Izolacja jąder z ludzkiej międzymięśniowej tkanki tłuszczowej i sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder w dół

Podsumowanie

Biologia międzymięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) jest w dużej mierze niezbadana ze względu na ograniczoną dostępność tkanek ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji jąder i przygotowania biblioteki zamrożonego ludzkiego IMAT do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder w celu identyfikacji składu komórkowego tego unikalnego magazynu tłuszczu.

Streszczenie

Międzymięśniowa tkanka tłuszczowa (IMAT) to stosunkowo słabo zbadany magazyn tkanki tłuszczowej znajdujący się pomiędzy włóknami mięśniowymi. Zawartość IMAT wzrasta wraz z wiekiem i BMI i jest związana z chorobami metabolicznymi i zwyrodnieniowymi mięśni; jednak poważnie brakuje zrozumienia właściwości biologicznych IMAT i jego interakcji z otaczającymi włóknami mięśniowymi. W ostatnich latach sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i jąder dostarczyło nam atlasów specyficznych dla typu komórki kilku tkanek ludzkich. Jednak skład komórkowy ludzkiego IMAT pozostaje w dużej mierze niezbadany ze względu na nieodłączne wyzwania związane z jego dostępnością z biopsji pobranej u ludzi. Oprócz ograniczonej ilości pobranej tkanki, przetwarzanie ludzkiego IMAT jest skomplikowane ze względu na jego bliskość do tkanki mięśni szkieletowych i powięzi. Obciążony lipidami charakter adipocytów sprawia, że jest on niezgodny z izolacją pojedynczych komórek. W związku z tym sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder jest optymalne do uzyskania wielowymiarowej transkryptomiki w rozdzielczości pojedynczej komórki i zapewnia potencjał do odkrycia biologii tego magazynu, w tym dokładnego składu komórkowego IMAT. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowy protokół izolacji jąder i przygotowania biblioteki zamrożonego ludzkiego IMAT do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder. Protokół ten pozwala na profilowanie tysięcy jąder przy użyciu podejścia kropelkowego, zapewniając w ten sposób możliwość wykrywania rzadkich i mało obfitych typów komórek.

Wprowadzenie

Międzymięśniowa tkanka tłuszczowa (IMAT) to ektopowy magazyn tkanki tłuszczowej znajdujący się pomiędzy włóknami mięśniowymi i wokół nich¹. Jak szczegółowo opisano w niedawnym przeglądzie przeprowadzonym przez Goodpaster i wsp., IMAT można wykryć za pomocą tomografii komputerowej o wysokiej rozdzielczości (CT) i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) (Rysunek 1A,B) i znajduje się wokół i wewnątrz włókien mięśniowych w całym ciele¹. Ilość IMAT różni się znacznie u poszczególnych osób i ma na nią wpływ BMI, wiek, płeć, rasa i siedzący tryb życia^2,3,4. Co więcej, odkładanie się IMAT jest powszechnie obserwowane w stanach patologicznych związanych ze zwyrodnieniem mięśni⁵, a liczne badania udokumentowały zwiększoną masę IMAT u osób z otyłością, cukrzycą typu 2, zespołem metabolicznym i insulinoopornością^6,7,8,9. Niemniej jednak, komórkowe i biologiczne właściwości IMAT dopiero zaczynają być odkrywane. Ograniczona dostępność oraz różnice w lokalizacjach i zawartości IMAT w całym ciele stanowiły wyzwanie dla pobierania próbek z tego wyjątkowego magazynu tłuszczu². Co więcej, próbki są łatwo "zanieczyszczone" mięśniami szkieletowymi (SM) po pobraniu, co sprawia, że oddzielenie wkładu biologicznego z różnych tkanek jest trudne do rozszyfrowania (Rysunek 1C). W tym celu sekwencjonowanie RNA pojedynczych jąder (snRNA-seq), które zyskało znaczną uwagę w ciągu ostatniej dekady, służy jako idealna metodologia pozwalająca na rozdzielenie wzorców ekspresji genów pochodzących z IMAT i SM z rozdzielczością pojedynczej komórki. Co więcej, izolacja jąder jest szczególnie przydatna dla tkanki tłuszczowej ze względu na duże adipocyty obciążone lipidami, które nie są w stanie zdysocjować do zawiesiny jednokomórkowej bez naruszenia integralności komórek. Wreszcie, technologia ta ma potencjał do odkrycia nowych markerów adipocytów specyficznych dla IMAT oraz odkrycia składu i obecności różnych populacji komórek progenitorowych, a także zbadania zmienności składu komórek w warunkach patologicznych i normalnych.

