Artykuł metodologiczny

Wysokiej jakości aktywność podobna do napadów padaczkowych z ostrych wycinków mózgu przy użyciu komplementarnego układu mikroelektrod o dużej gęstości z tlenkiem metalu i półprzewodnikiem

DOI:

10.3791/67065

⸱

27 września 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, Brigham Young University, 2Neuroscience Center, Brigham Young University, 3Department of Statistics, Brigham Young University, 4Department of Biology, Brigham Young University, 5Department of Physics and Astronomy, Brigham Young University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy protokół użycia komplementarnych systemów układów mikroelektrod o wysokiej gęstości (CMOS-HD-MEAs) do rejestrowania aktywności podobnej do napadu z wycinków mózgu ex vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komplementarne układy mikroelektrod o wysokiej gęstości (CMOS-HD-MEA) mogą rejestrować aktywność neurofizjologiczną z kultur komórkowych i wycinków mózgu ex vivo z niespotykanymi dotąd szczegółami elektrofizjologicznymi. CMOS-HD-MEA zostały najpierw zoptymalizowane pod kątem rejestrowania wysokiej jakości aktywności jednostek neuronalnych z hodowli komórkowych, ale wykazano również, że dostarczają wysokiej jakości danych z ostrych wycinków siatkówki i móżdżku. Naukowcy wykorzystali ostatnio CMOS-HD-MEA do rejestrowania lokalnych potencjałów pola (LFP) z ostrych, korowych wycinków mózgu gryzoni. Jednym z interesujących LFP jest aktywność podobna do napadów. Podczas gdy wielu użytkowników wytwarzało krótkie, spontaniczne wyładowania padaczkowe za pomocą CMOS-HD-MEA, niewielu użytkowników niezawodnie wytwarza wysokiej jakości aktywność podobną do napadów. Wiele czynników może przyczyniać się do tej trudności, w tym szum elektryczny, niespójny charakter wytwarzania aktywności podobnej do napadów padaczkowych podczas korzystania z zanurzonych komór nagraniowych oraz ograniczenie, że chipy 2D CMOS-MEA nagrywają tylko z powierzchni wycinka mózgu. Techniki wyszczególnione w tym protokole powinny umożliwić użytkownikom konsekwentne wywoływanie i rejestrowanie wysokiej jakości aktywności podobnej do napadu padaczkowego z ostrych wycinków mózgu za pomocą systemu CMOS-HD-MEA. Ponadto protokół ten określa prawidłowe traktowanie chipów CMOS-HD-MEA, zarządzanie roztworami i wycinkami mózgu podczas eksperymentów oraz konserwację sprzętu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komercyjnie dostępne systemy matryc mikroelektrod o wysokiej gęstości (HD-MEA), które zawierają układ MEA z tysiącami punktów zapisu1,2 oraz platforma MEA do wzmacniania i digitalizacji danych, są nowym narzędziem do badań elektrofizjologicznych. Te systemy HD-MEA wykorzystują komplementarną technologię półprzewodników metal-tlenek-półprzewodnik (CMOS) do rejestrowania danych elektrofizjologicznych z wysoką czułością z hodowli komórkowych i preparatów ex vivo wycinków mózgu. Te systemy MEA zapewniają bezprecedensową rozdzielczość przestrzenną i czasową dla badań neurofizjologicznych dzięki wysokiej gęstości elektrod i wysokiej jakości stosunkom sygnału do szumu3. Technologia ta była najczęściej wykorzystywana do badania zewnątrzkomórkowych potencjałów czynnościowych, ale może również wychwytywać wysokiej jakości lokalne potencjały pola (LFP) z różnych preparatów neuronalnych wycinków mózgu4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Dzięki wyżej wspomnianym możliwościom nagrywania w wysokiej rozdzielczości systemów CMOS-HD-MEA, użytkownicy mogą śledzić aktywność elektrofizjologiczną z dużą dokładnością przestrzenną16,17,18. Ta funkcja jest szczególnie istotna do śledzenia wzorców propagacji sieci LFPs5,12,15,19,20,21. W związku z tym systemy CMOS-HD-MEA mogą zapewnić bezprecedensowe zrozumienie wzorców propagacji aktywności fizjologicznej i patologicznej z różnych kultur komórkowych i preparatów do wycinków mózgu. Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że możliwości systemów CMOS-HD-MEA mogą pozwolić naukowcom na jednoczesne porównywanie wzorców napadów padaczkowych w różnych regionach mózgu i badanie, w jaki sposób różne związki przeciwpadaczkowe wpływają na te wzorce. W ten sposób zapewnia innowacyjną metodę badania iktogenezy i propagacji ictal oraz zrozumienia, w jaki sposób farmakologia zakłóca patologiczną aktywność sieci7,10,14. W związku z tym te nowatorskie możliwości systemów CMOS-HD-MEA mogą znacząco przyczynić się do badań nad zaburzeniami neurologicznymi, a także pomóc w badaniach nad odkrywaniem leków5,7,11,22. Naszym celem jest dostarczenie szczegółowych informacji na temat wykorzystania systemów CMOS-HD-MEA do badania aktywności podobnej do napadów padaczkowych.

Podczas korzystania z systemów CMOS-HD-MEA do badania LFP, takich jak aktywność epileptiform w ostrych wycinkach mózgu, użytkownicy mogą napotkać wiele wyzwań, w tym paraliżujący szum elektryczny, utrzymanie wycinka w zdrowiu podczas eksperymentów i wykrywanie sygnału jakości z dwuwymiarowego (2D) CMOS-MEA chipa, który nagrywa tylko z powierzchni wycinka mózgu. Protokół ten opisuje podstawowe kroki prawidłowego uziemienia platformy MEA i innego sprzętu używanego w eksperymentach, kluczowy krok, który może wymagać indywidualnego dostosowania dla każdej konfiguracji laboratorium. Ponadto omawiamy kroki, które pomogą w utrzymaniu zdrowego wycinka mózgu podczas długich nagrań w zanurzonych komorach używanych z systemami CMOS-HD-MEA23,24,25. Dodatkowo, w przeciwieństwie do bardziej powszechnych metod zapisu elektrofizjologicznego, które nagrywają z głębi wycinka mózgu, większość systemów CMOS-HD-MEA wykorzystuje chipy 2D, które nie wnikają w wycinek. Dlatego systemy te wymagają zdrowej zewnętrznej warstwy neuronalnej do wytworzenia większości zarejestrowanych sygnałów LFP. Inne wyzwania obejmują wizualizację ogromnej ilości danych generowanych przez tysiące elektrod. Aby przezwyciężyć te wyzwania, zalecamy prosty, ale skuteczny protokół, który zwiększa prawdopodobieństwo osiągnięcia wysokiej jakości sieciowej aktywności padaczkowej, która rozprzestrzenia się w całym wycinku mózgu. Zamieszczamy również krótki opis publicznie dostępnego graficznego interfejsu użytkownika (GUI), który opracowaliśmy wraz z powiązanymi zasobami, aby pomóc w wizualizacji danych10.

Poprzednie publikacje zawierały powiązane protokoły do korzystania z systemów zapisu MEA26,27,28,29. Jednak praca ta ma na celu pomóc eksperymentatorom korzystającym z systemów CMOS-HD-MEA z chipami 2D, w szczególności tym, którzy chcą badać wysokiej jakości aktywność padaczkową z wycinków mózgu. Ponadto porównujemy dwie z najczęstszych manipulacji roztworami w celu indukcji aktywności podobnej do napadów, a mianowicie paradygmaty 0 Mg2+ i 4-AP, aby pomóc użytkownikom zidentyfikować najbardziej odpowiednie media drgawkowe dla ich konkretnego zastosowania. Chociaż protokół koncentruje się przede wszystkim na generowaniu aktywności podobnej do napadów, może być modyfikowany w celu zbadania innych zjawisk elektrofizjologicznych za pomocą wycinków mózgu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Brighama Younga. Samce i samice (n = 8) myszy C57BL/6 w wieku co najmniej P21 wykorzystano w następujących eksperymentach.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczny rysunek eksperymentów CMOS-HD-MEA. (A) Wycinek mózgu jest przygotowywany preferowaną metodą cięcia i podsekcjonowany, aby pasował do MEA. (B) Przygotować roztwory i układ CMOS-HD-MEA. (C) Pod-wypreparowany wycinek mózgu umieszcza się na matrycy elektrod i kąpie w odpowiednich roztworach. (D) Ze zgromadzonych danych wybierane są odpowiednie kanały. Dane są następnie przygotowywane do analizy w preferowanym przez użytkownika programie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt.
NazwaStężenie (mM)g/L
Chlorek sodu (NaCl)126 Rozdział 126Godzina 7,36
Chlorek potasu (KCl)3,50,261
Diwodór Fosforan sodu (NaH2PO4)Pytanie 1,260,151
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)26Rozdział 2.18
Glukoza (C6H12O6)10Godzina 1,80
Chlorek magnezu (MgCl2)1 (z 1 mln zapasów)1 ml
Chlorek wapnia (CaCl2)2 (od 1 mln zapasów)2 ml

