Artykuł metodologiczny

Inżynieria komórek mikrogleju indukowanych ludzką krwią do badań mózgu z odwrotną translacją

DOI:

10.3791/66819

⸱

6 września 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuropsychiatry, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 2Department of Functional Anatomy and Neuroscience, Asahikawa Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do tworzenia ludzkich komórek mikrogleju (iMG) pochodzących z monocytów, które umożliwiają pośrednią ocenę stanu zapalnego mózgu. Przedstawia to model komórkowy, który może być korzystny dla badań koncentrujących się na potencjalnym zapaleniu mózgu i związanych z nim zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie badania z wykorzystaniem modeli zwierzęcych podkreśliły znaczenie mikrogleju jako kluczowych modulatorów immunologicznych w różnych chorobach neuropsychiatrycznych i fizycznych. Pośmiertna analiza mózgu i obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej są reprezentatywnymi metodami badawczymi, które oceniają aktywację mikrogleju u ludzi; Odkrycia ujawniły aktywację mikrogleju w mózgach pacjentów z różnymi zaburzeniami neuropsychiatrycznymi i przewlekłym bólem. Niemniej jednak wspomniana technika jedynie ułatwia ocenę ograniczonych aspektów aktywacji mikrogleju.

Zamiast biopsji mózgu i techniki indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, początkowo opracowaliśmy technikę generowania bezpośrednio indukowanych komórek mikrogleju (iMG) ze świeżo pozyskanych ludzkich monocytów krwi obwodowej poprzez uzupełnianie ich czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów oraz interleukiną 34 przez 2 tygodnie. Te komórki iMG mogą być wykorzystywane do przeprowadzania dynamicznych analiz morfologicznych i na poziomie molekularnym dotyczących pojemności fagocytarnej i uwalniania cytokin po stymulacji stresem na poziomie komórkowym. Ostatnio kompleksowa analiza transkryptomu została wykorzystana do zweryfikowania podobieństwa między ludzkimi komórkami iMG a pierwotnym mikroglejem w mózgu.

Pochodzące od pacjentów komórki iMG mogą służyć jako kluczowe zastępcze markery do przewidywania aktywacji mikrogleju w ludzkich mózgach i pomogły w odkryciu wcześniej nieznanej dynamicznej patofizjologii mikrogleju u pacjentów z chorobą Nasu-Hakola, fibromialgią, chorobą afektywną dwubiegunową i chorobą Moyamoya. W związku z tym technika oparta na iMG służy jako cenne narzędzie do odwrotnej translacji i dostarcza nowych informacji na temat dynamiki patofizjologii molekularnej mikrogleju w różnych chorobach psychicznych i fizycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach sugerowano, że zapalenie mózgu odgrywa kluczową rolę w patofizjologii różnych zaburzeń mózgowych i neuropsychiatrycznych; mikroglej został wyróżniony jako kluczowe komórki immunomodulujące przez ludzką analizę pośmiertną mózgu i techniki bioobrazowania oparte na pozytonowej tomografii emisyjnej (PET)1,2,3,4. Pośmiertne analizy obrazowania mózgu i PET przyniosły znaczące wyniki; Niemniej jednak podejścia te są nieskuteczne pod względem uchwycenia dynamicznej aktywności molekularnej ludzkiego mikrogleju w mózgu w całości. W związku z tym potrzebne są nowe strategie, które umożliwią kompleksową ocenę funkcji i dysfunkcji mikrogleju u ludzi na poziomie molekularnym i komórkowym.

W 2014 roku pierwotnie opracowaliśmy nowatorską technikę wytwarzania bezpośrednio indukowanych komórek mikrogleju (iMG)5,6, przed pierwszą publikacją ludzkich komórek podobnych do mikrogleju pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w 2016 roku7. W ciągu zaledwie 2 tygodni udało nam się przekształcić ludzkie monocyty krwi obwodowej w komórki iMG poprzez optymalizację cytokin, czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) i interleukiny 34 (IL-34). Kiedy opracowaliśmy tę technikę, innowacyjna metoda przeprogramowania polegająca na indukowaniu komórek neuronalnych z komórek iPS lub fibroblastów dopiero zaczynała dominować na świecie8,9,10,11. Jednak w tym czasie nie opisano jeszcze metody indukcji komórek mikrogleju pochodzących z iPS i pożądane było stworzenie modelu mikrogleju pochodzącego z ludzkich komórek somatycznych. Ponieważ cytokiny takie jak GM-CSF i IL-34, czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów, zostały uznane za niezbędne do rozwoju i utrzymania mikrogleju12,13,14,15, postawiliśmy hipotezę, że kombinacja tych cytokin może być bezpośrednio zastosowana do wygenerowania modelu komórkowego mikrogleju z monocytów krwi. Na koniec udało nam się opracować model mikrogleju pochodzącego z monocytów, łącząc GM-CSF i IL-345. Ponadto niektóre z tych kombinacji cytokin są również wykorzystywane do indukowania mikrogleju z komórek iPS7,16 i zakłada się, że są ważnym czynnikiem w uzyskiwaniu cech mikrogleju.

