Ten protokół przedstawia szybką i nieśmiercionośną metodę pozyskiwania przytarczyc od świń. Procedura składa się z trzech głównych etapów: preparatyki świńskiej w znieczuleniu, jednostronnego pobrania grasicy oraz identyfikacji ex vivo i ekstrakcji przytarczyc wewnątrz grasicy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie przytarczyc od żywych świń dawców i identyfikacja ex vivo
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niedoczynność przytarczyc, często wynikająca z powikłań chirurgicznych, poważnie zaburza homeostazę wapnia, prowadząc do objawów powodujących niepełnosprawność. Obecne metody leczenia oferują ograniczoną ulgę, co podkreśla potrzebę alternatywnych terapii, takich jak przeszczep przytarczyc. Badanie to wprowadza prostą metodę pobierania przytarczyc od żywych dawców od świń, z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach transplantacyjnych, zwłaszcza w dziedzinie ksenotransplantacji. Procedura składa się z trzech kluczowych etapów: przygotowania trzody chlewnej w znieczuleniu, jednostronnego pobrania grasicy oraz identyfikacji ex vivo i ekstrakcji przytarczyc wewnątrz grasicy. W protokole wykorzystuje się świnie Landrace, a procedury zapewniają etyczne leczenie i powrót do zdrowia po operacji. Udało nam się wyodrębnić przytarczyce, potwierdzając ich żywotność i integralność poprzez późniejszą analizę. Poziomy PTH w supernatancie tkankowym przekroczyły 1000 pg/ml, a barwienie immunofluorescencyjne odróżniało przytarczyce od tkanki grasicy, potwierdzając wiarygodność procedury. Protokół ten oferuje szybką, nieśmiertelną i etycznie uzasadnioną metodę pobierania przytarczyc od świń, rozwiązując różnice anatomiczne między świniami a ludźmi. Oferuje zrównoważone podejście o istotnych implikacjach dla badań nad niedoczynnością przytarczyc i ksenotransplantacją.
Wprowadzenie
Ten protokół przedstawia szybką i nieśmiercionośną metodę pobierania przytarczyc od świń. Niedoczynność przytarczyc, charakteryzująca się niedostatecznym wydzielaniem parathormonów, krytycznie zaburza homeostazę wapnia1. Ten stan, głównie powikłanie chirurgiczne po paratyreoidektomii lub tyreoidektomii, objawia się objawami takimi jak osłabienie, przewlekły ból, tachykardia, drgawki, a nawet schyłkowa niewydolność nerek2. Czasami wynika z rzadkich chorób autoimmunologicznych lub genetycznych. Obecne metody leczenia, głównie doustna suplementacja wapniem i witaminą D lub rekombinowany parathormon, zapewniają tylko częściową ulgę w objawach ogólnoustrojowych, takich jak zmęczenie i depresja3,4. Rosnąca potrzeba allotransplantacji przytarczyc jako potencjalnego lekarstwa na ciężką niedoczynność przytarczyc podkreśla konieczność ustanowienia jednolitych protokołów transplantacji5,6,7,8,9. Jednak badania przedkliniczne nad przeszczepem przytarczyc pozostają ograniczone i brakuje standaryzowanych modeli zwierzęcych. Co więcej, niedawny wzrost w dziedzinie ksenotransplantacji10,11, zwiększa zainteresowanie klinicznymi zastosowaniami ksenotransplantacji, zwłaszcza w dziedzinie endokrynologicznej terapii komórkowej12,13. Jednak modele ksenotransplantacji przytarczyc u świń są trudne ze względu na złożoność identyfikacji tkanki przytarczyc u świń. W związku z tym istnieje potrzeba zapewnienia powtarzalnej, zrównoważonej i etycznej techniki pobierania przytarczyc od świń w celu dalszego rozwoju ksenotransplantacji przytarczyc.
W przeciwieństwie do istot ludzkich, które zazwyczaj mają cztery gruczoły przytarczyczne zlokalizowane za tarczycą, świnie posiadają, w większości, dwa gruczoły przytarczycowe, każdy zlokalizowany w części czaszkowej grasicy. Wcześniejsze badania, które miały na celu zlokalizowanie gruczołów przytarczyc u świń, opierały się na śmiertelnych metodach identyfikacji ex vivo lub technikach opartych na fluoroforach, które mogą być trudne do wdrożenia w ksenotransplantacji14,15,16. Proponujemy tutaj prostą i nieśmiertelną technikę, odpowiednią do ksenotransplantacji, opartą na dwóch kluczowych etapach: pobraniu grasicy świńskiej i identyfikacji ex vivo przytarczycza pomocą transilluminacji. Technika ta może być przydatna w badaniach nad fizjologią przytarczyc, a także w transplantacji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez komisję etyki zwierząt Uniwersytetu w Lille (odniesienie #20491-20190219161313).
