanieczyszczenie tkanką mięśniową często oczekiwany jest jasnoróżowy kolor.
  3. Przenieść homogenizat do schłodzonej wcześniej probówki low-bind o pojemności 1,7 mL, umieszczonej w lodzie.
  4. Użyć 400 µL buforu HB do wypłukania homogenizatora, aby upewnić się, że cały materiał został przeniesiony, a następnie dodać go do probówki.
    UWAGA: Jednocześnie można przetworzyć dwie próbki. W tym celu należy podwoić ilość HB oraz NIM. Sproszkować i zhomogenizować jedną próbkę tkanki, a bezpośrednio po niej sproszkować i zhomogenizować drugą próbkę tkanki, aby móc przeprowadzić etapy izolacji i oczyszczania równolegle.

4. Izolacja i oczyszczanie jąder komórkowych (Rysunek 2B)

  1. Dodaj 14 µL Triton-X (10%) do homogenatu, aby uzyskać stężenie 0,1%.
  2. Przechowuj probówkę na lodzie i w ciemności przez 10-15 min, mieszając na wirówce vortex co 3 min.
  3. Namocz jedno sitko komórkowe 100 µm i jedno sitko komórkowe 40 µm (na próbkę), używając 100 µL RT DPBS dla każdego z nich w stożkowej probówce 50 mL.
  4. Przefiltruj homogenat przez sitko komórkowe 100 µm.
  5. Wypłucz probówkę 1,7 mL za pomocą 400 µL HB i przefiltruj przez sitko komórkowe 100 µm.
  6. Następnie przefiltruj roztwór przez sitko komórkowe 40 µm.
  7. Przenieś równą ilość roztworu do dwóch schłodzonych wcześniej probówek 1,7 mL typu low-bind, co odpowiada ok. 900 µL w każdej probówce.
  8. Wiruj probówki przez 10 min przy 2700 x g w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu powinien być widoczny mały pellet.
  9. Usuń i odrzuć górną warstwę lipidową oraz pozostały supernatant, pozostawiając ok. 50 µL roztworu w pierwszej probówce.
  10. Powtórz czynność dla drugiej probówki.
  11. Dokładnie resuspenduj pellet w pierwszej probówce, delikatnie pipetując w górę i w dół 20 razy, a następnie przenieś do nowej probówki 1,7 mL typu low-bind. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza.
  12. Powtórz tę procedurę dla drugiej probówki i przenieś zresuspendowany roztwór do tej samej probówki.
  13. Dodaj 500 µL NIM i wymieszaj poprzez pipetowanie.
  14. Wirowuj probówkę z przeciwwagą przy 1000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  15. Usuń supernatant, pozostawiając ok. 50 µL, i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aż pellet zostanie zresuspendowany. Opcjonalnie przenieś zresuspendowany pellet do nowej, czystej probówki, jeśli na ściankach probówki pozostały resztki lipidów.
  16. Dodaj 200 µL NIM i wymieszaj poprzez pipetowanie.

5. Barwienie i liczenie jąder komórkowych (Rycina 2C oraz Rycina 3)

UWAGA: Aby ułatwić zliczanie, należy skonfigurować protokół „zliczania jąder” w automatycznym liczniku komórek, ponieważ regulacja kanałów jasnego pola oraz DAPI może znacząco wpłynąć na wynik zliczania. Dostrój kanały w taki sposób, aby rejestrowane były tylko jądra, a nie zanieczyszczenia. Upewnij się, że kanał jasnego pola oznacza jedynie „obiekty”, które posiadają również barwienie DAPI.