Tabela 1: rozwiązanie aCSF.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj rozwiązania eksperymentalne.
    1. Przygotować 1 l sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) (szczegółowe informacje znajdują się w tabeli 1).
    2. Przygotować 1 l roztworu prodrgawkowego.
      UWAGA: Roztwory używane do generowania aktywności podobnej do napadu w tym protokole wykorzystywały aCSF ze 100 μM 4-aminopirydyną (4-AP) lub aCSF wolnym od jonów magnezu.
    3. Karbogenować wszystkie roztwory przez co najmniej 10 minut przed użyciem za pomocą porowatych kamieni.
    4. Zaopatrz się w zlewkę do wyrzucania roztworów.
    5. Umieścić 1 l płynu mózgowo-rdzeniowego, 1 l roztworu prodrgawkowego i zlewkę na powierzchni w pobliżu systemu perfuzyjnego.
  2. Przygotowanie roztworów komory do cięcia i przetrzymywania
    1. Przygotuj 0,5 l aCSF, pomijając CaCl2 i dodając 3 mM MgCl2 (zamiast 1 mM), aby stworzyć unikalne rozwiązanie do cięcia. Zachowaj ten roztwór do użycia w przygotowaniu plastrów mózgu gryzoni, umieszczając go w pobliżu obszaru przygotowania ostrego wycinka mózgu.
    2. Przygotuj 0,5 l płynu mózgowo-rdzeniowego i umieść go w komorze na tkanki, która będzie używana do przechowywania plastrów do wykorzystania w eksperymentach. Włożyć porowate kamienie do komory na tkanki i karbonować roztwór przez co najmniej 10 minut przed umieszczeniem wyciętych plastrów w komorze.

2. Przygotowanie wycinków mózgu gryzoni

  1. Przygotować wszystkie roztwory zgodnie z powyższym opisem (patrz punkt 1). Upewnij się, że wszystkie roztwory są prawidłowo karbogenowane podczas procesu przygotowania.
    UWAGA: Zalecany jest roztwór do cięcia (patrz sekcja 1.2), ale w celu uzyskania wysokiej jakości wycinków mózgu można użyć innych roztworów do cięcia, takich jak roztwór do cięcia sacharozy30.
  2. Użyj wibrującego mikrotomu, aby zrobić plastry mózgu gryzoni o grubości 350 μm. Protokoły korzystania z tych instrumentów są wymienione w references30,31,32,33.
  3. Przygotuj wycinki mózgu gryzoni tak, aby pasowały do obszaru elektrody rejestrującej chipa MEA (patrz Rysunek 2). Użyj ostrza chirurgicznego w rozmiarze 10, aby wyciąć plastry, jak pokazano na Rysunek 1A i Rysunek 2A , delikatnie obracając ostrze w przód iw tył po wycinku mózgu. Przeprowadzić podsekcję w wibrującej komorze cięcia mikrotomu. Zachowaj ostrożność, aby nie uszkodzić podwyciętego wycinka mózgu.
  4. Umieść wycięte plastry w komorze na tkanki wypełnionej płynem mózgowo-rdzeniowym. Upewnij się, że komora była karbonogenowana przez co najmniej 10 minut przed dodaniem podciętych plastrów.

3. Przygotowanie sprzętu

  1. Przygotowanie układów i systemu MEA (Rysunek 2 i Rysunek 3)
    UWAGA: Twarde materiały, takie jak tworzywa sztuczne i metale, mogą łatwo uszkodzić chip MEA, jeśli mocno stykają się z dolną częścią chipa. Używając pipet do przenoszenia roztworu do lub z chipów, nie należy stykać dna dołka chipa z pipetą, zwłaszcza elektrod odniesienia po bokach dołka chipa i elektrod rejestrujących w środku dołka chipa (Rysunek 2C). Zamiast tego dodaj roztwór, unosząc się nad dnem studzienki na wióry lub stykając się lub przybliżając plastikowe krawędzie studzienki na wióry. Aby łatwo wyciągnąć cały roztwór, lekko przechyl wiór, aby roztwór mógł zebrać się po jednej stronie wióra i wyjmij go z górnej części połączonego roztworu lub użyj chusteczki antystatycznej, aby lekko przetrzeć obszary, w których nadal znajduje się roztwór. Nie transportuj chipa, trzymając go dobrze lub kołki chipa (Rysunek 2C). Studzienka na wióry może pomieścić około 4 ml roztworu. W kolejnych krokach należy dobrze napełnić chip około 2 ml roztworu, jeśli nie określono inaczej.
    1. Przed rozpoczęciem przygotowania wiórów należy wyznaczyć pipety transferowe do różnych zadań. Oznacz jedną pipetę transferową do etanolu, jedną do odpadów, drugą do aCSF, a jeszcze inne do pozostałych roztworów, aby zapobiec niezamierzonemu mieszaniu.
    2. Napełnij studzienkę chipa MEA 190-procentowym etanolem, tak aby dno studzienki na wióry było całkowicie zakryte (Rysunek 3). Pozostaw etanol na 30-60 s, a następnie usuń go pipetą.
    3. Napełnij studzienkę chipa MEA płynem CSF i usuń go pipetą, aby wypłukać resztki etanolu z dołka chipa. Dodać i usunąć aCSF z dołka chipowego trzy razy, używając wcześniej wyznaczonych pipet na odpady i aCSF. Po trzykrotnym dokładnym umyciu frytki dodaj aCSF i odstaw na co najmniej 30 s.
      UWAGA: Elektrody rejestrujące wykazują najmniejszy poziom szumów pochodzących z oddziaływań hydrofobowych, gdy aCSF pozostaje w komorze przez co najmniej 45 minut po spłukaniu etanolem i aCSF.
    4. Przed zadokowaniem chipa MEA zwilż antystatyczną chusteczkę etanolem o odporności 190 i użyj jej do wytarcia pinów chipa (Rysunek 2C).
    5. Delikatnie wsuń chip MEA na platformę MEA i włącz mechanizm dokujący, aby zablokować chip na miejscu.
    6. Sprawdź, czy na elektrodach rejestrujących i referencyjnych nie ma pęcherzyków (Rysunek 2C). Jeśli obecne są bąbelki, weź czysty pędzel i delikatnie przeciągnij po elektrodach, aby je usunąć.
    7. Sprawdź chip pod kątem szumów za pomocą oprogramowania CMOS-HD-MEA34 i wizualnie zeskanuj mapę fałszywych kolorów w poszukiwaniu pęcherzyków, niebiologicznych oscylacji lub skoków spowodowanych zakłóceniami elektrycznymi. Odpowiednio uziemić system MEA, aby zniwelować napotkany hałas.
      UWAGA: Konfiguracja uziemienia będzie zależeć od środowiska nagrywania. Na potrzeby eksperymentów w tym protokole platforma MEA i system perfuzyjny zostały uziemione.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schematy konfiguracji i technologii. (A) Diagram wyboru ostrych wycinków mózgu myszy użytych w eksperymencie wyróżnionym przez ten protokół. (1) Region hipokampa (2) Obszar kory nowej. (B) Właściwe umieszczenie ostrego wycinka mózgu myszy i harfy na matrycy mikroelektrod (MEA). (C) Anatomia chipa 3Brain Accura CMOS-HD-MEA. (D) Właściwa konfiguracja wlotów i wylotów perfuzji. Wejście powinno znajdować się głęboko w studzience chipa, podczas gdy wyjście powinno znajdować się po przeciwnej stronie wlotu w górnej części studzienki chipa, aby zagwarantować stały przepływ świeżego, natlenionego aCSF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Schemat ideowy przygotowania i rozmieszczenia chipów do eksperymentów z plastrami mózgu. (A) Raz dobrze wypłucz chip etanolem, a następnie trzy razy CSF. (B) Przetrzyj kołki etanolem za pomocą chusteczki antystatycznej. (C) Zadokuj chip. (D) Umieść wycinek mózgu na elektrodach. (E) Umieść harfę na wycinku mózgu (zobacz Rysunek 2, aby uzyskać wskazówki dotyczące prawidłowego rozmieszczenia). (F) Przetrzyj róg dołka elektrod rejestrujących w pobliżu wycinka mózgu skręconą antystatyczną chusteczką. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Eksperymentowanie

