Protokół przedstawia model gryzonia przeżywającego do testowania interwencji balonem venoplasty (VB) w żyłach głębokich niezakrzepowych, zakrzepowych i pozakrzepowych.
Artykuł metodologiczny
Protokół przedstawia model gryzonia przeżywającego do testowania interwencji balonem venoplasty (VB) w żyłach głębokich niezakrzepowych, zakrzepowych i pozakrzepowych.
Plastyka żył balonowych jest powszechnie stosowaną techniką kliniczną w leczeniu zwężenia żył głębokich i niedrożności w wyniku urazu, wrodzonych nieprawidłowości anatomicznych, ostrej zakrzepicy żył głębokich (DVT) lub stentowania. Przewlekła niedrożność żył głębokich charakteryzuje się histopatologicznie zakrzepicą, zwłóknieniem lub jednym i drugim. Obecnie nie jest dostępne bezpośrednie leczenie ukierunkowane na te procesy patologiczne. W związku z tym niezbędny jest wiarygodny model zwierzęcy in vivo do testowania nowatorskich interwencji. Model balonu do wenoplastyki żyły głównej dolnej (IVC) (VBM) umożliwiający badanie wenoplastyki balonów w warunkach niezakrzepowych i pozakrzepowych w wielu punktach czasowych. Miejscowy i ogólnoustrojowy wpływ powlekanych i niepowlekanych balonów venoplastyki można określić ilościowo za pomocą testów tkanek, skrzeplin i krwi, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR), western blot, test immunoenzymatyczny (ELISA), zymografia, analiza komórkowa ściany żyły i skrzepliny, testy krwi pełnej i osocza oraz analiza histologiczna. VBM jest powtarzalny, replikuje interwencje chirurgiczne u ludzi, może identyfikować lokalne zmiany białkowe w ścianie żyły i skrzeplinach i umożliwia wielokrotne analizy z tej samej próbki, zmniejszając liczbę zwierząt wymaganych w grupie.
Niedrożność żył głębokich spowodowana nierozwiązanymi skrzeplinami jest częstą konsekwencją zakrzepicy żył głębokich (DVT) i jest jedną z przyczyn zespołu pozakrzepowego (PTS), kosztującego miliardy dolarów w opiece zdrowotnej i znacząco wpływającego na jakość życia1,2,3. PTS to wyjątkowa patologia zapalna z wynikającym z niej zwłóknieniem ściany żyły4 nie jest w pełni uchwycona w modelach DVT małych zwierząt5,6,7, a co ważniejsze, poprzednie modele nie mogą ocenić odpowiedzi na interwencje terapeutyczne. Zakrzepowe niedrożności żylne są często leczone za pomocą stentowania i wenoplastyki balonowej8,9; Takie interwencje są utrudnione przez wysoki wskaźnik reinterwencji spowodowany restenozą i okluzją10,11,12.
Pomimo dostępności balonów powlekanych lekiem do leczenia zwężeń/niedrożności specyficznych dla tętnic, nie ma ich dla żył głębokich. Molekularny mechanizm stojący za restenozą jest słabo poznany w żyłach i nie ma bezpośredniej terapii4. Dlatego naszym celem jest zaprezentowanie modelu zwierzęcego, który może testować miejscowo dostarczane terapie za pomocą balonów do wenoplastyki symulujących niedrożność żył głębokich po zakrzepowej. Model ten odtwarza stan pozakrzepowy i ocenia, w jaki sposób różne rodzaje balonów do venoplastyki wpływają na ścianę żyły in vivo.
Poniższy protokół jest zgodny z polityką i wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Michigan (UMICH), zasadami rządu USA dotyczącymi wykorzystania i opieki nad kręgowcami używanymi w testach, badaniach i szkoleniach oraz wytycznymi ARRIVE 2.0. Porozumienie UMICH w zakresie dobrostanu zwierząt jest zgodne z wymogami OLAW i USDA oraz posiada pełną akredytację AAALAC International. Protokół ten został zatwierdzony pod numerem PRO00010841. Wykorzystano samce szczurów Sprague Dawley z linii outbred z laboratorium Charles River Laboratories, o masie 450 g i wieku 15 tygodni.
