Artykuł metodologiczny

Obwody immunometaboliczne w zakażeniach w celu rozwoju terapii ukierunkowanych na gospodarza

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66980

⸱

13 września 2024

 , 
1Systems Medicine Laboratory, Biotechnology Research and Innovation Council - National Centre for Cell Science (BRIC-NCCS)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono protokół projektowania, konstruowania i dostarczania sterowanego tetracykliną indukowalnego obwodu syntetycznego. Wpływ obwodów syntetycznych na eliminację pasożytów i ekspresję cytokin można badać poprzez kanalizację prezentowanego rurociągu. Protokół ten jest istotny dla naukowców badających syntetyczne terapie oparte na obwodach w chorobach zakaźnych.

Streszczenie

Immunometabolizm jest kluczowym czynnikiem wpływającym na postęp leiszmaniozy. Podejście oparte na biologii syntetycznej przyciągnęło znaczną uwagę jako krok w kierunku interwencji terapeutycznej ukierunkowanej na czynniki związane z gospodarzem, które napędzają leiszmaniozę. Biologia syntetyczna pociąga za sobą inżynierię komponentów genetycznych w sposób ortogonalny i modułowy w celu precyzyjnej modulacji systemów biologicznych, nadając komórkom nowe funkcje. W prezentowanym badaniu wyjaśnienie systematycznego procesu rozwoju indukowalnego obwodu syntetycznego opartego na sterowaniu tetracykliną (TetON) miało na celu dostarczenie dehydrogenazy bursztynianowej jako środka terapeutycznego ułatwiającego eliminację wewnątrzkomórkowych pasożytów Leishmania. Przedstawiony protokół opisuje projektowanie obwodu syntetycznego i jego późniejszą walidację. Proponowana strategia koncentruje się również na włączeniu obwodów syntetycznych do szkieletu plazmidu jako nośnika transportowego. Ponadto w liniach komórkowych mysich makrofagów zastosowano maszynerię dostarczającą nanocząstki na bazie polipleksów do dostarczania obwodów syntetycznych bez uszczerbku dla morfologii komórki. Standaryzacja metody została przeprowadzona w celu selekcji transfekowanych komórek i wyznaczenia optymalnego stężenia indukcji dla ekspresji obwodu syntetycznego. Obserwacje wskazują na wyraźne zmniejszenie obciążenia pasożytami wewnątrzkomórkowymi w transfekowanych komórkach w porównaniu z komórkami zakażonymi. Cytokiny prozapalne ulegały ekspresji po zakażeniu w komórkach transfekowanych i indukowanych obwodem syntetycznym jako mechanizm sprzyjający eliminacji pasożytów. Podkreśla to, że metoda oparta na biologii syntetycznej jest skutecznym podejściem w leczeniu leiszmaniozy, ponieważ jest ukierunkowana na czynniki gospodarza związane z postępem choroby.

Wprowadzenie

Postęp w medycynie całościowej, integracyjnej jest znaczącym ogniwem, które zostało zidentyfikowane między zmianami metabolicznymi w komórkach odpornościowych a ich zdolnością do modulowania fenotypu komórek odpornościowych w chorobach zakaźnych. Immunometabolizm oferuje nowe perspektywy dla wyjaśnienia patogenezy chorób zakaźnych występujących u ludzi. Co więcej, dostarcza obiecujących technik opracowywania szczepionek i leków, identyfikując nowe cele interwencji1. Przeprogramowanie metaboliczne komórek odpornościowych jest identyfikowane w różnych chorobach zakaźnych, w tym leiszmaniozie. Leishmania spp. jest odpowiedzialny za wywoływanie leiszmaniozy, z czego Leishmania major (L. major) powoduje leiszmaniozę skórną (CL). L. główne pasożyty wywierają znaczący wpływ na metabolizm komórek gospodarza, szczególnie w makrofagach, w celu proliferacji i przetrwania jako pasożyty wewnątrzkomórkowe2. Makrofagi mogą zazwyczaj polaryzować się na klasycznie aktywowane (M1) lub alternatywnie aktywowane (M2) podzbiory, w których komórki M1 mają wysokie wydzielanie cytokin prozapalnych i produkcję tlenku azotu (NO) poprzez metabolizm form azotu. Komórki M2 wykazują podwyższony poziom cytokin przeciwzapalnych i wykazują wysoką aktywność arginazy poprzez metabolizm azotu3. Tak więc oba fenotypy różnią się nie tylko odpowiedzią immunologiczną, ale także szlakami metabolicznymi.

Biologia systemowa leiszmaniozy ma na celu zidentyfikowanie celów molekularnych do projektowania nowych terapii poprzez projektowanie i rozwój leków. Rekonstrukcja sieci sygnałowych i szlaków metabolicznych pomaga w zrozumieniu leiszmaniozy jako modelu holistycznego i dostarcza informacji w celu identyfikacji głównego składnika napędzającego stan chorobowy. Modelowanie matematyczne jest jednym z najbardziej preferowanych stosowanych podejść analitycznych do zrozumienia złożoności leiszmaniozy4. Sieci immunometaboliczne i modele matematyczne umożliwiły identyfikację dehydrogenazy bursztynianowej (SDHA) jako kluczowego składnika fenotypu M1, który ulega ekspresji w celu wyeliminowania pasożyta5. Biologia syntetyczna ma zastosowanie w diagnostyce, opracowywaniu szczepionek i terapii leiszmaniozy. Metabolizm ukierunkowany na modulację odpowiedzi immunologicznej można osiągnąć za pomocą narzędzi biologii syntetycznej. Do modulacji syntazy fosforylowo-ceramidowej inozytolu, która reguluje metabolizm sfingolipidów i zmienia sygnalizację immunologiczną gospodarza, wykorzystano obwód genetyczny, który posiadał zachowanie bistabilne, aby syntetycznie dostroić wewnętrzną odporność L. major infection model6,7. W związku z tym systemy i biologia syntetyczna mogą stanowić opartą na modelach platformę inżynierii genetycznej dla rozwoju medycyny precyzyjnej w systemie modelowym Leishmania.

fenotyp M1 charakteryzuje się ekspresją immuno-metabolicznych sieci sygnalizacyjnych, w których produkcja cytokin zapalnych i szlaków metabolicznych synergistycznie zwiększa eliminację pasożytów. Polaryzacja M1 oznacza wytwarzanie cytokin prozapalnych, takich jak interleukina-12 (IL-12), interferon-gamma (IFN-γ) i czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α). Szlaki metaboliczne, które są wysoko wzbogacone w fenotyp M1, obejmują glikolizę, szlak pentozofosforanowy i skrócony cykl kwasów trikarboksylowych (cykl TCA)5. Skrócony cykl TCA kieruje maszynerią eliminacji pasożytów poprzez zwiększone poziomy bursztynianu i cytrynianu, które kierują produkcją NO3. Akumulacja bursztynianu przez SDHA prowadzi do aktywacji czynnika transkrypcyjnego indukowanego hipoksją czynnika 1-alfa (HIF-1α), który indukuje produkcję IL-1β8. W fenotypie M2 obserwuje się utlenianie kwasów tłuszczowych, wzrost wykorzystania glutaminy i zwiększoną fosforylację oksydacyjną glukozy wraz z produkcją cytokin przeciwzapalnych, takich jak interleukina-10 (IL-10), transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-β), interleukina-4 (IL-4) i interleukina-13 (IL-13)3. M2 charakteryzuje się wydłużonymi mitochondriami, co prowadzi do zwiększenia wydajności wytwarzania energii. Wykorzystują kwasy tłuszczowe, glukozę i glutaminę jako substraty do napędzania cyklu TCA, generując w ten sposób ATP poprzez fosforylację oksydacyjną z większą szybkością, aby promować wzrost i proliferację pasożytów9. Enzym SDHA odpowiedzialny za akumulację bursztynianu poprzez skrócony TCA może nie tylko promować produkcję NO, ale także inicjować zależne od bursztynianu zużycie tlenu poprzez transport elektronów10. W makrofagach zakażonych Leishmania, SDHA jest regulowane w dół 2,17-krotnie, co wskazuje, że oddychanie tlenowe może być również obniżone11. Aby zwiększyć spożycie bursztynianu w celu indukowania prozapalnej produkcji NO za pośrednictwem cytokin i promowania eliminacji pasożytów, niezbędna jest ekspresja SDHA.

Syntetyczny obwód oferuje precyzyjnie ukierunkowane terapie, które mogą zmienić chory system w celu osiągnięcia bistabilnej oscylacji, która może przywrócić zdrowy fenotyp na poziomie czasoprzestrzennym. Syntetyczne dostarczanie i ekspresja obwodu sprawiają, że system jest dynamiczny i wytrzymały. Jednym z kluczowych czynników przyczyniających się do postępu biologii syntetycznej jest zdolność do łączenia części i elementów genetycznych w sposób modułowy, aby umożliwić generowanie skomplikowanych architektur i dostosowanych funkcjonalności12. Ograniczenia związane z tradycyjnymi technikami ekspresji pobudziły pojawienie się indukowanych obwodów syntezy plazmidu opartych na operonach tetracyklinowych, umożliwiając w ten sposób szybką ocenę plazmidu i łatwe dostarczanie do różnych typów komórek13. Białko represorowe reagujące na tetracyklinę (TetR), gdy występuje jako dimer, wykazuje silne powinowactwo wiązania do operonu tet (TetO), skutecznie hamując transkrypcję. Jednak w wyniku interakcji jego liganda, doksycykliny (dox), TetR ulega zmianie strukturalnej, w wyniku której dochodzi do dysocjacji od TetO, co w konsekwencji umożliwia niezakłócony przebieg transkrypcji. Ten obwód może wykazywać kontrolę translacji białek14. W związku z tym, dzięki zdefiniowanej metodologii, zaprojektowany obwód syntetyczny indukowalnego plazmidu opartego na operonach tetracyklinowych był w stanie wyrazić SDHA w wektorze pEGFP-N1. Ocena wydajności transformacji obwodu i jego wydajności dostarczyła informacji na temat kompetencji w zakresie dostarczania. Poprzez trawienie restrykcyjne wektora potwierdzono określenie skuteczności klonowania. Ponadto zaobserwowano transfekowaną linię komórkową mysich makrofagów RAW264.7 pochodzącą z makrofagów otrzewnowych myszy Balb / c pod kątem ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) zależnej od dawki doksycykliny w transfekowanych komórkach. Dodatkowo, efekt eliminacji pasożytów w transfekowanych komórkach został potwierdzony ekspresją obwodu syntetycznego. Ponadto zaobserwowano indukcję i ekspresję cytokin prozapalnych, co było ukierunkowane na zwiększenie punktu czasowego infekcji w komórkach transfekowanych i indukowanych w obwodzie syntetycznym, co było bezpośrednio związane z funkcjonowaniem obwodu syntetycznego.