  1. Dodać 1 kroplę roztworu do barwienia żywych komórek i pozostawić w ciemności, w lodzie, na 15 min.
  2. Przefiltrować roztwór przez sitko komórkowe 30 µm.
  3. Wymieszać roztwór jąder metodą pipetowania i nanieść 10 µL roztworu na szkiełko z komorą do liczenia komórek.
  4. Policzyć jądra za pomocą automatycznego licznika komórek.
    UWAGA: Optymalne stężenie wynosi 1000 jąder/µL, co odpowiada 1,0 x 106/mL.
    1. Upewnić się, że nie występują skupiska jąder, ponieważ mogłyby one zapchać chip do generowania kropel z pojedynczymi jądrami (Rysunek 3).
    2. Jeśli stężenie jąder jest zbyt niskie, odwirować roztwór przy 1000 x g przez 10 min w 4 °C w celu uzyskania osadu, usunąć nadsącz i resuspender w mniejszej objętości.
    3. Jeśli w roztworze znajduje się dużo zanieczyszczeń (debris), resuspender roztwór jąder w większej objętości NIM (np. 1 mL) i ponownie przefiltrować przez sitko komórkowe 30 µm. Następnie odwirować przy 1000 x g przez 10 min w 4 °C i resuspender w odpowiedniej objętości w zależności od stężenia jąder.
  5. Po uzyskaniu odpowiedniego stężenia jąder przejść bezpośrednio do pierwszego etapu przygotowania biblioteki.

Porównanie barwienia DAPI i mikroskopii w polu jasnym, obrazowanie komórek, analiza fluorescencji.
Rysunek 3: Barwienie wyizolowanych jąder. Obraz z licznika komórek przedstawiający jądra zabarwione NucBlue/DAPI (obraz po lewej) oraz odpowiadający mu obraz w polu jasnym (obraz po prawej). Na obrazie w polu jasnym widoczna jest obecność niewielkiej ilości zanieczyszczeń. Użyty tutaj automatyczny licznik komórek nie posiada opcji dodawania pasków skali. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Przygotowanie biblioteki i parametry sekwencjonowania

  1. Należy zapoznać się z dokładnym protokołem przygotowania bibliotek z wykorzystaniem metody kropelkowej dla pojedynczych jąder komórkowych, dostępnym na stronie internetowej dostawcy17.
    1. Należy dążyć do odzyskania docelowo 10 000 jąder. Jednak w przypadku próbek o wysokim poziomie zanieczyszczeń lub zawierających kruche jądra, należy spodziewać się uzyskania mniejszej liczby odzyskanych jąder.
    2. Aby umożliwić równoległe przetwarzanie większej liczby próbek, próbki można przechowywać w temperaturze 4°C do 72 h po wykonaniu kroku 2.3. protokołu przygotowania bibliotek. W tym celu należy przetwarzać dwie próbki do kroku 2.3. przez dwa kolejne dni, a w trzecim dniu przetworzyć wszystkie 4 próbki wspólnie, zaczynając od kroku 3. protokołu przygotowania bibliotek.
  2. Parametry sekwencjonowania: Sekwencjonowanie należy przeprowadzić na platformie sekwencyjnej, dążąc do uzyskania 50 000 odczytów par końcowych (paired-end reads) na jądro.
    UWAGA: Dane przedstawione w niniejszym protokole zostały zsekwencjonowane na platformie NovaSeq 6000, przy założeniu 50 000 odczytów par końcowych na jądro.

Proces pulveryzacji tkanki i izolacji jąder z użyciem ciekłego azotu, douncera, wirówki i licznika komórek.
Rysunek 2: Schemat procedury. Schematyczne przedstawienie przebiegu pracy w (A) krokach 2 i 3, (B) kroku 4 oraz (C) kroku 5 protokołu. Rysunek został przygotowany przy użyciu BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

7. Przetwarzanie i analiza danych

UWAGA: W niniejszym protokole krótko przedstawiono niektóre z zalecanych programów i pakietów R wykorzystywanych do przetwarzania uzyskanych danych z sekwencjonowania, koncentrując się na etapach następujących po wstępnym przetwarzaniu (Tabela 3). Niniejsze badanie dostarcza ogólnych wskaźników kontroli jakości (QC) oraz przykładu przybliżonej i rzutowanej projekcji jednostajnej rozmaitości (UMAP) w Rycina 4Jednak szczegółowy opis analizy bioinformatycznej wykracza poza zakres niniejszego protokołu. W związku z tym czytelnicy mogą zapoznać się z niedawnym przeglądem najlepszych praktyk w analizie pojedynczych komórek autorstwa Heumos i wsp.18.