1. Znieczulenie świń
- Buprenorfinę należy podawać (0,015 mg/kg mc., domięśniowo) 30 minut przed pierwszym nacięciem w celu zapewnienia przedoperacyjnej analgezji.
- Wykonać domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (3 mg/kg) w celu wywołania sedacji. Podawać 5% izofluranu w inhalacji przez 3 do 5 minut w celu pogłębienia znieczulenia.
- Oceń głębokość znieczulenia, sprawdzając odruch zamykania powiek i odruch połykania. Zaintubuj świnię i ułóż ją na wznak na stole operacyjnym. Stężenie izofluranu należy zmniejszyć do 2% poprzez inhalację w celu podtrzymania znieczulenia.
- Stale monitoruj tętno i nasycenie tlenem za pomocą przenośnego wieloparametrowego monitora weterynaryjnego, aby zapewnić optymalną głębokość znieczulenia i stabilność fizjologiczną podczas całej procedury.
2. Ekspozycja obszaru zainteresowań
- Ogol się i skrupulatnie oczyść okolicę szyjki macicy, rozciągającą się od obszaru podżuchwowego do mostka.
- Zastosuj mydło antyseptyczne, a następnie chlorheksydynę, aby zapewnić sterylne pole. Dokładnie osusz cały obszar.
- Ustaw sterylne serwety, aby odizolować przedni odcinek szyjki macicy do interwencji chirurgicznej.
3. Ekspozycja grasicy świńskiej
- Wykonaj 10 cm pionowe nacięcie wzdłuż białej linii szyjki macicy za pomocą skalpela. Ostrożnie wypreparuj obszar nożyczkami Metzenbauma, aby oddzielić mięśnie przedtarczycowe, tworząc czyste pole operacyjne.
- Umieść samozatrzymujący się retraktor między mięśniem omohyoidalnym a chrząstką tarczycy, aby ułatwić rozwarstwienie tkanki łącznej i odsłonić grasicę.
UWAGA: Unikaj nadmiernego nacisku na tchawicę, aby zapobiec obrażeniom. - Stopniowo odsłaniaj czaszkową część grasicy i ostrożnie oddzielaj ją od pochewki tętnicy szyjnej, która zawiera nerw błędny, żyłę szyjną wewnętrzną i tętnicę szyjną wspólną.
UWAGA: Aby zapobiec obrażeniom, użyj elektrokoagulacji w celu uzyskania hemostazy.
4. Pozyskiwanie grasicy świńskiej
- Po uwolnieniu usuń czaszkową część grasicy, która zwykle mierzy 5-8 cm.
- Wyekstrahowaną grasicę opłukać w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej, aby ułatwić identyfikację przytarczyc.
UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla poprawy wizualizacji i różnicowania wyraźnej tekstury przytarczyc
5. Identyfikacja przytarczyc dograsicowo ex vivo
- Delikatnie spłaszcz tkankę grasicy, aby ułatwić identyfikację przytarczyc.
UWAGA: Przytarczyce wykazują charakterystyczną teksturę, szczególnie w porównaniu z otaczającą tkanką. Zwłóknieniowa torebka przytarczyc jest twardsza i ma podobną wielkość do ziarnka grochu. - Użyj źródła światła, aby zidentyfikować przytarczyce za pomocą transillumination.
UWAGA: Układ naczyniowy otaczający przytarczyce powinien być wyraźnie widoczny, co pomaga w jego różnicowaniu. - Ostrożnie wyciąć kapsułkę i usunąć całe przytarczyce. Używanie kleszczy Debakey do delikatnego przenoszenia i nożyczek Metzenbaum do precyzyjnego preparowania. Odizoluj gruczoł od otaczającej tkanki grasicy.
- Umieścić wyizolowaną przytarczycę w roztworze chłodniczym i utrzymywać ją w temperaturze 4 °C, aby zachować jej żywotność do kolejnych zabiegów.
- Zanurz tkankę w parafinie w celu dalszej obróbki.
6. Chirurgiczne zamknięcie i przebudzenie
- Po pobraniu przytarczyc zamknij miejsce operacyjne warstwami. Zszyj mięśnie i tkanki podskórne za pomocą szwów wchłanialnych. Zamknij skórę niewchłanialnymi szwami.
- Stopniowo odzwyczajaj świnię od znieczulenia. Po odzyskaniu przytomności należy monitorować świnię pod kątem natychmiastowych powikłań pooperacyjnych.