Protokół

1. Hodowla komórkowa komórek RAW264.7

UWAGA: Używaj niskich liczb pasaży do eksperymentowania. Linia komórkowa RAW264.7 została zakupiona w National Cell repository of Biotechnology Research Innovation Council-National Centre for cell Sciences (BRIC-NCCS) w Pune. Ponieważ linia komórkowa RAW264.7 jest linią komórkową makrofagów, może zacząć różnicować się wraz ze wzrostem pasaży. Po ożywieniu komórki wykorzystują linię komórkową do transfekcji po 2 przejściach.

  1. Zasiew 5 x 105 komórek linii komórkowej RAW264.7 w kolbie o średnicy 25cm2 uzupełnionej 5 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modify Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 j.m./ml penicyliny jako kompletną pożywką.
  2. Komórki do wzrostu i proliferacji należy przechowywać w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia 90% zbieżności.
  3. Wyrzuć pożywkę i przemyj 3x 1x solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS). Dodać 1 ml PBS do kolby, zeskrobać komórki za pomocą skrobaka i zebrać komórki do probówki o pojemności 1,5 ml.
  4. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 24 °C i ponownie zawiesić osad za pomocą pipety o pojemności 1 ml w 1 ml kompletnej pożywki DMEM.
  5. Policz komórki w komorze do zliczania komórek za pomocą 0,5% błękitu trypanowego, aby określić procent żywych komórek.

2. Hodowla komórkowa L. major pasożyta

UWAGA: L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) był prezentem od BRIC-NCCS. Promastigoty powinny mieć numer przejścia mniejszy niż 10. Niższa liczba pasaży zapewnia, że pasożyt jest zdrowy, a jego zdolność do infekowania makrofagów jest wyższa.

  1. Uprawiaj L. major promastigotes (MHOM/Su73/5ASKH) w Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) uzupełnionym 20% FBS jako kompletne podłoże.
  2. Nasienie 1 x 106 promastigotów w niewentylowanej kolbie o średnicy 25 cm2 zawierającej 5 ml kompletnego podłoża. Inkubować kolbę w temperaturze 27 °C przez 5 dni i obserwować pasożyta L. major w fazie stacjonarnej przy 20x w mikroskopie jasnego pola.
    UWAGA: Promastigoty w fazie stacjonarnej można osiągnąć w ciągu 4-7 dni po hodowli. Charakteryzują się wydłużonym stanem wiciowców i zmniejszoną ruchliwością.

3. Projektowanie syntetycznego obwodu w plazmidzie jako wektorze dostarczania

  1. Projektowanie części obwodu syntetycznego
    1. Otwórz oprogramowanie Tinker cell i przejdź do zakładki Części. Wybierz komponent Promoter z biblioteki i umieść go na płótnie, aby symbolizować promotor wirusa cytomegalii (CMV) w obwodzie syntetycznym. Pobierz miejsce wiązania represora, analogicznie do TetO, z zakładki Części i umieść je obok promotora na płótnie, bezproblemowo integrując je z promotorem CMV.
    2. Włącz operator tetracykliny (TetO), wewnętrzne miejsca wejścia rybosomów (IRES) oraz region kodujący, przeciągając i upuszczając miejsce wiązania represorów, miejsce wiązania rybosomów (rbs) i region kodujący na płótno, integrując je z istniejącymi składnikami genetycznymi.
    3. Zmień nazwę regionu kodującego na TetR, co oznacza represor reagujący na tetracyklinę, który działa jako przypuszczalny ujemny regulator w obwodzie syntetycznym. Połącz te elementy genetyczne, aby ułatwić budowę części syntetycznych.
    4. Umieść obszar dystansowy (sd1) na płótnie, zaprojektowany tak, aby można go było rozszczepić przez proteazy komórkowe, takie jak teschowirus świński-1 2A (P2A). Wprowadź dodatkowy region kodujący reprezentujący interesujący nas gen, oznacz go jako SDHA do syntetycznego konstruktu i zintegruj go z innymi elementami.
    5. W sąsiedztwie regionu kodującego SDHA zintegruj inny region rozszczepialny proteazy (sd2), który będzie rozszczepialny przez proteazę komórkową P2A. Wprowadź region kodujący reprezentujący gen reporterowy i oznacz go jako GFP do konstruktu.
      UWAGA: Wyrażenie GFP może dostarczyć oszacowania produkcji SDHA i zapewnić, że obwód syntetyczny ma logicznie działający 13.
    6. Obok GFP dołącz terminator (ter1) i sprawdź zmontowane części, sprawdzając, czy wszystkie części są połączone. Obwód musi być czerwony po kliknięciu dowolnej części. Potwierdza to powstanie funkcjonalnego obwodu genetycznego.
    7. Na karcie Reakcja przypisz szybkości regulacyjne, które obejmują parametry i wartości początkowe produkcji białka, do TetR, SDHA i GFP, aby wyznaczyć reakcję translacji w obwodzie syntetycznym.
    8. Dodaj małą cząsteczkę z zakładki Części, nazwij ją Doksycyklina (dox) i przypisz do niej funkcję falową, wybierając Wejście z zakładki Części i połączenie, a następnie klikając Wejście fali.
    9. W zakładce Regulacja kliknij na Reakcja represji. Przeciągnij i upuść szybkość reakcji na płótnie między dox a TetR. Ustaw kinetykę reakcji między dox a TetR, klikając dwukrotnie ikonę funkcji fali na dox i dostosowując Doxyxycline.sin.amplitude do 10.
    10. Zaimplementuj transkrypcyjną reakcję regulacyjną między białkiem TetR a miejscem wiązania represorowego, wybierając reakcję z zakładki Regulacja i umieszczając ją na płótnie między TetR a TetO.
    11. Klikając dwukrotnie każdy komponent i reakcję, ustaw początkowe stężenie i parametr do symulacji. Kliknij Symulacja, wybierz Deterministyczne i zasymuluj obwód dla 100 jednostek czasu. Dostosuj wykres symulacji z panelu sterowania, który pojawi się wraz z wykresem, i obserwuj wzorzec wykresu dla białek SDHA i TetR.
  2. Identyfikacja składników genetycznych z rejestru części iGEM
    1. Otwórz Rejestr Standardowych Części Biologicznych (Tabela Materiałów) i kliknij Szukaj. Wprowadź nazwę składnika genetycznego, np. promotor CMV.
      UWAGA: Proces wyszukiwania identyfikatora iGEM musi być wykonany dla wszystkich składników genetycznych obwodu syntetycznego. Przedstawiono kroki umożliwiające identyfikację identyfikatora iGEM promotora CMV; Następnie kroki należy powtórzyć dla innych komponentów.
    2. Aby uzyskać sekwencję nukleotydową promotora CMV, kliknij opcję Pobierz sekwencję części i zapisz plik jako plik tekstowy.
      UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że dostępne są zapasy wszystkich części genetycznych.
    3. Powtórzyć kroki 3.2.1 i 3.2.2 dla wszystkich części genetycznych (operator tetracykliny, sekwencja Kozaka, TetR, P2A i GFP) z wyjątkiem SDHA.
    4. Aby uzyskać sekwencję kodującą białko SDHA, otwórz NCBI i wybierz Nukleotyd z listy rozwijanej obok okna wyszukiwania. Wpisz dehydrogenazę bursztynianową i Mus musculus i poszukaj sekwencji nukleotydów.
    5. Kliknij opcję CDS, aby uzyskać sekwencję kodowania SDHA i zapisać sekwencję w pliku tekstowym.
    6. Scal sekwencję nukleotydową wszystkich genetycznych części regulatorowych w jednym pliku sekwencyjnie. Dodaj kodon start (ATG) zaraz po sekwencji Kozaka i usuń wewnętrzne kodony stop, aby uniknąć tworzenia powstających polipeptydów.
    7. Otwórz witrynę ExPASy15 i wklej sekwencję nukleotydów. Kliknij opcję Przetłumacz sekwencję. Wybierz klatkę 5'3' 1 i usuń kodony stop, które zostaną podświetlone na czerwono w sekcji wyników.
      UWAGA: Aby określić, czy sekwencja nukleotydowa skutecznie ulega translacji na pożądaną sekwencję polipeptydową, można zastosować narzędzie do translacji, takie jak ExPASy. Zapewnia to zapobieganie powstawaniu niepożądanych polipeptydów. Wybór wektora pEGFP-N1 do ekspresji obwodu syntetycznego jest optymalny, biorąc pod uwagę, że promotor CMV i gen GFP istniały wcześniej w wektorze. Wszystkie części genetyczne zostały zmontowane przy użyciu protokołu klonowania (który został zlecony na zewnątrz). Enzymy restrykcyjne wykorzystywane do klonowania insertów to NotI i XhoI. Te miejsca enzymu restrykcyjnego znajdują się w obrębie miejsca wielokrotnego klonowania wektora pEGFP-N1.