W przeciwieństwie do metod iPSC, komórki iMG nie wymagają żadnych modyfikacji genetycznych i mogą być generowane w bardzo krótkim czasie przez prostą indukcję chemiczną, co skutkuje niższym czasem i kosztami finansowymi. Co więcej, komórki iMG nie wymagają przeprogramowania genetycznego, dlatego uważamy, że komórki iMG są silnymi komórkami zastępczymi do oceny nie tylko cech, ale także stanów ludzkiego mikrogleju. We wstępnym artykule na temat techniki iMG w 2014 roku potwierdziliśmy, że komórki iMG wykazują fenotyp ludzkiego mikrogleju, który może różnić się od monocytów i makrofagów. Na przykład komórki iMG wykazywały współczynnik nadekspresji receptora chemokiny CX3C 1 (CX3CR1) i receptora chemokiny C-C typu 2 (CCR2) niż monocyty i typowe markery mikrogleju, w tym białko transbłonowe 119 (TMEM 119) i receptor purynergiczny P2RY125,17. Niedawno potwierdziliśmy, że komórki iMG pochodzące z krwi obwodowej przypominają mikroglej mózgu pod względem profilu ekspresji genów dobrze znanych markerów mikrogleju u tego samego pacjenta, który przeszedł operacje mózgu18. Komórki iMG mogą być analizowane pod kątem dynamicznych funkcji na poziomie molekularnym, takich jak fagocytoza i produkcja cytokin, i oczekuje się, że zrekompensują wady pośmiertnych badań mózgu i badań PET.

Odkryliśmy wcześniej nieznane dynamiczne mechanizmy patofizjologiczne z udziałem mikrogleju u pacjentów, u których zdiagnozowano chorobę Nasu-Hakola5, fibromialgia19, choroba afektywna dwubiegunowa20,21, lub choroba Moyamoya22. Ponadto, w oparciu o naszą oryginalną metodologię, różne laboratoria wykorzystały komórki iMG (niektóre laboratoria wyznaczyły alternatywne nazwy dla tych komórek) jako kluczowe narzędzie do badań odwrotnej translacji23,24,25,26,27. Sellgren i wsp. z powodzeniem wygenerowali komórki iMG zgodnie z naszymi zaleceniami i przeprowadzili analizę mikromacierzy, która wykazała, że komórki te bardzo przypominają mikroglej ludzkiego mózgu23. Niedawno potwierdziliśmy podobieństwo między ludzkimi komórkami iMG a pierwotnym mikroglejem w mózgu, używając sekwencjonowania RNA18.

To badanie miało na celu udokumentowanie metodologii generowania komórek iMG z ludzkiej krwi obwodowej, aby ułatwić badania nad odwrotną translacją skoncentrowane na chorobach neuropsychiatrycznych. Technika ta ma potencjał jako rozsądne narzędzie analityczne, które może bez wysiłku wytworzyć modele komórkowe mikrogleju w krótkim czasie, nawet w źle wyposażonych laboratoriach, które nie mają aparatury do transferu genów lub wykwalifikowanego personelu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół badania został zatwierdzony przez Komitet Etyki Uniwersytetu Kiusiu i był zgodny ze wszystkimi postanowieniami Deklaracji Helsińskiej. Uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich uczestników, w tym zdrowych ochotników i pacjentów, na analizę ich krwi i opublikowanie danych. Materiały i wyposażenie są wymienione w Tabeli Materiałów, a składy roztworów są szczegółowo opisane w Tabeli 1.