- Podawać leki przeciwbólowe i antybiotyki zgodnie z protokołem pooperacyjnym (buprenorfina 0,03 à 0,05 mg/kg i Clamoxyl 15 mg/kg przez 48 godzin). Zwrócić świnie do ich pomieszczeń w celu odzyskania pod nadzorem lekarza weterynarii.
7. Protokół barwienia immunologicznego
- Przeprowadzić deparafinowanie i odwodnienie z próbek zatopionych w parafinie: ksylen przez 5 min, ksylen przez 10 min, 100% etanol przez 5 min, 90% etanol przez 7 min 30, 70% etanol przez 7 min 30, 50% etanol przez 5 min, woda destylowana przez 5 min i sól fizjologiczna z buforu fosforanowego (PBS) przez 5 min.
- Pobrać antygen poprzez podgrzewanie próbek w kuchence mikrofalowej w buforze cytrynianowym o pH 6 przy mocy 650 W przez 9 minut. Pozostawić próbki do ostygnięcia w buforze przez 20 minut. Przepłukać trzy razy PBS przez 5 minut każda.
- Próbki należy inkubować otoczone długopisem Dako w temperaturze pokojowej przez 20 minut z roztworem bloku białkowego w celu zablokowania niespecyficznego wiązania.
- Próbki inkubować przez noc w temperaturze 4°C z pierwszorzędowym przeciwciałem (przeciwciało PTH (H-7), mysie IgG-α-ludzkie, sc-398856, 1:100) rozcieńczone w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA). Umyć dwukrotnie PBS przez 5 minut każdy.
- Inkubować przez 1 godzinę i 30 minut w temperaturze pokojowej z przeciwciałem drugorzędowym (Alexa Fluor 488, kozio-α-mysz, A11001, 1:500) rozcieńczonym w 1% albuminie surowicy bydlęcej. Umyć dwa razy PBS i raz wodą podwójnie destylowaną przez 5 minut.
- Zamontuj szkiełka za pomocą roztworu DAPI i przechowuj je w temperaturze 4 °C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Głównymi wynikami niniejszego badania są pomyślne wyizolowanie przytarczyc od świń rasy Landrace oraz późniejsza analiza w celu potwierdzenia ich żywotności i integralności. Wyniki przedstawiono w następujący sposób. Identyfikację tkanki przytarczycy potwierdzono śródoperacyjnie poprzez transiluminację (Rysunek 1A). Po wyizolowaniu pobrano dwie małe próbki tkanki (każda około 10%). Jedną próbkę posiekano na płytce w 1 mL pożywki hodowlanej DMEM-F12. Po posiekaniu pobrano 1 mL nadsąc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten przedstawia szybką i nieśmiertelną metodę pobierania przytarczyc u świń. Kluczowym krokiem w ramach protokołu jest lokalizacja grasicy świni w celu zapewnienia całkowitego pobrania w celu dalszego badania ex vivo . Po ekstrakcji grasicy przytarczyce można łatwo zidentyfikować za pomocą transilluminacji.
Jednym z głównych wyzwań związanych z tą techniką jest konieczność unikania polegania na ludzkich nawykach chirurgicznych związanych z paratyreoidektomią, ponieważ nasz pr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Francuskiemu Towarzystwu Diabetologicznemu oraz Fondation pour la Recherche Médicale za wsparcie i finansowanie badań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| 22G Krótki cewnik obwodowy | Smiths Medical | 5060 | |
| Basic set II, krepa | Hartmann | 9389253 | |
| Bupaq (bupré norphine) | Virbac | ||
| Clippers Favorita II | Aesculap Schermaschinen | GT104 | |
| Jednorazowe skalpele | Swann-Morton | 0510 | |
| Szpatułka do elektrod | Erbe | 21191-002 | |
| Generator elektrochirurgiczny BE VIO 200p | Erbe | 10140-400 | |
| Euroklav 23 VS+ | MELAG | 10056 | |
| Zawór infuzyjny grawitacyjny 3-drogowy z ruchomą końcówką Luer Lock | Care Fusion | A64-3V | |
| Uchwyt z dwoma przyciskami do elektrod Slim-Line | Erbe | 20190-065 | |
| Waporyzator lejkowy z izofluranem | Supera Anesthesia Innovations | VAP3000 | |
| Isorane (izofluran) | Axience | ||
| Ketamidor (ké tamine) | Axience | ||
| Light Ceiling Double | RIMSA | PENTA81+30E | |
| Medisorb Absorent absorpcji dwutlenku węgla | Vyaire | 8570043 | |
| Mersutures 0 | Ethicon | F2520 | |
| Mikrotom | LEICA RM2255 | ||
| Miller Blade | Opticlar | 600.020 | |
| Koncentrator tlenu | DeVilbiss | 525KS | |
| monitor weterynaryjny | Virbac | ||
| Opticlar | 600.080 | ||
| Wentylator do znieczulenia małych zwierząt | Midmark | 91806001 | |
| Instrumenty chirurgiczne | Kohler medizintechnik | ||
| Stół chirurgiczny | Vetinox | TA700005 | |
| rurka tchawica | Smiths Medical | 100/179/070 | |
| Vicryl 2-0 | Ethicon | JV453 | |
| VMS | Midmark | 91800003 | |
| Materiały i odczynniki | |||
| DMEM F-12 pożywka | ThermoFischer | 11320033 | |
| przeciwciało parathormonu | SantaCruz | sc-398856 | |
| Szybki śródoperacyjny test pth | Beckman Coulter | A16972 |
Bibliografia
- Gafni, R. I., Collins, M. T. Hypoparathyroidism. N. Engl. J. Med. 380, 1738-1747 (2019).