1. Znieczulenie szczura
2. Skanowanie ultradźwiękowe szczura
3. Mikrochirurgia i rekonwalescencja szczura

Rysunek 1: Rozkład pomiarów duplex przezbrzusznych średnicy poprzecznej IVC (środkowy odcinek podnerkowy). Pomiar przeprowadzono w zależności od masy zwierzęcia. Nie stwierdzono istotnej korelacji między masą a średnicą IVC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
4. Przygotowanie próbek
VBM to model służący do oceny wpływu balonów do wenoplastyki na całkowitą kontrolę hemostazy. W pierwszej kolejności, w celu prawidłowego doboru rozmiaru balonu, zmierzyliśmy średnicę IVC (środkowy odcinek podnerkowy), co przedstawiono na Rysunku 1. Po drugie, opracowana krok po kroku technika mikrochirurgiczna została zilustrowana na Rysunku 2, a przykłady kluczowych etapów przedstawiono na Rysunku 3. Należy zwrócić uwagę na zastosowanie podejścia wstecznego podczas kanulacji IVC z użyciem zaostrzonego drutu prowadzącego.

Rycina 2: Technika mikrochirurgiczna do testowania balonów do wenoplastyki u szczurów.Tutaj opisano zastosowaną technikę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3: Obrazy in vivo techniki wdrażania. (A) Kontrola hemostatyczna. (B) Szew w kształcie litery U na podnerkowym odcinku IVC. (C) Wprowadzenie drutu przez szew w kształcie litery U z balonem 3 mm powlekanym sirolimusem. (D) Retrogardowe wdrożenie weno-plastyki balonowej (powlekanej sirolimusem). Skróty: IVC = żyła główna dolna; AO = aorta; CBV = weno-plastyka balonem powlekanym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Inne pomiary prawidłowych naczyń żylnych oraz różnice między IVC a aortą przedstawiono na Rysunku 4. Wyniki badania USG w przypadku zakrzepicy przedstawiono na Rysunku 5. Na koniec, na Rysunku 6 można zaobserwować porównanie średnicy w badaniu USG przed operacją oraz pomiarów po zakrzepicy. Średnia prędkość przepływu w dopplerowskim badaniu falowym (mm/s) w żyle głównej dolnej przed i po założeniu klipsa na naczynie przedstawiono na Rysunku 7.

Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy duplex przezbrzuszne, z przykładami pomiaru średnicy IVC w przekroju poprzecznym. (A) Proksymalna część IVC. (B) Środkowa część IVC poniżej nerek. (C) Dystalna część IVC. Analiza kolorowym dopplerem (D) środkowej części IVC poniżej nerek oraz (E) aorty brzusznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 5. Obrazy przedstawiające stan przed i po założeniu klipsa. (A) Wyniki badania USG po założeniu klipsa potwierdzające okluzję IVC. (B) Przepływ w aorcie proksymalnej i dystalnej. (C) Przepływ w IVC proksymalnej. (D) Wspólne żyły biodrowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 6. Obrazy ultrasonograficzne. Zmiany w obrazie USG przed oraz po 15 min, 30 min i 45 min, potwierdzające zamknięcie IVC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 7: Średnia prędkość przepływu w dopplerowskim badaniu falowym. Średnia prędkość przepływu (mm/s) w żyle głównej dolnej przed i po założeniu klipsa (**: P ≤ 0.01, wykonano test Manna-Whitneya). Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Aby przeanalizować wyniki różnych interwencji wenoplastycznych z zastosowaniem nowatorskich powłok, zalecamy pomiar białek efektorowych, które mogą wykazać celowy efekt badanego leku. W przypadku zastosowanego tutaj balonu do wenoplastyki powleczonego sirolimusem, zmierzono poziomy ufosforylowanego białka AKT (p-AKT) w lizatach IVC szczura, co potwierdziło zahamowanie szlaku mTOR, ponieważ p-AKT jest białkiem downstream, którego poziom spada w odpowiedzi na sirolimus14,15. Na Rycynie 8 można zaobserwować, że po wenoplastyce balonem powleczonym (CBV) poziom p-AKT jest znacząco obniżony w porównaniu z grupą pozorowaną.