4. Transformacja obwodu syntetycznego w komórkach DH5α Escherichia coli (E.coli)

  1. Przygotowanie komórek kompetentnych E.coli DH5α
    UWAGA: Zaleca się sterylizację odczynników w autoklawie. Odczynniki można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
    1. Hodowla 1 ml świeżego inokulum w 50 ml bulionu Luria (LB) w temperaturze 37 °C, 180 obr./min. Hoduj komórki przez około 2 godziny, aż do uzyskania gęstości optycznej (OD) 0,4-0,6 przy 600 nm.
    2. Odwirować komórki w temperaturze 4,696 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Odrzucić supernatant ręcznie do kolby odrzutowej, odwracając probówkę wirówkową o pojemności 50 ml i zbierając osad komórek.
    3. Delikatnie zawiesić osad w 2 ml lodowatego 0,1 M chlorku magnezu (MgCl2) za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Uzupełnić objętość do 20 ml lodowatym MgCl2.
    4. Odwirować probówkę o sile 4,696 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml w 1 ml lodowatego 0,1 M chlorku wapnia (CaCl2) i inkubować na lodzie przez 2 godziny. Użyj świeżo przygotowanych kompetentnych komórek do transformacji.
  2. Transformacja kompetentnych komórek za pomocą syntetycznego konstruktu obwodu
    1. Odmierz 50 μl kompetentnych komórek i dodaj komórki do probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść rurkę na lodzie. Dodać 10 ng syntetycznego konstruktu obwodowego do podwielokrotności i trzymać na lodzie przez 3 minuty.
    2. Ogniwa szoku cieplnego w temperaturze 42 °C przez 3 minuty na suchym bloku grzewczym. Po zakończeniu inkubacji na suchym bloku grzewczym umieścić komórki z powrotem na lodzie na 3 minuty, dodać 1 ml LB do komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy 250 obr./min.
    3. Po zakończeniu inkubacji odwirować komórki przy 4,696 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl LB i ułożyć je na agarze LB zawierającym 50 μg / ml kanamycyny. Odwrócić płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

5. Izolacja konstrukcji obwodu syntetycznego

  1. W probówce wirówkowej o pojemności 50 ml weź 10 ml pożywki LB i dodaj 50 μg / ml kanamycyny jako bulion selekcyjny do hodowli przekształconych komórek w celu izolacji plazmidu. Podnieś przekształconą kolonię za pomocą końcówki o pojemności 200 μl i dodaj ją do bulionu selekcyjnego.
  2. Korzystając z pętli zaszczepiającej, wybrać inną pojedynczą kolonię, przeciąć płytkę metodą pięciokątną i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w celu utrzymania izolatów pojedynczej kolonii.
  3. Hodować komórki przez noc z prędkością 180 obr./min w temperaturze 37 °C. Następnego dnia odwirować kulturę w temperaturze 4,696 x g przez 20 minut w temperaturze 24 °C. Po odwirowaniu odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki i dodać 1 ml buforu do reprodukcji (50 mM chlorowodorku tris (hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl), 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 100 μg/ml RNazy A (pH -8,0)) do osadu i ponownie zawiesić komórki przez delikatne pipetowanie.
    UWAGA: Aby ponownie zawiesić bufor, dodaj RNazę A 5 minut przed dodaniem mieszanki do osadu komórkowego.
  4. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 1 ml buforu do lizy (0,2 N wodorotlenku sodu (NaOH), 1 % dodecylosiarczanu sodu (SDS)) do komórek i mieszać przez odwrócenie probówki przez 2 minuty. Inkubować probówkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodać 1 ml buforu neutralizacyjnego do komórek (3 M octan potasu (CH, 3CO, 2K)) i wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę. Odwirować komórki przy 4,696 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej i zebrać supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml.
  6. Dodać 500 μl izopropanolu do supernatantu i dobrze wymieszać, odwracając. Inkubować supernatant na lodzie przez 15 minut, a następnie odwirowywać przy 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Inkubacja może trwać od 5 minut do 1 godziny. W tym czasie zaleca się delikatne mieszanie zawartości, odwracając co 5 minut.
  7. Odrzucić supernatant, dodać 1 ml 70% etanolu (schłodzonego) do osadu i odwirować przy 12000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok jeszcze raz.
  8. Wysuszyć granulkę na powietrzu i ponownie zawiesić uzyskany plazmid w 20 μl sterylnej wody wolnej od nukleaz (NFW). Zmierz stężenie plazmidu na spektrofotometrze o długości fali 260/280 nm.
    UWAGA: Dodaj więcej NFW, jeśli stężenie plazmidu jest bardzo wysokie, aby można je było oszacować za pomocą nanokropli. Proces rozcieńczania plazmidu musi być przeprowadzony w okapie laminarnym.

6. Elektroforeza w żelu agarozowym (AGE) obwodu syntetycznego

  1. Przygotowanie próbki plazmidu do AGE
    1. W probówce o pojemności 1,5 ml odmierz 20 μl 1x tris-octanu-EDTA (TAE). Dodać 4 μl 6-krotnego buforu ładującego i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
    2. Szybko obrócić probówkę, dodać 1 μg wektora plazmidu z obwodu syntetycznego i dobrze wymieszać, pipetując mieszaninę. Tę mieszaninę reakcyjną można załadować na żel agarozowy.
      UWAGA: Należy unikać rygorystycznego pipetowania, ponieważ może to spowodować uszkodzenie struktury plazmidu. Zamiast tego szybko zakręć odczynnikami.
  2. Trawienie restrykcyjne obwodu syntetycznego
    1. W probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 2 μl 10-krotnego buforu restrykcyjnego, 1 μl NotI i 1 μl enzymu restrykcyjnego XhoI i dobrze wymieszaj, szybko obracając zawartość. Dodaj 1 μg wektora plazmidu obwodu syntetycznego i szybko odkręć zawartość.
    2. Uzupełnić objętość probówki do 20 μl, dodając NFW do zawartości i szybko obracając probówkę. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Po inkubacji utrzymywać probówkę w temperaturze 70 °C przez 15 minut w suchym bloku grzewczym w celu dezaktywacji enzymów restrykcyjnych. Schłodzić zawartość probówki i dodać 6 μl buforu ładującego do mieszaniny reakcyjnej. Wymieszaj zawartość, szybko obracając tubkę. Tę mieszaninę reakcyjną można załadować na żel agarozowy.
    4. Skonfiguruj żel agarozowy i uruchom żel za pomocą wcześniej opisanego protokołu16. Krótko mówiąc, załaduj 20 μl próbek do każdej studzienki, załaduj 5 μl drabinki DNA o pojemności 1 Kb i uruchom żel przy napięciu 100 V. Odłącz zasilanie po zakończeniu elektroforezy, pobierz żel na obrazownik żelowy i włącz opcję fluorescencji, aby view pasma.

7. Transfekcja syntetycznego układu w linii komórkowej RAW264.7

  1. Przygotowanie próbek
    1. Przygotować próbki, aby określić efekt eliminacji pasożytów przez indukowany obwód syntetyczny. Pierwsza próbka to nietransfekowane komórki RAW264.7 (kontrolne), druga to komórki RAW264.7 zakażone promastygotami L. major przez 6 godzin (6 godzin zakażone), trzecia próbka to komórki RAW264.7 transfekowane obwodem syntetycznym i indukowane dox (IMT), próbki punktu czasowego infekcji to komórki RAW264.7 transfekowane obwodem syntetycznym i indukowane dox, który jest zakażony L. major promastigoty (IMTI) dla różnych punktów czasowych 6 h (6 h IMTI), 12 h (12 h IMTI), 18 godzin (18 h IMTI) i 24 h (24 h IMTI).
    2. Aby przygotować wszystkie próbki, zeskrobać komórki RAW264.7 z kolby o średnicy 25cm2 i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Zawiesić osad w 1 ml kompletnego podłoża DMEM. Weź 10 μl zawieszonych komórek w probówce o pojemności 100 μl, dodaj 10 μl 0,5% błękitu trypanowego do komórek i dobrze wymieszaj.
    4. Załadować 10 μl mieszanki komórek i błękitu trypanowego na szkiełko komory do liczenia komórek i pobrać liczbę komórek z 4 komór.
    5. Płytki w szkiełku nakrywkowym na dnie 96-dołkowe płytki po 2 x 104 komórki na studzienkę i inkubować komórki przez 24 godziny. Ta próbka jest próbą kontrolną. Ten etap pozostaje niezmienny w przypadku przygotowania innych próbek.
      UWAGA: Przed użyciem podgrzej media w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
    6. Aby przygotować 6-godzinną zakażoną próbkę, odwirować 1 ml stacjonarnych promastigotów fazy L. major przy 7,273 x g przez 10 minut. Ponownie zawiesić osad w 500 μl kompletnej pożywki DMEM i pobrać liczbę komórek w komorze do liczenia komórek, wykonując czynności 7.1.3-7.1.4.
    7. Dodać 2 x 105 L. major promastigotes do studzienki i inkubować je z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 6 godzin. Po inkubacji przemyć komórki 3x PBS.
    8. Aby przygotować próbkę IMT, należy zasiać komórki w następujących krokach (7.1.2-7.1.5) i wykonać kroki transfekcji 7.2.1-7.2.6.
    9. Aby przygotować próbki punktów czasowych IMTI, należy postępować zgodnie z krokami 7.1.2-7.1.5 i wykonać kroki transfekcji 7.2.1-7.2.6. Wyrzuć kompletną pożywkę DMEM zawierającą 500 μg/ml genetycyny (G418) i 1 μg/μL dox i umyj komórki 3x 1x PBS.
    10. Dodać 2 x 105 L. major promastigotes do studzienek i inkubować je przez 6 godzin, 12 godzin, 18 godzin i 24 godziny. Po zakażeniu odrzucić promastigoty zawierające kompletne pożywki DMEM i przemyć studzienki 3x 1x PBS. Dodać 200 μl kompletnej pożywki DMEM zawierającej 500 μg/ml genetycyny (G418) i 1 μg/μl dox do komórek i inkubować przez 24 godziny.
  2. Transfekcja obwodu syntetycznego
    1. W probówce o pojemności 1,5 ml dodaj 24 μl pożywki o obniżonej zawartości surowicy, która jest ulepszoną pożywką Minimal Essential Medium. Do pożywki dodać 1 μg wektora pEGFP-N1 sklonowanego za pomocą plazmidu z obwodem syntetycznym.
    2. Do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 24 μl minimalnej pożywki eterycznej i dodaj 1 μl polietyleniniminy (PEI; 1 μg /μl). Dobrze wymieszać, pipetując mieszaninę co najmniej 10 razy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Przenieś mieszaninę PEI do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej mieszaninę DNA. Dobrze wymieszać, pipetując kroplami co najmniej 10 razy. Inkubować DNA: wymieszać PEI w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    4. Wyrzuć pożywkę z dołków na 96-dołkowych płytach nakrywkowych szkiełka nakrywkowego i umyj komórki 3x PBS. Za pomocą pipety delikatnie dodaj kroplami DNA:PEI do komórek i delikatnie potrząśnij płytką. Inkubować komórki z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
    5. Po inkubacji dodać do komórek 200 μl świeżej pożywki Minimal Essential Systems, delikatnie wstrząsnąć płytką i inkubować przez 24 godziny z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: PEI jest cytotoksyczny; Dlatego zaleca się, aby nie inkubować komórek po transfekcji dłużej niż 24 godziny.
    6. Następnego dnia wyrzuć pożywkę i umyj komórki 2x PBS. Dodać do komórek kompletną pożywkę DMEM zawierającą 500 μg/ml genetycyny (G418) i 1 μg/μl dox do komórek i inkubować przez 24 godziny.
  3. Utrwalanie próbek do mikroskopii konfokalnej
    1. Aby utrwalić wszystkie próbki, umyj komórki 1x PBS 3x, dodaj 100 μl 4% paraformaldehydu do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    2. Umyj komórki PBS 3x. Po zakończeniu mycia dodać 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) do komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności.
    3. Po inkubacji przemyć komórki 3x PBS. Obserwuj komórki pod mikroskopem konfokalnym pod kątem ekspresji GFP i barwienia DAPI.