1. Przygotowanie pożywek i do eksperymentów

  1. Przygotować pożywkę izolacyjną, uzupełniając RPMI-1640 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (56 °C, 30 min) i 1% penicyliną-streptomycyną.
  2. Przygotować bufor izolacyjny, uzupełniając zasadowy roztwór buforowy 0,5% roztworem podstawowym albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i wysterylizować go przez filtrację (0,22 μm).

2. Izolacja komórek jednojądrzastych z krwi pełnej

  1. Przenieść 15 ml pożywki o gradionym natężeniu gęstości do probówki wirówkowej o gradiacji gęstości o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 000 × g przez 1 minutę w temperaturze 20 °C.
    UWAGA: Wyizoluj 15 ml krwi na probówkę wirówkową o gradiacji gęstości o pojemności 50 ml. Zwiększ liczbę probówek, gdy objętość krwi jest wysoka.
  2. Homogenizować krew zebraną w probówkach z heparyną przez odwrócenie i zdjąć pokrywkę z probówki do pobierania krwi za pomocą pęsety sterylizowanej ogniowo.
  3. Dozować równą objętość (10-15 ml) krwi do pożywki o gradiencie gęstości w probówce wirówkowej z gradientem gęstości.
  4. Ustaw poziom opóźnienia wirówki na 1 z 4 poziomów i odwiruj przy 1 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Przy tej prędkości zwalniania prędkość obrotowa 180 × g (1 000 obr./min) zatrzymuje się w ciągu 3 minut.
  5. Przygotować taką samą liczbę probówek wirówkowych o pojemności 50 ml jak probówki wirówkowe z gradientem gęstości o pojemności 50 ml i napełnić każdą probówkę 10 ml PBS (−).
  6. Po odwirowaniu usunąć wierzchnią warstwę osocza do około 1 cm powyżej kożuchówki.
    UWAGA: Włóż pipetę zasysającą pionowo do probówki i ostrożnie odsysaj od środka powierzchni cieczy. Nie przesadzaj, aby nie naruszyć kożuchwowej sierści.
  7. Zdekantować cały pozostały supernatant z probówki wirówkowej o gradiacji gęstości o pojemności 50 ml do probówki wirówkowej zawierającej 10 ml PBS (−).
  8. Zresetuj poziom opóźnienia wirówki do 3 z 4 poziomów i odwiruj przy 250 × g przez 10 minut przy temperaturze pokojowej. Na tym etapie przygotuj jedną probówkę wirówkową o pojemności 50 ml i dwie probówki o pojemności 15 ml oraz sitko do komórek o pojemności 100 μm.
  9. Po odwirowaniu ustalić temperaturę wirówki na 4 °C. Szukać białego osadu z czerwonym obrzeżem na dnie probówki wirówkowej. Usunąć supernatant przez aspirację i delikatnie poluzować osad, stukając.
  10. Umieść sitko o średnicy 100 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml za pomocą pęsety sterylizowanej ogniowo.
  11. Dodać 13 ml pożywki izolacyjnej do jednej z odwirowanych probówek i umyć wewnętrzną ściankę, aby prawidłowo zebrać komórki. Pobrać zawiesinę komórkową i kolejno przemyć pozostałe odwirowane probówki. Po zebraniu komórek ze wszystkich probówek, przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Podłoże izolacyjne musi być schłodzone przez cały proces izolacji (kroki 2.11-2.16).
  12. Ponownie przemyć każdą probówkę 13 ml pożywki izolacyjnej, jak opisano w kroku 2.11. Zbierz łącznie 26 ml zawiesiny komórek.
  13. Dozować równe ilości do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml, policzyć komórki i obliczyć odpowiednie stężenie buforu izolacyjnego (60 μl buforu na 107 wszystkich komórek) dla kroku 2.16.
    UWAGA: Stożkowa rurka o pojemności 15 ml jest lepsza w obsłudze, ponieważ objętość cieczy jest niewielka, a ciecz łatwo bąbelkuje podczas pipetowania w kroku 2.16.
  14. Wirować przy 250 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  15. Podczas wirowania należy dokładnie zdezynfekować stojak magnetyczny (zwłaszcza część stykającą się z kolumną) 70% etanolem i umieścić go na stole do wyschnięcia na powietrzu. Przechowywać bufor izolacyjny na lodzie.
  16. Usunąć supernatant przez aspirację (na tym etapie należy poszukać czerwonych granulek o grubości ~1 mm ze względu na obecność czerwonych krwinek), dodać odpowiednią ilość buforu izolacyjnego i delikatnie poluzować osad, pipetując ~20x.