  1. Umieszczanie wycinka mózgu
    1. Umieść platynową harfę w łodzi do ważenia (lub innej czystej powierzchni) w pobliżu platformy MEA. Przykryj harfę około 3 ml aCSF, aby zmniejszyć jej tendencje hydrofobowe.
    2. Użyj nożyczek, aby usunąć cienką końcówkę pipety transferowej. Odetnij jedną trzecią, około 1,5 cala, końcówki pipety.
      UWAGA: Ta zmodyfikowana pipeta nie uciska ani nie uszkadza wycinka mózgu podczas pobierania i transportu.
    3. Pobrać wycinek mózgu z komory na plasterki za pomocą zmodyfikowanej pipety. Delikatnie dozuj plasterek mózgu i dowolny roztwór z pipety do dołka na wióry. Aby prawidłowo ustawić plasterek, delikatnie wypuść więcej płynu mózgowo-rdzeniowego z pipety transferowej, aby manipulować pozycją wycinka mózgu lub użyj miękkiego pędzla, aby wytworzyć prąd w roztworze, który popycha wycinek mózgu na elektrody rejestrujące. Ogranicz kontakt z elektrodami rejestrującymi lub plasterkiem mózgu, aby zminimalizować uszkodzenia.
    4. Za pomocą kleszczy delikatnie umieść harfę na wycinku mózgu nitkami w dół, aby docisnąć plasterek do elektrod nagrywających. Unikaj kontaktu układu elektrod z harfą. Ustaw harfę tak, aby strona bez ramki była skierowana w stronę igły dopływowej, a rama harfy nie stykała się z żadną z elektrod nagrywających (Rysunek 2C, D).
    5. Weź pipetę do wyrzucenia i usuń nadmiar płynu mózgowo-rdzeniowego. Weź chusteczkę antystatyczną, przekręć róg, aby utworzyć końcówkę, i użyj jej, aby wchłonąć pozostały CSF otaczający elektrody nagrywające bez dotykania elektrod nagrywających, wycinka mózgu lub harfy (Rysunek 2).
    6. Używając przeznaczonej do tego pipety aCSF, szybko dodaj tyle karbonogenowanego aCSF, aby pokryć wycinek mózgu, około 2 ml.
    7. Powtórz kroki 4.1.5 i 4.1.6 jeszcze dwa razy.
    8. Napełnij studzienkę karbogenicznym aCSF, aż studzienka będzie wypełniona w około 3/4, około 3 ml.
    9. Zrób zdjęcie wycinka mózgu na chipie MEA za pomocą mikroskopu lub aparatu. Upewnij się, że zdjęcie ma wystarczająco wysoką rozdzielczość, aby zobaczyć granice matrycy elektrod rejestrujących i anatomię wycinka mózgu.
  2. Przeprowadzanie eksperymentu
    1. Obsługa systemu perfuzyjnego
      1. Umieścić rurki doprowadzające i odpływowe w zlewce wypełnionej CSF, a igły doprowadzające i odpływowe do studzienki na wióry. Umieść igłę dopływową blisko dna studzienki chipowej, tuż poza elektrodami rejestrującymi. Umieść igłę odpływową blisko górnej części dołka chipa w kierunku krawędzi, tak aby ciecz uniosła się prawie do brzegu dołka chipa, około 4 ml, a plasterek jest zanurzony przez cały eksperyment (Rysunek 2D).
      2. Ustaw dopływ perfuzji na 5 ml/min, a odpływ perfuzji na 7 ml/min.
        UWAGA: Zaleca się, aby szybkość wypływu przekraczała szybkość napływu, aby uniknąć przelewania się roztworu ze studzienki chipa i wytworzyć prąd roztworu nad wycinkiem mózgu.
      3. Włącz dopływ i odpływ. Wyjmij igłę dopływową z dołka chipa, aż igła zacznie wyprowadzać roztwór zamiast powietrza. Następnie umieść igłę z powrotem w jej pozycji wewnątrz chipa, jak opisano w kroku 4.2.1.1.
      4. Użyć podgrzewacza roztworu, aby utrzymać roztwór w temperaturze fizjologicznej lub zbliżonej do temperatury fizjologicznej, około 34-37 °C.
      5. Pozwól płynowi CSF przenikać przez plasterek mózgu przez 10 minut. Umożliwi to dostosowaniu wycinka do środowiska nagrywania.
      6. Po upływie 10 minut przesunąć rurkę odpływową do zlewki na odpadki. Następnie przesunąć rurkę dopływową do zlewki zawierającej roztwór prodrgawkowy. Pozostawić niedrgawkowy aCSF do wypłukania z systemu perfuzyjnego do zlewki na 10 minut.
      7. Przenieść rurkę odpływową do zlewki zawierającej roztwór prodrgawkowy.
      8. Pozwól, aby roztwór pro-drgawkowy krążył do momentu zakończenia eksperymentu.
      9. Jeśli czas zapisu wycinka przekracza 2 godziny, rozważ przygotowanie innego roztworu prodrgawkowego, aby zrównoważyć zużycie glukozy przez aktywny wycinek mózgu.
    2. Wymiana wycinków mózgu
      1. Wyłącz dopływ. Wyłącz odpływ 10-15 s później.
      2. Użyj kleszczy, aby usunąć harfę i umieścić ją na łodzi do ważenia lub innej powierzchni.
      3. Użyj zmodyfikowanej pipety, aby wyjąć i wyrzucić wycinek mózgu. Nie dotykaj elektrod odniesienia ani układu elektrod rejestrujących (Rysunek 2C).
      4. Umieścić rurkę dopływową w zlewce zawierającej niedrgawkowy roztwór płynu mózgowo-rdzeniowego. Umieścić rurkę odpływową w zlewce do odrzutów. Pozostaw igły doprowadzające i odpływowe w studzience na wióry. Uruchom system perfuzyjny na 10 minut, aby usunąć cały pozostały roztwór prodrgawkowy z dołka na wióry i systemu perfuzyjnego. Rozpocznij proces eksperymentowania ponownie z nowym wycinkiem mózgu (zaczynając od kroku 4.1).
  3. Zakończenie eksperymentu
    1. Czyszczenie platformy
      1. Usuń odpowiednio harfę, plasterek mózgu i roztwór ze studzienki.
      2. Odłącz chip MEA, umieść go na czystej powierzchni i dobrze napełnij chip wodą dejonizowaną.
      3. Wyrzuć wodę dejonizowaną, aby usunąć wszelkie sole pozostałe z roztworów aCSF.
      4. Za pomocą pipety transferowej dobrze napełnij wiór roztworem detergentu. Umieść końcówkę pipety transferowej w studzience na chip i skieruj ją na elektrody rejestrujące. Szybko i wielokrotnie wyciskaj i uwalniaj detergent do pipety transferowej, aby energicznie myć detergent na elektrodach nagrywających przez 1 minutę. Pozostaw detergent na 5-10 minut.
      5. Usuń detergent, a następnie dobrze spłucz wiór 4-6 razy wodą dejonizowaną, aby usunąć roztwór detergentu i wszelkie pozostałe substancje rozpuszczone.
      6. Usuń całą wodę z dołka na wiór, a następnie umieść antystatyczną chusteczkę na chipie MEA i pozostaw na noc, aby wiór dobrze wyschł.
      7. Umieść łódkę wagową lub inną wodoszczelną płytę na platformie rejestrującej MEA, na której wcześniej spoczywał chip MEA. Umieść harfę na środku talerza i umieść igły dopływu i odpływu po obu stronach harfy.
      8. Oczyść system perfuzyjny i harfę, wysyłając odpowiednio 50 ml wody, 50 ml 140-procentowego etanolu i 200 ml wody przez rurkę do zlewki jednorazowej.
        UWAGA: W tym czasie prędkości perfuzji można zwiększyć, aby skrócić czas czyszczenia, ale prędkość odpływu musi zawsze przekraczać prędkość dopływu, aby uniknąć zalania.
      9. Oczyść kamienie karbogenu, umieszczając je w zlewce z wodą destylowaną i wysyłając karbogen przez rurkę przez 5 minut. Odstaw je na noc na suchą, czystą powierzchnię i przykryj, aby uniknąć gromadzenia się kurzu.