  1. Wstępne przetwarzanie danych z sekwencjonowania
    1. Zmapuj odczyty z pojedynczych jąder do ludzkiego genomu referencyjnego GRCh38.
    2. Uwzględnij odczyty intronowe w zliczaniu.
  2. Przeprowadź kontrolę jakości (QC) i filtrowanie danych przy użyciu pakietu Seurat R19.
    1. Oblicz wskaźnik złożoności komórek, dzieląc log(10) liczby wykrytych genów przez log(10) liczby wykrytych odczytów.
    2. Przedstaw najważniejsze metryki QC na histogramach lub wykresach skrzypcowych, w tym liczbę genów wykrytych na jądro, procent odczytów mitochondrialnych oraz wskaźnik złożoności komórek.
    3. Odrzuć jądra z liczbą genów mniejszą niż 200 lub większą niż 10 000 na jądro, odsetkiem odczytów mitochondrialnych przekraczającym 10% oraz wskaźnikiem złożoności poniżej 0.8.
  3. Znormalizuj dane i przeprowadź redukcję wymiarowości.
    1. Użyj funkcji SCTransform z pakietu Seurat , aby znormalizować dane przy użyciu 2000 cech zmiennych.
    2. Pogrupuj dane (klasteryzacja), korzystając z następujących funkcji pakietu Seurat R: RunPCA, FindNeighbors, FindClusters oraz RunUMAP.
    3. Wygeneruj wykres UMAP, aby zwizualizować klastry danych.
  4. Odrzuć przewidywane dublety przy użyciu pakietu DoubletFinder R 20 i przeprowadź ponowną klasteryzację danych.
  5. Adnotuj klastry, korzystając ze znanych markerów genowych typów komórek spodziewanych w tkance (podejście nadzorowane) lub na podstawie 5 genów o największej różnicy w ekspresji pomiędzy klastrami (podejście nienadzorowane).
  6. Użyj narzędzia decontX21 , aby określić stopień kontaminacji tłem RNA (ambient RNA) i skorygować macierz ekspresji genów pod kątem tego zjawiska.
    1. Uwzględnij surową macierz genów jako tło.
  7. Zapisz obiekt Seurat do przyszłej analizy danych.
    UWAGA: Kod do analizy QC i klasteryzacji znajduje się w Pliku uzupełniającym 1.
Oprogramowanie/pakiety R wykorzystane w przepływie danychAlternatywne oprogramowanie/pakietyEtap przetwarzania
CellRangerSTARsolo, kallistoPrzycinanie, wyrównywanie, mapowanie 
SeuratSingleCellExperiment, CellrangerKontrola jakości, analiza i eksploracja danych
DoubletFinderscds, scdblFinder, ScrubletWykrywanie dubletów
DecontXSoupX, CellBenderKorekta RNA tła

Tabela 3: Oprogramowanie/narzędzia do przepływu danych.

Wyniki

Niniejszy schemat pracy został opracowany w celu przeprowadzenia obróbki zamrożonych próbek ludzkiej tkanki IMAT w celu uzyskania profili ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczych jąder, co umożliwia identyfikację typów komórek. W niniejszej procedurze zaprezentowano jedną reprezentatywną próbkę IMAT pochodzącą od uczestnika badania SOMMA.

Pierwszym krokiem każdej analizy danych snRNA-seq jest ocena jakości danych w celu zidentyfikowania jąder o niskiej jakości, które potencjalnie powinny zostać usunięte ze zbioru danych. Co istotne, kroki filtrowania oraz progi powinny zostać określone dla konkretnego rodzaju próbki i posiadanego zbioru danych, ponieważ powszechnie oceniane mierniki mogą różnić się w zależności od tkanek i typów komórek22,23. Rycina 4A przedstawia wizualizację niektórych kluczowych mierników stosowanych do oceny jakości wygenerowanych danych snRNA-seq. Liczba genów wykrytych na jądro zależy od głębokości sekwencjonowania i typu komórki, jednak w przypadku jąder dobrej jakości spodziewana wartość powinna przekraczać 20018,23. Stwierdzono, że dane wygenerowane przy użyciu niniejszego protokołu mieszczą się w oczekiwanym zakresie, z medianą 1134 genów na jądro, przy całkowitej liczbie 4662 jąder.