3. Izolacja monocytów za pomocą mikrogranulek CD11b

  1. Wiruj ludzki odczynnik blokujący FcR przez 10 s przed aplikacją. Wprowadzić wymaganą ilość odczynnika (20 μl odczynnika blokującego FcR na 10-7 wszystkich komórek) i inkubować w komorze w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  2. Wiruj mikrogranulki CD11b przez 10 s przed aplikacją. Wprowadzić wymaganą ilość odczynnika (20 μl mikrogranulek CD11b na 107 wszystkich komórek) i inkubować w komorze o temperaturze 4 °C przez 20 minut, mieszając ręcznie co 5 minut.
  3. Po inkubacji dodać 10 ml buforu izolacyjnego, zawiesić przez delikatne pipetowanie i odwirować przy 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Podczas wirowania umieść kolumnę magnetyczną na stojaku magnetycznym i przepłucz ją 3 ml buforu izolacyjnego.
    UWAGA: Powstrzymaj się od dotykania magnetycznej części kolumny i ustaw kolumnę prawidłowo. Jeśli bąbelki dostaną się do kolumny, usuń je pipetą. Bufor izolacyjny musi być schładzany przez cały proces izolacji (kroki 3.4-3.9).
  5. Usunąć supernatant po odwirowaniu przez aspirację, dodać 1 ml buforu izolacyjnego, delikatnie wymieszać pipetując i nałożyć zawiesinę na kolumnę.
  6. Przemyć kolumnę 3x, dodając 3 ml buforu izolacyjnego za każdym razem, gdy zbiornik kolumny jest pusty
    7. .
  7. Umieścić kolumnę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, nie dotykając części magnetycznej; wprowadzić 5 ml buforu izolacyjnego do kolumny i wypchnąć ciecz przez kolumnę za pomocą tłoka włożonego do probówki.
  8. Odwirować zawiesinę komórkową zebraną w probówce o stężeniu 300 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce izolacyjnej. Ponieważ ~5-10% liczby komórek zliczonych w kroku 2.13 zostanie odzyskanych, dostosuj objętość zawiesiny do liczby komórek.
    UWAGA: Podłoże izolacyjne powinno być używane w temperaturze pokojowej i nie powinno być podgrzewane, aby uniknąć gwałtownych zmian temperatury od 4 °C.
  10. Zliczyć komórki i podwielokrotność 500 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki 24-dołkowej płytki o stężeniu 40 × 104 komórki/ml i inkubować przez noc.
    UWAGA: Zawiesiny komórek powinny być odpowiednio pipetowane zgodnie z dostosowaną objętością wysiewu wymaganą dla różnych płytek. Na przykład 1 ml na jedną studzienkę w 12-dołkowej płytce i 250 μl na jedną studzienkę w 8-dołkowym szkiełku macierzystym.
  11. Na koniec należy zutylizować lub zdezynfekować skażony sprzęt zgodnie z polityką postępowania z odpadami zakaźnymi ustanowioną przez zakład.

4. Indukcja komórek iMG z monocytów

  1. Przygotować pożywkę indukcyjną, uzupełniając podstawową pożywkę indukcyjną 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym, 10 ng/ml rekombinowanego ludzkiego GM-CSF i 100 ng/ml rekombinowanego ludzkiego IL-34.
  2. Zastąp pożywkę izolacyjną z siewu z poprzedniego dnia pożywką indukcyjną. Przechylić płytkę do przodu i natychmiast odessać zubożone podłoże od przedniej krawędzi dna studzienki za pomocą pipety Pasteura. Wymieniaj pożywkę w ilości maksymalnie 1 płytki (= 24 dołki) na raz i natychmiast delikatnie dodaj 500 μl pożywki indukcyjnej.
    UWAGA: Na tym etapie należy wybrać przylegające monocyty.
  3. Inkubuj komórki przez 14 dni, aby zakończyć indukcję.
  4. Po 14 dniach ponownie zastąpić pożywkę 500 μl pożywki indukcyjnej. Następnie, w celu konserwacji ogniw po indukcji, należy co tydzień zastępować pożywkę indukcyjną 500 μl świeżej pożywki indukcyjnej.