5. Analiza danych

UWAGA: Istnieje wiele pakietów analitycznych używanych do analizy danych elektrofizjologicznych generowanych przez CMOS-HD-MEAs, w tym BrainWave od 3Brain, Yet Another Spike Sorter (YASS) i niestandardowe narzędzia Pythona34,35,36,37. Wyodrębniliśmy dane z formatu pliku danych BrainWave do wykorzystania na platformie Xenon LFP Analysis w celu wygenerowania danych przedstawionych w Rysunek 4 i Rysunek 5. Niestandardowy kod Matlab został użyty do analizy danych w Rysunek 6. Protokoły dla platformy Xenon LFP Analysis są publicznie dostępne10. Poniższe kroki protokołu są specyficzne dla nagrań wykonanych za pomocą Brainwave 438; W przypadku innych systemów zapoznaj się z dokumentacją pomocniczą związaną z tymi systemami34,35,36,37. Poniżej znajduje się przegląd etapów analizy podjętych w celu uzyskania danych za pomocą tego protokołu. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat eksportowania, wizualizowania i analizowania danych, w tym filmy instruktażowe i wszystkie odpowiednie pliki kodu, zobacz39.

  1. Wyeksportuj plik nagrania do analizy.
    1. Utwórz folder dla plików zapisu danych, które będą próbkowane w dół.
    2. Przytnij obraz zrobiony w kroku 4.1.9 tak, aby zawierał tylko tablicę zapisów z wycinkami mózgu.
    3. Otwórz plik ExportToHDF5-ChannelSelection.py (dostęp do tego pliku kodu można uzyskać na GitHub pod adresem xenon-lfp-analysis/code-files/3Brain-processing40), a następnie skopiuj i wklej adres URL podany w górnej części okna do przeglądarki internetowej.
    4. Wprowadź ścieżkę do pliku zapisu danych i prześlij przycięty obraz tablicy skojarzonej z nagraniem.
    5. W obszarze Wybierz kanały do eksportu użyj narzędzia do zaznaczania lasso, aby zaznaczyć regiony hipokampa i kory nowej pokazane na przyciętym obrazie tablicy.
    6. Ustaw zarówno liczbę wierszy do pominięcia, jak i liczbę kolumn do pominięcia na 2.
      UWAGA: Pliki nagrań są często duże; Jeśli jest to odpowiednie dla żądanej analizy, wyeksportowane dane mogą zostać poddane próbkowaniu w dół. Istnieją opcje próbkowania w dół przestrzennie (poprzez pomijanie rzędów i kolumn elektrod rejestrujących) i czasowo (poprzez zmniejszanie próbkowania do niższej częstotliwości próbkowania). W analizie co 2 wiersze i 2 kolumny są pomijane; Pozwala to na przestrzenne próbkowanie danych w dół bez odchylania do niektórych kanałów. Każdy kanał jest na tyle daleko od siebie, że różnice w aktywności między nimi mogą być znaczące; W związku z tym nie jest wykonywane uśrednianie kanałów. W przypadku pomijania rzędów i kolumn elektrod dane z niewybranych kanałów nie są uwzględniane podczas eksportowania pliku wyjściowego.
    7. Ustaw częstotliwość zmniejszania próbkowania na 300 Hz.
    8. Kliknij przycisk Eksportuj kanały, aby wygenerować plik wyboru kanałów.
      UWAGA: Oprogramowanie automatycznie zapisze plik wyboru kanału w folderze, w którym zapisany jest plik z zapisem danych.
    9. Otwórz plik ExportToHDF5-ExtractDownsample.py (znajdujący się również na GitHubie pod adresem xenon-lfp-analysis/code-files/3brain-processing40), wklej ścieżkę do folderu zawierającego plik(i) wyboru kanału i plik(i) zapisu danych, a następnie naciśnij enter na klawiaturze, aby wygenerować wersję pliku zapisu danych z próbkowaniem w dół.
  2. Korzystanie z platformy analitycznej
    1. W wierszu poleceń komputera wpisz run_lfp_analysis i naciśnij Enter, aby otworzyć platformę analizy.
    2. Wprowadź ścieżki do pliku obrazu i pliku nagrania z próbkowaniem w dół, a następnie kliknij przycisk Prześlij.
    3. W obszarze Wybierz zakres czasu do analizy wybierz całe nagranie.
    4. W obszarze Wybierz kanały dla wykresów wyróżnij hipokamp jako Grupę-1, a korę nową jako Grupę-2.
    5. W obszarze Raster kanału ustaw wartość Threshold (Próg) na 0,06 mV, a pole Time Duration (Czas trwania) na 0,02 s.
    6. Kliknij przycisk Zastosuj ustawienia i Generuj raster.
    7. Wykres rastrowy służy do eksplorowania różnych kanałów, które pokazują interesujące wzorce aktywności.
      UWAGA: Zobacz Rysunek 4, aby zapoznać się z przykładami wysokiej jakości aktywności podobnej do napadu (Rysunek 4A-D) w porównaniu z aktywnością suboptymalną (Rysunek 4E-F).

figure-protocol-4
Rysunek 4: Przykład ewolucji aktywności padaczkowej z paradygmatów 0 Mg2+ i 4-AP. (A) Przykładowy wykres rastrowy z zastosowania aCSF z 0 Mg2+ przez około 40 minut. (B) Przykładowe ślady elektrofizjologiczne pobrane z kory nowej (niebieski) i hipokampa (czerwony) wykazujący aktywność padaczkową z paradygmatu 0 Mg2+. (C) Przykładowy wykres rastrowy z aplikacji 100 mM 4-AP w ciągu około 40 min. (D) Przykładowe ślady elektrofizjologiczne pobrane z kory nowej (fioletowy) i hipokampa (zielony) wykazujące aktywność padaczkową po zastosowaniu 4-AP. (E) Przykładowy wykres rastrowy z zastosowania aCSF o 0 Mg2+ przez około 40 minut wykazujące aktywność rozrywającą, w przeciwieństwie do aktywności podobnej do napadowej, jak stwierdzono w innych reprezentatywnych śladach. (F) Przykładowe ślady elektrofizjologiczne pobrane z kory nowej (ciemnofioletowy) i hipokampa (rdza) wykazujące nieoptymalną aktywność z paradygmatu 0 Mg2+ przeznaczone do porównania z jakością aktywności podobnej do napadu stwierdzonej w B i D. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Reprezentatywne wyniki wyładowań padaczkowych zarówno z paradygmatu 0 Mg2+, jak i 4-AP. (A) Przykładowe wykresy typowego zdarzenia podobnego do napadu korowego nowego wywołanego przez paradygmat 0 Mg2+, w tym (Ai) spektrogram ze zdarzenia podobnego do napadu, (Aii) powiązany ślad elektrofizjologiczny, (Aiii) filtr górnoprzepustowy 80 Hz zastosowany do śladu z Aii, (Aiiii) i powiększony fragment śladu z Aii. (B) Przykładowe wykresy typowego wybuchu padaczkowego hipokampa wywołanego paradygmatem 0 Mg2+, w tym (Bi) spektrogram wybuchu padaczkowego, (Bii) związany ślad elektrofizjologiczny, (Biii) filtr górnoprzepustowy 80 Hz zastosowany do śladu z Bii, (Biiii) i powiększony wycinek śladu z Bii (C) Przykładowe wykresy typowego zdarzenia przypominającego napad podobny do napadu kory nowej wywołanego przez paradygmat 4-AP, w tym (Ci) spektrogram aktywności padaczkowej, (Cii) powiązany ślad elektrofizjologiczny, (Ciii) filtr górnoprzepustowy 80 Hz zastosowany do śladu z Cii, (Ciiii) i powiększony przekrój śladu z Cii (D) Przykładowe wykresy wybuchu padaczkowca w hipokampie w paradygmacie 4-AP, w tym (Di) spektrogram aktywności padaczkowej, (Dii) związany z nim ślad elektrofizjologiczny, (Diii) filtr górnoprzepustowy 80 Hz nałożony na ślad z Dii, (Diiii) i powiększony wycinek śladu z Dii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-6
Rysunek 6: Porównanie procentu mocy wyjściowej w różnych pasmach paradygmatu i regionu mózgu podczas stereotypowych wyładowań padaczkowych. (A) Moc podczas wyładowań padaczkowych była znacząco różna między paradygmatami i regionami mózgu dla większości pasm częstotliwości (2-kierunkowa ANOVA z testem Tukeya, *P < 0,05, **P < 0,001, ***P < 0,0001). Środkowa linia dla każdego pola reprezentuje średnią, granice pola ±1 błąd standardowy średniej (SEM), a najbardziej zewnętrzne linie ±2 SEM. (B) Zarówno paradygmaty, jak i regiony mózgu wykazywały ograniczoną moc w pasmach związanych z aktywnością o wysokiej częstotliwości powyżej 150 Hz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak to jest standardem przy wizualizacji aktywności z wielu kanałów1,4,5,10, uważamy, że korzystne jest najpierw wygenerowanie wykresu rastrowego danych, które pozyskujemy za pomocą CMOS-HD-MEA (Rysunek 4A,C,E). Ten wykres może stworzyć widok z lotu ptaka na aktywność we wszystkich kanałach rejestrujących w każdym wycinku mózgu, wyświetlając każdy kanał na osi y, a czas na osi x. Na tym wykresie rastrowym każdy punkt sygnału reprezentuje kanał, który przekroczył ustawiony próg napięcia LFP (patrz krok 5.2.6 i poprzednio opublikowany work10). Takie wykresy rastrowe wskazują, kiedy i gdzie zachodzi aktywność elektrofizjologiczna w przestrzeni i czasie (Rysunek 4A,C,E). Wizualizacja danych w ten sposób pozwala użytkownikowi w pełni wykorzystać możliwości systemu CMOS-HD-MEA w zakresie rozdzielczości przestrzennej i czasowej. Reprezentatywne ślady kory nowej i hipokampa z kanałów odpowiadających wykresom rastrowym pokazują, w jaki sposób można również wizualizować określone dane LFP dla każdego kanału (Rysunek 4B, D, F). Powiększone zdarzenia wyładowań padaczkowych są wyświetlane dla różnych regionów mózgu i paradygmatów w Rysunek 5, a porównanie względnych mocy częstotliwości, które zaobserwowaliśmy na podstawie paradygmatów 0 Mg2+ i 4-AP, podsumowano w Rysunek 6. We wszystkich wyświetlanych pasmach częstotliwości (1-150 Hz) aktywność podobna do napadów zarówno w regionach hipokampa, jak i kory nowej przy obu paradygmatach była znacznie większa niż wartość wyjściowa, po odjęciu wszystkich szumów elektrycznych 60 Hz (częstotliwość AC w Ameryce Północnej) za pomocą cyfrowego filtra wycinającego.

