Protokół przedstawia model gryzonia przeżywającego do testowania interwencji balonem venoplasty (VB) w żyłach głębokich niezakrzepowych, zakrzepowych i pozakrzepowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model balonu do Vena Cava Vena Cava Gryzonia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Plastyka żył balonowych jest powszechnie stosowaną techniką kliniczną w leczeniu zwężenia żył głębokich i niedrożności w wyniku urazu, wrodzonych nieprawidłowości anatomicznych, ostrej zakrzepicy żył głębokich (DVT) lub stentowania. Przewlekła niedrożność żył głębokich charakteryzuje się histopatologicznie zakrzepicą, zwłóknieniem lub jednym i drugim. Obecnie nie jest dostępne bezpośrednie leczenie ukierunkowane na te procesy patologiczne. W związku z tym niezbędny jest wiarygodny model zwierzęcy in vivo do testowania nowatorskich interwencji. Model balonu do wenoplastyki żyły głównej dolnej (IVC) (VBM) umożliwiający badanie wenoplastyki balonów w warunkach niezakrzepowych i pozakrzepowych w wielu punktach czasowych. Miejscowy i ogólnoustrojowy wpływ powlekanych i niepowlekanych balonów venoplastyki można określić ilościowo za pomocą testów tkanek, skrzeplin i krwi, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR), western blot, test immunoenzymatyczny (ELISA), zymografia, analiza komórkowa ściany żyły i skrzepliny, testy krwi pełnej i osocza oraz analiza histologiczna. VBM jest powtarzalny, replikuje interwencje chirurgiczne u ludzi, może identyfikować lokalne zmiany białkowe w ścianie żyły i skrzeplinach i umożliwia wielokrotne analizy z tej samej próbki, zmniejszając liczbę zwierząt wymaganych w grupie.
Wprowadzenie
Niedrożność żył głębokich spowodowana nierozwiązanymi skrzeplinami jest częstą konsekwencją zakrzepicy żył głębokich (DVT) i jest jedną z przyczyn zespołu pozakrzepowego (PTS), kosztującego miliardy dolarów w opiece zdrowotnej i znacząco wpływającego na jakość życia1,2,3. PTS to wyjątkowa patologia zapalna z wynikającym z niej zwłóknieniem ściany żyły4 nie jest w pełni uchwycona w modelach DVT małych zwierząt5,6,7, a co ważniejsze, poprzednie modele nie mogą ocenić odpowiedzi na interwencje terapeutyczne. Zakrzepowe niedrożności żylne są często leczone za pomocą stentowania i wenoplastyki balonowej8,9; Takie interwencje są utrudnione przez wysoki wskaźnik reinterwencji spowodowany restenozą i okluzją10,11,12.
Pomimo dostępności balonów powlekanych lekiem do leczenia zwężeń/niedrożności specyficznych dla tętnic, nie ma ich dla żył głębokich. Molekularny mechanizm stojący za restenozą jest słabo poznany w żyłach i nie ma bezpośredniej terapii4. Dlatego naszym celem jest zaprezentowanie modelu zwierzęcego, który może testować miejscowo dostarczane terapie za pomocą balonów do wenoplastyki symulujących niedrożność żył głębokich po zakrzepowej. Model ten odtwarza stan pozakrzepowy i ocenia, w jaki sposób różne rodzaje balonów do venoplastyki wpływają na ścianę żyły in vivo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Poniższy protokół jest zgodny z polityką i wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Michigan (UMICH), zasadami rządu USA dotyczącymi wykorzystania i opieki nad kręgowcami używanymi w testach, badaniach i szkoleniach oraz wytycznymi ARRIVE 2.0. Porozumienie UMICH w zakresie dobrostanu zwierząt jest zgodne z wymogami OLAW i USDA oraz posiada pełną akredytację AAALAC International. Protokół ten został zatwierdzony pod numerem PRO00010841. Wykorzystano samce szczurów Sprague Dawley z linii outbred z laboratorium Charles River Laboratories, o masie 450 g i wieku 15 tygodni.
1. Znieczulenie szczura
- Wyjąć zwierzęta z klatki i umieścić je w komorze indukcyjnej do znieczulenia przedoperacyjnego z zastosowaniem 5% isofluranu i 100% tlenu przy przepływie od 0,8 do 1 L/min (sterowanym przez parowar), aby wprowadzić w stan narkozy ogólnej.
- Po sedacji szczurów w komorze indukcyjnej wyjąć je z komory, zważyć, nasmarować oczy sterylną maścią okulistyczną, a następnie ułożyć w pozycji na plecach na urządzeniu grzewczym z cyrkulacją ciepłej wody. Potwierdzić odpowiednią głębokość znieczulenia za pomocą odruchu stopowego (mocne uciśnięcie palca).