5. Immunocytochemia

  1. Usunąć pożywkę z szkiełka 8-dołkowego z komórkami wysianymi komórkami w kroku 3.10 przez aspirację i przepłukać PBS (−).
  2. Utrwal komórki przez 20 minut w temperaturze pokojowej za pomocą 4% paraformaldehydu.
  3. Usunąć odczynnik utrwalający i płukać komórki przez 3 x 5 minut PBS (−).
  4. Przepuszczalność komórek za pomocą PBS (−) zawierającego 0,1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej.
  5. Inkubować permeabilizowane komórki z roztworem blokującym (3% BSA/PBS (−)) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Inkubować komórki przez noc z przeciwciałami pierwszorzędowymi (tabela materiałów) w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Wszystkie przeciwciała rozcieńcza się w roztworze blokującym.
  7. Płukać komórki przez 3 x 5 min PBS (−) przez 5 minut każda.
  8. Inkubować wypłukane komórki z odpowiednimi fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi przez 1 godzinę w RT (Tabela Materiałów).
  9. Przepłukać komórki przez 3 x 5 minut PBS (−) w celu usunięcia przeciwciał drugorzędowych.
  10. Inkubować komórki z roztworem DAPI (1:10 000) rozcieńczonym PBS (−) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Przepłukać komórki przez 3 x 5 minut PBS (−).
  12. Zamontuj studzienkę za pomocą podłoża montażowego i zwizualizuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Co ważne, istnieje duża niejednorodność na poziomie osoby i czasu w charakterach komórek iMG, w tym morfologiach i ekspresjach genów. Komórki iMG u niektórych osobników przybierają wygląd licznie rozgałęzionych (Rycina 1A), podczas gdy u innych pozostają kuliste (Rycina 1B). Charakterystyka iMG może się różnić nawet w obrębie jednej osoby, co sprawia, że komórki iMG są kluczowym narzędziem do wykrywania biomarkerów stanu choroby. Z drugiej strony, badanie takich różnic międzyosobniczych uzasadnia ograniczenie błędów technicznych. Komórki iMG definiuje się jako monocyty indukowane GM-CSF i IL-34 przez co najmniej 14 dni. Aby zminimalizować błędy techniczne, zaleca się standaryzację czasu indukcji, stosowanie tych samych ilości odczynników i powstrzymanie się od używania przeterminowanych odczynników.

Walidacja barwienia immunologicznego potwierdza również, że komórki iMG wyrażają markery mikrogleju, w tym P2RY12 i TMEM119 (Rysunek 2). Wcześniejsze badania wykazały, że cechy morfologiczne i ekspresja genów komórek iMG są związane z patofizjologią choroby afektywnej dwubiegunowej20,21. Najwcześniejsze rozgałęzione komórki zaobserwowano w 3 dniu po leczeniu GM-CSF i IL-34, a komórki iMG w optymalnym stanie mogą przetrwać dłużej niż 1 miesiąc, gdy zmiana pożywki jest wykonywana raz w tygodniu. Komórki iMG mogą być wykorzystywane do analizy ekspresji genów. Na przykład, pod wpływem stymulacji interferonem gamma lub IL-4, komórki iMG zmieniły wzorzec ekspresji genów, który można wykorzystać do oceny funkcjonalnej spolaryzowanego mikrogleju M1 i M25,22. Co więcej, koraliki FITC wywołują podobne do ameboidów modyfikacje morfologiczne i zwiększają ekspresję TNFα i innych genów5. Ponadto fagocytozę można ocenić, mierząc intensywność fluorescencji koralików5,22. Ponadto, ponieważ komórki iMG są komórkami żywotnymi, ich rzeczywisty ruch i zmiany morfologiczne można zaobserwować, robiąc zdjęcia komórek (Ryc. 3) lub poprzez fotografię poklatkową (Wideo 1).

