Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Skuteczne wykrywanie komórek populacji bocznej Hoechsta za pomocą cytometrii przepływowej

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67012

⸱

23 sierpnia 2024

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Hematology, Department of Hematology, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, 2The Lab of Aging Research, State Key Laboratory of Biotherapy, National Clinical Research Center for Geriatrics, West China Hospital, Sichuan University, 3Precision Medicine Research Laboratory, West China Hospital, Sichuan University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj pokazujemy, że lasery o dużej mocy 375 nm i 405 nm mogą skutecznie wzbudzić Hoechst 33342 i służyć jako realna alternatywa dla lasera 355 nm do wykrywania komórek populacji bocznej (SP), rozszerzając tym samym zakres dostępnych laserów w zastosowaniach cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Komórki populacji bocznej (SP) są identyfikowane za pomocą barwienia Hoechst 33342 i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej (FCM). Metoda Hoechst SP jest wykorzystywana do izolacji komórek macierzystych w oparciu o właściwości wypływu barwnika transporterów kasetowych wiążących ATP (ABC). Metoda ta była początkowo stosowana do identyfikacji i izolacji hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC), ale obecnie ewoluowała, koncentrując się przede wszystkim na identyfikacji i izolacji nowotworowych komórek macierzystych (CSC). Tradycyjna metoda wykrywania FCM wykorzystuje laser o długości fali 355 nm do wzbudzania barwnika w celu wykrycia komórek SP. Dzięki temu badaniu udało nam się zidentyfikować alternatywne podejścia do wzbudzania barwnika, które mogą skutecznie zastąpić wykrywanie komórek SP za pomocą lasera 355 nm. Osiąga się to dzięki wykorzystaniu laserów o dużej mocy 375 nm lub 405 nm. Pozwala nam to na zwiększenie selektywności w wykrywaniu komórek SP, a nie ograniczanie się wyłącznie do laserowej cytometrii przepływowej 355 nm.

Wprowadzenie

Komórki populacji bocznej (SP) są identyfikowane za pomocą barwienia Hoechst 33342 i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej (FCM). Komórki SP charakteryzują się pompowaniem fluorescencyjnego barwnika DNA z komórek przez transporter kasety wiążącej ATP (ABC)1,2. Metoda została pierwotnie opracowana do izolowania mysich hematopoetycznych komórek macierzystych szpiku kostnego (HSC)1. Komórki SP szpiku kostnego wzbogacono populacją HSC charakteryzującychsię niską ekspresją CD117+Sca-1+Lin-Thy13,4. Następnie metoda ta była szeroko stosowana do izolowania i wzbogacania komórek macierzystych z innych tkanek, w tym mięśnia sercowego5, liver6, lung7, kidney8 i forebrain9. W szczególności w ciągu ostatniej dekady metoda ta została zastosowana do izolowania nowotworowych komórek macierzystych (CSC). CSCs reprezentują niewielką populację komórek, które posiadają właściwości inicjacji nowotworu, samoodnowy, oporności na chemioterapię i potencjału przerzutowego10. CSC zostały początkowo zidentyfikowane w nowotworach układu krwiotwórczego układu krwiotwórczego11, a następnie zaobserwowano je w różnych guzach litych, takich jak raki prostaty12, ovarian13, gastric14, breast15 i lung16 raków. Pomimo dostępności różnych technik identyfikacji CSC, technika SP pozostaje preferowanym wyborem ze względu na jej szerokie zastosowanie w różnych tkankach i liniach komórkowych. Co więcej, jest to cenna technika, która izoluje CSC za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)16,17,18. Wyniki eksperymentu pokazują, że komórki SP wykazują wyraźną rakotwórczość i wykazują podwyższony poziom ekspresji genów związanych z komórkami macierzystymi19,20. Nasze poprzednie badanie21 wykazało również, że analiza transkryptomiczna izolowanych komórek SP w szpiczaku mnogim ujawnia wzbogacenie szlaków sygnałowych związanych z komórkami macierzystymi, takich jak szlak jeża. W międzyczasie przeprowadziliśmy analizy wzbogacania szlaku na genach o zróżnicowanej ekspresji w komórkach SP ostrej białaczki szpikowej 22. Zmienione geny zostały wzbogacone w szlaki związane z komórkami macierzystymi (Wnt/β-katenina, TGF-β, Hedgehog, Notch). Odkryliśmy, że 1 x 105 komórek SP może tworzyć guzy u myszy o zerowym BALB/c22, podczas gdy komórki inne niż SP nie mogą, co wskazuje, że komórki SP mają cechy komórek macierzystych białaczki. Skuteczność metody Hoechst SP w identyfikacji CSC jest oczywista.