- Ogolić brzuszną stronę brzucha za pomocą trymera elektrycznego. Utrzymywać narkozę ogólną przy zastosowaniu 2,5% isofluranu i 100% tlenu przy przepływie 0,8 do 1 L/min za pomocą obiegu nieoddychającego przez maskę nosową.
2. Skanowanie ultradźwiękowe szczura
- Monitoruj parametry fizjologiczne, w tym częstość oddechów, tętno i temperaturę, podczas obrazowania.
- W celu obrazowania brzusznego żyły głównej dolnej (IVC), nałóż żel przewodzący i ustaw przetwornik w pozycji poprzecznej. Podczas wstępnej konfiguracji dla naczyń obwodowych, korzystając z trybu obrazowania dwuwymiarowego lub trybu B, przyłóż liniową głowicę (10 MHz) do środka brzucha, regulując głębokość poprzez ucisk, aż do pojawienia się naczyń brzusznych w polu widzenia.
- Odróżnij IVC od aorty brzusznej, oceniając podatność na ucisk oraz przepływ, wykorzystując zarówno kolorowy Doppler, jak i Doppler pulsacyjny z wysokoczęstotliwościową głowicą liniową (10 MHz).
- Podczas przykładania ucisku głowicą ultradźwiękową, odróżnij oba naczynia: IVC jest podatna na ucisk, podczas gdy aorta zachowuje swój kształt i drożność.
- Oceń kierunek i prędkość przepływu krwi, korzystając z kolorowego Dopplera oraz Dopplera pulsacyjnego. Okno kolorowego Dopplera reprezentuje przepływ w stronę głowicy kolorem czerwonym, a przepływ oddalający się od głowicy kolorem niebieskim. Przełącz urządzenie w tryb Dopplera pulsacyjnego (tryb Duplex), aby ocenić kierunek i prędkość przepływu krwi w czasie. Pozyskaj niezbędne obrazy przepływu, korzystając z automatycznego narzędzia przechwytywania obrazu w aparacie USG (dokładne specyfikacje pozyskiwania obrazów mogą się różnić w zależności od systemu USG).
- Stosuj następującą metodę oceny: aorta wykazuje przepływ krwi w stronę głowicy i posiada falę trójfazową, podczas gdy IVC wykazuje spontaniczny przepływ oddalający się od głowicy o znacznie niższej amplitudzie.
- Jeśli w proksymalnym odcinku IVC widoczna jest prawidłowa fala, a w odcinku dystalnym wykryta zostanie fala niefazowa lub brak fali (linia płaska), rozważ możliwość wystąpienia niedrożności żylnej pomiędzy tymi punktami badania.
- Po zlokalizowaniu IVC, zidentyfikuj odcinek środkowy, znajdujący się w środkowej jednej trzeciej, poniżej żył nerkowych i powyżej rozwidlenia IVC, najprawdopodobniej w miejscu przebiegu żył lędźwiowych.
- Zmierz średnicę od ściany do ściany IVC w odcinku środkowym w przekroju poprzecznym, korzystając z obrazu w trybie B, zapisując największą średnicę naczynia. Sposób pozyskiwania obrazów może się różnić w zależności od modelu aparatu USG. Przechowuj dane na płytach CD w plikach DICOM.
3. Mikrochirurgia i rekonwalescencja szczura
- Oczyść brzuch gazikiem nasączonym preparatem do mycia na bazie chlorheksydyny oraz roztworem chlorheksydyny (3x), aby zapewnić aseptyczne warunki chirurgiczne. Podaj buprenorfinę w zawiesinie do wstrzykiwań o przedłużonym uwalnianiu w dawce 0,65 mg/kg podskórnie (SC) jako lek przeciwbólowy dla szczurów, ponieważ nie wpływa ona na panele biomarkerów cząsteczek zapalnych podczas analizy białek.
- Załóż sterylną folię stretch jako osłonę chirurgiczną, aby zakryć klatkę piersiową i obszar brzuszny szczura, pokrętła mikroskopu (powiększenie i ostrość) oraz okular.
- Wykonaj cięcie w linii środkowej brzucha (3 cm) około 2 cm poniżej wyrostka mieczykowatego nożyczkami irydowymi przez skórę i ścianę brzucha, odsłaniając zawartość jamy brzusznej. Użyj sterylnej gazy o wymiarach 2 cal x 2 cale nasączonej solą fizjologiczną, aby odsunąć jelita na prawą stronę zwierzęcia.