8. Pozyskiwanie transfekowanych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej i kwantyfikacji

  1. Oczyść dno szkiełka nakrywkowego studzienek za pomocą chusteczki chłonnej. Włącz elementy sterujące konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Następnie włącz sprężarkę i lampę rtęciową.
  2. Aby obsługiwać maszynę, elementy sterujące mikroskopu, sterowanie głowicą skanującą, klucz laserowy, moduł laserowy, lampa, kontroler mikroskopu i procesor muszą być włączane sekwencyjnie.
  3. Na komputerze otwórz oprogramowanie (Tabela materiałów) i kliknij Włącz sterowanie XY Stage. Otworzy się wyskakujące okienko z prośbą o wykonanie czyszczenia dla 7S3. Kliknij Nie. Zamknij wykres na żywo i dostosuj ekrany ustawień.
  4. Do obiektywu 60x dodaj kroplę olejku immersyjnego, umieść dolną płytkę nakrywkową z 96-dołkową płytką nakrywkową na stoliku i przesuń stolik w płaszczyźnie XY, aby dostosować położenie obiektywu na dołku. Kliknij Okular i wybierz Kanał Alexa-488. Kliknij Migawka wyłączona, aby ustawić ostrość komórek na okularze. Wyreguluj okular według rdzenia i precyzyjnego ustawiania ostrości.
  5. Kliknij Migawka włączona znajdująca się na skrzynce kontrolnej mikroskopu i przesuń obiektyw, aby dostosować jego położenie i ustawić ostrość obszaru zainteresowania, aby obserwować komórki w różnicowym kontraście interferencyjnym (DIC). Przełącz na tryb EPI w skrzynce kontrolnej mikroskopu, aby obserwować komórki w filtrze długości fali Alexa-488 pod kątem ekspresji GFP. Komórki powinny być zielone.
  6. Kliknij Migawka wyłączona, przejdź do obrazowania LSM i wybierz rozdzielczość obrazu jako 1,024 x 1,024. Kliknij Dodaj fazę i przeciągnij, aby dodać zielony kanał jako fazę.
  7. W programie Olympus kliknij LSM, a następnie kliknij przycisk Na żywo, aby obserwować komórki w kontraście fazowym i kanale Alexa 488nm. Naciśnij Control i przewiń, aby ustawić ostrość komórek w oprogramowaniu do przechwytywania obrazów.
  8. Dostosuj wzmocnienie i przesunięcie, aby dostosować intensywność fluorescencji uchwyconej przez detektor. Kliknij Przechwyć, nazwij obrazy i kliknij Zapisz.
  9. W oprogramowaniu do obrazowania kliknij Plik, wybierz wszystkie obrazy z rozszerzeniem .oir i kliknij Otwórz.
  10. Kliknij Widok kafelków, aby wyświetlić obrazy we wszystkich kanałach. Aby dodać pasek skali do obrazów, kliknij Widok, a następnie wybierz opcję Pasek skali.
  11. Aby zapisać obrazy z pojedynczych kanałów w 16-bitowej skali szarości, kliknij Plik i wybierz Eksportuj obraz. Wybierz obraz i sprawdź znaczniki na wszystkich kanałach. Na karcie wyboru klatki w opcji podzielonego widoku wybierz opcję Tak. Na karcie wyjściowej wybierz 24-bitowy kolor RGB z opcją informacji o wypaleniu i wybierz tiff jako typ pliku obrazu. W folderze eksportu do wybierz odpowiednią lokalizację pliku, aby zapisać obrazy, a następnie kliknij OK.
  12. Aby zapisać scalone obrazy, wykonaj te same kroki, z wyjątkiem tego, że w opcji podzielonego widoku wybierz Nie, a na karcie danych wyjściowych wybierz Scalone kanały z informacjami o nagrywaniu.
  13. Aby przeanalizować wyrażenie GFP w komórkach, otwórz Fiji w systemie Windows i wyeksportuj plik tiff. Wybierz kolor zielony, aby przeanalizować wyrażenie GFP.
  14. Wybierz obszar komórki za pomocą opcji narzędzia odręcznego i kliknij Analizuj, aby zmierzyć intensywność fluorescencji. Powtórz ten proces dla 3 obrazów.
  15. Eksportuj dane do oprogramowania analitycznego i wykonuj testy statystyczne na danych ilościowych.

9. Test obciążenia pasożytami

  1. Wizualizując komórki pod mikroskopem konfokalnym, policz całkowitą liczbę pasożytów obecnych w poszczególnych makrofagach.
  2. Losowo zbadaj 100 makrofagów i zanotuj liczbę pasożytów wewnątrzkomórkowych. Wykonaj test statystyczny między zakażonymi a punktami czasowymi próbek IMTI w celu zbadania wpływu ekspresji SDHA na liczbę pasożytów.

10. Kwantyfikacja IL-10 i IL-12 za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA)

  1. Przygotować próbki zgodnie z krokami 7.1 i 7.2 i zebrać pożywkę w probówce o pojemności 1,5 ml. Podłoże należy przechowywać na lodzie lub przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji obsługi i wykonaj test ELISA dla IL-10 i IL-12.