Rysunek 1: Obrazy IMAT. Reprezentatywny obraz IMAT metodą rezonansu magnetycznego (MRI) od (A) szczupłej kobiety w średnim wieku i (B) mężczyzny w średnim wieku z otyłością. Czerwony: podskórna tkanka tłuszczowa, żółty: międzymięśniowa tkanka tłuszczowa, zielony: mięśnie szkieletowe, niebieski: kość. Zdjęcie dzięki uprzejmości Heather Cornnell, AdventHealth Translational Research Institute. (C) Próbka świeżej tkanki za pomocą IMAT (otoczona czarną linią przerywaną). Zdjęcie dzięki uprzejmości Meghan Hopf, AdventHealth Translational Research Institute i Bryana Bergmana, University of Colorado. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Goodpaster et al.¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Opublikowano wiele badań z branży hodowlanej, które badają marmurkowatość mięsa (w szczególności IMAT) u świń, kurczaków i bydła przy użyciu jednokomórkowych (sc) i snRNA-seq¹⁰. Badania te zidentyfikowały kilka subpopulacji adipocytów i markerów potencjalnych komórek progenitorowych IMAT^11,12,13; jednak nie wiadomo, czy te składy komórkowe przekładają się na ludzki IMAT. Według naszej wiedzy, tylko jedno badanie dotyczyło niejednorodności komórkowej ludzkich mięśni z naciekiem tłuszczowym, uzyskanej od mężczyzn z chorobą zwyrodnieniową stawu biodrowego, przy użyciu snRNA-seq¹⁴. Badacze odnotowali małą populację adipocytów i kilka subpopulacji włóknisto-adipogennych progenitorów (FAP) w dużej populacji mięśni¹⁴. Nasze badanie jest pierwszym, w którym opracowano metodę bezpośredniego badania IMAT ręcznie wypreparowanego z ludzkich mięśni w celu ustalenia składu komórkowego przy użyciu sekwencji snRNA.

Co ważne, protokoły sekwencyjnego snRNA muszą być dostosowane do konkretnej badanej tkanki, ponieważ ilość dostępnej tkanki i właściwości fizyczne konkretnej tkanki będą dyktować optymalne etapy przetwarzania. Wydajność tkanek dla IMAT jest zazwyczaj niewielka, często nie przekracza 50 mg, nawet podczas wykonywania biopsji pod kontrolą USG. W związku z tym niezbędne jest odpowiednie przetwarzanie tej rzadkiej tkanki. Wierzymy, że protokół ten posłuży jako cenne źródło informacji dla naukowców zajmujących się ludzkimi IMAT.

Protokół

Próbka użyta do tego protokołu była częścią Studium Mięśni, Mobilności i Starzenia się (SOMMA)^15, które zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Western IRB-Copernicus Group (WCG) i zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu.

UWAGA : Ten protokół jest zaadaptowany z poprzedniego protokołu wykorzystującego 100 mg ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej w jamie brzusznej na platformie opartej na nanowellach¹⁶. Obecny protokół jest zoptymalizowany pod kątem 50 mg ludzkiego IMAT i przygotowania biblioteki przy użyciu platformy opartej na kropelkach. Może być konieczna dalsza optymalizacja tego protokołu pod kątem izolacji jąder z IMAT lub innych magazynów tłuszczu innych niż ludzkie.

1. Przygotowanie i odczynników (Tabela 1 i Tabela 2)

UWAGA: Przygotuj świeże w dniu eksperymentu i nie używaj ich ponownie.

1. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.
2. Przygotować bufor homogenizacyjny i pożywkę do izolacji jąder.
   1. Zaopatrz się w dwa wiadra z lodem i wstępnie ostudź 2 stożkowe probówki o pojemności 15 ml.
   2. Wymieszać wszystkie odczynniki do buforu homogenizacyjnego (HB) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w kolejności podanej w tabeli 1. Trzymaj na lodzie. Wymieszaj przez wirowanie.
   3. Wymieszać wszystkie odczynniki do izolacji jąder w stożkowej probówce o pojemności 15 ml z uporządkowanego wykazu w tabeli 2. Trzymaj na lodzie. Wymieszaj przez wirowanie.
   4. Przygotuj 10% Triton-X, dodając 100 μl Triton X-100 do 900 μl wody bez nukleaz. Wiruj, aby zapewnić prawidłowe mieszanie. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).

Rozdział SZT. szt. TGL szt.

Odczynnik	Objętość (μL)		Stężenie końcowe (mM)
	1x	2x
1 M MgCl2	10	20	5
1 M bufor Tris, pH 8,0	20	Rozdział 40	10
2 mln KCl	25	50	25
1,5 M sacharoza (-4oC)	Rozdział 334	668	Z kolei 250
1mM naziemna telewizja cyfrowa	cyfra arabska	4	0,001 (~1 μM)
100x inhibitor proteazy	20	Rozdział 40	1x
Superasin 20 U/μL	Rozdział 40	Rozdział 80	0,4 U/μL
Woda wolna od nukleaz	Rok 1549	Numer katalogowy: 3098	-
Całkowita objętość	Rok 2000	4000	-

Tabela 1: Bufor homogenizacyjny (HB). Trzymaj na lodzie. Wymieszaj przez wirowanie.

szt.