figure-results-1
Rysunek 1: Morfologia komórek iMG. (A) Typowy rozgałęziony iMG wykazywał drobne ciała somy i liczne rozgałęzione boczki. (B) Niektóre próbki różniły się wyglądem, np. typ ameboidalny. Podziałka skali, 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Immunocytobarwienie komórek iMG. Komórki iMG wyrażają typowe markery mikrogleju: (A) TMEM 119, (B) P2RY12. Jądra barwiono DAPI (na niebiesko). Podziałka =10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Modyfikacje morfologiczne w komórkach iMG. iMG zmieniają swoją morfologię podczas procesu indukcji. Wypukłości komórek pojawiają się (A) około 3 dnia i wydłużają się w dniach (B) 7 i (C) 14 w miarę postępu indukcji. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Fotografia poklatkowa komórek iMG. Rozgałęziona komórka iMG w centrum wydawała się nawiązywać kontakt z otaczającymi komórkami, jednocześnie wydłużając i kurcząc ich procesy. Ponadto komórka wykonywała fagocytozę uszkodzonych komórek. Interwały akwizycji obrazu wynosiły 46 sekund, a czas filmowania wynosił około 14 godzin. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Tabela 1: Skład roztworów Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki analityczne wykorzystujące komórki iMG mogą służyć jako silne narzędzia badawcze odwrotnej translacji 5,6. Aby wygenerować wystarczającą ilość ludzkich komórek iMG, eksperymentatorzy powinni zaprojektować swoje badania z uwzględnieniem pewnych kwestii. Próbki krwi pochodzące od ludzi są niezwykle wrażliwe; W związku z tym uzyskane próbki wymagają szybkiego przetwarzania i skrupulatnego obchodzenia się z nimi, aby uniknąć zanieczyszczenia. W szczególności próbki krwi powinny być oddzielone natychmiast po pobraniu i nie pozostawiane bez opieki przez dłuższy czas. Doświadczenia zwykle rozpoczyna się w ciągu 3 godzin od pobrania krwi w celu potwierdzenia ich ważności; Możliwe jest jednak przechowywanie próbek krwi w temperaturze 4°C przez ponad 3 godziny i doprowadzenie ich do temperatury pokojowej przed rozpoczęciem protokołów separacji.

Aby zapewnić stabilne wyniki, zaleca się użycie odczynników, takich jak pożywki hodowlane, w ciągu miesiąca od rozpieczętowania i wyrzucenie po upływie terminu. Podczas oddzielania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej za pomocą wirowania w gradionym gradiencie gęstości, w niektórych próbkach można zaobserwować agregację komórek. W takich przypadkach próbka krwi pełnej musi być rozcieńczona PBS (−) w celu zapobieżenia agregacji. Podczas indukcji różnicowania do mikrogleju pożywka hodowlana nie jest wymieniana przez 14 dni, aby uniknąć niepotrzebnej stymulacji komórek. Po zakończeniu indukcji różnicowania, zastąpienie pożywki świeżą pożywką może przywrócić osłabione komórki i utrzymać żywotność przez jakiś czas.

Technika iMG ustalona w tym badaniu stanowi ograniczenie; Eksperymentalnie wywołane "komórki podobne do mikrogleju" są porównywalne, ale nie całkowicie identyczne z rzeczywistymi komórkami mikrogleju w ludzkim mózgu. Ponadto wcześniejsze badania udokumentowały metodologię indukcji ludzkich komórek podobnych do mikrogleju pochodzących z monocytów, a różne grupy badawcze zaproponowały własne odrębne protokoły i nazwy zależne od oryginalnych metod iMG28. Na przykład niektóre protokoły wykorzystują M-CSF 29,30,31,32 lub TGF-β 33, które według doniesień promują fenotyp podobny do mikrogleju w kulturach mikrogleju pochodzących z iPSC lub na powłokach, takich jak Geltrex24,34; Czynniki te mogą okazać się skuteczne w indukowaniu komórek podobnych do mikrogleju.

Oryginalna technologia iMG jest korzystna ze względu na prosty i łatwy do odtworzenia protokół z zaledwie dwiema cytokinami i bez powłok, który umożliwia różnorodne eksperymenty z odwrotną translacją z wykorzystaniem ludzkiej krwi. I odwrotnie, postęp technologiczny ułatwił rozwój wielu produktów. Metody separacji magnetycznej obejmują selekcję pozytywną opartą na kolumnach, podobną do naszego protokołu, a także selekcję negatywną i metody bez kolumn. Ponadto zamiast separacji magnetycznej można rozważyć alternatywną metodę separacji wykorzystującą adhezję plastyczną. Pozytywna selekcja oparta na kolumnach zapewnia czystość, ale technika ta jest czasochłonna, a stymulacja za pomocą kulek magnetycznych znacząco wpływa na komórki35. Przeciwnie, selekcja negatywna i adhezja plastyczna mogą być mniej szkodliwe dla komórek; Niemniej jednak podejścia te mogą być mniej czyste 35,36. W przyszłości może być konieczna dalsza modyfikacja w oparciu o inne protokoły.

