Artykuł metodologiczny

Izolacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny o wysokiej wydajności i niskich uszkodzeniach

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66835

⸱

5 lipca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3Obstetrical Department, Longgang District Maternity & Child Healthcare Hospital of Shenzhen City, 4Longgang Maternity and Child Institute of Shantou University, Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia unikalną procedurę sekcji w celu zachowania integralności galarety Whartona (WJ), co skutkuje mniej uszkodzonym WJ oraz większą ilością i żywotnością pobranych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). Metoda ta wykazuje lepszą wydajność i zdolność proliferacyjną w porównaniu z konwencjonalnymi metodami ostrej sekcji.

Streszczenie

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) to populacja komórek multipotencjalnych o niezwykłych właściwościach regeneracyjnych i immunomodulujących. Galaretka Whartona (WJ) z pępowiny (UC) cieszy się coraz większym zainteresowaniem w dziedzinie biomedycyny jako doskonałe źródło MSC. Pojawiły się jednak wyzwania, takie jak ograniczona podaż i brak standaryzacji istniejących metod. W artykule przedstawiono nowatorską metodę zwiększania wydajności MSC poprzez wypreparowanie nienaruszonego WJ z pępowiny. Metoda polega na rozwarstwieniu w celu usunięcia warstwy nabłonka, zachowując integralność całego WJ i skutkując zwiększoną ilością i żywotnością zebranych MSC. Takie podejście znacznie zmniejsza ilość odpadów WJ w porównaniu z konwencjonalnymi metodami ostrej sekcji. Aby zapewnić czystość WJ-MSC i zminimalizować zewnętrzny wpływ komórek, przeprowadzono procedurę wykorzystującą napięcie wewnętrzne do odklejenia śródbłonka po odwróceniu UC. Dodatkowo szalka Petriego została odwrócona na krótki czas podczas hodowli eksplantatów, aby poprawić przyczepianie i wzrost komórek. Analiza porównawcza wykazała wyższość proponowanej metody, wykazując wyższą wydajność WJ i WJ-MSC przy lepszej żywotności niż tradycyjne metody. Podobna morfologia i wzorzec ekspresji markerów powierzchni komórek w obu metodach potwierdza ich charakterystykę i czystość w różnych zastosowaniach. Metoda ta zapewnia wysokowydajne i opłacalne podejście do izolacji WJ-MSC, wykazując duży potencjał w klinicznym zastosowaniu MSC.

Wprowadzenie

Od czasu pierwszej izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) z galaretki Whartona (WJ) w 1991 roku, te multipotencjalne komórki macierzyste zyskały znaczną uwagę badaczy ze względu na ich właściwości regeneracyjne i zdolność do różnicowania wieloliniowego1. MSCs mogą być izolowane z różnych źródeł, w tym ze szpiku kostnego, krwi obwodowej, miazgi zębowej, tkanki tłuszczowej, płodu (aborcja u człowieka) i tkanek związanych z urodzeniem2. Pępowina (UC) okazała się obiecującym rezerwuarem ze względu na swój nieinwazyjny charakter, obfity plon komórek i zdolność różnicowania, wykazując wysokie tempo proliferacji, potencjał różnicowania i właściwości modulacji immunologicznej3. Płodowe MSCs wykazują silne właściwości macierzyste i odpornościowe, co czyni je głównym przedmiotem badań klinicznych i podstawowych badań prowadzonych w ciągu ostatnich dwóch dekad2,4,5. MSCs pochodzące z UC mają większy potencjał terapeutyczny w porównaniu z innymi źródłami MSC, takimi jak szpik kostny czy tkanka tłuszczowa6,7.

UC składa się z nabłonka owodniowego, trzech naczyń (dwie tętnice i jedna żyła) oraz galaretowatej substancji znanej jako WJ3. Co ciekawe, UC stanowi proste unaczynienie, składające się tylko ze śródbłonka i międzybłonka, ale nie z osłonki lekarskiej; WJ nie zawiera limfy ani nerwów8. UC prezentuje unikalną strukturę idealną do separacji segmentowej. UC-MSC znajdują się głównie w WJ. MSC mogą być izolowane z różnych przedziałów WJ, w tym owodni, subamniony (owodnia i subamnion oznaczone również jako obszar wyściółki pępowiny) oraz obszaru okołonaczyniowego klasy WJ8. Każdy region WJ ma swoją własną strukturę, charakterystykę immunohistochemiczną i funkcję3,6.

MSC odizolowane od WJ UC są powszechnie uważane za mające wyższą użyteczność kliniczną w porównaniu do tych z innych regionów3. WJ-MSCs były szeroko badane w warunkach przedklinicznych i klinicznych w leczeniu różnych chorób ze względu na ich potencjał różnicowania wieloliniowego, właściwości immunomodulujące, działanie parakrynne, działanie przeciwzapalne i właściwości uprzywilejowane immunologicznie2,3. Udowodniono, że WJ-MSC są obiecujące w leczeniu wielu chorób, w tym choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD), odrzucenia przeszczepu, choroby Leśniowskiego-Crohna, chorób autoimmunologicznych i chorób układu krążenia9,10,11,12,13,14. Ponieważ zapotrzebowanie kliniczne na WJ-MSC stale rośnie, niedobór podaży pępowiny jest obecnie przeszkodą w ich powszechnym zastosowaniu.