Podczas korzystania z paradygmatu 0 Mg2+ lub 4-AP, często obserwowano silną aktywność podobną do napadu elektrograficznego w obszarach kory nowej. Regiony hipokampa wykazywały większą zmienność między wycinkami mózgu, przy czym niektóre fragmenty mózgu wykazywały aktywność podobną do napadów, a inne wykazywały krótsze (~1 s) przejściowe wyładowania (Rycina 4 i Rycina 5). Moc dla każdego nagrania została znormalizowana do 10-sekundowej "cichej" sekcji podstawowej na początku każdego nagrania, w której nie zaobserwowano żadnych wyładowań. Cała dalsza dyskusja na temat "mocy" oznacza moc widmową w porównaniu z kontrolną linią bazową w próbie. Stwierdzono, że aktywność kory nowej jest silniejsza w wielu pasmach częstotliwości w paradygmacie 0 Mg2+ w porównaniu z paradygmatem 4-AP. Dotyczyło to pasm częstotliwości delta (1-4 Hz), theta (4-8 Hz), niskiej gamma (30-60 Hz) i wysokiej gamma (60-150 Hz) (Rysunek 6). Ponadto aktywność hipokampa w paradygmacie 0 Mg2+ wykazała wyższą moc w pasmach częstotliwości wysokiego pasma gamma (60-150 Hz) w porównaniu z korą nową w paradygmacie 0 Mg2+, a także w porównaniu z obydwoma regionami mózgu testowanymi w paradygmacie 4-AP (Ryc. 6). Chociaż paradygmat 4-AP wykazywał mniejszą moc w większości pasm częstotliwości w naszych badaniach, w porównaniu z warunkami 0 Mg2+, próbki hipokampa 4-AP wykazywały tendencję do wykazywania bardziej ogólnych wyładowań padaczkowych (Rysunek 4D). Nie zaobserwowaliśmy żadnej różnicy między regionami mózgu lub paradygmatami podczas analizy aktywności o wysokiej częstotliwości (Rysunek 6B). Jest to prawdopodobne, ponieważ nagrania są wykonywane na dwuwymiarowym, niepenetrującym chipie rejestrującym, co oznacza, że aktywność o wysokiej częstotliwości może nie zostać wychwycona ze względu na odległość między neuronami wytwarzającymi aktywność a miejscami rejestracji elektrod. Podsumowując, przedstawione tutaj wyniki sugerują, że przy użyciu systemów CMOS-HD-MEA z układami 2D CMOS-MEA, generalnie osiąga się większą moc ogólną podczas wyładowań padaczkowych przy użyciu paradygmatu 0 Mg2+, gdzie dane o jakości mogą być rejestrowane do wysokich pasm gamma (od 1 do 150 Hz). Ponadto przedstawione tutaj dane sugerują, że model 4-AP może nie być dobrym wyborem dla tego systemu, jeśli ktoś chce badać informacje z pasm gamma za pomocą tego protokołu. Dostarcza jednak bogatych danych w niższych pasmach mocy, jednocześnie wyświetlając wiele wyładowań padaczkowych. Co ważne, oba modele będą wykazywać wysokiej jakości aktywność podobną do napadu padaczkowego z powyższym protokołem.

Różnice w modelach napadów prawdopodobnie skutkują charakterystycznie unikalnymi wzorcami indukowanej aktywności podobnej do napadu, opartymi na mechanizmach komórkowych tych paradygmatów i ze względu na mikroanatomię regionu mózgu41. Na przykład, 4-AP blokuje pewne klasy kanałów K+ bramkowanych napięciem (głównie rodzinę Kv3), wydłużając czas pobudliwości neuronów i powodując początek aktywności padaczkowej w ciągu kilku minut od ekspozycji w obrębie hipokampa42,43,44,45,46. Jednak kora nowa zazwyczaj ma znacznie opóźniony początek aktywności padaczkowej niż hipokamp po wystawieniu na działanie 4-AP41. Z drugiej strony, paradygmat 0 Mg2+ indukuje aktywność padaczkową głównie poprzez wypłukiwanie bloku Mg2+ receptorów NMDA w neuronach glutaminergicznym, co skutkuje wczesną aktywnością padaczkowatą kory nowej47,48,49,50. Chociaż w wielu z wyróżnionych grup istniały znaczące różnice między regionami mózgu i paradygmatami, pozostały również pewne kluczowe podobieństwa między paradygmatami a regionami mózgu. Moc zarówno w pasmach częstotliwości alfa, jak i beta była porównywalna we wszystkich regionach mózgu i paradygmatach, a w regionach hipokampa paradygmaty wykazały podobną wydajność w paśmie delta (Ryc. 6). Dodatkowo, zgodnie z oczekiwaniami, ogólny wzrost mocy w porównaniu z wartością wyjściową dla wszystkich częstotliwości (1-150 Hz) zaobserwowano podczas aktywności padaczkowej (Rysunek 5 i Rysunek 6). Ostatnią godną uwagi obserwacją obszarów kory nowej podczas ekspozycji na 4-AP był prążkowany wzór obserwowany na spektrogramach przedstawiający większą aktywność dla wyższych częstotliwości podczas początku ictal, po którym następował stopniowy spadek częstotliwości w miarę postępu aktywności (Figura 5C), co może sugerować wysoką synchronizację międzyneuronalną podczas początku ictal.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten zawiera szczegółowe wytyczne związane z leczeniem ostrych wycinków mózgu, które dotyczą typowych problemów, z jakimi borykają się użytkownicy CMOS-HD-MEA, a mianowicie powstawania hałasu pod wycinkiem mózgu i utrzymywania zdrowego środowiska dla wycinka mózgu. Powstawanie szumu pod wycinkiem występuje, gdy wycinek nie jest prawidłowo przylegający do tablicy; Jeśli wycinek mózgu nie jest odpowiednio przylegający, pod wycinkiem mogą tworzyć się kieszenie powietrzne, co powoduje hałas. Spowoduje to brak możliwości pozyskania danych. Aby złagodzić te wyzwania, protokół kładzie nacisk na dwa kluczowe kroki: po pierwsze, zapewnienie właściwej orientacji harfy podczas umieszczania, aby zapobiec przepychaniu się przez perfuzję napływową (krok 4.1.4), a po drugie, użycie chusteczki antystatycznej do usunięcia nadmiaru aCSF wokół elektrod, promując w ten sposób skuteczną przyczepność plastrów (kroki 4.1.5-4.1.7). Innym częstym problemem poruszonym w protokole jest hydrofobowość chipów, która może prowadzić do tworzenia się pęcherzyków i powodować szumy podczas nagrań. W celu złagodzenia tych problemów zaleca się takie kroki, jak uzdatnianie etanolu, a następnie płukanie wodą dejonizowaną (kroki 3.1.2, 3.1.3 i 3.1.6). Jeśli jednak problem będzie się powtarzał, można podjąć dodatkowe kroki. Napełnij dobrze chip 140-procentowym etanolem i użyj pędzla, aby delikatnie szczotkować tablicę przez 30 s do 60 s. Usuń etanol i dobrze wypłucz wiór trzy razy wodą dejonizowaną. Następnie napełnij studzienkę plikiem CSF i kontynuuj protokół w kroku 4.