Protokół Hoechst SP został udoskonalony i ulepszony w miarę postępu badań. Protokół obejmuje ścisłą kontrolę stężenia barwnika, gęstości komórek, temperatury i czasu trwania inkubacji, składu buforu i wartości pH. Próbki komórek przygotowane zgodnie z tym protokołem poddano analizie cytometrii przepływowej. Ze względu na wzbudzenie barwnika Hoechst za pomocą lasera UV o długości fali 355 nm i detekcję jego emisji fluorescencyjnej za pomocą zarówno filtra 690/50 nm (Hoechst Red), jak i filtra 450/50 nm (Hoechst Blue), do FCM wymagany jest laser o długości fali 350 nm. Jednak lasery 350 nm nie są powszechnie wyposażone w większość FCM ze względu na ich wysoki koszt. W związku z tym podjęliśmy próbę znalezienia alternatywnego podejścia do wzbudzania barwnika w celu skutecznego wykrywania komórek SP za pomocą cytometrii przepływowej. W tym badaniu oceniono zdolność laserów 375 nm i 405 nm do wykrywania komórek SP i porównano je z laserem 355 nm. Nasze odkrycia wykazują niezwykłe podobieństwo między komórkami SP wykrytymi przez lasery 355 nm, 375 nm i 405 nm. Wyniki te sugerują, że lasery o dużej mocy 375 nm i 405 nm mogą służyć jako realna alternatywa dla lasera 355 nm do wykrywania komórek SP. Włączenie dodatkowych źródeł światła wzbudzającego dla Hoechst 33342 ułatwia stosowanie większej liczby modeli cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty w tym badaniu wykorzystały łącznie 10 myszy C57BL/6 w wieku od 8 do 12 tygodni. Operacje eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z protokołem, który został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Syczuańskiego (#201609309). Materiały doświadczalne i parametry cytometrii przepływowej wykorzystane w tym artykule wymieniono w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja i pobieranie komórek szpiku kostnego myszy

  1. Eutanazja myszy odbywa się w ścisłej zgodności z wytycznymi instytucji. W celu wywołania utraty przytomności u myszy, należy podać wziewne środki znieczulające, zaczynając od 2% izofluranu, a następnie stopniowo zwiększać dawkę do 5% izofluranu, aż do ustania oddychania.
  2. Przeprowadź sekcję myszy na sali operacyjnej lub w dygestorium. Oczyść i wysterylizuj myszy 70% etanolem.
  3. Całkowicie przetnij skórę i mięsień nogi ostrymi nożyczkami i wypreparuj kości udowe.
  4. Delikatnie zmiażdżyć kość udową prętem szlifierskim w moździerzu i wypłukać komórki szpiku kostnego pożywką DMEM, aż kość stanie się biała.
  5. Uzyskane komórki szpiku kostnego przefiltrować filtrem 100 μm do probówek o pojemności 15 ml. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Odrzucić supernatant i poddać lizie resztki krwinek czerwonych za pomocą 1 ml buforu do lizy krwinek czerwonych przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu ponownie przemyć pożywką DMEM.
  7. Ponownie zawiesić komórki w 2 ml roztworu inkubacyjnego (pożywka DMEM + 5% FBS), policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i dostosować stężenie komórek do 1,0 x 106 komórek/ml z roztworem do inkubacji.