Wydajność WJ-MSCs zależy od metody użytej do ekstrakcji komórek15. Podczas gdy WJ-MSC można wyizolować poprzez hodowlę eksplantatów lub trawienie enzymatyczne, ta druga metoda ma dłuższy czas namnażania, co może zwiększyć ryzyko uszkodzenia komórek i zmniejszyć ich żywotność16. Jednak liczne badania wykazały, że metoda hodowli eksplantatów zwiększa wydajność i żywotność komórek, a czynniki parakrynne uwalniane z tkanek eksplantacji również pomagają promować proliferację komórek17,18.

To badanie zastosowało unikalne podejście do sekcji, aby uzyskać całe WJ, uzyskując MSC o zwiększonej zdolności proliferacyjnej, żywotności i ilości, jednocześnie minimalizując uszkodzenia WJ. Ta innowacyjna metoda oferuje uproszczoną strategię izolowania WJ-MSC, odpowiadając na krytyczne potrzeby w aplikacjach MSC.

Protokół

Próbki pobrano od zdrowych dawców z Shenzhen Longgang District Maternity and Child Healthcare Hospital, Guangdong, Chiny. Wykorzystanie próbek ludzkich do badania zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Shenzhen, Pekińskiego Uniwersytetu Medycyny Chińskiej (SZLDH2020LSYM-095) oraz Komisję Etyki Medycznej Szpitala Opieki Zdrowotnej dla Położnictwa i Dzieci w Shenzhen Longgang (LGFYYXLLS-2020-005). Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi. Szczegółowe informacje na temat odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Pobranie ludzkiej pępowiny

  1. Próbki ludzkiej pępowiny należy pobrać ze szpitala współpracującego w sterylnych warunkach.
    UWAGA: Wybierz dawcę w wieku poniżej 35 lat, najlepiej pierwotnego, bez historii zapalenia wątroby, chorób przenoszonych drogą płciową lub zaburzeń genetycznych. Wyniki egzaminów wstępnych na obecność wirusa zapalenia wątroby typu B, wirusa zapalenia wątroby typu C i wirusa cytomegalii muszą być negatywne. Wybierz cięcie cesarskie jako metodę porodu.
  2. Wybierz prosty i nienaruszony kawałek UC o długości około 10-15 cm.
  3. Zamknij oba końce kleszczami hemostatycznymi i podwiąż węzłami chirurgicznymi na wewnętrznym końcu między kleszczami zaraz po porodzie noworodka urodzonego o czasie przez cesarskie cięcie. (zebrane UC, jak pokazano w Rysunek 1, krok 1).
    UWAGA: Operacja cesarskiego cięcia zapewnia, że pobranie jest sterylne. Używaj węzłów chirurgicznych o rozmiarze 0 lub szwu 2-0, aby uzyskać lepszą wytrzymałość na rozciąganie.
  4. Przetnij zawiązaną pępowinę między kleszczami i węzłami za pomocą nożyczek chirurgicznych (Rysunek 1, krok 1).
  5. Przepłukać go roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć wszelkie zanieczyszczające skrzepy krwi z powierzchni i niezwłocznie przenieść do sterylnej plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 20 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    UWAGA: Podczas transferu nie zastosowano żadnego antybiotyku.
  6. Uszczelnij rurkę. Umieścić go na lodzie w styropianowym pudełku i przechowywać w temperaturze 4 °C przed transportem do laboratorium.
    UWAGA: Przeciąć przewód w ciągu 4 godzin od pobrania.