Powyższe wyniki potwierdzają, że główną zaletą tej technologii iMG jest jej krótki czas trwania, opłacalna metodologia i zdolność do przetwarzania dużej liczby próbek do badań o wysokiej przepustowości. W związku z tym technologia ta może być wykorzystywana do pozyskiwania wiedzy z próbek pobranych od ludzi, a następnie do przeprowadzania dalszych badań walidacyjnych z wykorzystaniem różnych modeli zwierzęcych. Ponadto korzystne mogą być wyniki badań przeprowadzonych na modelach komórkowych i zwierzęcych z zastosowaniem techniki iMG. W ten sposób nasza technika iMG może być stosowana do dwukierunkowych badań translacyjnych w sposób od łóżka do łóżka pacjenta i od stołu do łóżka.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez następujące granty na badania naukowe: (1) Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (KAKENHI; JP18H04042, JP19K21591, JP20H01773, a JP22H00494 do TAK, JP22H03000 do M.O.); (2) Japońska Agencja Badań i Rozwoju Medycznego (AMED; JP21wm0425010 do TAK, JP22dk0207065 do M.O.) oraz (3) Japońska Agencja Nauki i Technologii CREST (JPMJCR22N5 do TAK). Organy finansujące nie odgrywały żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowywaniu manuskryptu. Serdecznie dziękujemy firmie Editage (www.editage.jp) za redakcję w języku angielskim.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1% Triton X-100Sigma-Aldrich30-5140-5
4% paraformaldehydNacalai Tesque09154-14
Antybiotyk-Antybiotyk (100x)gibco15240-062opisany jako "roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy"
autoMACS Roztwór do płukaniaMiltenyi Biotec130-091-222opisany jako "podstawowy roztwór buforowy" i stosowany jako "bufor izolacyjny"
CD11b MicroBeadsMiltenyi Biotec130– 049-601
Roztwór DAPIDOJINDO28718-90-3
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco,Nacalai Tesque14249-24opisana jako "PBS (−)"
Płodowa surowica bydlęcabiowestS1760-500
Ludzki odczynnik blokujący FcRMiltenyi Biotec130– 059-901
LeucosepGreiner Bio-One227290opisany jako "probówka wirówkowa z gradientem gęstości"
Kolumny MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401opisany jako "kolumna magnetyczna"
MACS BSA Roztwór podstawowyMiltenyi Biotec130-091-376opisany jako "roztwór podstawowy albuminy surowicy bydlęcej (BSA)"
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303opisany jako "stojak magnetyczny"
Penicylina-StreptomycynaNacalai Tesque26253– 84
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP10144opisany jako "medium montażowe"
rekombinowany ludzki GM-CSFR& D Systems215-GM
rekombinowana ludzka IL-34R& D Systems5265-IL
RPMI 1640 Medium + Suplement GlutaMAX (pożywka wstępnie uzupełniona)Thermo Fisher Scientific61870036opisany jako "podstawowa pożywka indukcyjna"
RPMI-1640Nacalai Tesque30264<
strong>przeciwciała
anti-P2RY12Sigma-AldrichHPA014518przeciwciało pierwszorzędowe, królik, 1:100
przeciwciało anty-TMEM119Sigma-AldrichHPA051870, królik, 1:100
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) z adsorbacją krzyżową wtórną, Alexa Fluor 568invitrogenA-11011przeciwciało drugorzędowe, królik, 1:1000
Przeciwciało pierwszorzędowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steiner, J., et al. Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide. J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).
  2. Setiawan, E., et al. Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study. Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).
  3. Holmes, S. E., et al. Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study. Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).
  4. Meyer, J. H., et al. Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets. Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).
  5. Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Sci Rep. 4, 4957(2014).
  6. Method of producing microglial cells. France patent EP. , 3 092 305 B1 (2023).
  7. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  8. Mattis, V. B., Svendsen, C. N. Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology. Lancet Neurol. 10 (4), 383-394 (2011).
  9. Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
  10. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10343-10348 (2011).
  11. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  12. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nat Immunol. 13 (8), 753-760 (2012).