Odczynnik	Objętość (μL)		Stężenie końcowe (mM)
	1x	2x
Edta	0,4	0,8	0,1
Inhibitor RNAzy rybolocku (40U/μL)	Rozdział 40	Rozdział 80	0,8 U/μL
1% BSA-PBS (-/-)	Rok 1959.6	3919.2	-
Całkowita objętość	Rok 2000	4000	-

Tabela 2: Pożywka do izolacji jąder (NIM). Trzymaj na lodzie. Wymieszaj przez wirowanie.

2. Proszkowanie zamrożonej tkanki ( Rysunek 2A)

1. Przygotuj stację roboczą do homogenizacji.
   1. Napełnij kanister ciekłym azotem (LN₂).
      UWAGA: podczas pracy z LN₂ należy zawsze nosić okulary i rękawice kriogeniczne.
   2. Zdobądź 2x moździerz, 1x tłuczek, 1x szpatułkę do mikro-szufelki, 1x szklane odbicie i 1x tłuczek ze stali nierdzewnej do automatycznego bramkarza.
   3. Skonfiguruj automatyczny bramkarz.
   4. Napełnij zlewkę lodem i wstępnie ostudź szklankę.
2. Napełnij 2 moździerze (zawierające tłuczek i szpatułkę) LN₂, aby schłodzić instrumenty. Pozwól LN₂ odparować i powtórz.
3. Podczas gdy instrumenty stygną, dodaj 1 ml HB do szklanego odbicia.
4. Napełnić obie zaprawy LN₂ po raz ostatni i wlać próbkę 50 mg IMAT do jednej z zapraw.
5. Sproszkowaj IMAT za pomocą tłuczka, delikatnie dociskając go do kawałka tkanki, aby rozbić go na małe kawałki. Upewnij się, że wszystkie kawałki są sproszkowane.
6. LN₂ będzie powoli odparowywać podczas sproszkowania tkanki. Gdy tkanka jest odpowiednio sproszkowana, a pozostała jeszcze 1/4 - 1/2 zaprawy LN₂, należy przechylić zaprawę w kierunku krawędzi moździerza, aby zebrać sproszkowaną tkankę za wargę. Pozwól, aby LN₂ całkowicie wyparował.
7. Natychmiast po odparowaniu ostatniego LN₂ należy zgarnąć sproszkowaną tkankę do szklanej beczki zawierającej 1 ml HB.

3. Homogenizacja sproszkowanej tkanki

1. Homogenizuj sproszkowaną tkankę za pomocą automatycznego dokiwalacza. Przesuń szklankę w górę iw dół tłuczka ze stali nierdzewnej przez 10 uderzeń w kierunku do przodu, a następnie 10 uderzeń w odwrotnym kierunku.
2. Upewnij się, że roztwór po homogenizacji jest mętny i nie zawiera widocznych kawałków tkanki. Często oczekuje się jasnoróżowego koloru z powodu zanieczyszczenia tkanką mięśniową.
3. Przenieść homogenat do wstępnie schłodzonej probówki o niskim wiązaniu o pojemności 1,7 ml na lodzie.
4. Użyj 400 μl HB do przepłukania dounce, aby upewnić się, że cały materiał został przeniesiony i dodaj go do probówki.
   UWAGA: Jednocześnie można przetwarzać dwie próbki. Aby to zrobić, podwój ilość HB i NIM. Sproszkować i zhomogenizować jedną próbkę tkanki, a natychmiast po tym sproszkować i zhomogenizować drugą próbkę tkanki, aby móc równolegle przeprowadzić etapy izolacji i oczyszczania.

4. Izolacja i oczyszczanie jąder ( Rysunek 2B)

1. Dodać 14 μl Triton-X (10%) do homogenatu w celu uzyskania stężenia 0,1%.
2. Trzymaj rurkę na lodzie i w ciemności przez 10-15 minut, wirując co 3 minuty.
3. Wstępnie zwilżyć jedno sitko o pojemności 100 μm i jedno sitko o pojemności 40 μm (na próbkę) ze 100 μl RT DPBS na każdą próbkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
4. Przefiltrować homogenat przez sitko o pojemności 100 μm.
5. Przepłukać probówkę o pojemności 1,7 ml 400 μl HB i przefiltrować przez sitko o pojemności 100 μm.
6. Następnie przefiltruj roztwór przez sitko komórkowe 40 μm.
7. Przenieś równą ilość roztworu do dwóch wstępnie schłodzonych probówek o niskiej zawartości wiązania o pojemności 1,7 ml, odpowiadających ~900 μl w każdej probówce.
8. Odwirowywać probówki przez 10 minut przy 2700 x g w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu powinna być widoczna mała osadka.
9. Usunąć i wyrzucić górną warstwę lipidową i pozostały supernatant, pozostawiając ~50 μl roztworu z pierwszej probówki.
10. Powtórz dla drugiej probówki.
11. Dokładnie zawiesić granulkę w pierwszej probówce, delikatnie pipetując w górę i w dół 20 razy, a następnie przenieść do nowej probówki o niskim stopniu wiązania o pojemności 1,7 ml. Unikaj tworzenia bąbelków.
12. Powtórzyć tę procedurę dla drugiej probówki i przenieść ponownie zawieszony roztwór do tej samej probówki.
13. Dodać 500 μl NIM i wymieszać z pipetowaniem.
14. Odwirować probówkę z wagą o masie 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
15. Usunąć supernatant, pozostawiając ~50 μl i delikatnie pipetować w górę i w dół, aż osad zostanie ponownie zawieszony. Opcjonalnie przenieś zawieszony osad do nowej czystej probówki, jeśli z boku probówki pozostały resztki lipidów.
16. Dodać 200 μl NIM i wymieszać pipetując.