- W celu odsłonięcia IVC przeprowadź tępe rozczłonkowanie za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianym końcem. Umieść rozwieracz drutowy w nacięciu, co umożliwi wizualizację IVC.
- Wypal wszystkie gałęzie lędźwiowe IVC za pomocą nisko-temperaturowego koagulatora z cienką końcówką, od żył nerkowych do rozwidlenia biodrowego, a gałęzie boczne podwiąż nićmi z niewchłanialnego polipropylenu 7-0.
- Załóż proksymalny zakrzywiony mikroklips naczyniowy na IVC w miejscu oddzielonym od aorty, tuż poniżej żył nerkowych. Załóż prosty mikroklips na dystalnym odcinku IVC, oddzielonym od aorty i powyżej rozwidlenia IVC.
- Załóż szew w kształcie litery U z nylonu 8-0 gudiowo do lewej żyły nerkowej, centrując go na przedniej powierzchni IVC.
- Wprowadź zaostrzony drut prowadzący o średnicy 0,014 mm z nałożonym balonem do wenoplastyki, retrograde do kierunku przepływu krwi, do podnerkowego odcinka IVC, gudiowo względem zakrzywionego mikroklipsa.
- Przesuń balon do środkowego odcinka IVC, stosując technikę Seldingera. Usuń zaostrzony drut prowadzący i nadmuchaj balon do wenoplastyki przez 3 min, stosując nadrozciągnięcie IVC o 10% do 15% przy użyciu strzykawki do nadmuchiwania o pojemności 20 mL, aby wygenerować nadciśnienie w zakresie 0-30 Atm. Przed kaniulacją IVC przepłucz wszystkie systemy sterylną solą fizjologiczną, aby uniknąć zatoru powietrznego.
UWAGA: IVC o średnicy 2,8 mm zostałoby poddane wenoplastyce do 3,22 mm (nadrozciągnięcie o 15%). Wymagane ciśnienie nadmuchiwania w celu osiągnięcia pożądanego nadrozciągnięcia jest określone przez charakterystykę balonu i jest podane na opakowaniu producenta. - Zaciśnij szew w kształcie litery U po spuszczeniu powietrza z balonu do wenoplastyki i jego usunięciu. Usuń mikroklipsy.
- Zamknij miejsce laparotomii dwuwarstwowo. Użyj wchłanialnej syntetycznej nici z poliglaktyny 5-0 w szwie ciągłym do zamknięcia zarówno ściany brzusznej, jak i skóry.
- Poddaj szczury rekonwalescencji w oddzielnych klatkach, obserwuj je pooperacyjnie (30 min) pod lampą grzewczą (minimalna odległość - 24 cale od klatki), a następnie przenieś je z powrotem do pierwotnych jednostek mieszkalnych.
- W przypadku zwierząt z grupy pozorowanej (sham) z każdej grupy eksperymentalnej wykonaj jedynie rozczłonkowanie, bez podwiązywania gałęzi IVC, wypalania i kaniulacji.
- W przypadku warunków pozakrzepowych załóż proksymalny prosty mikroklips naczyniowy na IVC, oddzielony od aorty, tuż poniżej żył nerkowych, na 24 h. Zastosuj te same techniki rozczłonkowania i zamykania.
- Sprawdź ultradźwiękowe oznaki okluzji IVC, które obejmują wizualizację klipsa IVC, potwierdzenie braku przepływu w dystalnym odcinku IVC oraz poszerzenie wspólnych żył biodrowych. Punkty czasowe obserwacji można dostosować do specyfikacji badania.
- Aby zaobserwować modelowane zmiany fizjologiczne, wybierz punkty czasowe w ciągu pierwszych 72 h dla wczesnego tworzenia się zakrzepów oraz od 3 do 7 dni po zabiegu dla późniejszej rezolucji zakrzepów. Późniejsze punkty czasowe testowane w tym modelu obejmują okres od 7 do 28 dni5,13.
- Użyj technik opisanych w krokach 3.5-3.9 do pozakrzepowej wenoplastyki balonowej z następującymi zastrzeżeniami: może być wymagane wyższe ciśnienie insuflatora, aby osiągnąć pożądane nadrozciągnięcie, ponieważ średnica IVC zwiększa się w warunkach pozakrzepowych.
- Przeprowadź eutanazję zgodnie z zaleceniami zawartymi w aktualnych Wytycznych Amerykańskiego Stowarzyszenia Lekarzy Weterynarii (AVMA) dotyczącymi eutanazji gryzoni, stosując dwie metody potwierdzające (usunięcie krwi i usunięcie organów żywotnych), aby upewnić się, że zwierzę nie odzyska przytomności.