- Gosmanova, E. O., Houillier, P., Rejnmark, L., Marelli, C., Bilezikian, J. P. Renal complications in patients with chronic hypoparathyroidism on conventional therapy: a systematic literature review: Renal disease in chronic hypoparathyroidism. Rev. Endocr. Metab. Disord. 22, 297-316 (2021).
- Frey, S., et al. Impact of permanent post-thyroidectomy hypoparathyroidism on self-evaluation of quality of life and voice: results from the national qol-hypopara study. Ann. Surg. 274, 851-858 (2021).
- Büttner, M., Krogh, D., Siggelkow, H., Singer, S. What are predictors of impaired quality of life in patients with hypoparathyroidism. Clin. Endocrinol. (Oxf). 97, 268-275 (2022).
- Gadelha, D. D., Filho, W. A., Brandão, M. A. J., Montenegro, R. M. Is parathyroid allotransplantation a viable option in the treatment of permanent hypoparathyroidism? A review of the literature. Endocrine. 80 (2), 253-265 (2022).
- Sakane, E. N., Vieira, M. C. C., Vieira, G. M. M., Maeda, S. S. Treatment options in hypoparathyroidism. Arch. Endocrinol. Metab. 66, 651-657 (2022).
- Zhang, J. L. H., Appelman-Dijkstra, N. M., Schepers, A. Parathyroid allotransplantation: A systematic review. Med. Sci. 10, 19(2022).
- Goncu, B., et al. Graft survival effect of HLA-A allele matching parathyroid allotransplantation. J. Investig. Med. Off. Publ. Am. Fed. Clin. Res. 69, 785-788 (2021).
- Barczyński, M., Gołkowski, F., Nawrot, I. Parathyroid transplantation in thyroid surgery. Gland Surg. 6, 530-536 (2017).
- Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. N. Engl. J. Med. 386, 1889-1898 (2022).
- Loupy, A., et al. Immune response after pig-to-human kidney xenotransplantation: a multimodal phenotyping study. The Lancet. 402, 1158-1169 (2023).
- Goncu, B., et al. Xenotransplantation of microencapsulated parathyroid cells as a potential treatment for autoimmune-related hypoparathyroidism. Exp. Clin. Transplant. Off. J. Middle East Soc. Organ Transplant. 21, 901-912 (2023).
- Hasse, C., et al. Parathyroid xenotransplantation without immunosuppression in experimental hypoparathyroidism: long-term in vivo function following microencapsulation with a clinically suitable alginate. World J. Surg. 24, 1361-1366 (2000).
- Oster, M., et al. Fast and reliable dissection of porcine parathyroid glands - A protocol for molecular and histological analyses. Ann. Anat. - Anat. Anz. 219, 76-81 (2018).
- Hyun, H., et al. Structure-inherent targeting of near-infrared fluorophores for parathyroid and thyroid gland imaging. Nat. Med. 21, 192-197 (2015).
- Klute, K. Contribution to the topography and histology of porcine parathyroid glands. , Justus Liebig University of Giessen. Beitrag zur Topographie und Histologie der Epithelkörperchen des Schweines. Ph.D. thesis. Justus Liebig-Universität zu Giessen (1959).
- Arndt, H. On the topography of epithelial cells in pigs with special consideration of the suitability of pigs for the production of organo-therapeutic epithelial cell preparations. Z. Anat. 81, (Zur Topographie der Epithelkörperchen beim Schwein mitbesonderer Berücksichtigung der Eignung des Schweines für die Gewinnungorgano-therapeutischer Epithelkörperchenpräparate) 191-197 (1926).
- Butylina, M., Föger-Samwald, U., Gelles, K., Pietschmann, P., Sipos, W. Challenges in establishing animal models for studying osteoimmunology of hypoparathyroidism. Front. Vet. Sci. 10, 1163903(2023).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