5. Barwienie i liczenie jąder (Rysunek 2C i Rysunek 3)

UWAGA : Aby ułatwić liczenie, ustaw protokół 'zliczania jąder' na automatycznym liczniku komórek, ponieważ dostosowanie jasnego pola i kanałów DAPI może znacznie wpłynąć na liczenie. Wyreguluj kanały tak, aby wychwytywane były tylko jądra, a nie zanieczyszczenia. Upewnij się, że kanał jasnego pola oznacza tylko "obiekty", które również mają plamę DAPI.

1. Dodać 1 kroplę roztworu do barwienia żywych komórek i pozostawić w ciemności, na lodzie, na 15 minut.
2. Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 30 μm.
3. Wymieszać roztwór jąder przez pipetowanie i dodać 10 μl roztworu do szkiełka w komorze do liczenia komórek.
4. Policz jądra za pomocą automatycznego licznika komórek.
   UWAGA: Optymalne stężenie to 1000 jąder/μl, co odpowiada 1,0 x 10⁶/ml.
   1. Upewnij się, że nie ma żadnych grudek jąder, ponieważ może to zatkać chip w celu generowania kropelek pojedynczych jąder (Rysunek 3).
   2. Jeżeli stężenie jąder nie jest wystarczająco wysokie, należy odwirowywać roztwór o stężeniu 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w mniejszej objętości.
   3. Jeśli stopień zanieczyszczeń w roztworze jest wysoki, ponownie zawiesić roztwór jąder w większej objętości NIM (tj. 1 ml) i ponownie przefiltrować przez sitko do komórek o wielkości 30 μm. Następnie wirować w temperaturze 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości w stosunku do stężenia jąder.
5. Po uzyskaniu stężenia jąder należy przejść bezpośrednio do pierwszego kroku w przygotowaniu biblioteki.

Rysunek 3: Barwienie izolowanych jąder. Obraz z licznika komórkowego jąder wybarwionych NucBlue/DAPI (obraz po lewej) i odpowiadający mu obraz jasnego pola (obraz po prawej). Obecność niewielkich ilości szczątków jest widoczna na obrazie w jasnym polu. Zastosowany tutaj automatyczny licznik komórek nie ma opcji dołączania podziałek liniowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Parametry przygotowania i sekwencjonowania biblioteki

1. Zapoznaj się z dokładnym protokołem przygotowania biblioteki przy użyciu podejścia opartego na pojedynczych jądrach opartych na kropelkach, dostępnym na stronie internetowej dostawcy¹⁷.
   1. Dążenie do odtworzenia jądra na poziomie 10 000. Jednak w przypadku próbek o wysokim poziomie szczątków lub delikatnych jąder przewiduje się mniejszą liczbę odzyskanych jąder.
   2. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4°C do 72 godzin po kroku 2.3 w protokole przygotowania biblioteki, aby połączyć równoległe przetwarzanie większej liczby próbek. W tym celu należy przetworzyć dwie próbki do kroku 2.3 przez dwa kolejne dni, a trzeciego dnia przetworzyć 4 próbki razem z kroku 3 i dalej w protokole przygotowania biblioteki.
2. Parametry sekwencjonowania: Sekwencja na platformie sekwencjonowania mająca na celu uzyskanie 50 000 odczytów sparowanych końców na jądro.
   UWAGA: Dane przedstawione w tym protokole zostały zsekwencjonowane na platformie NovaSeq 6000, dążąc do 50 000 odczytów sparowanych końców na jądro.