Rysunek 8: Poziomy białka p-AKT. Poziomy białka w lizatach IVC szczurów w grupie sham w porównaniu z grupą angioplastyki balonem powlekanym (CBV) w warunkach prawidłowych, potwierdzające efekt celowany poprzez hamowanie ścieżki mTOR przy użyciu balonów do angioplastyki żył powlekanych sirolimusem. (**: P ≤ 0.01, wykonano test Mann-Whitneya). Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
VBM można wykonać na szczurach o masie ≥ 250 g przy użyciu balonów w zakresie 2,5-3,5 mm. W przypadku szczurów o masie ciała przekraczającej 750 g technika ta jest ograniczona przez większą ilość tkanki tłuszczowej w jamie brzusznej i wielkość narządu, a nie zmiany średnicy IVC. Z naszego doświadczenia wynika, że potrzeba 10 lub więcej zwierząt w grupie, aby uzyskać istotność statystyczną między grupami do analizy białek w ścianie żył lub testów aktywności i histologii. Okresowa kontrola temperatury i nadzór nad częstością oddechów podczas zabiegów chirurgicznych są bardzo ważne dla zagwarantowania powodzenia zabiegu, a także starannego postępowania pooperacyjnego.
VBM jest bezpieczny (91,2% przeżywalności, 83/91 wykonanych zabiegów) i powtarzalny, a średni czas zabiegu wynosi 30 minut. Zachorowalność związana z zabiegiem obejmuje powikłania anestezjologiczne (1%, 1/91), działania niepożądane opioidów (1%, 1/91), krwawienie (2,1%, 2/91) i zakrzepicę (4,3%, 4/91). Krwawienie IVC zostało znacznie zmniejszone podczas opracowywania modelu dzięki zastosowaniu wstecznego podejścia kanaulacyjnego IVC z punktem wstawienia obok IVC podnerkowego, co zapewnia szerszy kąt wprowadzania drutu przy mniejszej ingerencji ze strony narządów jamy brzusznej. Również podczas faz wprowadzania i wdmuchiwania zalecamy asystenta chirurgicznego, który gwarantuje prawidłowe podawanie ciśnienia, czas pompowania i zaostrzone zwijanie drutu prowadzącego. Po opróżnieniu należy zapewnić prawidłowe wyjęcie balonu do wenoplastyki, aby zapobiec rozerwaniu ścianki IVC w miejscu wprowadzenia. Pomiary ciśnienia są przestrzegane przez producenta, aby uniknąć hiperinflacji i pęknięcia balonu. Ogólnie rzecz biorąc, pomiary te przyczyniają się do bardziej stabilnego podejścia, zmniejszając powikłania krwotoczne i poprawiając przeżywalność zwierząt.
Krwawienie IVC można również złagodzić, stosując następujące środki ostrożności. Najpierw sprawdź całkowitą kauteryzację tylnych gałęzi i podwiązania gałęzi bocznych. Gwarantuje to również powtarzalność wyników opartych na wcześniejszej analizie podwiązania IVC u gryzoni 5,16,17. Po drugie, sprawdź poprawność okluzji za pomocą klipsów proksymalnych i dystalnych, aby zagwarantować pełną kontrolę hemostatyczną. Na koniec sprawdź całkowitą okluzję szwu U po usunięciu balonu przed zdjęciem klipsów IVC. Jeśli występuje krwawienie, delikatny ucisk na IVC za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką, aż do uzyskania kontroli hemostatycznej, zwykle zatrzyma krwawienie. W przypadku krwawienia można zastosować dodatkowe środki kontroli hemostatycznej, takie jak wchłanialna żelatyna w proszku.
Powikłania zakrzepowe powinny być minimalne, jeśli czas napompowania balonu, opróżnienia i zamknięcia szwu U jest krótszy niż 5 minut. W razie potrzeby można podać leki przeciwzakrzepowe. Do tej pory nie ma całkowicie przezskórnej procedury naśladującej minimalnie inwazyjne wenoplastyki, które są obecnie wykonywane u ludzi. Rozmiar naczynia dostępowego (żyły udowej szczura) jest znacznie mniejszy (średnio 0,81 mm)18 niż zewnętrzna średnica najmniejszej dostępnej na rynku osłonki 4F (1,61 mm), która byłaby wymagana do przeprowadzenia całkowicie wewnątrznaczyniowego zabiegu. Ograniczenia obejmują potrzebę wykwalifikowanych mikrochirurgów i konieczność posiadania specjalistycznego sprzętu.