Ocenia się odsetek odczytów mitochondrialnych, ponieważ wysoki stopień kontaminacji mitochondrialnej może wynikać z uszkodzeń jąder komórkowych lub przyłączenia się zewnętrznego RNA do jąder, co wskazuje na niską jakość tych struktur. W prezentowanym tutaj zestawie danych stwierdzono medianę odsetka odczytów mitochondrialnych na poziomie 2,65, co znajduje się znacznie poniżej progu 5%-20% powszechnie stosowanego w literaturze24,25,26. Odsetek odczytów rybosomalnych różni się w zależności od typu komórek i tkanki. Jednakże, ponieważ duże proporcje genów rybosomalnych mogą wpływać na klasteryzację danych, zaleca się sprawdzenie odsetka odczytów rybosomalnych i ewentualne usunięcie genów rybosomalnych lub jąder z wysokim poziomem genów rybosomalnych z zestawu danych przed przeprowadzeniem klasteryzacji. Dane wygenerowane zgodnie z niniejszym protokołem wykazały niski poziom odczytów rybosomalnych z medianą 2,46% i maksymalną wartością 16,5%, w związku z czym nie zastosowano filtrowania w oparciu o tę metrykę. Na koniec obliczono wskaźnik złożoności komórki na podstawie log(10) liczby wykrytych genów podzielonej przez log(10) liczby wykrytych odczytów. Oczekuje się, że wysokiej jakości jądra będą miały wartość powyżej 0,8; w próbce użytej w niniejszym badaniu uzyskano medianę 0,92. Na podstawie tych metryk kontroli jakości można zdecydować, które jądra należy odfiltrować z zestawu danych. Do analizy zdecydowaliśmy się odfiltrować jądra z mniej niż 200 lub więcej niż 10 000 genów na jądro, odsetkiem odczytów mitochondrialnych przekraczającym 10% oraz wskaźnikiem złożoności poniżej 0,8.

Po wstępnej ocenie jakości i etapie filtrowania można wygenerować wykres UMAP, aby zwizualizować grupowanie jąder. Klasteryzację przeprowadzono w oparciu o 2000 najbardziej zmiennych genów z zastosowaniem transformacji SCT. Wstępne etapy grupowania mogą służyć do sprawdzenia, czy cechy QC grupują się razem, np. jądra z wysoką liczbą odczytów mitochondrialnych. Ponadto informacje o klastrach są wymagane dla niektórych metod detekcji dubletów, w tym DoubletFinder20, który został wykorzystany w niniejszym protokole. DoubletFinder zastosowano z oczekiwaną stopą multipletów ustawioną na 4,8%, zgodnie z sugestią dostawców platformy opartej na kropelkach. Po usunięciu dubletów oszacowano poziom zanieczyszczenia wolnym RNA (ambient RNA), co jest szczególnie powszechne w preparatach pojedynczych jąder, ponieważ RNA uwalnia się z cytoplazmy podczas lizy komórek, przedostaje się do kropelek Gel Beads-in-emulsion (GEMs) i ulega amplifikacji w kolejnych etapach przygotowania biblioteki. W związku z tym opracowano kilka narzędzi do korekty problemu zanieczyszczenia wolnym RNA (patrz Tabela 3). Wykorzystano pakiet R decontX21, w którym surowa macierz tła (zawierająca tylko puste kropelki) służy do skorygowania macierzy ekspresji genów, co wzmacnia rzeczywisty sygnaturę ekspresji genów.

Klastrowanie i zdolność do wykrywania rzadkich typów komórek zależą od liczby jąder. W niniejszym badaniu, po filtracji QC, usunięciu dubletów i korekcie RNA tła, zidentyfikowano wszystkie oczekiwane główne typy komórek w IMAT (Rycina 4B) z łącznej liczby 3817 jąder. Obejmowały one komórki macierzyste, fibro-adipogenne komórki progenitorowe (FAPs) i dojrzałe adipocyty, a także perycyty, komórki mięśni gładkich, komórki układu odpornościowego, komórki progenitorowe mięśni oraz mionukleidy pochodzące z zanieczyszczenia komórkami mięśni szkieletowych.