2. Wyizolowanie galaretki Whartona z pępowiny

  1. Przetwarzaj pępowinę, wykonując poniższe czynności:
    1. Przygotuj wysterylizowaną tacę z narzędziami chirurgicznymi, aseptycznie zapakowanymi szalkami o średnicy 90 mm, pipetami 1000 μl, sterylnym PBS, 75% roztworem etanolu i pożywką hodowlaną MSC bez ksenokształtu.
      UWAGA: Ząbkowane kleszczyki i zaciski na komary pozwalają na skuteczne radzenie sobie z linką ślizgową.
    2. Powierzchnia: Odkaż wymagane przedmioty i strefę roboczą przed umieszczeniem ich w szafie bezpieczeństwa biologicznego.
      UWAGA: Przed rozpoczęciem pracy pozwól, aby powietrze w strefie roboczej się oczyściło.
    3. Zdezynfekować powierzchnię probówki i przenieść próbkę na płytkę Petriego w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zanurzyć próbkę z węzłami w 75% etanolu na 30 s, a następnie przepłukać ją wielokrotnie sterylnym PBS na nowej szalce Petriego.
      UWAGA: Sznurek należy podwiązać przed zanurzeniem w 75% etanolu, a czas zanurzenia należy ograniczyć do 30 s do 1 minuty, aby w pełni zdezynfekować przewód bez uszkodzeń.
    4. Odetnij węzły i przetnij sznur między dwoma węzłami poprzecznie na krótkie kawałki o długości około 2 cm za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
      UWAGA: Końce sznurka z węzłami należy wyrzucić. Długość UC nie powinna być ani za długa, ani za krótka; Oba warunki mogą zwiększyć trudność operacji.
    5. Wykonaj fuzję żyły (większe naczynie) za pomocą PBS za pomocą pipet o pojemności 1000 μl, aż płyn wychodzący z drugiego końca przewodu stanie się całkowicie przezroczysty19.
  2. Przeciąć pępowinę.
    1. Przenieś jeden z już pociętych kawałków na nową szalkę Petriego.
      UWAGA: Dwie tętnice i jedna żyła powinny być widoczne na przekroju poprzecznym8 (Rysunek 2B).
    2. Dodaj odpowiednią ilość PBS, aby przewód był mokry przez całą operację.
    3. Chwyć sznurek kleszczami i wyciągnij tętnice wzdłuż jego głównej osi za pomocą zacisków na komary.
      UWAGA: Spróbuj pociągnąć z drugiego końca sznurka, jeśli tętnica została oderwana, ponieważ ściana tętnicy ma dużą elastyczność.
    4. Zamocuj pępowinę poziomo grubszą stroną skierowaną do góry, wkładając jedno ostrze kleszczy do żyły pępowinowej, a następnie mocno zaciskając, upewniając się, że kleszcze clamp po grubszej stronie.
    5. Wykonaj liniowe nacięcie na warstwie nabłonka owodniowego od jednego końca do drugiego wzdłuż krawędzi drugiego ostrza kleszczy za pomocą skalpela (Ryc. 3).
      UWAGA: Zachowaj integralność galaretki Whartona, tnąc jak najmniej WJ.
    6. Zacznij od jednego rogu szczeliny cięcia. Podnieś róg nabłonka owodniowego za pomocą ząbkowanych zacisków i kontynuuj cięcie poziome nieco dalej nożyczkami rogówkowymi wzdłuż wewnętrznej powierzchni nabłonka.
      1. Oddziel galaretkę Whartona i nabłonek owodniowy za pomocą zacisków i stopniowo rozszerzaj się na cały okrąg jednego końca UC. Oderwij warstwę nabłonka wzdłuż (Rysunek 3).
        UWAGA: Galaretka Whartona to śluzowa tkanka łączna otoczona gęstym nabłonkiem owodniowym8. Cała operacja powinna przebiegać płynnie, ale zaciski na komary mogą być używane do rozwarstwienia, jeśli napotka się trudności podczas peelingu.
    7. Włóż oba ostrza kleszczyków do żyły, zaciśnij część WJ, a następnie odwróć ją na lewą stronę, aby odsłonić nabłonek żyły pępowinowej (Ryc. 3).
    8. Łatwo odklej nabłonek żyły, ponieważ napięcie wewnętrzne tworzy separację między nabłonkiem żyły a okołonaczyniowym WJ (Ryc. 3).
  3. Przeanalizuj UC przy użyciu konwencjonalnej metody porównania20.
    1. Wybierz inną, już przyciętą próbkę o prawie takiej samej wadze jak poprzedni sznurek i przenieś ją na nową szalkę Petriego.
    2. Przeciąć wzdłuż żyły pępowinowej wzdłuż nożyczek i rozciągnąć UC, aby odsłonić naczynia i WJ.
    3. Usuń żyłę pępowinową i dwie tętnice, a następnie usuń WJ z warstwy śródbłonka za pomocą nożyczek i skalpela.