11. Profilowanie cytokin za pomocą ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

  1. Przygotować próbki zgodnie z krokami 7.1 i 7.2. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i dodać 500 μl odczynnika TRIzol i inkubować komórki przez 2 minuty w temperaturze RT.
    UWAGA: Etapy izolacji RNA należy wykonywać w komorze z przepływem laminarnym jako środek ostrożności przed zanieczyszczeniem RNazą.
  2. Zbierz próbki do probówki o pojemności 1,5 ml, dodaj do nich 100 μl chloroformu i wymieszaj, odwracając probówki 5x-8x. Inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze pokojowej at. Odwirowywać próbki przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Będą obserwowane trzy warstwy, zbierz przezroczystą wodną warstwę wierzchnią w świeżej probówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 500 μl izopropanolu do warstwy wodnej, dobrze wymieszać przez odwrócenie 10x i inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po każdych 5 minutach należy ponownie wymieszać próbki, odwracając probówki.
  4. Odwirować próbki przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć osad 2x 75% etanolem wyprodukowanym z 0,1% pirowęglanu dietylu (DEPC) zawierającym wodę przez 5 minut i odwirować przy 8 000 x g w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: DEPC zawierający wodę rozkłada RNazy, dlatego zaleca się stosowanie go do izolacji RNA.
  5. Na koniec wysuszyć osad na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej, rozpuścić go w 20 μl DEPC zawierającym wodę i zmierzyć stężenie izolowanego RNA, w stosunku 260/280 i 260/230, za pomocą spektrofotometru.
    UWAGA: Stosunek 260/280 powinien wynosić około 2,0, co ogólnie wskazuje na czystą formę RNA, a stosunek 260/230 powinien wynosić od 2,0 do 2,2, aby uznać, że wyizolowany RNA jest wolny od niepożądanych związków chemicznych, takich jak TRIzol.
  6. W celu przygotowania 20 μl każdej próbki cDNA, należy rozmrozić odczynniki na lodzie i krótko wirować przez 15 s w temperaturze pokojowej at. Przed użyciem należy krótko zawirować wszystkie odczynniki, a nawet próbki RNA.
  7. W autoklawowanej probówce o pojemności 100 μl weź 0,8 μl 25x dNTP, 2 μl 10x Primer, 2 μL 10x buforu. Dodać 1 μg/μl stężenia RNA i dodać 0,5 μl enzymu odwrotnej transkryptazy. Uzupełnić objętość do 20 μl przy użyciu DEPC zawierającego wodę.
  8. Próbki cDNA należy obracać przez krótki czas przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Próbki należy przechowywać na lodzie.
  9. Włącz termocykler, odkręć górny panel, aby poluzować uchwyt, i umieść próbki na bloku. Po umieszczeniu próbek należy mocno zakręcić pokrywkę.
  10. Po włączeniu systemu kliknij Uruchom. Wybierz opcję Główna, a następnie wejdź do menu Programy i wybierz opcję CDNA. Określ objętość próbki jako 20 μl i kliknij URUCHOM. Termocykler uruchamia program w czterech krokach. Pierwszy krok to 25 °C przez 10 minut, drugi to 37 °C przez 2 godziny, trzeci to 85 °C przez 5 minut, a ostatni krok to 4 °C na zawsze.
  11. Gdy cykl przejdzie w czwarty krok, kliknij Enter i zakończ cykl. Pobrać próbki i przystąpić do qRT-PCR. Próbki RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C, a próbki cDNA w temperaturze -20 °C.
  12. W celu wykrycia cytokin rozmrozić wymagane odczynniki 2x PCR Master mix, cDNA i sondy do TNF-α, IFN-γ, TGF-β i NFW na lodzie.
    UWAGA: Wszystkie odczynniki, mieszaniny reakcyjne i próbki muszą być przechowywane na lodzie.
  13. W probówce o pojemności 100 μl przygotuj próbkę cDNA, dodając 1 μl cDNA i 3,5 μl NFW. Aby przygotować mieszankę wzorcową, weź 5 μl mieszanki wzorcowej i dodaj 0,5 μl sondy do probówki o pojemności 100 μl. Wymieszaj zawartość, dając krótkie wirowanie. Obliczyć liczbę próbek i genów docelowych i odpowiednio przygotować mieszaninę reakcyjną.
    UWAGA: Dodaj NFW i mieszankę główną na dno probówki o pojemności 100 μl. Dodaj cDNA i sondę do ścianki probówki wirówkowej jako środek ostrożności, aby upewnić się, że objętość została dodana i uniknąć mieszania krzyżowego jakiegokolwiek odczynnika.
  14. Umieść 8-dołkowe paski w chłodziarce PCR. Przenieść 5,5 μl mieszanki wzorcowej i fiolki zawierającej sondę na dno każdej studzienki w paskach 8-dołkowych. W związku z tym powtórz ten krok dla wszystkich genów docelowych.
  15. Przenieś 4,5 μl mieszaniny cDNA i NFW do ściany studzienki w 8-dołkowych paskach. W związku z tym powtórz ten krok dla wszystkich próbek.
  16. Uszczelnij paski pokrywkami i odkręć krótko przez 10 sekund, aby wymieszać geny i próbki w studzience. Umieść pasek w gnieździe na próbkę qRT-PCR i zamknij ten pasek.
  17. Na pulpicie uruchom oprogramowanie i zaloguj się jako gość. Na ekranie pojawi się wyskakujące okienko. Kliknij Kontynuuj bez połączenia.
  18. W menu Setup (Konfiguracja) kliknij Advanced Setup (Ustawienia zaawansowane). W obszarze Właściwości eksperymentu wpisz nazwę eksperymentu na karcie Nazwa eksperymentu. W jakim typie eksperymentu chcesz skonfigurować opcję, wybierz Quantitation-Comparative CT (ΔΔ CT).
  19. W zakładce Jaką prędkość rampy chcesz użyć w instrumencie? kliknij Szybki (~ 40 minut, aby ukończyć bieg). W menu ustawień płytki zdefiniuj nazwy genów w opcji Definiuj cele i wpisz nazwy próbek w polu Definiuj próbki.
  20. Na karcie Run Method (Metoda uruchamiania) wpisz 10 μL w polu Reaction Volume Per Well. Tuż przed wstrzymaniem etapu kliknij Dodaj etap i wybierz Wstrzymanie etapu. Zmień temperaturę na 50 °C i czas na 2 min. W drugim etapie utrzymywania nie należy dokonywać żadnych zmian, które będą wynosić 95 °C przez 1 s.
  21. W etapie cyklu Krok 1 zmień temperaturę na 95 °C i czas na 3 s. W kroku 2 zmień temperaturę na 60 °C i czas na 30 s. Kliknij Uruchom, aby rozpocząć cykl qRT-PCR.

12. Analiza statystyczna

UWAGA: Dla wszystkich danych średnia jest reprezentowana jako słupek, a odchylenie standardowe reprezentuje słupek błędu na wykresie słupkowym (wartość p< 0,05 jest uważana za znaczącą).

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy danych i wstaw uzyskane dane z eksperymentu konfokalnego.
  2. Do analizy mikroskopii konfokalnej należy zastosować zwykłą jednoczynnikową analizę ANOVA z testem korekcji Tukeya do porównania wielu grup pod kątem ekspresji GFP. Rozważ dane o p < 0,05 jako statystycznie istotne. Przygotuj graficzną reprezentację danych ze średnią przedstawioną jako słupek i odchyleniem standardowym reprezentującym słupek błędu.
  3. W przypadku testu obciążenia pasożytami utwórz nowy arkusz i wprowadź dane dotyczące liczby pasożytów dla 100 makrofagów. Zastosuj zwykłą jednokierunkową ANOVA z poprawką Tukeya między wszystkimi próbkami. Rozważ dane z wartością p< 0,05 jako statystycznie istotne.
  4. W przypadku testu ELISA wykonaj dwukierunkową analizę ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya. W przypadku qRT-PCR wykonaj jednokierunkową ANOVA z testem korekcyjnym Tukeya.

Wyniki

Układ elementów genetycznych tworzących obwód syntetyczny do ekspresji tego obwodu przedstawiono na (Rysunku 1A). Odpowiednie elementy zostały sklonowane w wektorze pEGFP-N1 w sposób ortogonalny i modułowy, co przedstawiono na Rysunku 1B. Symulacja obwodu syntetycznego ujawniła dynamikę oscylacyjną zarówno dla SDHA, jak i represora tetracykliny. Obserwacja ta sugeruje wzajemny wzorzec ekspresji charakteryzujący się okresowymi funkcjami falowymi. Wzrost stężenia SDHA można przypisać indukcji doksycykliną, podczas gdy ekspresja TetR może wynikać ze spadku poziomu doksycykliny (Rysunek 1C). Biorąc pod uwagę indukowalną oscylacyjną ekspresję SDHA i TetR zaobserwowaną in silico, opracowano i wdrożono strategię dostarczenia obwodu syntetycznego za pomocą plazmidowego wektora pEGFP-N1.

Części iGEM zidentyfikowane na potrzeby badania obejmowały odpowiednio: BBa_K1493803 dla TetO, BBa_K4344028 dla sekwencji Kozaka, BBa_C0040 dla TetR oraz BBa_K1537016 dla P2A. Numer dostępu NCBI dla SDHA to NM_025848. Komponenty te zostały złożone w celu skonstruowania syntetycznego obwodu TetON indukowanego doksycykliną, o łącznej długości 1317 par zasad (Supplementary File 1). Ponieważ TetO pełni funkcję elementu regulacyjnego DNA, jego sekwencja nie została przetłumaczona. Do walidacji translacji in silico wybrano sekwencję znajdującą się za sekwencją Kozaka, rozciągającą się od 5' TetR do końca 3' P2A, umieszczoną za SDHA. Obserwacje wykazały brak wewnętrznych kodonów stop, co zapewnia nieprzerwaną translację wzdłuż całej długości sekwencji (Supplementary File 2). Elementy regulacyjne obwodu syntetycznego o długości 1317 bp zostały wstawione między miejsca restrykcyjne NotI i XhoI, znajdujące się w pozycji 5' powyżej EGFP (Figure 1B). Wyniki sekwencjonowania potwierdzają, że sekwencja wstawki została sklonowana w plazmidzie (Supplementary File 3).

Wprowadzenie obwodu immunometabolicznego do szczepu E. coli DH5α doprowadziło do wzrostu przekształconych kolonii wykazujących odporność na kanamycynę, antybiotyk zastosowany jako marker selekcyjny podczas transformacji bakteryjnej. Duża liczba przekształconych kolonii na płytce selekcyjnej wskazuje, że komórki kompetentne wykazały wysoki potencjał transformacyjny, co świadczy o efektywności zastosowanego protokołu transformacji (Rycina 1D).

Pojedynczą kolonię wyizolowano i zaszczepiono w 10 mL pożywki LB z dodatkiem kanamycyny w celu izolacji plazmidu. Wydajność plazmidu uzyskaną z 10 mL hodowli przedstawiono w Tabeli 1. W procedurze tej zastosowano standardową metodę izolacji plazmidów. Roztwory buforowe przygotowano świeżo w dniu poprzedzającym izolację plazmidu, a warunki inkubacji zoptymalizowano w celu maksymalizacji wydajności plazmidu. Uzyskane stężenie plazmidu przekroczyło 1 µg/µL, a stosunki 260/280 oraz 260/230 przekroczyły odpowiednio 1,8 i 2,0. Wyniki te wskazują, że wyizolowane plazmidy charakteryzowały się wysoką czystością i były wolne od zanieczyszczeń, takich jak białka, EDTA, węglowodany i fenol.