Rysunek 2: Przepływ pracy z protokołem. Schematyczna ilustracja przepływu pracy w (A) krokach 2 i 3, (B) kroku 4 i (C) kroku 5 protokołu. Figura została stworzona przy użyciu BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Przetwarzanie i analiza danych

UWAGA : W tym protokole pokrótce przedstawiono niektóre z zalecanych programów i pakietów R używanych do przetwarzania wynikowych danych sekwencjonowania, koncentrując się na krokach po początkowym wstępnym przetwarzaniu (Tabela 3). Badanie to dostarcza ogólnych wskaźników kontroli jakości (QC) oraz przykładowego przybliżenia i projekcji rozmaitości jednorodnej (UMAP) w Rysunek 4. Szczegółowy opis analizy bioinformatycznej wykracza jednak poza zakres niniejszego protokołu. Dlatego czytelnicy mogą zapoznać się z niedawnym przeglądem najlepszych praktyk w zakresie analizy pojedynczych komórek autorstwa Heumos et al.¹⁸.

1. Wstępne przetwarzanie danych sekwencjonowania
   1. Mapowanie odczytanych pojedynczych jąder do ludzkiego genomu referencyjnego GRCh38.
   2. Uwzględnij odczyty intronów w liczbie.
2. Wykonaj kontrolę jakości i filtrowanie danych za pomocą pakietu Seurat R¹⁹.
   1. Oblicz wynik złożoności komórki, dzieląc logarytm (10) liczby wykrytych genów przez logarytm (10) liczby wykrytych odczytów.
   2. Wykreśl najważniejsze wskaźniki kontroli jakości za pomocą histogramu lub wykresu skrzypcowego, w tym liczbę wykrytych genów na jądra, procent odczytu mitochondriów i wynik złożoności komórki.
   3. Odfiltruj jądra z mniej niż 200 lub więcej niż 10 000 genów na jądro, więcej niż 10% odczytów mitochondrialnych i wynikiem złożoności poniżej 0,8.
3. Normalizuj dane i przeprowadzaj redukcję wymiarów.
   1. Użyj funkcji SCTransform z Seurat, aby znormalizować dane przy użyciu 2000 zmiennych funkcji.
   2. Grupuj dane przy użyciu następujących funkcji z pakietu Seurat R: RunPCA, FindNeighbors, FindClusters i RunUMAP.
   3. Wykreśl UMAP, aby zwizualizować klastrowanie danych.
4. Odfiltruj przewidywane dublety za pomocą DoubletFinder R package²⁰ i ponownie grupuj dane.
5. Opisuj klastry przy użyciu znanych markerów genowych typów komórek, które mogą być obecne w tkance (podejście nadzorowane) lub w oparciu o 5 pierwszych genów o zróżnicowanej ekspresji między klastrami (podejście nienadzorowane).
6. Użyj decontX²¹, aby określić stopień zanieczyszczenia RNA w otoczeniu i dostosować macierz ekspresji genów dla RNA w otoczeniu.
   1. Uwzględnij surową matrycę genów jako tło.
7. Zapisz obiekt Seurat do przyszłej eksploracji danych.
   UWAGA: Kod do analizy QC i koncentracji jest dostępny w pliku uzupełniającym 1.

Pakiety oprogramowania/R używane w przepływie danych	Alternatywne oprogramowanie/pakiety	Etap przetwarzania
Strażnik komórki	STARsolo, kallisto	Przycinanie, wyrównywanie, mapowanie
Seurat powiedział:	SingleCellExperiment, Cellranger	Kontrola jakości, analiza i eksploracja danych
Wyszukiwarka dubletów	scds, scdblFinder, Scrublet	Wykrywanie dubletów
DecontX	SoupX, CellBender	Regulacja RNA otoczenia

Tabela 3: Oprogramowanie/narzędzia do przepływu danych.

Wyniki

Ten przepływ pracy został zaprojektowany, aby kierować przetwarzaniem zamrożonych próbek IMAT człowieka w celu uzyskania profili ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczych jąder, umożliwiając identyfikację typu komórki. W tym miejscu przedstawiono jedną reprezentatywną próbkę IMAT od uczestnika badania SOMMA.

Pierwszym krokiem każdej analizy danych sekwencyjnych snRNA jest ocena jakości danych w celu zidentyfikowania jąder niskiej jakości, które potencjalnie powinny zostać usunięte ze zbioru danych. Co ważne, kroki i progi filtrowania powinny być określone dla konkretnego typu próbki i zestawu danych, które masz pod ręką, ponieważ powszechnie oceniane wskaźniki mogą się różnić w zależności od typu tkanek i komórek^22,23. Rysunek 4A przedstawia wizualizacje niektórych kluczowych wskaźników używanych do oceny jakości generowanych danych sekwencyjnych snRNA. Liczba wykrytych genów w jądrze zależy od głębokości sekwencjonowania i typu komórki, ale oczekuje się, że będzie wyższa niż 200 dla jąder dobrej jakości^18,23. Stwierdzono, że dane wygenerowane przy użyciu tego protokołu mieszczą się w oczekiwanym zakresie z medianą 1134 genów na jądro, z łącznej liczby 4662 jąder.