3. Izolacja i kultura UC-MSCs

  1. Umieść zebrany WJ na wstępnie oznaczonej szalce Petriego o średnicy 90 mm i pokrój na 1-3 mm kawałki nożyczkami i kleszkami.
  2. Odwróć naczynie z nakrętką na dnie i umieść je w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C na 30 minut, aby wzmocnić mocowanie między kawałkami a plastikową powierzchnią.
  3. Odwróć naczynie na drugą stronę i delikatnie dodaj odpowiednią ilość pożywki dla ludzkich kultur MSC w celu dalszego wyhodowania.
    UWAGA: Użyj najniższej prędkości, aby upewnić się, że elementy są nadal przymocowane.
  4. Zmieniaj pożywkę hodowlaną MSC co 3 dni. Wymień dwie trzecie pożywki i obserwuj pojawienie się wyrostka komórek włóknistych co 2 dni w ciągu pierwszych 7 dni, zmień pełną pożywkę, a następnie obserwuj ją codziennie.
    UWAGA: Unikaj przesuwania szalki Petriego przez pierwsze 7 dni. Wyraźny rozrost komórek podobnych do fibroblastów zaobserwowano po około 4 dniach.
  5. Subkultura do momentu, gdy konfluencja osiągnie 80%.
    UWAGA: Ten krok trwa 7-10 dni.
    1. Podgrzej PBS, 0,25% trypsynę i wolne od ksenotypów ludzkie podłoże hodowlane MSC do 37 °C w łaźni wodnej.
    2. Przepłukać PBS po zaessaniu supernatantu za pomocą pipet i odłączyć komórki wstępnie podgrzaną 0,25% trypsyną, aż komórki będą mogły zostać usunięte przez dotknięcie szalki Petriego.
    3. Dezaktywować trypsynę przez zmieszanie wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej MSC w stosunku 4:1, zebrać zawiesinę komórkową i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Te komórki są uważane za przejście 0 (P0).
    4. Odrzucić supernatant za pomocą pipety, ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej MSC i zaszczepić na nowych szalkach Petriego o gęstości wysiewu 1x104 komórki/cm2 w celu rozmnażania.
  6. Za pomocą hemocytometru policz całkowitą liczbę komórek obu metod po amplifikacji przy pierwszym, drugim i trzecim pasażu. Określ morfologię komórek pod mikroskopem w pierwszym, trzecim i piątym pasażu.
    UWAGA: Morfologia tych komórek powinna być podobna do komórek P0.
  7. Użyj komórek w piątym pasażu do cytometrii przepływowej i innych eksperymentów.

4. Ekspresja markerów powierzchni komórek za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Odłączyć 5 komórek (P5) z 0,25% trypsyną, przemyć komórki buforem do barwienia komórek i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić granulki z buforem do barwienia komórek do 100 μl każdy.
  2. Oznacz każdą probówkę i dodaj odpowiednie ilości przeciwciał, które zostały sprzężone z allofikocyjaniną (APC), izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) lub fikoerytryną (PE): CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE zgodnie z instrukcjami producenta21. Inkubować przez 15-20 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
  3. Odwirować zabarwione komórki przy sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odessać supernatant pipetą i raz przemyć buforem do barwienia komórek.
  4. Powtórzyć odwirowywanie i ponowne zawieszenie komórek w 300 μl buforu do barwienia komórek.
  5. Przepuść komórki przez cytometr przepływowy i przeanalizuj komórki barwione przeciwciałami zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Wyznaczanie krzywej wzrostu komórek metodą zliczania komórek

  1. Przygotować jednokomórkową zawiesinę komórek P5 dwiema metodami, rozcieńczając je w ludzkiej pożywce hodowlanej MSC.
  2. Wysiewaj 8 000 komórek na dołek na 24-dołkowej płytce, w sumie wysiewając 21 dołków każdej metody.
    UWAGA: Przed wysiewem delikatnie wymieszaj komórki, przedmuchując i odsysając pipetami.
  3. Zbierz komórki z trzech dołków po 24 godzinach siewu. Wykonaj zliczanie komórek za pomocą hemocytometru, aby obliczyć wartość średnią.
    UWAGA: Wstrząśnij płytką przed zliczaniem komórek. Czas wytrząsania można wydłużyć, aby zapobiec tworzeniu się agregatów komórkowych.
  4. Powtarzaj liczenie komórek co 24 godziny przez łączny czas 7 dni. Wykreślić krzywą wzrostu, używając czasu (d) na osi X i liczby komórek (x104/ml) na osi Y.

Wyniki

Procedury pobierania i hodowli UC-MSCs, a także ich późniejsza analiza, zostały podsumowane na Rysunku 1. Pępowinę (UC) starannie podzielono na kilka sekcji przy użyciu unikalnej metody; szczegółowy schemat operacyjny głównych etapów został przedstawiony na Rysunku 2. Wzrost komórek z hodowli eksplantów był rutynowo monitorowany i rejestrowany. Przywierające, wrzecionowate komórki zaobserwowano około 4 dni po wysianiu eksplantów, przy czym coraz częściej układały się one w kształt wiru. Komórki te zidentyfikowano jako P0 i kontynuowano ich proliferację w celu dalszego pasażowania, podczas gdy w trakcie proliferacji i pasażowania zachowywały one jednorodny rozmiar i morfologię. Metoda konwencjonalna i obecna wykazały pomijalne różnice pod kątem rozmiaru i morfologii komórek (Rysunek 3).

Konwencjonalna metoda sekcji polega na zdrapywaniu galaretki Wharton (WJ) z naczyń krwionośnych i wewnętrznego nabłonka pępowiny (UC). Uzyskana ilość WJ wykazała znaczącą różnicę między dwiema metodami po korekcie wagowej. Wydajność WJ można obliczyć, mierząc procentową wagę WJ w 2 cm odcinku pępowiny (2,4 g ± 0,2 g). Porównanie stosunku wydajności WJ między obecną a tradycyjną metodą wykazało znaczący wzrost wydajności WJ przy zastosowaniu nowego podejścia (Rysunek 4A). Dalsza analiza polegająca na jednoczesnym policzeniu całkowitej liczby WJ-MSC pozyskanych obiema metodami z równoważnej wagi UC wykazała wyraźną różnicę w ilości komórek wraz ze wzrostem numeru pasażu (Rysunek 4B). Krzywa wzrostu wskazała, że szybkość proliferacji MSC w nowej metodzie była znacząco wyższa niż w metodzie konwencjonalnej przy tej samej gęstości szczepienia po 2 dniach (Rysunek 4C). Eksperymenty te demonstrują zalety obecnej metody, która umożliwia efektywne zwiększenie podaży tego samego materiału.