Podsumowując, wykazaliśmy, że niniejszy protokół pozwala na uzyskanie danych o pojedynczych jądrach o wysokiej rozdzielczości, co umożliwia adnotację typów komórek istotną dla wyjaśnienia biologii i pochodzenia komórkowego IMAT.

Wykresy skrzypcowe i klastry UMAP w analizie ekspresji genów; procent odczytów i wskaźniki złożoności.
Rysunek 4: Ocena jakości, klastrowanie i adnotacja typów komórek w danych sekwencyjnych. (A) Wykresy skrzypcowe kluczowych parametrów do oceny próbek i wydajności sekwencjonowania, w tym liczby genów wykrytych na jądro, procenta odczytów mitochondrialnych, procenta odczytów rybosomalnych oraz złożoności komórkowej mierzonej jako log(10) liczby wykrytych genów podzielone przez log(10) liczby wykrytych odczytów. Wartości mediany dla każdego parametru przedstawiono w zamkniętych polach. Całkowita liczba jąder: 4662. (B) Wykres UMAP przedstawiający klastrowanie poszczególnych jąder oraz odpowiadający mu wykres DotPlot ukazujący względną ekspresję genów markerowych dla typów komórek w każdym klastrze po filtrowaniu. Liczba jąder: 3817. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Kod do analizy QC i klastrowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Praca z IMAT wiąże się z kilkoma nieodłącznymi wyzwaniami. Oprócz ograniczonej dostępności, wydajność materiału próbki jest często bardzo rzadka, a "zanieczyszczenie" mięśni szkieletowych jest prawie niemożliwe do uniknięcia. Aby uzyskać próbkę najlepszej jakości, należy przeniknąć do powięzi mięśniowej podczas wprowadzania igły do biopsji (aby upewnić się, że nie pobiera się podskórnej tkanki tłuszczowej) i usunąć jak najwięcej tkanki mięśniowej poprzez wypreparowanie próbki pod mikroskopem natychmiast po pobraniu, a następnie przetworzenie w celu histologii, szybkiego zamrożenia itp. Jest to pierwsza metoda wykorzystania próbek IMAT prospektywnie pobranych i wypreparowanych z mięśni szkieletowych. Dla porównania, poprzednie dane dotyczące sekwencji snRNA w IMAT pochodziły z izolacji jąder mieszaniny biopsji mięśni szkieletowych ze znanym naciekiem tłuszczowym, a nie samego IMAT.

IMAT ma charakter gęstszy w porównaniu do podskórnych tkanek tłuszczowych, co sprawia, że prawidłowe sproszkowanie tkanki podczas izolacji jąder jest niezbędne do uwolnienia jąder ze struktury tkanki. Niewłaściwa proszkowanie może prowadzić do mniejszej wydajności jąder, co jest niekorzystne przy ograniczonej ilości tkanki. Co więcej, obliczenie prawidłowej liczby jąder w przygotowanym roztworze jąder jest krytycznym krokiem w celu zapewnienia wystarczającej liczby (ale nie za wielu) jąder do załadowania do chipa w celu wygenerowania GEM. Zbyt wiele jąder lub obecność dużych klastrów jąder lub szczątków może spowodować zatkanie, wpływając na końcowe stężenie cDNA i ostatecznie na wynik sekwencjonowania. Ominięcie zlepiania się jąder i zanieczyszczeń w preparacji pojedynczych jąder jest trudne i zależy od jakości próbki. Zbrylanie się jąder i/lub obecność zanieczyszczeń można zmniejszyć, włączając dodatkowy etap filtracji z sitkiem do komórek o średnicy 30 μm.