2. Barwienie komórkowe

  1. Uzupełnić 2 ml zawiesiny komórek szpiku kostnego od każdej myszy za pomocą 5 μg/ml Hoechst 33342. Do kolejnej 1 ml porcji dodać 100 μM werapamilu jako kontrolę ujemną.
  2. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 90 minut, delikatnie mieszając co 30 minut.
  3. Po inkubacji schłodzić komórki na lodzie przez 5 minut, a następnie odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w roztworze chłodzącym (HBSS + 2% FBS). Wirować w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  4. Zawiesić powstały osad komórkowy w 500 μl roztworu bieżącego na próbkę. Przed analizą FCM należy uzupełnić komórki 2 μg/ml jodku propidyny (PI) i umieścić na lodzie na około 5 minut.

3. Cytometria przepływowa

UWAGA: Podsumowanie różnych używanych systemów i konfiguracji znajduje się w Tabeli 1.

  1. Skalibruj wartości współczynnika zmienności (CV) wymaganych kanałów za pomocą fluorosfer codziennej kontroli jakości (QC) w FCM i wykonaj badanie próbki po pomyślnym zakończeniu kontroli jakości.
    1. Wybierz skrót oprogramowania na pulpicie i uruchom oprogramowanie.
    2. Wybierz opcję Start QC/Standaryzacja w menu QC/Standaryzacja, aby uzyskać dostęp do eksperymentu QC.
    3. Włóż probówkę z fluorosferą QC do uchwytu probówki.
    4. Wybierz opcję Uruchom, aby załadować próbkę i rozpocząć uruchamianie procedury kontroli jakości. FCM są gotowe do użycia po przejściu kontroli jakości.
  2. Wzbudzić barwnik Hoechst 33342 z tych samych próbek za pomocą lasera o długości fali 355 nm, 375 nm i 405 nm, odpowiednio w celu wykrycia czerwieni Hoechst w kanale 690/50 nm i błękitu Hoechst w kanale 450/50 nm.
    1. Utwórz nowy eksperyment, wybierając pozycję Nowy eksperyment w menu Plik, określ ścieżkę pliku i zapisz eksperyment.
    2. Wybierz Ustaw kanał w menu Ustawienia. Zaznacz pole wyboru sygnału kanału (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660), a następnie dodaj nazwę odczynnika w kolumnie Etykieta (Y585: PI; V450: Hoechst niebieski – 405 nm; V660: Hoechst czerwony-405 nm; NUV450: Hoechst Niebieski-375 nm; NUV660: Hoechst Niebieski-375 nm; UV450: Hoechst Niebieski-355nm; UV660: Hoechst Blue-355 nm).
    3. Kliknij ikony Wykresy pseudokolorowe w obszarze kreślenia, aby utworzyć wykresy. Wybierz nazwę osi, aby zmienić wyświetlany kanał.
    4. Kliknij przycisk Dodaj probówkę na ekranie probówki, aby utworzyć nowe probówki z próbkami i zmienić ich nazwy.
    5. Wybierz pozycję Uruchom, aby załadować próbkę, wyświetlić wykresy i ustanowić bramy. Dostosuj ustawienia wzmocnienia i progu. Wybierz opcję Nagraj, aby zapisać dane.
  3. Zaprojektuj logikę ustawień bramy.
    1. Na pierwszym wykresie kliknij oś X, aby wybrać FSC-W, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać FSC-A. Wybierz Bramka wielokątna, aby narysować bramkę A, aby zakreślić pojedynczą komórkę i wykluczyć przylegające komórki (Rysunek 1A).
    2. W przypadku drugiego wykresu kliknij oś X, aby wybrać FSC-A, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać SSC-A. Wybierz Bramka wielokątna, aby narysować bramkę B w celu oddzielenia niefragmentarycznych komórek i wykluczenia szczątków komórkowych (Rysunek 1B).
    3. W przypadku trzeciego wykresu kliknij oś X, aby wybrać PI-A, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać SSC-A. Wybierz bramkę wielokątną, aby narysować bramkę D. Wybierz żywe komórki wykazujące ujemne PI ( Rysunek 1C) i narysuj bramkę C, aby uzyskać żywe komórki.