Utrzymanie zdrowego środowiska dla wycinka mózgu jest niezbędne i jest zarządzane poprzez właściwe umieszczenie igieł dopływu i odpływu oraz szybkość przepływu systemu perfuzyjnego (krok 4.2.1). Konieczne jest odpowiednie natlenienie plastra i znalezienie najskuteczniejszej szybkości perfuzji23,51. Ze względu na te problemy, komory interfejsu są powszechnie używane do nagrań ostrych wycinków mózgu i zapewniają stabilniejsze natlenienie. Jednak doniesiono, że nagrywanie z komorami interfejsu kompresuje przestrzeń zewnątrzkomórkową między neuronami, co może zmienić fizjologię wycinka w czasie 24,52,53. Dynamika napięcia powierzchniowego wynikająca z tej zmienionej fizjologii skutkuje wyższą podstawową wrażliwością elektryczną neuronów54. Ta dodatkowa pobudliwość zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzeń podobnych do napadów padaczkowych i innych LFP będących przedmiotem zainteresowania. Dla porównania, komory zanurzeniowe, z którymi współpracuje większość platform CMOS-HD-MEA, mogą wydajniej dostarczać leki i glukozę do warstwy23,51. Aby utrzymać zdrowe środowisko dla wycinka podczas sesji nagraniowej, która trwałaby ponad 2 godziny z platformami CMOS-HD-MEA, korzystne jest przygotowanie innego roztworu prodrgawkowego (krok 4.2.1.9). Zapewni to, że plasterek będzie miał wystarczającą ilość glukozy, aby kontynuować aktywność.

Brak rozdzielczości przestrzennej może być poważnym ograniczeniem w elektrofizjologii23,55. Na przykład zaciskanie łat jest techniką często stosowaną w elektrofizjologii, która może dostarczyć bardzo szczegółowych informacji na temat tego, jak zachowuje się pojedyncza komórka podczas aktywności sieciowej; Jednak jednym z ograniczeń zaciskania krosek jest to, że nagrywanie jest wykonywane z jednej komórki i domyślnie z jednej lokalizacji. Patch-clamping może być wykorzystany do badania aktywności sieciowej, ale oferuje raczej ograniczony przestrzenny obraz aktywności sieci41,56. Niektóre techniki obrazowania zapewniają szerokie przestrzenne szczegóły aktywności neuronalnej, takie jak genetycznie kodowane bioczujniki fluorescencyjne; Odbywa się to jednak kosztem czasowej rezolucji 57,58,59. Podejścia multimodalne, takie jak jedno- lub wielokanałowe zapisy elektrodowe, można połączyć z obrazowaniem wapnia w celu uzyskania większej rozdzielczości czasoprzestrzennej; Rozdzielczość przestrzenna zapisu elektrofizjologicznego jest jednak nadal ograniczona do kilku lokalizacji60,61. Przy prawidłowym zastosowaniu technologia CMOS-HD-MEA pozwala użytkownikom przezwyciężyć te ograniczenia poprzez nagrywanie z dużą gęstością przestrzenną (elektrody są zwykle oddalone od siebie o 20-200 μm) z wielu obszarów mózgu jednocześnie (ilustracja 4). Dane CMOS-HD-MEA mogą pozwolić naukowcom na rozróżnienie i scharakteryzowanie wzorców rozprzestrzeniania się aktywności w całym wycinku mózgu z większą szczegółowością niż większość innych technik rejestracji 10,62,63. Chociaż technologia CMOS-HD-MEA wykazuje doskonałą zdolność mapowania przestrzennego z dużą szczegółowością czasową64, istnieją ograniczenia, takie jak niemożność niezawodnego nagrywania z pojedynczych komórek za pomocą wycinków korowych ze względu na zastosowanie niepenetrujących matryc 2D oraz niemożność wykorzystania do eksperymentów in vivo. Systemy CMOS-HD-MEA zazwyczaj rejestrują tylko lokalne potencjały pola z wycinków kory mózgowej; Mogą jednak wychwytywać zewnątrzkomórkowe potencjały czynnościowe na niektórych kanałach za pomocą wysokiej jakości preparatów plastrowych, chociaż ta zdolność może być zawodna. Aktywność jednostek jednokomórkowych można badać na nagranych kanałach z systemu CMOS-HD-MEA za pomocą filtra górnoprzepustowego (~50 Hz górnoprzepustowego) w połączeniu z oprogramowaniem do sortowania szczytów 65,66,67. Warto podkreślić, że możliwe jest połączenie zapisów mikroelektrodowych z systemami CMOS-HD-MEA w celu uzyskania informacji o pojedynczej komórce z kilku lokalizacji, nałożonych na bogate informacje CMOS-HD-MEA5. Obecna metoda z niepenetrującymi chipami 2D jest ograniczona trudnościami w wykrywaniu aktywności o wyższej częstotliwości (150-500 Hz) w korowych obszarach mózgu. Jest to prawdopodobnie spowodowane odległością między neuronami wytwarzającymi aktywność a elektrodami rejestrującymi (ryc. 6B). Wyzwanie to można przezwyciężyć dzięki zastosowaniu nowych penetrujących chipów 3D-CMOS-HD-MEA, które nagrywają z wnętrza wycinka mózgu, a nie tylko z jego powierzchni68.

Korzystając z powyższego protokołu, wygenerowaliśmy przykładowe dane, aby zademonstrować wysokiej jakości sygnały LFP w postaci aktywności podobnej do napadu, którą można osiągnąć za pomocą tych instrumentów (Rysunek 4 i Rysunek 5). Wykazaliśmy, że aktywność podobną do napadów można zaobserwować przy różnych paradygmatach rejestracji (w szczególności 4-AP i 0 Mg2+) przy użyciu systemów CMOS-HD-MEA pomimo idiosynkratycznych różnic między paradygmatami.