Ważne jest, aby szybko przetwarzać próbki, aby zmniejszyć ryzyko degradacji RNA. Utrzymywanie roztworów na lodzie lub schładzanych podczas wszystkich możliwych etapów izolacji jąder, a także dodanie wystarczającej ilości inhibitorów RNAzy, może zminimalizować degradację. Ze względu na znaczenie czasu przetwarzania dla każdej próbki, zalecamy przeprowadzanie maksymalnie dwóch próbek jednocześnie. Ponadto z roztworem jąder należy obchodzić się ostrożnie, aby jądra nie były zbyt delikatne. Delikatne jądra są podatne na pękanie podczas generowania GEM, co może skutkować powstawaniem dużych ilości RNA w próbce. W tym protokole etap filtrowania za pomocą strzykawki (opisany w protokole STAR16) został wykluczony w celu zachowania integralności jąder.

Wybór metody przygotowania biblioteki zależy od pytania badawczego. Pracowaliśmy zarówno nad podejściem opartym na pojedynczych jądrach kropelkowych, jak i nanostunkowych. Podejście oparte na nanostudzienkach profiluje 1200-1600 jąder i około 3000-6000 wykrytych genów na jądro16. Co więcej, podejście to obsługuje transkryptomikę o pełnej długości, co pozwala na badanie zmienności strukturalnej, pseudogenów i wariantów splicingu27. Dla porównania, ponad 10 000 jąder można profilować przy użyciu podejścia kropelkowego, ale kosztem mniejszej liczby wykrywanych genów na jądro (2-3-krotnie niższej). W przypadku tego protokołu zdecydowaliśmy się użyć jednej z platform opartych na kropelkach, ponieważ większa liczba profilowanych jąder daje nam większą zdolność do wykrywania rzadkich typów komórek o niskiej liczebności28.

Głównym ograniczeniem sekwencji snRNA jest utrata zawartości cytozolu, co ogranicza analizę ekspresji do transkryptów jądrowych. Jądro zawiera 10-100 razy mniej mRNA niż cała komórka29, co może być problemem dla odkrycia wszystkich typów komórek w tkance. Jednak niedawne badanie przeprowadzone przez Guptę i wsp. wykazało, że transkryptomika jądrowa - w porównaniu z transkryptomiką całych komórek29 - wykryła podobne populacje komórek i profile ekspresji biologicznie istotnych genów w hodowanych preadipocytach i dojrzałych adipocytach. Podobne wyniki uzyskano w innych typach komórek30,31.

Izolacja pojedynczych jąder ma swoje zalety w zapewnianiu wzorców ekspresji genów o rozdzielczości pojedynczej komórki (sc) w delikatnych komórkach niezgodnych z sekwencją scRNA. Ponadto można wykorzystać zamrożone próbki z biobanków, a izolacja jąder nie wymaga enzymatycznego trawienia tkanki, co może wywołać reakcję stresową w komórkach, wpływając na transkryptom32. Stosując sekwencję snRNA, byliśmy w stanie transkrypcyjnie profilować adipocyty i inne typy komórek obecne w IMAT, co nie byłoby możliwe w przypadku sekwencji scRNA, ponieważ adipocyty są obciążone lipidami i niezgodne z podejściem opartym na kropelkach.