Procent odczytów mitochondriów jest oceniany, ponieważ wysoki stopień zanieczyszczenia mitochondriów może wynikać z uszkodzonych jąder lub otaczającego RNA przyczepiającego się do jąder, co wskazuje na niską jakość jąder. W przedstawionym tutaj zestawie danych stwierdzono medianę procentu odczytu mitochondriów wynoszącą 2,65, czyli znacznie poniżej progu 5%-20% powszechnie stosowanego w literaturze^24,25,26. Odsetek odczytów rybosomalnych różni się w zależności od typu komórek i tkanek. Ponieważ jednak duże proporcje genów rybosomalnych mogą wpływać na grupowanie danych, zaleca się sprawdzenie procentu odczytu rybosomalnego i potencjalne usunięcie genów rybosomalnych lub jąder z wysokim poziomem genów rybosomalnych ze zbioru danych przed grupowaniem. Dane wygenerowane za pomocą tego protokołu wykazały niski poziom odczytów rybosomalnych z medianą 2,46% i maksimum 16,5%, dlatego nie filtrowaliśmy na podstawie tej metryki. Na koniec obliczono wynik złożoności komórki na podstawie logarytmu (10) liczby wykrytych genów podzielonej przez logarytm (10) liczby wykrytych odczytów. Oczekuje się, że dobrej jakości jądra będą powyżej 0,8, a medianę 0,92 uzyskano w próbce użytej w tym badaniu. Na podstawie tych wskaźników kontroli jakości można zdecydować, które jądra odfiltrować ze zbioru danych. Do analizy zdecydowaliśmy się odfiltrować jądra z mniej niż 200 lub więcej niż 10 000 genów na jądro, więcej niż 10% odczytów mitochondrialnych i wynikiem złożoności poniżej 0,8.

Po wstępnym etapie oceny jakości i filtrowania, można wygenerować UMAP do wizualizacji grupowania jąder. Grupowanie przeprowadzono w oparciu o 2000 najbardziej zmiennych genów za pomocą transformacji SCT. Początkowe etapy grupowania można wykorzystać do sprawdzenia, czy którakolwiek z cech QC grupuje się razem, np. jądra o wysokich odczytach mitochondrialnych. Co więcej, informacje o grupowaniu są wymagane dla niektórych metod wykrywania dubletów, w tym DoubletFinder²⁰, który był używany w tym protokole. Użyto DoubletFinder z oczekiwaną szybkością wielokrotności ustaloną na 4,8%, zgodnie z sugestią dostawców platformy opartej na kropelkach. Po usunięciu dubletu oszacowano poziom zanieczyszczenia RNA w otoczeniu, co jest szczególnie powszechne w preparatach pojedynczych jąder, ponieważ RNA jest uwalniane z cytoplazmy podczas lizy komórki i jest dozowane do żelowych kulek w emulsji (GEMs) i amplifikowane w następujących etapach przygotowania biblioteki. W związku z tym opracowano kilka narzędzi w celu skorygowania nieodłącznego problemu zanieczyszczenia RNA w otoczeniu (patrz Tabela 3). Użyliśmy pakietu R decontX^21, w którym surowa matryca tła (zawierająca tylko puste kropelki) jest używana do dostosowania macierzy ekspresji genów, zwiększając rzeczywistą sygnaturę ekspresji genów.

Grupowanie i zdolność do wykrywania typów komórek o niskiej liczebności zależy od liczby jąder. W tym badaniu wykryto wszystkie oczekiwane główne typy komórek w IMAT (Figura 4B) z łącznej liczby 3817 jąder po filtrowaniu QC, usunięciu dubletu i dostosowaniu otaczającego RNA. Obejmowały one komórki macierzyste, włóknisto-adipogenne komórki progenitorowe (FAP) i dojrzałe adipocyty, a także perycyty, komórki mięśni gładkich, komórki odpornościowe, komórki progenitorowe mięśni i mięśnie po zanieczyszczeniu komórek mięśni szkieletowych.

Ogólnie rzecz biorąc, wykazaliśmy, że ten protokół generuje dane o pojedynczych jądrach o wysokiej rozdzielczości, umożliwiając wykrycie adnotacji typu komórki, ważnej dla rozwikłania biologii i komórkowego pochodzenia IMAT.