Podsumowując, protokół i przykładowe dane przedstawione za pomocą CMOS-HD-MEA stanowią mapę drogową, za pomocą której można gromadzić przestrzenne i czasowe dane LFP o wysokiej wierności. Przyszłe zastosowania tej techniki obejmują zastosowanie tego protokołu do dodatkowych paradygmatów, które indukują aktywność padaczkową oraz integrację CMOS-HD-MEA z technikami uzupełniającymi, takimi jak obrazowanie. Badania te niewątpliwie pomogą nam w zrozumieniu zaburzeń napadowych u ludzi przy użyciu tych prostych modeli wycinków mózgu69. Na przykład, rozszerzenie tego protokołu może zapewnić wnikliwe badanie krzyżowe zachowań elektrofizjologicznych i mapowania genetycznego z różnych zwierzęcych modeli padaczki z mutacjami w klinicznie istotnych genach70. Podczas gdy skupiliśmy się na aktywności padaczkowej, inna ważna aktywność sieciowa, taka jak długoterminowe wzmocnienie, może być również badana z niespotykaną rozdzielczością przestrzenną za pomocą systemów CMOS-HD-MEA. Mamy nadzieję, że ten protokół i technologia zostaną wdrożone, aby pomóc innym w tej dziedzinie przezwyciężyć wyzwania związane z gromadzeniem danych i opracować bardziej precyzyjne metody badawcze w celu zrozumienia różnych zaburzeń neurologicznych, takich jak padaczka.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma konfliktu interesów związanego z tym badaniem.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują byłym i obecnym członkom laboratorium Parrish za ich zmiany w tym manuskrypcie. Chcielibyśmy również podziękować Alessandro Maccione z 3Brain za jego opinie na temat tej pracy. Praca ta została sfinansowana ze środków AES/EF Junior Investigator Award oraz przez Kolegium Nauk Przyrodniczych oraz Nauk Fizycznych i Matematycznych Uniwersytetu Brighama Younga.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stół warsztatowy 2DCloudrayLM04CLLD26B
4-aminopirydynaSigma-Aldrich275875
Accura Chip3BrainUkład Accura HD-MEACMOS-HD-MEA
AgarozaThermo Fisher ScientificBP160-100
Stół wibroizolacyjnyKinetic Systems91010124
Zlewka do komora na plastry, 270 mlVWR10754-772
Platforma BioCam3BrainBioCAM DupleXCMOS-HD-MEA
Oprogramowanie Brainwave3BrainWersja 4Oprogramowanie CMOS-HD-MEA
Chlorek wapniaThermo Fisher ScientificBP510-500
CarbogenAirgasX02OX95C2003102
CarbogenAirgas12005
Carbogen StonesSupelco59277
PrecyzyjnakompresjaVF-300-0Z
KomputerDellPrecission3650
uziemiające z zaciskiem krokodylkowymJWQIDIB06WGZG17W
DetergentMetrex10-4100-0000
D-GlucoseMacron Fine Chemicals4912-12
Diwodór Fosforan soduThermo Fisher ScientificBP329-500
DinoCamDino-LiteAM73915MZTL
EtanolThermo Fisher ScientificA407P-4
KleszczeFine Science Tools11980-13
Płyta grzejnaThermo Fisher ScientificSP88857200
Maszyna do loduHoshizakiF801MWH
Igły doprowadzające i odpływoweJensen GlobalJG 18-3.0X
Podgrzewacz roztworu liniowegoWarner InstrumentsSH-27B
IzofluorDechra08PB-STE22002-0122
Kim WipesThermo Fisher Scientific06-666
Magnez Mikropipety ChlorideThermo Fisher ScientificFLM33500
GilsonF144069
Mili-Q Filtr do wodyMili-QZR0Q008WW
PędzelDaler RowneyAF85 Okrągły: 0
Filtr papierowyWhatmanEW-06648-24
ParafilmAmerican National PuszkaPM996
System perfuzyjnySystem wielokanałowyPipetor PPS2
Thermo Fisher ScientificFB14955202
Platinum Harp3Brain3Brain
Chlorek potasuThermo Fisher ScientificP330-3
ŻyletkaPersonnaBP9020
WagaMetter ToledoAB204
NożyczkiSolingen92008
Komora do przechowywania plastrówNiestandardowyniestandardowy projekt drukarki 3D, dostępny na żądanie
Wodorowęglan soduMacron Fine Chemicals7412-06
Chlorek soduThermo Fisher ScientificS271-3
Skrzynka kontrolna temperaturyWarner InstrumentsTC344B
Pipety transferoweGenesee Scientific30-200
RurkaTygonB-44-3
VZ-300PrecyzyjnaVF-00-VM-NC
Łódź do ważeniaMikroskopia elektronowa Sciences70040
Wibratom TPE