Ważnym zastosowaniem snRNA-Seq IMAT jest rozszyfrowanie składu komórkowego i różnic transkrypcyjnych IMAT w różnych stanach metabolicznych. Co więcej, zestawy danych snRNA-seq mogą być wykorzystane do dekonwolucji masowego sekwencjonowania RNA na IMAT w celu oceny różnic w składzie komórek na większą skalę33. Dodatkowo, pseudo-czasowa analiza danych sekwencyjnych snRNA-seq może służyć do identyfikacji trajektorii dojrzewania komórek, co jest szczególnie interesujące w tkankach takich jak IMAT, w których pochodzenie komórkowe dojrzałych adipocytów jest nadal przedmiotem dyskusji.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Bryanowi Bergmanowi, doktorowi z University of Colorado za dostarczenie obrazu biopsji IMAT na rysunku 1C z badania MoTrIMAT (R01AG077956). Jesteśmy wdzięczni za to, że Badanie Mięśni, Mobilność i Starzenie się dostarczyło próbkę IMAT, z której dane są pokazane w sekcji reprezentatywnych wyników. National Institute on Aging (NIA) sfinansował badanie mięśni, mobilności i starzenia się (SOMMA; R01AG059416) oraz jego badania pomocnicze SOMMA AT (R01AG066474) i SOMMA Knee OA (R01AG070647). Wsparcie infrastruktury badawczej zostało częściowo sfinansowane przez NIA Claude D. Pepper Older American Independence Centers na Uniwersytecie w Pittsburghu (P30AG024827) i Wake Forest University (P30AG021332) oraz Instytuty Nauk Klinicznych i Translacyjnych, finansowane przez National Center for Advancing Translational Science, na Uniwersytecie Wake Forest (UL1 0TR001420).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; Filtry strzykawkowe M Corning Rurki Millipore SigmaCLS431229
1,7 ml DNA LoBindEppendorf22431021probówki o niskim poziomie wiązania
10% Tween 20Bio-Rad1662404
100x inhibitor proteazyThermo Fisher Scientific78437
10X Separator magnetyczny10X Genomics230003
10X Adapter Vortex10X Genomics
Probówki kanoniczne 15 mlSarstedt6,25,54,502
2100 Bioanalizator AgilentG2939BA
50 mlSarstedt6,25,47,254
Zestaw akcesoriów CellRangerGenomicsN/A
Chromium iX10X GenomicsPN1000323
Chromium iX Controller10X GenomicsPN1000326
Chromium Next GEM Chip G Zestaw jednoogniwowy 10X GenomicsPN1000127
Chromium Next GEM Jednokomórkowy 3-calowy zestaw kulek żelowych v3.1 10X GenomicsPN1000129
Chromium Next GEM Zestaw jednokomórkowy GEM v3.110X GenomicsPN1000130
Countess 3 Automatyczny licznik komórekThermo Fisher ScientificAMQAX2000Automatyczny licznik komórek
Szkiełka komory zliczania komórek CountessThermo Fisher ScientificC10228
DoubletFinderR N/A
DPBS (bez wapnia, bez magnezu)Thermo Fisher Scientific14190144
DTTThermo Fisher ScientificR0861
Zestaw podwójnego indeksu TT Zestaw A, 96 rxns10X GenomicsPN1000215
Dynabeads MyOne SILANE 10X GenomicsPN2000048
Falcon 100 µ m Sitko do komórekCorning Life Science352360
Falcon 40 µ m Sitko komórkoweCorning Life Science352340
Gliceryna (glicerol), 50% (v/v) Roztwór wodnyRicca Chemical Company3290-32
KCLThermo Fisher ScientificAM9640G
Library Zestaw konstrukcyjny v3.110X GenomicsPN1000196
MACS SmartStrainers (30µ m)Miltenyi Biotec130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient TermocyklerEppendorf6331000017
MgCl2AmbionAM9530G
Moździerz i pestelLogistyka opieki zdrowotnej 14075
Odczynnik do sond NucBlue Live ReadyThermo Fisher ScientificR37605
Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)Thermo Fisher ScientificAM9930
Probumin Albumina surowicy bydlęcej bez kwasów tłuszczowych, proszekSigma-Aldrich820024
Qiagen Bufor EBQiagen19086
Inhibitor RNAzy rybolokuThermo Fisher ScientificEO0382
SeuratR Nie dotyczy Sacharozy
Sigma-AldrichS0389
SUPERasin 20 U/µ LThermo Fisher ScientificAM2695
ThermoMixer CEppendorf 
Homogenizator tkankowyGlass-Col099C K54
Tris bufor pH 8,0Thermo Fisher ScientificAM9855G
Triton X-100Thermo Fisher ScientificAC327372500
UltraPure 0,5M EDTA pH 8,0Gibco15575020
330002Probówki stożkowe 5382000015