  13. Aloisi, F., De Simone, R., Columba-Cabezas, S., Penna, G., Adorini, L. Functional maturation of adult mouse resting microglia into an APC is promoted by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interaction with Th1 cells. J Immunol. 164 (4), 1705-1712 (2000).
  14. Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6 (10), e26317(2011).
  15. Nandi, S., et al. The CSF-1 receptor ligands IL-34 and CSF-1 exhibit distinct developmental brain expression patterns and regulate neural progenitor cell maintenance and maturation. Dev Biol. 367 (2), 100-113 (2012).
  16. Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Rep. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  17. Yonemoto, K., et al. Heterogeneity and mitochondrial vulnerability configurate the divergent immunoreactivity of human induced microglia-like cells. Clin Immunol. 255, 109756(2023).
  18. Tanaka, S., et al. CD206 expression in induced microglia-like cells from peripheral blood as a surrogate biomarker for the specific immune microenvironment of neurosurgical diseases including glioma. Front Immunol. 12, 2424-2424 (2021).
  19. Ohgidani, M., et al. Fibromyalgia and microglial TNF-alpha: Translational research using human blood induced microglia-like cells. Sci Rep. 7 (1), 11882(2017).
  20. Ohgidani, M., et al. Microglial CD206 gene has potential as a state marker of bipolar disorder. Front Immunol. 7, 676(2016).
  21. Ohgidani, M., et al. A case of bipolar disorder with AIF1 (coding gene of Iba-1) deletion: A pilot in vitro analysis using blood-derived microglia-like cells. Psychiatry Clin Neurosci. 77 (2), 128-130 (2023).
  22. Shirozu, N., et al. Angiogenic and inflammatory responses in human induced microglia-like (iMG) cells from patients with Moyamoya disease. Sci Rep. 13 (1), 14842(2023).
  23. Sellgren, C. M., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Mol Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  24. Sellgren, C. M., et al. Increased synapse elimination by microglia in schizophrenia patient-derived models of synaptic pruning. Nat Neurosci. 22 (3), 374-385 (2019).
  25. Banerjee, A., et al. Validation of induced microglia-like cells (iMG Cells) for future studies of brain diseases. Front Cell Neurosci. 15, 629279(2021).
  26. You, M. J., et al. A molecular characterization and clinical relevance of microglia-like cells derived from patients with panic disorder. Transl Psychiatry. 13 (1), 48(2023).
  27. Rocha, N. P., et al. Microglia activation in basal ganglia is a late event in Huntington disease pathophysiology. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 8 (3), e984(2021).
  28. Sargeant, T. J., Fourrier, C. Human monocyte-derived microglia-like cell models: A review of the benefits, limitations and recommendations. Brain Behav Immun. 107, 98-109 (2023).
  29. Lannes, N., et al. Interactions of human microglia cells with Japanese encephalitis virus. Virol J. 14 (1), 8(2017).
  30. Ryan, K. J., et al. A human microglia-like cellular model for assessing the effects of neurodegenerative disease gene variants. Sci Transl Med. 9 (421), 7635(2017).
  31. Etemad, S., Zamin, R. M., Ruitenberg, M. J., Filgueira, L. A novel in vitro human microglia model: characterization of human monocyte-derived microglia. J Neurosci Methods. 209 (1), 79-89 (2012).
  32. Bortolotti, D., Gentili, V., Rotola, A., Caselli, E., Rizzo, R. HHV-6A infection induces amyloid-beta expression and activation of microglial cells. Alzheimers Res Ther. 11 (1), 104(2019).
  33. Ormel, P. R., et al. A characterization of the molecular phenotype and inflammatory response of schizophrenia patient-derived microglia-like cells. Brain Behav Immun. 90, 196-207 (2020).
  34. Akiyama, H., et al. Expression of HIV-1 intron-containing RNA in microglia induces inflammatory responses. J Virol. 95 (5), e01386-e01420 (2021).
  35. Nielsen, M. C., Andersen, M. N., Moller, H. J. Monocyte isolation techniques significantly impact the phenotype of both isolated monocytes and derived macrophages in vitro. Immunology. 159 (1), 63-74 (2020).
  36. Kelly, A., Grabiec, A. M., Travis, M. A. Culture of human monocyte-derived macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 1-11 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Monocyty z krwi ludzkiejbadania w kierunku odwrotnej translacjizaburzenia neuropsychiatryczneizolacja kom rekgradient g sto cimagnetyczna separacja kom rekuwalnianie cytokinzdolno fagocytarnaczynnik stymuluj cy kolonie granulocyt w i makrofag w

Powiązane artykuły