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Obien, M. E. J., Frey, U. Large-scale, high-resolution microelectrode arrays for interrogation of neurons and networks. Adv Neurobiol. 22, 83-123 (2019).
  2. Schroter, M., et al. Functional imaging of brain organoids using high-density microelectrode arrays. MRS Bull. 47 (6), 530-544 (2022).
  3. Miccoli, B., et al. High-density electrical recording and impedance imaging with a multi-modal CMOS multi-electrode array chip. Front Neurosci. 13, 641(2019).
  4. Emery, B. A., Hu, X., Khanzada, S., Kempermann, G., Amin, H. High-resolution CMOS-based biosensor for assessing hippocampal circuit dynamics in experience-dependent plasticity. Biosens Bioelectron. 237, 115471(2023).
  5. Ferrea, E., et al. high-resolution electrophysiological imaging of field potentials in brain slices with microelectronic multielectrode arrays. Front Neural Circuits. 6, 80(2012).
  6. Gagliano, G., et al. Non-linear frequency dependence of neurovascular coupling in the cerebellar cortex implies vasodilation-vasoconstriction competition. Cells. 11 (6), 1047(2022).
  7. Goodchild, S. J., et al. Molecular pharmacology of selective Na(V)1.6 and dual Na(V)1.6/Na(V)1.2 channel inhibitors that suppress excitatory neuronal activity ex vivo. ACS Chem Neurosci. 15 (6), 1169-1184 (2024).
  8. Hu, X., Khanzada, S., Klutsch, D., Calegari, F., Amin, H. Implementation of biohybrid olfactory bulb on a high-density CMOS-chip to reveal large-scale spatiotemporal circuit information. Biosens Bioelectron. 198, 113834(2022).
  9. Kim, S., et al. Alteration of neural network and hippocampal slice activation through exosomes derived from 5XFAD nasal lavage fluid. Int J Mol Sci. 24 (18), 14064(2023).
  10. Mahadevan, A., Codadu, N. K., Parrish, R. R. Xenon LFP analysis platform is a novel graphical user interface for analysis of local field potential from large-scale MEA recordings. Front Neurosci. 16, 904931(2022).
  11. Medrihan, L., Ferrea, E., Greco, B., Baldelli, P., Benfenati, F. Asynchronous GABA release is a key determinant of tonic inhibition and controls neuronal excitability: A study in the synapsin II-/- mouse. Cereb Cortex. 25 (10), 3356-3368 (2015).
  12. Monteverdi, A., Di Domenico, D., D'Angelo, E., Mapelli, L. Anisotropy and frequency dependence of signal propagation in the cerebellar circuit revealed by high-density multielectrode array recordings. Biomedicines. 11 (5), 1475(2023).
  13. Obien, M. E. J., Hierlemann, A., Frey, U. Accurate signal-source localization in brain slices by means of high-density microelectrode arrays. Sci Rep. 9 (1), 788(2019).
  14. Thouta, S., et al. Pharmacological determination of the fractional block of Nav channels required to impair neuronal excitability and ex vivo seizures. Front Cell Neurosci. 16, 964691(2022).
  15. Tognolina, M., Monteverdi, A., D'Angelo, E. Discovering microcircuit secrets with multi-spot imaging and electrophysiological recordings: The example of cerebellar network dynamics. Front Cell Neurosci. 16, 805670(2022).
  16. Hierlemann, A., Frey, U., Hafizovic, S., Heer, F. Growing cells atop microelectronic chips: Interfacing electrogenic cells in vitro with CMOS-based microelectrode arrays. Proceedings of the IEEE. 99 (2), 252-284 (2011).
  17. Maccione, A., et al. Experimental investigation on spontaneously active hippocampal cultures recorded by means of high-density MEAs: Analysis of the spatial resolution effects. Front Neuroeng. 3, 4(2010).
  18. van Vliet, E., et al. Electrophysiological recording of re-aggregating brain cell cultures on multi-electrode arrays to detect acute neurotoxic effects. Neurotoxicology. 28 (6), 1136-1146 (2007).
  19. Emery, B. A., et al. Large-scale multimodal recordings on a high-density neurochip: Olfactory bulb and hippocampal networks. Annu Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc. 2022, 3111-3114 (2022).
  20. Veleanu, M., et al. Modified climbing fiber/Purkinje cell synaptic connectivity in the cerebellum of the neonatal phencyclidine model of schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (21), e2122544119(2022).
  21. Giansante, G., et al. Neuronal network activity and connectivity are impaired in a conditional knockout mouse model with PCDH19 mosaic expression. Mol Psychiatry. , (2023).
  22. Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), e51870(2014).
  23. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
  24. Hill, M. R., Greenfield, S. A. The membrane chamber: a new type of in vitro recording chamber. J Neurosci Methods. 195 (1), 15-23 (2011).
  25. Raimondo, J. V., et al. Methodological standards for in vitro models of epilepsy and epileptic seizures. A TASK1-WG4 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58 (Suppl 4), 40-52 (2017).
  26. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). J Vis Exp. (39), 2056(2010).
  27. Lin, C. H., Lee, J. K., LaBarge, M. A. Fabrication and use of microenvironment microarrays (MEArrays). J Vis Exp. (68), 4152(2012).
  28. Panuccio, G., Colombi, I., Chiappalone, M. Recording and modulation of epileptiform activity in rodent brain slices coupled to microelectrode arrays. J Vis Exp. 135, 57548(2018).
  29. Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, site-specific transfection of adherent cells with siRNA using microelectrode arrays (MEA). J Vis Exp. 67, e4415(2012).
  30. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods Mol Biol. 1183, 221-242 (2014).
  31. Papouin, T., Haydon, P. G. Obtaining acute brain slices. Bio Protoc. 8 (2), e2699(2018).
  32. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N-Methyl-D-glucamine protective recovery method. J Vis Exp. 132, 53825(2018).
  33. Van Hoeymissen, E., Philippaert, K., Vennekens, R., Vriens, J., Held, K. Horizontal hippocampal slices of the mouse brain. J Vis Exp. (163), 61753(2020).
  34. 3Brain. , Available from: https://www.3brain.com/ (2022).
  35. Bridges, D. C., Tovar, K. R., Wu, B., Hansma, P. K., Kosik, K. S. MEA Viewer: A high-performance interactive application for visualizing electrophysiological data. PLoS One. 13 (2), e0192477(2018).
  36. Hawrylycz, M., et al. Inferring cortical function in the mouse visual system through large-scale systems neuroscience. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (27), 7337-7344 (2016).
  37. Maccione, A., et al. Microelectronics, bioinformatics and neurocomputation for massive neuronal recordings in brain circuits with large scale multielectrode array probes. Brain Res Bull. 119 (Pt B), 118-126 (2015).
  38. 3Brain. , BrainWave 4 https://www.3brain.com/products/software/brainwave4 (2022).
  39. Mahadevan, A. Xenon LFP Analysis. , https://xenon-lfp-analysis.readthedocs.io/en/latest/Installation.html (2022).
  40. Mahadevan, A. xenon-lfp-analysis github. , https://github.com/MicroBrew09/xenon-lfp-analysis (2022).
  41. Codadu, N. K., et al. Divergent paths to seizure-like events. Physiol Rep. 7 (19), e14226(2019).
  42. Kirsch, G. E., Drewe, J. A. Gating-dependent mechanism of 4-aminopyridine block in two related potassium channels. J Gen Physiol. 102 (5), 797-816 (1993).
  43. Levesque, M., Salami, P., Behr, C., Avoli, M. Temporal lobe epileptiform activity following systemic administration of 4-aminopyridine in rats. Epilepsia. 54 (4), 596-604 (2013).
  44. Myers, T. L., Gonzalez, O. C., Stein, J. B., Bazhenov, M. Characterizing concentration-dependent neural dynamics of 4-Aminopyridine-induced epileptiform activity. Epilepsy J. 4 (2), 128(2018).
  45. Perreault, P., Avoli, M. Physiology and pharmacology of epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 65 (4), 771-785 (1991).
  46. Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).
  47. Chen, Y., Chad, J. E., Cannon, R. C., Wheal, H. V. Reduced Mg2+ blockade of synaptically activated N-methyl-D-aspartate receptor-channels in CA1 pyramidal neurons in kainic acid-lesioned rat hippocampus. Neuroscience. 88 (3), 727-739 (1999).
  48. Fujiwara-Tsukamoto, Y., Isomura, Y., Takada, M. Comparable GABAergic mechanisms of hippocampal seizure-like activity in posttetanic and low-Mg2+ conditions. J Neurophysiol. 95 (3), 2013-2019 (2006).
  49. Swartzwelder, H. S., Anderson, W. W., Wilson, W. A. Mechanism of electrographic seizure generation in the hippocampal slice in Mg2+-free medium: the role of GABAa inhibition. Epilepsy Res. 2 (4), 239-245 (1988).
  50. Trevelyan, A. J., Graham, R. T., Parrish, R. R., Codadu, N. K. Synergistic positive feedback mechanisms underlying seizure initiation. Epilepsy Curr. 23 (1), 38-43 (2023).
  51. Croning, M. D., Haddad, G. G. Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro. J Neurosci Methods. 81 (1-2), 103-111 (1998).
  52. Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. J Neurosci Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
  53. Huang, Y., Williams, J. C., Johnson, S. M. Brain slice on a chip: opportunities and challenges of applying microfluidic technology to intact tissues. Lab Chip. 12 (12), 2103-2117 (2012).
  54. Andrew, R. D., et al. The critical role of spreading depolarizations in early brain injury: Consensus and contention. Neurocrit Care. 37 (Suppl 1), 83-101 (2022).
  55. Devonshire, I. M., Dommett, E. J., Grandy, T. H., Halliday, A. C., Greenfield, S. A. Environmental enrichment differentially modifies specific components of sensory-evoked activity in rat barrel cortex as revealed by simultaneous electrophysiological recordings and optical imaging in vivo. Neuroscience. 170 (2), 662-669 (2010).
  56. Parrish, R. R., Codadu, N. K., Mackenzie-Gray Scott, C., Trevelyan, A. J. Feedforward inhibition ahead of ictal wavefronts is provided by both parvalbumin- and somatostatin-expressing interneurons. J Physiol. 597 (8), 2297-2314 (2019).
  57. Wang, H., Jing, M., Li, Y. Lighting up the brain: genetically encoded fluorescent sensors for imaging neurotransmitters and neuromodulators. Curr Opin Neurobiol. 50, 171-178 (2018).
  58. Yaksi, E., Jamali, A., Diaz Verdugo, C., Jurisch-Yaksi, N. Past, present and future of zebrafish in epilepsy research. FEBS J. 288 (24), 7243-7255 (2021).
  59. He, M. F., et al. Ex vivo calcium imaging for drosophila model of epilepsy. J Vis Exp. 200, 65825(2023).
  60. Driscoll, N., et al. Multimodal in vivo recording using transparent graphene microelectrodes illuminates spatiotemporal seizure dynamics at the microscale. Commun Biol. 4 (1), 136(2021).
  61. Parrish, R. R., Grady, J., Codadu, N. K., Trevelyan, A. J., Racca, C. Simultaneous profiling of activity patterns in multiple neuronal subclasses. J Neurosci Methods. 303, 16-29 (2018).
  62. Valderhaug, V. D., et al. Criticality as a measure of developing proteinopathy in engineered human neural networks. bioRxiv. , (2020).
  63. Multi-electrode array (MEASs) to investigate pathogenetic disease mechanisms and pharmacological properties in iPSC-derived neurons modelling neuropsychiatric diseases. Carleo, G., Lee, Y. -S., Secondo, A., Miceli, F., Taglialatela, M. 2022 IEEE International Conference on Metrology for Extended Reality, Artificial Intelligence and Neural Engineering (MetroXRAINE), , Rome, Italy. 667-672 (2022).
  64. Ruz, I. D., Schultz, S. R. Localising and classifying neurons from high density MEA recordings. J Neurosci Methods. 233, 115-128 (2014).
  65. Franke, F., Natora, M., Boucsein, C., Munk, M. H. J., Obermayer, K. An online spike detection and spike classification algorithm capable of instantaneous resolution of overlapping spikes. J Comput Neurosci. 29 (1-2), 127-148 (2010).
  66. Vollgraf, R., Obermayer, K. Improved optimal linear filters for the discrimination of multichannel waveform templates for spike-sorting applications. IEEE Signal Processing Letters. 13 (3), 121-124 (2006).
  67. Muller, J., et al. High-resolution CMOS MEA platform to study neurons at subcellular, cellular, and network levels. Lab Chip. 15 (13), 2767-2780 (2015).
  68. Mapelli, L., et al. implementation, and functional validation of a new generation of microneedle 3D high-density CMOS multi-electrode array for brain tissue and spheroids. bioRxiv. , (2022).
  69. Reddy, D. S., Kuruba, R. Experimental models of status epilepticus and neuronal injury for evaluation of therapeutic interventions. Int J Mol Sci. 14 (9), 18284-18318 (2013).
  70. Parrish, R. R., Trevelyan, A. J. Stress-testing the brain to understand its breaking points. J Physiol. 596 (11), 2033-2034 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

System CMOS MEAlokalne potencja y polowerejestracja elektrofizjologicznastatus epilepticusostry przekr j m zguroztw r prokonwulsyjnyparadygmat zerowej zawarto ci magnezu

Powiązane artykuły