Rysunek 1: Rozkład pomiarów duplex przezbrzusznych średnicy poprzecznej IVC (środkowy odcinek podnerkowy). Pomiar przeprowadzono w zależności od masy zwierzęcia. Nie stwierdzono istotnej korelacji między masą a średnicą IVC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
4. Przygotowanie próbek
- Przeprowadź potwierdzający transfer tkanek balonów do wenoplastyki pokrytych lekiem, stosując technikę analizy wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
- Wypreparuj żyłę główną dolną (IVC) oraz aortę i usuń je en bloc w celu utrwalenia w formalinie, zatopienia w parafinie i analizy histologicznej.
- Do analizy białek użyj buforu RIPA w stężeniu rozcieńczającym 60 000 µg/g próbki; homogenizuj tkankę za pomocą homogenizatora w pomieszczeniu o niskiej temperaturze w 4 °C, a po obróbce przechowuj w temperaturze -80 °C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
VBM to model służący do oceny wpływu balonów do wenoplastyki na całkowitą kontrolę hemostazy. W pierwszej kolejności, w celu prawidłowego doboru rozmiaru balonu, zmierzyliśmy średnicę IVC (środkowy odcinek podnerkowy), co przedstawiono na Rysunku 1. Po drugie, opracowana krok po kroku technika mikrochirurgiczna została zilustrowana na Rysunku 2, a przykłady kluczowych etapów przedstawiono na Rysunku 3. Należy zwrócić uwagę na zastos...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
VBM można wykonać na szczurach o masie ≥ 250 g przy użyciu balonów w zakresie 2,5-3,5 mm. W przypadku szczurów o masie ciała przekraczającej 750 g technika ta jest ograniczona przez większą ilość tkanki tłuszczowej w jamie brzusznej i wielkość narządu, a nie zmiany średnicy IVC. Z naszego doświadczenia wynika, że potrzeba 10 lub więcej zwierząt w grupie, aby uzyskać istotność statystyczną między grupami do analizy białek w ścianie żył lub testów aktywności i histologii. Okresowa kontrola temperatury i nadzór nad częstośc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
To badanie jest wspierane przez grant badawczy American Venous Forum (AVF) 2023 Basic Science oraz Surmodics, Inc.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 3-0 DemeCRYL | DemeTech | G183019F4P | 12 w pudełku |
| 5-0 DemeCRYL | DemeTech | G285017B0P | 12 w pudełku |
| 7-0 DemeLENE | DemeTech | PM197011F13M | 12 w pudełku |
| 8-0 DemeLON | DemeTech | NL868007C7P | 12 w pudełku |
| Kątowy klips aplikacyjny | SCANLAN | 3795-01A | 7-1/4″ (18,5 cm) |
| Baxter 0,9% butelka do nawadniania chlorkiem sodu | Baxter | SKU: 195-7124 | Butelka 1000 ml |
| Bovie Cautery Niskotemperaturowa cienka końcówka | Symetria chirurgiczna Inc | AA00 | 10 / bx |
| Buprenorphine | Fidelis Zdrowie zwierząt | SKU- 099114 | 1,3 mg / ml, 3 ml |
| CD (Sprague Dawley) Szczury | River Kod szczepu 001 | Mężczyzna, 400 g | |
| Clip-It Identyfikowalny zegar | PRODUKTY IDENTYFIKOWALNE | Kat. Nr 5046 | |
| Aplikator z bawełnianą końcówką 3" | Dukal Corporation | 922-00037BX100 | 1000/BOX |
| Enzymatyczny detergent do narzędzi chirurgicznych i Presoak | Medline | MDS88000B9 | 1 galon |
| Eye Lube | Optixcare | SKU-065441 | 20gm |
| Gaymar T/Pump Stryker Miejscowy system terapii ocieplającej/chłodzącej | Stryker | TP700 | |
| Heifetz Microclips 12mmx2.25mm | SCANLAN | 3795-20 | |
| Mikroklipsy proste Heifetz 12mmx2.25mm | SCANLAN | 3795-28 | |
| Mikroklipsy Heifetz zakrzywione 8mmx1.75mm | SCANLAN | 3795-14 | Mikroklipy proste |
| Heifetz 8mmx1,75mm | SCANLAN | 3795-18 | Zakrzywione |
| urządzenie do pompowania | Merit Medical | IN4130 | BasixCOMPAK z wyświetlaczem analogowym |
| Isoflurane | MFR VETONE | SKU-501017 | 100mL, płyn do inhalacji |
| Zestaw mikrochirurgiczny zawierający pęsetę i kleszcze | Dostosowany | ||
| tlen, E-tank | Medline | MDM1630 | |
| Zaostrzony prowadnik | Dostosowany | ||
| sterylny zadowolony Press-n-Seal | Glad | SKU # PSS-140 | ETO |
| Exposed Sterylne gąbki z włókniny z gazy 2s 4ply 4x4 | Medline | SKU PRM21444H | 100Ct |
| Mikroskop chirurgiczny | Zeiss | S100 / OPMI pico | |
| Peeling chirurgiczny & Mycie rąk | Vetoquinol | NDC: 17030-003-16 | 16 uncji |
| Żel ultradźwiękowy | Medline | CTR001305 | 8.5 uncji, 12/CS |
| System ultrasonograficzny | Siemens | ACUSON Antares | 3-D, kolor, fala ciągła (CW), fala pulsacyjna (PW), balon spektralny do |
| plastyki żył | Dostosowany |
Bibliografia
- Prandoni, P., et al. The long-term clinical course of acute deep venous thrombosis. Ann Inter Med. 125 (1), 1-7 (1996).