Oceniono przesunięcie mobilności elektroforetycznej dla wyizolowanego obwodu syntetycznego. Trawienie restrykcyjne przeprowadzono przy użyciu enzymów restrykcyjnych NotI i XhoI, ponieważ były to miejsca restrykcyjne, w których wstawiono obwód syntetyczny. Na 1% żelu agarozowym zaobserwowano dwa prążki: jeden w pobliżu 1500 bp i drugi pomiędzy 4 kb a 5 kb. Biorąc pod uwagę, że rozmiar wstawki wynosi 1317 bp, prążek przy 1500 bp prawdopodobnie odpowiada wstawce. Wektor pEGFP-N1 ma rozmiar 4,7 kb. Zatem przyjmuje się, że prążek w pobliżu 5 kb jest wektorem pEGFP-N1. W konsekwencji wyciągnięto wniosek, że w wektorze dostawczym znajdował się kompletny i nienaruszony obwód syntetyczny. Dodatkowo, dla nietrawionego, nienaruszonego obwodu syntetycznego wykryto prążek o wielkości około 6 kb, co wskazuje, że wektor pEGFP-N1 zawiera wstawkę o rozmiarze blisko 1,3 kb w obrębie wektora plazmidowego (Rycina 1E).

Schemat syntetycznego obwodu genowego z mapą plazmidu, szalkami z kulturami bakterii, elektroforezą w żelu i wykresem danych.
Rysunek 1: Projektowanie i walidacja syntetycznego obwodu. (A) Przedstawienie syntetycznych obwodów poprzez zestawienie części genetycznych i komponentów regulacyjnych. (B) Wykres symulacji deterministycznej pokazujący okresową ekspresję SDHA i TetR w ciągu 100 jednostek czasu. (C) Kolonie E. coli DH5α po transformacji syntetycznym obwodem, oporne na kanamycynę. Jednostką jest 100 jednostek czasu, ponieważ jest to symulacja deterministyczna. (D) Elektroforeza w żelu agarozowym intaktowanego oraz trawionego enzymami restrykcyjnymi NotI i XhoI syntetycznego obwodu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Stężenie plazmidu (μg/mL)260/280260/230
1248.51.952.45
1123.11.892.43
1155.81.872.41
1056.81.942.47

Tabela 1: Wydajność konstrukcji syntetycznego obwodu otrzymanej po izolacji plazmidu. Tabela przedstawia stężenie plazmidu w µg/mL oraz ich stosunki 260/280 i 260/230.

W komórkach kontrolnych i zakażonych obserwowana intensywność fluorescencji GFP była niska. Jednakże stwierdzono, że transfekcja syntetycznego obwodu w stosunku plazmidu do PEI 1:1 z dodatkiem 500 µg/mL G418 oraz indukcja za pomocą 1 µg/µL dox powoduje wysoką ekspresję GFP w komórkach IMT. W komórkach IMTI po 6 h ekspresja GFP była również znacznie wyższa, choć niższa niż w próbce IMT (Rysunek 2A,B). Ponadto zaobserwowano wzrost ekspresji GFP w próbkach IMTI po 12 h, 18 h i 24 h. Wzrost ten może wynikać z wydłużenia czasu zakażenia, co mogło wywołać silniejsze zmiany metaboliczne w makrofagach wywołane przez pasożyta rezydentnego17. Wewnątrzkomórkowe poziomy SDHA mogą ulec zmianie w wyniku wydłużenia czasu zakażenia18. Ponieważ do tych próbek IMTI dodano dox, poziomy SDHA w syntetycznych obwodach mogły wzrosnąć, co doprowadziło do zwiększenia ekspresji SDHA.

Barwienie DAPI wykonano w celu określenia liczby pasożytów rezydujących w makrofagach. W makrofagach zainfekowanych L. major po 6 h zaobserwowana liczba pasożytów wewnątrzkomórkowych wynosiła 6 komórek na makrofag, co jest wartością wyższą w porównaniu z próbką IMTI po 6 h, w której stwierdzono 1-2 pasożyty wewnątrzkomórkowe na makrofag. Po transfekcji i indukcji doksycykliną zaobserwowano znaczną redukcję ładunku pasożytów wewnątrzkomórkowych w różnych punktach czasowych infekcji (Ryc. 2C). Obserwacje sugerują, że syntetyczne obwody mogły wywołać efekt eliminacji pasożytów poprzez stymulację ekspresji SDHA.

Analiza infekcji komórek RAW264.7; mikroskopia fluorescencyjna, wykres słupkowy intensywności; kanały DAPI, 488nm.
Rysunek 2: Konfokalna mikroskopia skaningowa. Obrazy próbek kontrolnej, zainfekowanej, IMT oraz IMTI. (A) Analiza ekspresji GFP we wszystkich próbkach eksperymentalnych z paskiem skali 50 µm dla próbek kontrolnej, zainfekowanej po 6 h oraz IMT, 20 µm dla IMTI po 6 h, 10 µm dla IMTI po 12 h, 18 h IMTI oraz 24 h IMTI odpowiednio. Wykorzystane kanały to DIC, DAPI, GFP oraz obrazy scalone ze wszystkich kanałów. (B) Jednoczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z testem korekcji Tukeya dla wszystkich próbek eksperymentalnych (n=3) pod kątem ekspresji GFP (za istotne uznano p < 0.05). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. (C) Analiza jednoczynnikową ANOVA z testem korekcji Tukeya dla obciążenia pasożytniczego w 100 komórkach makrofagów dla próbek z punktu (A) (n=3) (za istotne uznano p < 0.05). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Oznaczenie poziomów IL-10 i IL-12 w pożywce wszystkich próbek wykazało, że stężenia IL-10 i IL-12 były najwyższe 6 h po infekcji, z obniżeniem poziomów cytokin po 24 h infekcji. Nie stwierdzono istotnej różnicy w poziomach IL-10 i IL-12 po transfekcji i indukcji obwodów syntetycznych. Odnotowano również nieistotną różnicę w poziomach IL-10 i IL-12 w próbkach w punkcie czasowym IMTI (Rycina 3). Wcześniej wykazano, że próbka zainfekowana przez 6 h wykazuje ekspresję IL-10 i IL-1219,20; zaobserwowanie nieistotnej różnicy w poziomach IL-10 i IL-12 skłoniło nas do zbadania wpływu obwodu syntetycznego na inne cytokiny.

Wykres słupkowy poziomów IL-10 i IL-12; analiza stężenia cytokin; p-value<0.0001.
Rysunek 3: Analiza ELISA dla IL-10 i IL-12 w celu określenia poziomów ich sekrecji w pożywkach z różnych próbek. Próbki (n=2) obejmują grupę kontrolną, próbki zainfekowane przez 6 h, zainfekowane przez 24 h, IMT, IMTI 6 h, IMTI 12 h, IMTI 18 h oraz IMTI 24 h. Przeprowadzono analizę dwukierunkową ANOVA z testem korekcji Tukeya (za istotne uznano p < .05). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza poziomów transkrypcji TNF-α, IFN-γ i TGF-β w próbkach zainfekowanych po 6 h, IMT oraz IMTI po 24 h wykazała, że w próbce IMTI po 24 h zaobserwowano istotny wzrost poziomu TNF-α do 2,5-krotności w porównaniu do próbek zainfekowanych i IMT (Rycina 4). W próbce IMTI po 24 h odnotowano 35-krotny wzrost poziomu IFN-γ w porównaniu do próbek zainfekowanych i IMT. Poziomy TGF-β, mimo istotnej nadekspresji do 1,5-krotności w próbce IMTI po 24 h, wykazały niższą względną zmianę krotności w porównaniu z TNF-α i IFN-γ, co sugeruje, że cytokiny prozapalne ulegają znaczącej nadekspresji w próbce IMTI po 24 h.

Wykres słupkowy porównujący względne zmiany krotności dla TNF-α, IFN-γ i TGF-β dla różnych rodzajów infekcji.
Rysunek 4: Analiza cytokin metodą qRT-PCR. (A) TNF-α, (B) IFN-γ oraz (C) TGF-β dla próbek po 6 h infekcji, IMT oraz 24 h IMTI (n=2). Przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z testem korekcji Tukeya (p < 0,05 uznano za istotne). Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Sekwencja nukleotydowa elementów genetycznych złożonych w celu utworzenia syntetycznego obwodu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Przetłumaczona sekwencja syntetycznego obwodu ekspresującego TetR, P2A i SDHA. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Wynik sekwencjonowania sklonowanego syntetycznego obwodu w plazmidzie pEGFP-N1. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Dyskusja

Uzyskane wyniki podkreślają efektywność rurociągu, który został wykorzystany do zaprojektowania i wdrożenia obwodu syntetycznego. Budowa tego syntetycznego obwodu była krokiem w kierunku rozwoju medycyny precyzyjnej dla chorób zakaźnych, takich jak leiszmanioza. Poprzez składanie części genetycznych in silico i symulację deterministyczną monitorowano wyróżniający się efekt modulacyjny systemu TetON. Efekt obwodu, w szczególności, mógł doprowadzić do wzajemnej bistabilnej ekspresji TetR i SDHA/GFP. Ekspresja SDHA była okresowa, co może wskazywać, że tylko w obecności doksycykliny jej ekspresja była zwiększona. Aby zaobserwować potencjalne zmiany we wzorcach wyrażeń w okresie, wybrano jednostkę czasu 100. Wyniki wskazują, że obwód syntetyczny wykazywał okresowe zachowanie dla TetR i SDHA/GFP, co prawdopodobnie można przypisać jego ortogonalnej naturze21. Kluczową rolę odegrało zebranie części genetycznych z rejestru części iGEM, ponieważ dostarczyło komponentów genetycznych niezbędnych do budowy obwodów syntetycznych22. Modułowe ułożenie części genetycznych jest niezbędne, ponieważ translacja i funkcjonowanie obwodu mogą zostać zakłócone, co może prowadzić do nieefektywnej ekspresji i efektu modulacyjnego w komórkach23.

