Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie pęknięć DNA w dzielących się komórkach ludzkich za pomocą neutralnego testu komety

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67110

⸱

23 sierpnia 2024

 , 
1Department of Molecular Biosciences, University of South Florida, Tampa

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół jest przeznaczony do badania zakresu uszkodzeń DNA występujących podczas replikacji DNA. W neutralnych warunkach indukcję pęknięć DNA można łatwo ocenić w krótkim czasie. Dodatkowo protokół można dostosować do innych typów komórek i różnych odczynników stresu replikacyjnego.

Streszczenie

Replikacja DNA jest nieustannie kwestionowana przez szeroką gamę endogennych i egzogennych stresorów, które mogą uszkadzać DNA. Takie zmiany napotkane podczas duplikacji genomu mogą zatrzymać replikosomy i przekształcić widełki replikacyjne w pęknięcia dwuniciowe. Jeśli nie zostaną naprawione, te toksyczne pęknięcia DNA mogą wywołać rearanżacje chromosomów, prowadząc do zwiększonej niestabilności genomu i zwiększonego prawdopodobieństwa transformacji komórkowej. Ponadto komórki nowotworowe wykazują utrzymujący się stres replikacyjny, co sprawia, że celowanie w podatności widełek replikacyjnych w komórkach nowotworowych jest atrakcyjną strategią chemioterapii. Wysoce wszechstronną i potężną techniką badania pęknięć DNA podczas replikacji jest test kometowy. Ta technika elektroforezy żelowej niezawodnie wykrywa indukcję i naprawę pęknięć DNA na poziomie pojedynczej komórki. W niniejszym artykule przedstawiono protokół, który pozwala badaczom zmierzyć zakres uszkodzeń DNA w mitotycznie dzielących się komórkach ludzkich przy użyciu środków zatrzymujących widełki w wielu typach komórek. Połączenie tego z automatyczną oceną komet ułatwia szybką analizę i zwiększa wiarygodność w badaniu indukcji pęknięć DNA.

Wprowadzenie

Test kometa to metoda elektroforezy żelowej używana do wykrywania pęknięć DNA na poziomie pojedynczej komórki. Opiera się na zasadzie, że otwarte pęknięcia DNA migrują w warunkach elektroforetycznych, podczas gdy nienaruszone DNA pozostaje w dużej mierze statyczne. Uszkodzone DNA migruje, ponieważ pęknięcia powodują relaksację superskręconego DNA, powodując jego stopniowe przestrzenne przemieszczenie w kierunku anody w komorze elektroforetycznej, co skutkuje wyglądem podobnym do komety obserwowanym przez immunofluorescencję1,2. Zakres uszkodzenia DNA jest następnie mierzony poprzez ilościowe określenie ilości uszkodzonego DNA, które migrowało w stosunku do zwartego DNA.

Dwie najczęściej używane metody testowania komet to test komet alkalicznych (AC) i test neutralnych komet (NC). Test AC przeprowadza się w warunkach denaturacji przy użyciu roztworu o wysokim zasadowym pH, podczas gdy test NC przeprowadza się w roztworze o neutralnym pH. Zarówno testy NC, jak i AC mogą niezawodnie wykrywać pęknięcia DNA, które występują w jądrze. Jednak wersja alkaliczna jest również korzystna do wykrywania miejsc nieporażnych alkalicznie3. Oba formaty testu wymagają zastosowania warunków lizy w celu zapewnienia, że DNA jest wolne od białek przed elektroforezą.

Ten test jest prostą metodą wykrywania pęknięć DNA i oferuje kilka unikalnych zalet do określania uszkodzeń DNA komórkowego. Metoda jest stosunkowo łatwa do skonfigurowania i wymaga odczynników, które można przygotować w laboratorium lub zakupić od komercyjnych dostawców. Jako technika rozdzielczości pojedynczej komórki, test wymaga bardzo małej ilości materiału wyjściowego. Warto zauważyć, że test NC może mierzyć przerwy z wysoką czułością, według doniesień wykrywa od 50 do 10 000 pęknięć na komórkę4. O wszechstronności tej techniki świadczy szeroki zakres jej zastosowań, w tym ekotoksykologia5, biomonitoring ludzi6 oraz badania genotoksyczności7. Test może być również niezawodnie stosowany w różnych typach komórek i dostosowany do testów o wysokiej przepustowości8 oraz do oceny pęknięć w określonych regionach genomu9. W związku z tym test ten służy jako szybka i niezawodna technika badania powstawania pęknięć na poziomie pojedynczej komórki.