Bibliografia

  1. Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. Intermuscular adipose tissue in metabolic disease. Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).
  2. Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C. The metabolic significance of intermuscular adipose tissue: Is IMAT a friend or a foe to metabolic health. Diabetes. 70 (11), 2457-2467 (2021).
  3. Gallagher, D., et al. Adipose tissue in muscle: A novel depot similar in size to visceral adipose tissue. Am J Clin Nutr. 81 (4), 903-910 (2005).
  4. Manini, T. M., et al. Reduced physical activity increases intermuscular adipose tissue in healthy young adults. Am J Clin Nutr. 85 (2), 377-384 (2007).
  5. Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. Intermuscular fat: A review of the consequences and causes. Int J Endocrinol. 2014, 309570(2014).
  6. Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Arch Intern Med. 165 (7), 777-783 (2005).
  7. Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. Am J Clin Nutr. 71 (4), 885-892 (2000).
  8. Goodpaster, B. H., et al. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).
  9. Sachs, S., et al. Intermuscular adipose tissue directly modulates skeletal muscle insulin sensitivity in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 316 (5), E866-E879 (2019).
  10. Ford, H., Liu, Q., Fu, X., Strieder-Barboza, C. White adipose tissue heterogeneity in the single-cell era: From mice and humans to cattle. Biology (Basel). 12 (10), 1289(2023).
  11. Wang, L., et al. Single-nucleus and bulk RNA sequencing reveal cellular and transcriptional mechanisms underlying lipid dynamics in high marbled pork. NPJ Sci Food. 7 (1), 23(2023).
  12. Li, J., et al. Identification of diverse cell populations in skeletal muscles and biomarkers for intramuscular fat of chicken by single-cell RNA sequencing. BMC Genomics. 21 (1), 752(2020).
  13. Lyu, P., Qi, Y., Tu, Z. J., Jiang, H. Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneity of cultured bovine satellite cells. Front Genet. 12, 742077(2021).
  14. Fitzgerald, G., et al. MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle. Commun Biol. 6 (1), 111(2023).
  15. Cummings, S. R., et al. The study of muscle, mobility and aging (SOMMA): A unique cohort study about the cellular biology of aging and age-related loss of mobility. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 78 (11), 2083-2093 (2023).
  16. Whytock, K. L., et al. Isolation of nuclei from frozen human subcutaneous adipose tissue for full-length single-nuclei transcriptional profiling. STAR Protoc. 4 (1), 102054(2023).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits User Guide (v3.1 Chemistry Dual Index), Document Number CG000315 RevE. , Available from: https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1668017706/support-documents/CG000315_ChromiumNextGEMSingleCell3-_GeneExpression_v3.1_DualIndex__RevE.pdf (2022).
  18. Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (1), 550-572 (2023).
  19. Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2023).
  20. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. Cell Syst. 8 (4), 329-337 (2019).
  21. Yang, S., et al. Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX. Genome Biol. 21 (2), 57(2020).
  22. Common considerations for quality control filters for single cell RNA-seq data. 10X Genomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/common-considerations-for-quality-control-filters-for-single-cell-rna-seq-data (2022).
  23. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
  24. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).
  25. Hildreth, A. D., et al. Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity. Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).
  26. Whytock, K. L., et al. Single cell full-length transcriptome of human subcutaneous adipose tissue reveals unique and heterogeneous cell populations. iScience. 25 (8), 104772(2022).
  27. Probst, V., et al. Benchmarking full-length transcript single cell mRNA sequencing protocols. BMC Genomics. 23 (1), 860(2022).
  28. CG000148 Rev A Technical Note - Resolving cell types as a function of read depth and cell number. Technical note. 10X Genomics. , Available from: https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/6gDArDPBTOg4IIkYEO2Sis/803be2286bb a5ca67f353e6baf68d276/CG000148_10x_Technical _Note_Resolving_Cell_Types_as_Function_of_ Read_Depth_Cell_Number_RevA.pdf (2018).
  29. Gupta, A., et al. Characterization of transcript enrichment and detection bias in single-nucleus RNA-seq for mapping of distinct human adipocyte lineages. Genome Res. 32 (2), 242-257 (2022).
  30. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
  31. Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).
  32. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).
  33. Avila Cobos, F., Alquicira-Hernandez, J., Powell, J. E., Mestdagh, P., De Preter, K. Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data. Nat Commun. 11 (1), 5650(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja jąder komórkowychludzka tkanka tłuszczowaprofilowanie typów komóreksekwencjonowanie oparte na kropelkachpulveryzacja tkankifiltracja przez sitko do komórekautomatyczny licznik komórekbadania nad chorobami metabolicznymi
Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.