Rysunek 4: Ocena jakości, grupowanie i adnotacja typu komórki w danych sekwencjonowania. (A) Wykresy skrzypcowe z podstawowymi wskaźnikami do oceny próbki i wydajności sekwencjonowania, w tym liczbą wykrytych genów w jądrze, procentem odczytów mitochondrialnych, procentem odczytów rybosomalnych i złożonością komórki mierzoną jako log(10) liczba wykrytych genów podzielona przez log(10) liczbę wykrytych odczytów. Mediany wartości dla każdej metryki są podane w zamkniętych polach. Łączna liczba jąder: 4662. (B) UMAP przedstawiający grupowanie pojedynczych jąder i odpowiadający im DotPlot pokazujący względną ekspresję genów markera typu komórki dla każdego klastra po filtrowaniu. Liczba jąder: 3817. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Kod do analizy QC i klastrów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Praca z IMAT wiąże się z kilkoma nieodłącznymi wyzwaniami. Oprócz ograniczonej dostępności, wydajność materiału próbki jest często bardzo rzadka, a "zanieczyszczenie" mięśni szkieletowych jest prawie niemożliwe do uniknięcia. Aby uzyskać próbkę najlepszej jakości, należy przeniknąć do powięzi mięśniowej podczas wprowadzania igły do biopsji (aby upewnić się, że nie pobiera się podskórnej tkanki tłuszczowej) i usunąć jak najwięcej tkanki mięśniowej poprzez wypreparowanie próbki pod mikroskopem natychmiast po pobraniu, a następnie przetworzenie w celu histologii, szybkiego zamrożenia itp. Jest to pierwsza metoda wykorzystania próbek IMAT prospektywnie pobranych i wypreparowanych z mięśni szkieletowych. Dla porównania, poprzednie dane dotyczące sekwencji snRNA w IMAT pochodziły z izolacji jąder mieszaniny biopsji mięśni szkieletowych ze znanym naciekiem tłuszczowym, a nie samego IMAT.

IMAT ma charakter gęstszy w porównaniu do podskórnych tkanek tłuszczowych, co sprawia, że prawidłowe sproszkowanie tkanki podczas izolacji jąder jest niezbędne do uwolnienia jąder ze struktury tkanki. Niewłaściwa proszkowanie może prowadzić do mniejszej wydajności jąder, co jest niekorzystne przy ograniczonej ilości tkanki. Co więcej, obliczenie prawidłowej liczby jąder w przygotowanym roztworze jąder jest krytycznym krokiem w celu zapewnienia wystarczającej liczby (ale nie za wielu) jąder do załadowania do chipa w celu wygenerowania GEM. Zbyt wiele jąder lub obecność dużych klastrów jąder lub szczątków może spowodować zatkanie, wpływając na końcowe stężenie cDNA i ostatecznie na wynik sekwencjonowania. Ominięcie zlepiania się jąder i zanieczyszczeń w preparacji pojedynczych jąder jest trudne i zależy od jakości próbki. Zbrylanie się jąder i/lub obecność zanieczyszczeń można zmniejszyć, włączając dodatkowy etap filtracji z sitkiem do komórek o średnicy 30 μm.

Ważne jest, aby szybko przetwarzać próbki, aby zmniejszyć ryzyko degradacji RNA. Utrzymywanie roztworów na lodzie lub schładzanych podczas wszystkich możliwych etapów izolacji jąder, a także dodanie wystarczającej ilości inhibitorów RNAzy, może zminimalizować degradację. Ze względu na znaczenie czasu przetwarzania dla każdej próbki, zalecamy przeprowadzanie maksymalnie dwóch próbek jednocześnie. Ponadto z roztworem jąder należy obchodzić się ostrożnie, aby jądra nie były zbyt delikatne. Delikatne jądra są podatne na pękanie podczas generowania GEM, co może skutkować powstawaniem dużych ilości RNA w próbce. W tym protokole etap filtrowania za pomocą strzykawki (opisany w protokole STAR¹⁶) został wykluczony w celu zachowania integralności jąder.

Wybór metody przygotowania biblioteki zależy od pytania badawczego. Pracowaliśmy zarówno nad podejściem opartym na pojedynczych jądrach kropelkowych, jak i nanostunkowych. Podejście oparte na nanostudzienkach profiluje 1200-1600 jąder i około 3000-6000 wykrytych genów na jądro¹⁶. Co więcej, podejście to obsługuje transkryptomikę o pełnej długości, co pozwala na badanie zmienności strukturalnej, pseudogenów i wariantów splicingu²⁷. Dla porównania, ponad 10 000 jąder można profilować przy użyciu podejścia kropelkowego, ale kosztem mniejszej liczby wykrywanych genów na jądro (2-3-krotnie niższej). W przypadku tego protokołu zdecydowaliśmy się użyć jednej z platform opartych na kropelkach, ponieważ większa liczba profilowanych jąder daje nam większą zdolność do wykrywania rzadkich typów komórek o niskiej liczebności²⁸.

Głównym ograniczeniem sekwencji snRNA jest utrata zawartości cytozolu, co ogranicza analizę ekspresji do transkryptów jądrowych. Jądro zawiera 10-100 razy mniej mRNA niż cała komórka²⁹, co może być problemem dla odkrycia wszystkich typów komórek w tkance. Jednak niedawne badanie przeprowadzone przez Guptę i wsp. wykazało, że transkryptomika jądrowa - w porównaniu z transkryptomiką całych komórek²⁹ - wykryła podobne populacje komórek i profile ekspresji biologicznie istotnych genów w hodowanych preadipocytach i dojrzałych adipocytach. Podobne wyniki uzyskano w innych typach komórek^30,31.