Zgodnie z minimalnymi kryteriami definicji MSC ustanowionymi przez Międzynarodowe Towarzystwo Terapii Komórkowych i Genowych (ISCT), immunofenotyp MSC wykazuje pozytywną ekspresję CD105, CD44, CD90, CD73 (powyżej 95%), przy jednoczesnym braku ekspresji CD45, CD19, CD34, CD11b oraz HLA-DR (poniżej 2%).22Zbadano mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) pochodzące z żylnej krwi pępowinowej (WJ). poprzez ilościowa cytometria przepływowa (Rysunek 5); komórki wyizolowane obiema metodami wykazały wysoką ekspresję antygenów powierzchniowych CD105, CD44, CD90 i CD73 (wszystkie powyżej 99%), natomiast ekspresja cząsteczek powierzchniowych CD45, CD19, CD34, CD11b i HLA-DR znajdowała się poniżej poziomu wykrywalności (dane nie przedstawiono). Na podstawie wyników markerów powierzchniowych komórek można jednoznacznie uznać komórki adherentne za MSC, co potwierdza ich identyfikację oraz czystość.

Proces hodowli MSC z pępowiny; schemat; etapy: sekcja, hodowla, charakterystyka, wzrost.
Rysunek 1: Schematyczna reprezentacja sekcji i izolacji WJ-MSC z pępowiny. Krok 1: Próbka ludzkiej pępowiny jest pobierana od noworodka i płukana roztworem soli fizjologicznej, po czym następuje perfuzja żyły. Pępowina jest następnie cięta na fragmenty o długości 2 cm. Krok 2: Czystą galaretkę Whartona (WJ) uzyskuje się za pomocą obecnej metody, obejmującej oddzielenie tętnic, nabłonka owodni oraz nabłonka żyły. Do porównania stosowana jest również metoda tradycyjna. Pępowina jest odpowiednio preparowana. Krok 3: Wypreparowana WJ jest cięta na fragmenty o wielkości 1-3 mm, a naczynie jest umieszczane dnem do góry w inkubatorze na 30 min, aby wzmocnić przyleganie fragmentów do plastikowej powierzchni. Fragmenty WJ są następnie hodowane i pasażowane przy gęstości wysiewu 1 x 104 komórek/cm2 aż do osiągnięcia 80% konfluencji. Krok 4: Do charakterystyki komórek w pasażu P5 wykorzystuje się cytometrię przepływową poprzez analizę markerów powierzchniowych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC). Krok 5: Zdolność proliferacyjna komórek jest określana poprzez wykreślenie krzywej wzrostu komórek z zastosowaniem metody liczenia komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces sekcji pępowiny; schemat ekstrakcji galarety Whartonowskiej; separacja żyły i tętnicy.
Rycina 2: Anatomia pępowiny i schematyczna prezentacja sekcji. (A) Przekrój poprzeczny pępowiny, z zaznaczonymi tętnicami (A), żyłą (V), galaretą Whartonowską (WJ); następna sekcja rozdziela pępowinę na poszczególne komponenty. (B) Schematyczna prezentacja usuwania warstwy nabłonka owodniowego. Nacięcie wykonuje się wzdłuż przerywanej linii na nabłonku owodniowym, oddzielając nabłonek, zaczynając od bocznego rogu pępowiny. (C) Schematyczna prezentacja usuwania nabłonka żyły. Wywinięcie pępowiny na drugą stronę (kierunek strzałki wskazuje kierunek przyłożonej siły) odsłania nabłonek żyły w celu jego usunięcia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie wzrostu komórek na obrazach mikroskopowych metod aktualnej i tradycyjnej; pasek skali 200 μm.
Rysunek 3: Cechy morfologiczne pierwotnych kultur i pasażowanych WJ-MSC. W okolicach 4. dnia można zaobserwować wyraźny fibroblastoidalny wzrost komórek z eksplantów (oznaczony strzałkami), który z czasem przybrał formę wzorca wzrostu przypominającego wir. Eksplanty zostały usunięte i poddane subkulturze; izolowane komórki były jednorodnie wielkością i morfologią. Nie stwierdzono istotnych różnic w wielkości i morfologii komórek pomiędzy obiema metodami. Pasek skali: 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy słupkowe i liniowe porównujące tradycyjne i obecne metody hodowli komórkowej; schematy przedstawiające wydajność, pasaż i dynamikę wzrostu w ciągu dni.
Rycina 4: Graficzna analiza porównawcza wydajności WJ oraz charakterystyki wzrostu hodowlanych MSC. (A) Porównanie wydajności WJ przy użyciu 2 cm UC o wadze początkowej 2,4 g ± 0,2 g obiema metodami. Wydajność WJ = (masa WJ) / (masa początkowa nieprzetworzonej pępowiny). Stosunek wydajności WJ (%) = (wydajność WJ) / (średnia wydajność WJ metody obecnej) × 100. (B) Porównanie liczby komórek po hodowli i pasażu w tych samych warunkach obiema metodami. (C) Krzywe wzrostu komórek P5 w obu metodach. Wszystkie eksperymenty obejmowały trzy powtórzenia biologiczne, a różnice statystyczne analizowano metodą dwuczynnikowej analizy wariancji ANOVA (***p < 0,001). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Histogramy cytometrii przepływowej dla markerów powierzchniowych komórek CD44, CD105, CD90, CD73; wyniki analizy danych.
Rysunek 5: Ekspresja markerów powierzchniowych MSC analizowana metodą cytometrii przepływowej. Komórki P5 pobrane zarówno metodą konwencjonalną, jak i aktualną, poddano analizie cytometrycznej. Antygeny powierzchniowe CD44, CD105, CD90 i CD73 wykazały wysoką dodatniość (wszystkie powyżej 99%), natomiast ekspresja cząsteczek powierzchniowych CD45, CD19, CD34, CD11b i HLA-DR znajdowała się poniżej granicy wykrywalności. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