    4. Dla czwartego wykresu dwuwymiarowego kliknij oś X, aby wybrać opcję Czerwony Hoechst, a następnie kliknij oś Y, aby wybrać opcję Niebieski Hoechsta. Kliknij prawym przyciskiem myszy pozycję Wykres i wybierz opcję Właściwość z menu rozwijanego. Wybierz opcję Format liniowy flub oś X i oś Y. Wybierz Bramka wielokątna, aby narysować bramkę SP, aby uzyskać komórki SP (Rysunek 1D).
  4. Aby ocenić kwalifikowalność próbki, użyj 355 nm specyficznego cytometru przepływowego23 do wykrywania komórek SP.
  5. Użyj jednocześnie laserów 355 nm (moc lasera: 20 mW) i 405 nm (moc lasera: 80 mW), aby wykryć zarówno komórki kontrolne (z dodatkiem werapamilu), jak i komórki eksperymentalne.
  6. Zbieraj sygnały fluorescencyjne w kanałach 690/50 nm i 450/50 nm odpowiadających dwóm laserom. Obserwuj skuteczną stymulację barwnika Hoechst 33342 za pomocą laserów 355 nm i 405 nm z przezroczystymi komórkami SP (Rysunek 2B-C).
  7. W przypadku tych samych próbek do wykrywania komórek należy użyć laserów 375 nm (moc lasera: 60 mW) i 405 nm (moc lasera: 80 mW).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Na Rysunku 2 grupa kontrolna została poddana działaniu werapamilu, który blokuje transportery ABC w komórkach macierzystych, zapobiegając usuwaniu Hoechst 33342. W związku z tym komórki macierzyste w grupie bez werapamilu usuwają Hoechst 33342 i tworzą negatywną populację komórek znaną jako komórki SP. Laser o długości fali 355 nm skutecznie wzbudził barwnik Hoechst 33342, co pozwoliło na wyraźną obserwację komórek SP szpiku kostnego (Rysunek 2A). Stwierdzono, ż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Użyliśmy opisanego protokołu do przeprowadzenia trzech eksperymentów, z których każde obejmowało 3-4 myszy, w wyniku czego uzyskano w sumie 10 myszy. Udział komórek SP wahał się od 0,05% do 0,76%. Należy zauważyć, że wśród myszy zaobserwowano indywidualne różnice. Do analizy próbek Hoechst wykorzystaliśmy cztery cytometry przepływowe. Zaobserwowano, że wzbudzenie barwnika Hoechsta przez laser o długości fali 20 mW i długości fali 355 nm w nowej wersji cytometrii przepływowej jest równoważne wzbudzeniu przez laser o długo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty dla J.H. z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81800207). Pomoc firmy Beckman Coulter, Inc. w zapewnieniu wsparcia w zakresie cytometrii przepływowej i kalibracji parametrów jest bardzo doceniana. Dziękujemy Jiao Chen z Państwowego Kluczowego Laboratorium Chorób Jamy Ustnej Zachodniochińskiego Szpitala Stomatologicznego Uniwersytetu Syczuańskiego oraz Yu Qi z Centrum Badawczego Medycyny Regeneracyjnej Szpitala Zachodniochińskiego Uniwersytetu Sichuan za pomoc w pozyskiwaniu danych cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Automatyczny licznik komórekCountstar1M1200
(100 µ m)BIOFILCSS-013-100
Codzienna kontrola jakości fluorosferyBeckman CoulterB5230
Modyfikacja pożywki Eagle's Dulbecco z 4,5 g / l glukozy (pożywka DMEM)CORNING10-013-CVRC
Surowica bydlęcapłodu CORNING35-081-CV
Hyklon HBSSSH30030.02
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
Jodek propidyny (PI)Sigma-AldrichP4170
Bufor do lizy czerwonych krwinekBeyotimeC3702
VerapamilSigma-AldrichV4629
Filtr komórkowy