Rozmiar wkładki obwodu syntetycznego wynosił około 1,3 kb, aby zapewnić, że rozmiar wektora nie jest zbyt duży, co może potencjalnie zmniejszyć wydajność transformacji24. Wybór odpowiedniego wektora jest krytycznym krokiem, ponieważ musi on posiadać części genetyczne, które są niezbędne do zwiększenia liczby kopii w systemie bakteryjnym i uzyskania kopii o wysokiej zawartości plazmidu, a jego maszyneria ekspresyjna musi dobrze dostosować się do systemu ssaków25. Wektor pEGFP-N1 jest dobrze scharakteryzowany w linii komórkowej RAW264.7 i posiada zwartą strukturę plazmidową z wielokrotnym miejscem klonowania26. Do izolacji plazmidu zastosowano standaryzowane laboratoryjnie roztwory buforowe, aby zapewnić produkcję wysoce skoncentrowanego i czystego plazmidu, co zostało zweryfikowane za pomocą estymacji spektrofotometrycznej i AGE. Wprowadzenie obwodu syntetycznego do wektora pEGFP-N1 zostało zweryfikowane poprzez trawienie restrykcyjne, a próbki przeanalizowano pod kątem AGE i sekwencjonowania. Wyniki AGE reprezentowały pasmo 1,3 kb wstawki, 4,7 kb pasmo wektora pEGFP-N1 i pasmo 6 kb całego obwodu syntetycznego.

Przeprowadzono transfekcję z wykorzystaniem proporcji 1:1, 1:2 i 2:1 DNA: PEI, gdzie obserwowany stosunek 1:1 działał najlepiej bez naruszania morfologii komórki (dane nie pokazane). Zaleca się stosowanie stężenia G418 400 μg/ml - 1000 μg/ml do selekcji transfekowanych komórek27. Do selekcji transfekowanych komórek użyto 500 μg / ml G418, ponieważ skutecznie hamował wzrost komórek nietransfekowanych bez upośledzenia wzrostu komórek lub morfologii transfekowanych komórek (dane nie pokazane). Biorąc pod uwagę znaczenie fenotypu komórkowego w wydajności transfekcji, szczególnie w liniach komórkowych makrofagów, które mogą ulegać różnicowaniu i stawać się trudne do transfekcji, do transformacji wykorzystano niską liczbę pasaży linii komórkowej RAW264.728. Liczba pasaży komórkowych może być również krytycznym czynnikiem wpływającym na wydajność transfekcji. Duża liczba przejść może prowadzić do nieefektywnej transfekcji29. Dox jest preferowanym induktorem dla systemu indukcyjnego Tet-ON ze względu na wysoką skuteczność wiązania z TetR, korzystną dystrybucję w tkankach, niską toksyczność i okres półtrwania wynoszący 24 godziny30. Po transfekcji komórki indukowano dox przez 24 godziny i obserwowano ekspresję GFP. W przypadku ogniw RAW264.7 stężenie dox stosowane do indukcji obwodów syntetycznych wynosiło 1 μg/ml, co mieści się w zalecanym zakresie 1-2 μg/ml31 (dane nie pokazane). Jednak regulacja stężenia SDHA po indukcji nie była określona. Ogólnie rzecz biorąc, określenie i standaryzacja liczby pasaży komórkowych, DNA: stężenie PEI, stężenie markera selekcji transfekcji ssaków i stężenie indukcji doksycykliny są kluczowymi czynnikami w procesie transfekcji.

Po indukcji obwodu syntetycznego po zakażeniu w różnych punktach czasowych zaobserwowano znaczne zmniejszenie obciążenia pasożytami wewnątrzkomórkowymi. Porównanie obciążenia pasożytami między próbkami zakażonymi i IMTI wykazało mniejsze obciążenie komórek indukowanych przez obwód syntetyczny, co prawdopodobnie można przypisać ekspresji SDHA. Ponieważ ekspresja SDHA jest związana z produkcją NO, zaobserwowano, że komórki IMTI mają nieregularną i szorstką formę morfologiczną, która występuje w linii komórkowej RAW264.7, gdy wytwarzany jest NO32. Poziomy IL-10 i IL-12 po 6-godzinnym zakażeniu były najwyższe, ponieważ zgłoszono, że obie cytokiny są regulowane w górę w tym punkcie czasowym, który dalej ulega modyfikacji fenotypowej w celu wytworzenia IL-10 więcej niż IL-1219. Ponieważ poziomy IL-10 i IL-12 nie zmieniły się znacząco po transfekcji i w próbkach IMTI, przeprowadzono profilowanie cytokin w celu wykrycia odpowiedzi cytokin prozapalnych i przeciwzapalnych.

Poziomy ekspresji TNF-α, IFN-γ i TGF-β zidentyfikowano w 6-godzinnych próbkach infekcji, IMT i 24-godzinnych IMTI. Aby wyeliminować pasożyty wewnątrzkomórkowe, TNF-α i IFN-γ są zasadniczo niezbędne, ponieważ indukują wybuchy oksydacyjne poprzez produkcję NO. Spolaryzowane makrofagi M2 wyrażają TGF-β, który obniża cytokiny prozapalne33. 24-godzinna próbka IMTI wykazała zwiększoną ekspresję TNF-α i IFN-γ niż TGF-β, co sugeruje, że makrofagi po transfekcji i zakażeniu L. major mogły spolaryzować się do fenotypu eksprymującego cytokiny prozapalne. Badanie dostarcza zatem informacji na temat zmian fenotypowych wywołanych podczas transfekcji z obwodem syntetycznym i podkreśla dynamikę infekcji. Wpływ obwodów syntetycznych jako terapeutycznych może być badany, ponieważ ich indukcja znacznie zwiększyła ekspresję cytokin prozapalnych w porównaniu z cytokinami przeciwzapalnymi. W ten sposób badanie nie tylko ustaliło proces budowy i dostarczania obwodu syntetycznego, ale także wykazało jego potencjał terapeutyczny w modelu leiszmaniozy poprzez regulację w górę cytokin prozapalnych w komórkach gospodarza z leiszmanią.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Dyrektorowi Rady ds. Badań i Innowacji Biotechnologicznych - Narodowemu Centrum Nauk o Komórkach (BRIC-NCCS), Pune za wsparcie naszych badań oraz Ośrodkowi Bioinformatycznemu BRIC-NCCS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 μ L końcówkiTarson521050
10X bufor restrykcyjnyBioLabsR0146SOgraniczenie trawienia
końcówki1 ml Tarson521016
1 ml probówkaEppendorf30121023
200 μ L końcówkiTarson521010
Kolba 25cm2Corning430639Do hodowli komórkowych
4',6-diamidino-2-fenyloindolThermoFischer ScientificD1306barwienie jądrowe
probówka 50 mlCorning352070
Talerze 60 mmFalcon353002
6X TrackIt Cyjan/Pomarańczowy Bufor ładującyThermoFischer Scientific10488085Ładowanie próbek do
płyty szkiełka nakrywkowego AGE 96ThermoFischer Scientific160376Do obrazowania konfokalnego i transfekcji
96-dołkowa mikro płytka testowa dołki płaskie Tarson941196
AgaroseSigmaA9539Do montażu
elektroforezy w żelu agarozowymAGE GeNei93Dla AGE
Bakteryjny przepływ laminarnyESCO Nauki przyrodnicze2120765Do przemiany
Chlorek wapniaMerckC4901Przygotowanie buforu / odczynnika
Laminarny przepływ powietrza do hodowli komórkowychThermoFischer Scientific1323TSDo hodowli komórkowych
Skrobakkomórkowy Genetix90020Do hodowli komórkowych
Rozsiewacz komórekFischer Scientific12822775
Wirówka do probówek 1,5 mlEppendorfEP5404000537
Wirówka do 50 ml sokołaThermoFischer Scientific75004210
ChlorofromFischer Scientific67-66-3do izolacji RNA
ThermoFischer Scientific3110Do kuwety
do hodowli komórkowychEppendorf6138000018Oznaczanie stężenia plazmidu
Obrazownik żelowy CYTIVA IQ 500Cytiva29655893Dla AGE
DEPC TREATED H2O 1000 MLThermoFischer Scientific750023Do izolacji RNA
DoksycyklinaMerck33429Do indukcji transfekowanych komórek
Suchy blok grzewczyLabnetDo transformacji i inaktywacji enzymów restrykcyjnych
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's EagleKrajowe centrum naukkomórkach Do hodowli komórkowych
EtanolSigma-Aldrich1.00983Bufor / Preparat odczynnikowy
Bromek etydynySigmaE7637Dla AGE
Kwas etylenodiaminotetraoctowyFischer Scientific12635Bufor / Przygotowanie odczynnika
Mikroskop jasnego polaEvos ThermoFischer ScientificAMEX1000
ExPasyhttps://web.expasy.org/translate/do budowy obwodu syntetycznego
Surowica bydlęcapłodu Gibco16000-044Do hodowli komórkowych
Oprogramowanie FV31S-SWOlypmusAkwizycja obrazu
GeneticinGibco1563411do transfekcji
Metoda montażu Gibsona do klonowaniaBIOMATIKBudowa obwodu syntetycznego
Pryzmat GraphpadAnaliza statystyczna
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościThermoFischer Scientific4368814do syntezy cDNA
IsopropanolFischer Scientific13825Bufor / Preparat odczynnikowy
KanamycinSigma60615Do transformacji i selekcji kolonii
Rosół Luria BertiniHimediaM1245Do hodowli E.coli
Chlorek magnezuFischer ScientificBP214Bufor / Przygotowanie odczynnika
Micro Filt Pionowy mikrofilt
z laminarnym przepływem powietrzaMicroAmp Fast 8-rurkowy pasek, 0,1 mlThermoFischer Scientific4358293Do qRT-PCR
Optyczne paski MicroAmp z 8 nasadkamiThermoFischer Scientific4323032Do qRT-PCR
Kuchenka mikrofalowaLGMC-7649DWDla AGE
Mm00434228_m1 (IFN-γ)Sondy ThermoFischer Scientific4331182Taqman
Mm00443258_m1 (TNF)ThermoFischer Scientific4331182Sondy Taqman
Mm01321739_m1(TGFB)ThermoFischer Scientific4331182Sondy Taqman
Mysz Zestaw ELISA IL-10ThermoFischer ScientificBMS614Do myszy ELISA
Zestaw ELISA IL-12ThermoFischer ScientificBMS616Dla ELISA
Multiskan Sky z ekranem dotykowym + μ Płyta opadającaThermoFischer Scientific51119600DPDo mieszalników mikropłytek ELISA
MX-M 96-dołkowy mieszalnik płytkowy do kultur komórkowych Regulowany 0-1500 obr./min Wytrząsarka laboratoryjna MieszadłoDIAB
Narodowe Centrum Biotechnologii Informacyjnehttps://www.ncbi.nlm.nih.govdo budowy obwodu syntetycznego
Komora NeubaueraMarienfeld superior640010Dla liczby komórek
Niewentylowana 25cm2 flaskCorning353014Do hodowli pasożytów
NotIBioLabsR3189MEnzym restrykcyjny
Woda wolna od nukleazBiodesign1QIAPrzygotowanie odczynnika
Olympus Cell Sens Dimension Desktop 2.3oprogramowanie OlypmusPrzetwarzanie obrazu
Olympus FV 3000OlympusDo obrazowania konfokalnego
Pożywka OPTI-MEMGibco31985070do transfekcji
Wektor pEGFP-N1 sklonowany za pomocą obwodu syntetycznegoBiomatik
PenicylinaThermoFischer15070063Do hodowli komórkowych
PolietyleniminaMERCK764965do transfekcji
Octan potasuFischer ScientificYBP364500Bufor / Preparat odczynnikowy
Chlorek potasuFischer ScientificBP366Bufor / Preparat odczynnikowy
Fosforan potasu monobasicSigmaP5655Bufor / Przygotowanie odczynnika
ZasilaczBIORAD1645070Dla AGE
Rejestr standardowych części biologicznychhttps://parts.igem.org/Main_Pagedo budowy obwodu syntetycznego
RNAiso PlusTakara38220090Do izolacji
RNA RNazaA ThermoFischer Scientific12091021Bufor / Przygotowanie odczynnika
Roswell Park Memorial Institute MediumNarodowe Centrum NaukiDo hodowli pasożytów
Inkubator ShakerREMICIS 24 plusDo hodowli E.coli
Chlorek soduQualigensQ27605Bufor / Preparat odczynnikowy
Dodecyl siarczanu soduSigma-AldrichL3771Bufor / Preparat odczynnikowy
Wodorotlenek soduFischer Scientific15895Bufor / Preparat odczynnikowy
Fosforan sodu dwuzasadowySigmaS5136Bufor / odczynnik przygotowanie
SpektrofotometrEppendorfSzacowanie stężenia plazmidu
Spin winTrason1020
System Real Time PCR StepOne plusTechnologie życia272006777Dla qRT-PCR
Oprogramowanie StepOne w wersji 2.3Life DlaqRT-PCR
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2X), bez AmpErase UNGThermoFischer Scientific4366072
Tinker cellBudowa i symulacja obwodów syntetycznych
TrackIt 1 Kb Plus Drabinka DNAThermoFischer Scientific10488085Dla AGE
Chlorowodorek tris (hydroksymetyloaminometanuHimediaMB029Bufor / Przygotowanie odczynnika
Tris-acetate-EDTASERVA42549.1Bufor / Przygotowanie odczynnika
Trypan blueSigmaT8154Do liczenia komórek
XhoIBioLabsR0146SEnzym restrykcyjny
dolnej Do inkubatora CO2 o o Komórkach )