MSCs stanowią dynamiczny obszar badań o głębokich implikacjach dla medycyny regeneracyjnej22 . Ich unikalne właściwości sprawiają, że są one centralnym punktem badań naukowych i mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie szerokiego zakresu chorób i urazów7. WJ-MSC są odrębnym podzbiorem MSC, który można uzyskać z galaretowatej tkanki łącznej w obrębie UC położonej między nabłonkiem międzynaczyniowym a owodniowym23. Kliniczne zastosowanie MSCs polega na osiągnięciu wystarczającej liczby komórek24. Jednak wraz ze wzrostem liczby pasaży komórki zaczęły wykazywać pewien stopień zjawiska starzenia, a zdolność proliferacyjna MSCs stopniowo zmniejszała się po P524. W związku z tym konieczna jest optymalizacja metod mających na celu zwiększenie plonu MSC.

Najskuteczniejszym sposobem wyizolowania WJ-MSC jest rozwarstwienie całego WJ przy zachowaniu jego integralności6. Badania pokazują, że te komórki graniczne z regionów granicznych pępowiny mają wyższą charakterystykę migracji i wyższy współczynnik proliferacji niż międzynaczyniowe WJ-MSCs23. Jednak regiony i metody preparacji WJ nie zostały ustandaryzowane i pozostaje niejasne, czy populacje komórek macierzystych w WJ-MSC mają te same cechy ze względu na brak wyraźnych granic histologicznych między przegrodami3.

Wcześniejsze badania wykazały znaczące różnice we właściwościach WJ-MSC pochodzących z różnych przedziałów pępowiny, przy czym komórki zlokalizowane blisko powierzchni owodni wykazują zwiększoną zdolność proliferacyjną3. Obecna unikalna metoda preparowania UC i izolowania WJ-MSC ma na celu zmniejszenie zarówno utraty wyściółki WJ, jak i uszkodzenia komórek, co zwiększa wydajność i żywotność komórek. Protokół ten demonstruje metodę, która ułatwiła przetwarzanie UC do prawie nienaruszonego WJ. Pierwszym etapem protokołu jest usunięcie warstwy nabłonkowej poprzez złuszczanie i rozwarstwienie. Innowacyjnym krokiem jest odklejenie warstwy nabłonka wzdłuż za pomocą klamer na komary. Takie podejście jest skuteczne w zmniejszaniu uszkodzeń sąsiednich komórek spowodowanych konwencjonalnym ostrym rozwarstwieniem nożyczkami25.

Śródbłonek żyły jest delikatny i trudny do pozbycia się. Po usunięciu nabłonka owodniowego z żyły pępowinowej, pępowina jest przewracana przez żyłę, aby odsłonić śródbłonek. Napięcie wewnętrzne wytworzone przez WJ jest następnie wykorzystywane do odklejania śródbłonka żyły, minimalizując w ten sposób zakłócenia ze strony ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) podczas kolejnych procesów hodowli komórek.

Stosuje się metodę hodowli eksplantatów, ponieważ daje ona wyższy plon w porównaniu z innymi dostępnymi metodami18. Nieprzyłączone komórki będą stopniowo usuwane poprzez wymianę ludzkiej pożywki hodowlanej MSC, co spowoduje utratę komórek26. Eksplantaty, które nie przylegają do plastiku, mogą hamować wzrost komórek w poprzednich doświadczeniach. Należy wziąć pod uwagę wpływ pary wodnej wydzielanej z tkanki w wyniku zmian temperatury wewnętrznej i zewnętrznej inkubatora. Aby utrzymać suchy stan szalki Petriego, zastosowano innowacyjny etap polegający na odwróceniu szalki do góry nogami na 30 minut podczas inkubacji z pokrywką na dnie. To odwrócenie szalki pozwoliło uniknąć kondensacji pary wodnej na kontakcie między tkanką a powierzchnią szalki Petriego, co z kolei pozwala na lepsze przyleganie egzosomów do powierzchni tworzywa sztucznego w celu poprawy wzrostu komórek.