Bibliografia

  1. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  2. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).
  3. Camargo, F. D., Chambers, S. M., Drew, E., McNagny, K. M., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cells do not engraft with absolute efficiencies. Blood. 107 (2), 501-507 (2006).
  4. Challen, G. A., Boles, N. C., Chambers, S. M., Goodell, M. A. Distinct hematopoietic stem cell subtypes are differentially regulated by TGF-beta1. Cell Stem Cell. 6 (3), 265-278 (2010).
  5. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
  6. Terrace, J. D., et al. Side population cells in developing human liver are primarily haematopoietic progenitor cells. Exp Cell Res. 315 (13), 2141-2153 (2009).
  7. Martin, J., et al. Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential. Cytotherapy. 10 (2), 140-151 (2008).
  8. Challen, G. A., Bertoncello, I., Deane, J. A., Ricardo, S. D., Little, M. H. Kidney side population reveals multilineage potential and renal functional capacity but also cellular heterogeneity. J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1896-1912 (2006).
  9. Mouthon, M. A., et al. Neural stem cells from mouse forebrain are contained in a population distinct from the 'side population'. J Neurochem. 99 (3), 807-817 (2006).
  10. Cordon-Cardo, C. Cancer stem cells. Ann Oncol. 21 (Suppl 7), 93-94 (2010).
  11. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  12. Yun, E. J., et al. Targeting cancer stem cells in castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res. 22 (3), 670-679 (2016).
  13. Lupia, M., Cavallaro, U. Ovarian cancer stem cells: still an elusive entity. Mol Cancer. 16 (1), 64(2017).
  14. Zhao, R., et al. AQP5 complements LGR5 to determine the fates of gastric cancer stem cells through regulating ULK1 ubiquitination. J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 322(2022).
  15. Liu, S., et al. A novel lncRNA ROPM-mediated lipid metabolism governs breast cancer stem cell properties. J Hematol Oncol. 14 (1), 178(2021).
  16. Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).
  17. Chiba, T., et al. Side population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties. Hepatology. 44 (1), 240-251 (2006).
  18. Haraguchi, N., et al. Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system. Stem Cells. 24 (3), 506-513 (2006).
  19. Zhou, J., et al. Activation of the PTEN/mTOR/STAT3 pathway in breast cancer stem-like cells is required for viability and maintenance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16158-16163 (2007).
  20. Ota, M., et al. ADAM23 is downregulated in side population and suppresses lung metastasis of lung carcinoma cells. Cancer Sci. 107 (4), 433-443 (2016).
  21. Wang, F., et al. ALCAM regulates multiple myeloma chemoresistant side population. Cell Death Dis. 13 (2), 136(2022).
  22. Wang, F., et al. Homoharringtonine synergizes with quizartinib in FLT3-ITD acute myeloid leukemia by targeting FLT3-AKT-c-Myc pathway. Biochem Pharmacol. 188, 114538(2021).
  23. Dong, X. L., Wei, Y. Y., Xu, T., Tan, X. Y., Li, N. Analysis of side population in solid tumor cell lines. J Vis Exp. (168), e60658(2021).
  24. Bhowmick, D., Sheridan, R. T. C., Bushnell, T. P., Spalding, K. L. Practical guidelines for optimization and characterization of the Beckman Coulter CytoFLEX platform. Cytom Part A. 97 (8), 800-810 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Barwienie Hoechst 33342nowotworowe komórki macierzysteizolacja komórek macierzystychefekt efflux barwnikatransportery ABCkomórki szpiku kostnegowzbudzenie laserowejodek propidyny
Skuteczne wykrywanie komórek populacji bocznej Hoechsta za pomocą cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.