Izolacja pojedynczych jąder ma swoje zalety w zapewnianiu wzorców ekspresji genów o rozdzielczości pojedynczej komórki (sc) w delikatnych komórkach niezgodnych z sekwencją scRNA. Ponadto można wykorzystać zamrożone próbki z biobanków, a izolacja jąder nie wymaga enzymatycznego trawienia tkanki, co może wywołać reakcję stresową w komórkach, wpływając na transkryptom³². Stosując sekwencję snRNA, byliśmy w stanie transkrypcyjnie profilować adipocyty i inne typy komórek obecne w IMAT, co nie byłoby możliwe w przypadku sekwencji scRNA, ponieważ adipocyty są obciążone lipidami i niezgodne z podejściem opartym na kropelkach.

Ważnym zastosowaniem snRNA-Seq IMAT jest rozszyfrowanie składu komórkowego i różnic transkrypcyjnych IMAT w różnych stanach metabolicznych. Co więcej, zestawy danych snRNA-seq mogą być wykorzystane do dekonwolucji masowego sekwencjonowania RNA na IMAT w celu oceny różnic w składzie komórek na większą skalę³³. Dodatkowo, pseudo-czasowa analiza danych sekwencyjnych snRNA-seq może służyć do identyfikacji trajektorii dojrzewania komórek, co jest szczególnie interesujące w tkankach takich jak IMAT, w których pochodzenie komórkowe dojrzałych adipocytów jest nadal przedmiotem dyskusji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,2 &mikro; Filtry strzykawkowe M Corning	Rurki Millipore Sigma	CLS431229
1,7 ml DNA LoBind	Eppendorf	22431021	probówki o niskim poziomie wiązania
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
100x inhibitor proteazy	Thermo Fisher Scientific	78437
10X Separator magnetyczny	10X Genomics	230003
10X Adapter Vortex	10X Genomics
Probówki kanoniczne 15 ml	Sarstedt	6,25,54,502
2100 Bioanalizator	Agilent	G2939BA
50 ml	Sarstedt	6,25,47,254
Zestaw akcesoriów CellRanger	Genomics	N/A
Chromium iX	10X Genomics	PN1000323
Chromium iX Controller	10X Genomics	PN1000326
Chromium Next GEM Chip G Zestaw jednoogniwowy	10X Genomics	PN1000127
Chromium Next GEM Jednokomórkowy 3-calowy zestaw kulek żelowych v3.1	10X Genomics	PN1000129
Chromium Next GEM Zestaw jednokomórkowy GEM v3.1	10X Genomics	PN1000130
Countess 3 Automatyczny licznik komórek	Thermo Fisher Scientific	AMQAX2000	Automatyczny licznik komórek
Szkiełka komory zliczania komórek Countess	Thermo Fisher Scientific	C10228
DoubletFinder	R	N/A
DPBS (bez wapnia, bez magnezu)	Thermo Fisher Scientific	14190144
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0861
Zestaw podwójnego indeksu TT Zestaw A, 96 rxns	10X Genomics	PN1000215
Dynabeads MyOne SILANE	10X Genomics	PN2000048
Falcon 100 µ m Sitko do komórek	Corning Life Science	352360
Falcon 40 µ m Sitko komórkowe	Corning Life Science	352340
Gliceryna (glicerol), 50% (v/v) Roztwór wodny	Ricca Chemical Company	3290-32
KCL	Thermo Fisher Scientific	AM9640G
Library Zestaw konstrukcyjny v3.1	10X Genomics	PN1000196
MACS SmartStrainers (30µ m)	Miltenyi Biotec	130-098-458
Mastercycler Nexus Gradient Termocykler	Eppendorf	6331000017
MgCl2	Ambion	AM9530G
Moździerz i pestel	Logistyka opieki zdrowotnej	14075
Odczynnik do sond NucBlue Live Ready	Thermo Fisher Scientific	R37605
Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)	Thermo Fisher Scientific	AM9930
Probumin Albumina surowicy bydlęcej bez kwasów tłuszczowych, proszek	Sigma-Aldrich	820024
Qiagen Bufor EB	Qiagen	19086
Inhibitor RNAzy ryboloku	Thermo Fisher Scientific	EO0382
Seurat	R	Nie dotyczy Sacharozy
	Sigma-Aldrich	S0389
SUPERasin 20 U/µ L	Thermo Fisher Scientific	AM2695
ThermoMixer C	Eppendorf
Homogenizator tkankowy	Glass-Col	099C K54
Tris bufor pH 8,0	Thermo Fisher Scientific	AM9855G
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	AC327372500
UltraPure 0,5M EDTA pH 8,0	Gibco	15575020