Obecna metoda jest porównywana z konwencjonalną metodą preparacji poprzez pomiar procentu wagowego uzyskanego WJ oraz ilości hodowanych i pasażowanych MSCs; nowatorską metodą wykazano znacznie wyższy plon WJ i dalszą ilość zebranych MSC. Chociaż każdy protokół izolacji populacji komórek macierzystych z każdego z tych przedziałów niesie ze sobą ryzyko zanieczyszczenia komórek z innych przedziałów, wyniki wykazały czystość izolowanych MSC, charakteryzującą się wysoką ekspresją markerów mezenchymalnych (wszystkie powyżej 99%) i minimalnym wykrywaniem markerów krwiotwórczych i śródbłonka (dane nie pokazane). Wyniki dowiodły, że WJ-MSC są czyste i nadają się do różnych zastosowań, zgodnie z wytycznymi ISCT21. Hodowane MSCs w krótkim czasie wykazywały komórki podobne do fibroblastów, a komórki coraz częściej przekształcały się w komórki w kształcie wiru, wykazujące duży potencjał proliferacyjny i właściwości migracyjne.

Protokół przedstawiony w tym badaniu ma kilka niedociągnięć. Po pierwsze, biegłość wymagana od operatora jest wysoka, na co wskazuje oddzielenie nabłonka owodniowego. Może to utrudnić jego powszechne zastosowanie w zastosowaniach badawczych lub klinicznych. Po drugie, protokół opiera się w dużej mierze na ręcznej manipulacji podczas sekcji, co może wprowadzić niespójność między eksperymentami lub operatorami. Standaryzacja procesu preparacji zwiększyłaby wiarygodność i odtwarzalność protokołu25. Co więcej, brak innych porównań z metodą konwencjonalną pozostawia pytania bez odpowiedzi.

Podsumowując, obecna metoda zapewnia skuteczny sposób na oddzielenie nienaruszonego WJ od nabłonka owodniowego i naczyń krwionośnych, co skutkuje zbiorem obejmującym galaretkę Whartona okołonaczyniową i podowodniową. Wprowadzenie etapu inkubacji odwróconej dodatkowo przyczynia się do poprawy przywiązania MSC. Analiza porównawcza z tradycyjnymi metodami wskazuje na znaczące zalety proponowanego protokołu w zakresie uzyskania wyższego plonu WJ i zebrania większej liczby MSCs o lepszej zdolności proliferacyjnej. Odkrycia podkreślają również czystość wyizolowanych MSCs, na co wskazuje wyraźny wzór ekspresji markerów na powierzchni komórki. Metoda ta może zwiększyć wydajność i zdolność proliferacyjną MSC, oferując opłacalną metodę zwiększania produkcji MSC.

Oświadczenia

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana finansowo przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82172107), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Guangdong, Chiny (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), Shenzhen Medical Research Fund (SMRF. D2301015), Miejski Komitet ds. Innowacji Naukowych i Technologicznych w Shenzhen (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) oraz Specjalny Fundusz Rozwoju Gospodarczego i Technologicznego Dystryktu Longgang (LGKCYLWS2022007).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało APC anty-ludzkie CD44 Legenda biologiczna 
24-dołkowe płytki do hodowli komórkowychThermo Scientific142475
APC przeciwciało anty-ludzkie CD73 (ekto-5'-nukleotydaza) Legenda biologiczna 
Mysz APC IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Przeciwciało Biolegend 
Autoklaw400122 HIRAYAMAHVE-50
Automatyczny licznik komórekCountstarFL-CD
BAMBANKER Roztwór do kriokonserwacjiWako302-14681
Bufor do barwienia komórekBiolegend 
420201 Maszyna odśrodkowaEppendorf5424R
Clean BenchShanghai ZhiChengC1112B
Inkubator CO2Thermo ScientificHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
Elektrotermostatyczny piec do wydmuchiwaniaShanghai JingHongDHG-9423A
Przeciwciało anty-ludzkie CD105 FITC Legenda biologiczna 
Przeciwciało anty-ludzkie CD90 (Thy1) FITC Legenda biologiczna 
Mysz FITC IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Przeciwciało Biolegend 400110
Cytometria przepływowaHemocytometr BeckmanCytoFLEX
Superior Marienfeld640410
Bufor do płukania do barwienia wewnątrzkomórkowego (10 razy) Legenda biologiczna 
Odwrócony mikroskop biologicznyZEISSAxio Vert. A1
Zbiornik magazynujący ciekły azotThermo ScientificCY50935-70
Sól normalna (NS)MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE anty-ludzkie przeciwciało CD11bBiolegend 
PE przeciwciało anty-ludzkie CD19 Legenda biologiczna 
PE przeciwciało anty-ludzkie CD34 Biolegend 
PE przeciwciało anty-ludzkie CD45 Biolegend 368510
PE Przeciwciało anty-ludzkie HLA-DR Legenda biologiczna 
Mysz PE IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Przeciwciało Biolegend 
Mysz PE IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) Przeciwciało Biolegend 
Precyzyjna waga elektronicznaSatoriusPRACTUM313-1CN
Maszyna do lodu z płatkami śnieguZIEGRAZBE 30-10
sterylna plastikowa rurka 50 mlGreniner227270
Termostatyczna łaźnia wodnaSzanghaj YiHengHWS12
Trypsyna 1:250SolarbioT8150
UltraGRO-ZaawansowanyHelios 
System oczyszczania wody ultraczystej i czystejMilli-QMilli-Q Referencyjne
pożywki hodowlane MSC dla ludzi bez ksenotypówFUKOKU 
338806344006323204328108421002393112392506343606307606400114400214HPCFDCGL50T2011301