Podsumowując, model VBM ściśle symuluje scenariusz kliniczny wenoplastyki żył głębokich po zakrzepicy żył głębokich. Jest to cenne narzędzie do badania wewnątrznaczyniowego wpływu balonów do plastyki żył na IVC z różnymi alternatywami leków w wielu punktach czasowych. Przyszłe zastosowania tej techniki obejmują badania przedkliniczne innych wyrobów medycznych, w tym stentów, cewników do trombektomii, powłok balonowych i nowatorskich terapii farmakologicznych.
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
To badanie jest wspierane przez grant badawczy American Venous Forum (AVF) 2023 Basic Science oraz Surmodics, Inc.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3-0 DemeCRYL | DemeTech | G183019F4P | 12 w pudełku |
| 5-0 DemeCRYL | DemeTech | G285017B0P | 12 w pudełku |
| 7-0 DemeLENE | DemeTech | PM197011F13M | 12 w pudełku |
| 8-0 DemeLON | DemeTech | NL868007C7P | 12 w pudełku |
| Kątowy klips aplikacyjny | SCANLAN | 3795-01A | 7-1/4″ (18,5 cm) |
| Baxter 0,9% butelka do nawadniania chlorkiem sodu | Baxter | SKU: 195-7124 | Butelka 1000 ml |
| Bovie Cautery Niskotemperaturowa cienka końcówka | Symetria chirurgiczna Inc | AA00 | 10 / bx |
| Buprenorphine | Fidelis Zdrowie zwierząt | SKU- 099114 | 1,3 mg / ml, 3 ml |
| CD (Sprague Dawley) Szczury | River Kod szczepu 001 | Mężczyzna, 400 g | |
| Clip-It Identyfikowalny zegar | PRODUKTY IDENTYFIKOWALNE | Kat. Nr 5046 | |
| Aplikator z bawełnianą końcówką 3" | Dukal Corporation | 922-00037BX100 | 1000/BOX |
| Enzymatyczny detergent do narzędzi chirurgicznych i Presoak | Medline | MDS88000B9 | 1 galon |
| Eye Lube | Optixcare | SKU-065441 | 20gm |
| Gaymar T/Pump Stryker Miejscowy system terapii ocieplającej/chłodzącej | Stryker | TP700 | |
| Heifetz Microclips 12mmx2.25mm | SCANLAN | 3795-20 | |
| Mikroklipsy proste Heifetz 12mmx2.25mm | SCANLAN | 3795-28 | |
| Mikroklipsy Heifetz zakrzywione 8mmx1.75mm | SCANLAN | 3795-14 | Mikroklipy proste |
| Heifetz 8mmx1,75mm | SCANLAN | 3795-18 | Zakrzywione |
| urządzenie do pompowania | Merit Medical | IN4130 | BasixCOMPAK z wyświetlaczem analogowym |
| Isoflurane | MFR VETONE | SKU-501017 | 100mL, płyn do inhalacji |
| Zestaw mikrochirurgiczny zawierający pęsetę i kleszcze | Dostosowany | ||
| tlen, E-tank | Medline | MDM1630 | |
| Zaostrzony prowadnik | Dostosowany | ||
| sterylny zadowolony Press-n-Seal | Glad | SKU # PSS-140 | ETO |
| Exposed Sterylne gąbki z włókniny z gazy 2s 4ply 4x4 | Medline | SKU PRM21444H | 100Ct |
| Mikroskop chirurgiczny | Zeiss | S100 / OPMI pico | |
| Peeling chirurgiczny & Mycie rąk | Vetoquinol | NDC: 17030-003-16 | 16 uncji |
| Żel ultradźwiękowy | Medline | CTR001305 | 8.5 uncji, 12/CS |
| System ultrasonograficzny | Siemens | ACUSON Antares | 3-D, kolor, fala ciągła (CW), fala pulsacyjna (PW), balon spektralny do |
| plastyki żył | Dostosowany |