Bibliografia

  1. Chen, J. Y., Zhou, J. K., Pan, W. Immunometabolism: Towards a better understanding the mechanism of parasitic infection and Immunity. Front Immunol. 12, 661241(2021).
  2. Ferreira, C., Estaquier, J., Silvestre, R. Immune-metabolic interactions between Leishmania and macrophage host. Curr Opin Microbiol. 63, 231-237 (2021).
  3. Ty, M. C., Loke, P., Alberola, J., Rodriguez, A., Rodriguez-Cortes, A. Immuno-metabolic profile of human macrophages after Leishmania and Trypanosoma cruzi infection. PloS one. 14 (12), e0225588(2019).
  4. Horácio, E. C. A., Hickson, J., Murta, S. M. F., Ruiz, J. C., Nahum, L. A. Perspectives From systems biology to improve knowledge of Leishmania drug resistance. Front Cell Infection Microbiol. 11, 653670(2021).
  5. Khandibharad, S., Singh, S. Immuno-metabolic signaling in leishmaniasis: insights gained from mathematical modeling. Bioinfo Adv. 3 (1), vbad125(2023).
  6. Mandlik, V., Limbachiya, D., Shinde, S., Mol, M., Singh, S. Synthetic circuit of inositol phosphorylceramide synthase in Leishmania a chemical biology approach. J Chem Biol. 6 (2), 51-62 (2013).
  7. Khandibharad, S., Singh, S. Synthetic biology for combating leishmaniasis. Front Microbiol. 15, 1338749(2024).
  8. Volpedo, G., et al. The history of live attenuated centrin gene-deleted Leishmania vaccine candidates. Pathogens. 11 (4), 431(2022).
  9. Almeida, F. S., et al. Leishmaniasis: Immune cells crosstalk in macrophage polarization. Trop Med Infect Dis. 8 (5), 276(2023).
  10. Duarte, M., et al. Leishmania type II dehydrogenase is essential for parasite viability irrespective of the presence of an active complex I. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (42), e2103803118(2021).
  11. Verma, A., et al. Transcriptome profiling identifies genes/pathways associated with experimental resistance to paromomycin in Leishmania donovani. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 7 (3), 370-377 (2017).
  12. Bolintineanu, D. S., et al. Investigation of changes in tetracycline repressor binding upon mutations in the tetracycline operator. J Chem Eng Data. 59 (10), 3167-3176 (2014).
  13. Yang, J., et al. A synthetic circuit for buffering gene dosage variation between individual mammalian cells. Nat Comm. 12 (1), 4132(2021).
  14. Verbič, A., Praznik, A., Jerala, R. A guide to the design of synthetic gene networks in mammalian cells. FEBS J. 288 (18), 5265-5288 (2021).
  15. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nuc Acid Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  17. Rabhi, I., et al. Transcriptomic signature of Leishmania infected mice macrophages: a metabolic point of view. PLoS Negl Trop Dis. 6 (8), e1763(2012).
  18. Renkema, G. H., et al. SDHA mutations causing a multisystem mitochondrial disease: novel mutations and genetic overlap with hereditary tumors. Eur J Human Gene. 23 (2), 202-209 (2015).
  19. Khandibharad, S., Singh, S. Artificial intelligence channelizing protein-peptide interactions pipeline for host-parasite paradigm in IL-10 and IL-12 reciprocity by SHP-1. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (10), 166466(2022).
  20. Khandibharad, S., Singh, S. Single-cell ATAC sequencing identifies sleepy macrophages during reciprocity of cytokines in L. major infection. Microbiol Spectr. 12 (3), e0347823(2024).
  21. Costello, A., Badran, A. H. Synthetic biological circuits within an orthogonal central dogma. Trend Biotechnol. 39 (1), 59-71 (2021).
  22. Cooling, M. T., et al. Standard virtual biological parts: a repository of modular modeling components for synthetic biology. Bioinformatics. 26 (7), 925-931 (2010).
  23. Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).
  24. Chan, V. W., Dreolini, L. F., Flintoff, K. A., Lloyd, S. J., Mattenley, A. A. The effect of increasing plasmid size on transformation efficiency in Escherichia coli. , (2002).
  25. Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. A plasmid system with tunable copy number. Nat Comm. 13 (1), 3908(2022).
  26. Li, P., He, Y., Zhang, J., Fang, C. Zinc-dependent metalloprotease 1 promotes apoptosis of RAW264.7 macrophages. Chinese J Cell Mol Immunol. 31 (12), 1585-1587 (2015).
  27. Stein, S. C., Falck-Pedersen, E. Sensing adenovirus infection: activation of interferon regulatory factor 3 in RAW 264.7 cells. J Virol. 86 (8), 4527-4537 (2012).
  28. Cheung, S. T., Shakibakho, S., So, E. Y., Mui, A. L. F. Transfecting RAW264.7 cells with a luciferase reporter gene. J Vis Exp. (100), (2015).
  29. Fus-Kujawa, A., et al. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Front Bioeng Biotechnol. 9, 701031(2021).
  30. Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression. Curr Gene Ther. 16 (3), 156-167 (2016).
  31. De Boeck, J., Verfaillie, C. Doxycycline inducible overexpression systems: how to induce your gene of interest without inducing misinterpretations. Mol Biol Cell. 32 (17), 1517-1522 (2021).
  32. Wu, L., et al. 5-Methoxyl Aesculetin abrogates lipopolysaccharide-induced inflammation by suppressing MAPK and AP-1 pathways in RAW 264.7 Cells. Int J Mol Sci. 17 (3), 315(2016).
  33. Tomiotto-Pellissier, F., et al. Macrophage polarization in Leishmaniasis: Broadening horizons. Front Immunol. 9, 2529(2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Immunometabolizmbiologia syntetycznazakażenie Leishmaniaobwód syntetycznysystem indukowany tetracyklinądehydrogenaza bursztynianowatransfekcja makrofagówcytokiny prozapalnenanocząstki polypleksowe
Obwody immunometaboliczne w zakażeniach w celu rozwoju terapii ukierunkowanych na gospodarza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.