Bibliografia

  1. Abbaszadeh, H., et al. Regenerative potential of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: A new horizon of stem cell therapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9230-9240 (2020).
  2. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Curr Res Transl Med. 68 (1), 5-16 (2020).
  3. Kim, D. -W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: Phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  4. Drobiova, H., et al. Wharton's jelly mesenchymal stem cells: A concise review of their secretome and prospective clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1211217(2023).
  5. Joerger-Messerli, M. S., et al. Mesenchymal stem cells from Wharton's jelly and amniotic fluid. Best Pract Res Cl Ob. 31, 30-44 (2016).
  6. Pera, M., Subramanian, A., Fong, C. -Y., Biswas, A., Bongso, A. Comparative characterization of cells from the various compartments of the human umbilical cord shows that the Wharton's jelly compartment provides the best source of clinically utilizable mesenchymal stem cells. Plos One. 10 (6), 0127992(2015).
  7. Petrenko, Y., et al. A comparative analysis of multipotent mesenchymal stromal cells derived from different sources, with a focus on neuroregenerative potential. Sci Rep. 10 (1), 4290(2020).
  8. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise review: Wharton's jelly: The rich, but enigmatic, source of mesenchymal stromal cells. Stem Cells Transl Med. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  9. Pan, Y., Wu, W., Jiang, X., Liu, Y. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cardiovascular and cerebrovascular diseases: From mechanisms to therapy. Biomed Pharmacother. 163, 114817(2023).
  10. Elshaer, S. L., Bahram, S. H., Rajashekar, P., Gangaraju, R., El-Remessy, A. B. Modulation of mesenchymal stem cells for enhanced therapeutic utility in ischemic vascular diseases. Int J Mol Sci. 23 (1), 249(2021).
  11. Wang, R., et al. Stem cell therapy for Crohn's disease: Systematic review and meta-analysis of preclinical and clinical studies. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 463(2021).
  12. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  13. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: Potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  14. Saleh, M., Fotook Kiaei, S. Z., Kavianpour, M. Application of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells in patients with pulmonary fibrosis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 71(2022).
  15. Varaa, N., Azandeh, S., Khodabandeh, Z., Gharravi, A. M. Wharton's jelly mesenchymal stem cell: Various protocols for isolation and differentiation of hepatocyte-like cells; narrative review. Iran J Med Sci. 44 (6), 437-448 (2019).
  16. Hassan, G., Kasem, I., Soukkarieh, C., Aljamali, M. A simple method to isolate and expand human umbilical cord derived mesenchymal stem cells: Using explant method and umbilical cord blood serum. Int J Stem Cells. 10 (2), 184-192 (2017).
  17. Naeem, A., et al. A comparison of isolation and culture protocols for human amniotic mesenchymal stem cells. Cell Cycle. 21 (15), 1543-1556 (2022).
  18. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726(2013).
  19. Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (CFCs). J Vis Exp. (32), e1525(2009).
  20. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. J Vis Exp. (122), e55224(2017).
  21. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2173-2185 (2017).
  23. Sypecka, M., Bzinkowska, A., Sulejczak, D., Dabrowski, F., Sarnowska, A. Evaluation of the optimal manufacturing protocols and therapeutic properties of mesenchymal stem/stromal cells derived from Wharton's jelly. Int J Mol Sci. 24 (1), 652(2022).
  24. Binato, R., et al. Stability of human mesenchymal stem cells during in vitro culture: Considerations for cell therapy. Cell Prolif. 46 (1), 10-22 (2012).
  25. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  26. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Prolif. 50 (2), 12334(2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Galaretka Whartonaizolacja kom rek macierzystychrozdzielanie t peywotno kom rekhodowla eksplantat wmarkery powierzchniowe kom rekmedycyna regeneracyjnatransplantacja organoid w

Powiązane artykuły