- Prandoni, P., Kahn, S. R. Post-thrombotic syndrome: prevalence, prognostication and need for progress. Br J Haematol. 145 (3), 286-295 (2009).
- Gloviczki, P., et al. The 2023 Society for Vascular Surgery, American Venous Forum, and American Vein and Lymphatic Society clinical practice guidelines for the management of varicose veins of the lower extremities. Part II. J Vas Surg Venous Lymph Diso. 12 (1), 101670(2024).
- Henke, P., Sharma, S., Wakefield, T., Myers, D., Obi, A. Insights from experimental post-thrombotic syndrome and potential for novel therapies. Transl Res. 225, 95-104 (2020).
- Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: A consensus assessment of utility and application. Arterioscl Thrombo Vasc Biol. 39 (3), 311-318 (2019).
- Lee, Y. U., Lee, A. Y., Humphrey, J. D., Rausch, M. K. Histological and biomechanical changes in a mouse model of venous thrombus remodeling. Biorheology. 52 (3), 235-245 (2015).
- Xie, H., et al. Correspondence of ultrasound elasticity imaging to direct mechanical measurement in aging DVT in rats. Ultrasound Med Biol. 31 (10), 1351-1359 (2005).
- Moini, M., et al. Venoplasty and stenting in post-thrombotic syndrome and non-thrombotic iliac vein lesion. Minim Invasive Ther Allied Technol. 29 (1), 35-41 (2020).
- Chaitidis, N., et al. Management of post-thrombotic syndrome: A comprehensive review. Curr Pharma Des. 28 (7), 550-559 (2022).
- Dangas, G. D., et al. In-stent restenosis in the drug-eluting stent era. J Am Coll Cardiol. 56 (23), 1897-1907 (2010).
- Neglén, P., Berry, M. A., Raju, S. Endovascular surgery in the treatment of chronic primary and post-thrombotic iliac vein obstruction. Euro J Vas Endovas Surg. 20 (6), 560-571 (2000).
- Sharifi, M., Mehdipour, M., Bay, C., Smith, G., Sharifi, J. Endovenous therapy for deep venous thrombosis: The TORPEDO trial. Catheter Cardiovasc Interv. 76 (3), 316-325 (2010).
- Nicklas, J. M., Gordon, A. E., Henke, P. K. Resolution of deep venous thrombosis: Proposed immune paradigms. Int J Mol Sci. 21 (6), 2080(2020).
- Li, J., Kim, S. G., Blenis, J. Rapamycin: One drug, many effects. Cell Metabol. 19 (3), 373-379 (2014).
- Chen, X., et al. Rapamycin regulates Akt and ERK phosphorylation through mTORC1 and mTORC2 signaling pathways. Mol Carcinogen. 49 (6), 603-610 (2010).
- Diaz, J. A., Farris, D. M., Wrobleski, S. K., Myers, D. D., Wakefield, T. W. Inferior vena cava branch variations in C57BL/6 mice have an impact on thrombus size in an IVC ligation (stasis) model. J Thromb Haemo. 13 (4), 660-664 (2015).
- Schönfelder, T., Jäckel, S., Wenzel, P. Mouse models of deep vein thrombosis. Gefässchirurgie. 22 (1), 28-33 (2017).
- de Barros, R. S. M., et al. Morphometric analysis of rat femoral vessels under a video magnification system. J Vasc Bras. 16 (1), 73-76 (2017).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