Proces replikacji DNA jest nieustannie kwestionowany przez kilka endogennych i egzogennych czynników stresogennych10,11. Zatrzymanie replikosomów z powodu takich zmian może powodować pęknięcia DNA i skutkować zwiększoną niestabilnością genomu. Pęknięcia DNA często pojawiają się również jako produkty pośrednie replikacji, aby ułatwić naprawę DNA12. Ponadto kilka chemioterapeutyków indukuje zależne od replikacji dwuniciowe pęknięcia (DSB), takie jak kamptotecyna (CPT)13,14,15i inhibitory PARP16,17. W związku z tym test ten służy jako potężna metodologia do badania natury zmian DNA, oceny przetwarzania widełek replikacyjnych i badania potencjału terapeutycznego czynników uszkadzających DNA. Adaptacje testu, które obejmują znakowanie nowo zsyntetyzowanego DNA za pomocą BrdU, były przydatne do badania fenotypów stresu związanego z replikacją18,19,20,21. Warto zauważyć, że test NC jest wiarygodną metodą badania indukcji pękania DNA w kontekście replikacji, jak wykazano w badaniach obejmujących charakterystykę białek widelc22,23, analiza produktów pośrednich replikacji24,25, oraz badanie konfliktów transkrypcji-replikacji w utrzymaniu genomu26,27. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół testu NC w celu ilościowego określenia pęknięć DNA podczas replikacji w komórkach ludzkich. Protokół ten może być łatwo wdrożony przez naukowców zainteresowanych oceną uszkodzeń związanych ze stresem replikacyjnym w szerokiej gamie dzielących się komórek ludzkich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół (Rysunek 1) wykorzystuje głównie przylegające linie komórek rakowych U2OS, ale można go dostosować do szerokiej gamy komórek przylegających i zawiesinowych hodowanych w hodowli tkankowej. Roztwory i użyte w tym badaniu przedstawiono w tabeli 1. Stosowane odczynniki i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Przed dniem eksperymentu umieść dostarczoną butelkę z niskotopliwą agarozą (1% niskotopliwej agarozy w PBS) w gorącej kąpieli wodnej na 5-10 minut, aby upewnić się, że agaroza całkowicie się rozpuściła.
    UWAGA: Nie podgrzewaj butelki w kuchence mikrofalowej.
  2. Po stopieniu szybko przesypać 100 μl agarozy do 1,5 ml probówek wirówkowych w zależności od potrzeb i przechowywać probówki w temperaturze 4 °C. Zestaloną agarozę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 roku.
  3. W dniu doświadczenia wyjąć wymaganą liczbę probówek wirówkowych z magazynu w temperaturze 4 °C. Rozpuść agarozę, umieszczając probówki w bloku grzewczym lub łaźni wodnej o temperaturze 42 °C.
    UWAGA: Umieść probówki w temperaturze 42 °C przed pobraniem komórek, aby upewnić się, że agaroza jest całkowicie stopiona do ponownego zawieszenia (krok 3.7).
  4. Przygotować świeży bufor do lizy i bufor TAE w dniu doświadczenia i przechowywać je odpowiednio w temperaturze pokojowej i 4 °C do czasu przygotowania do użycia. Ponadto rozmieścić 1x PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i umieścić w lodówce do użycia na etapie ponownego zawieszenia (krok 3.5).
  5. Zaznacz identyfikatory próbek na oszronionym końcu 2-dołkowych szkiełek kometarnych i przechowuj je w temperaturze pokojowej do czasu, gdy będą gotowe do użycia.

2. Przygotowanie próbek

  1. Przed dniem doświadczenia należy wysiać komórki w 6-dołkowym naczyniu i hodować je przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . W przypadku komórek U2OS wysiewano około 2-3 x 105 komórek dla każdej próbki.
    UWAGA: Numery komórek mogą wymagać dostosowania w zależności od typu komórki używanej do analiz.
  2. W dniu eksperymentu należy potraktować komórki warunkami zgodnymi z projektem eksperymentalnym. Jako kontrolę pozytywną, aby wykazać indukcję przerwania zależną od replikacji, potraktuj komórki 1 μM CPT przez 1 godzinę. CPT jest inhibitorem topoizomerazy-1, który indukuje pęknięcia dwuniciowe w sposób zależny od replikacji14.

3. Zawieszenie i liza komórek

  1. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i dwukrotnie przepłukać 1x PBS.
  2. Dodaj 300 μl trypsyny do każdej studzienki. Inkubować naczynie w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 2-3 minuty
    UWAGA: Długotrwała inkubacja w trypsynie może generować fałszywe wyniki podczas analiz komet.
  3. Do każdego dołka dodać 700 μl pożywki do hodowli komórkowych. Delikatnie zawiesić i przenieść próbki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Zliczanie komórek na tym etapie jest zalecane w celu uzyskania odpowiedniej gęstości komórek w kroku 3.6, aby zmniejszyć częstotliwość nakładania się ogonów podczas analizy.
  4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 2400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 1 ml zimnego 1x PBS.
  6. Powtórz krok 3.4 i krok 3.5 dwa razy i ponownie zawieś komórki w zimnym 1x PBS przy gęstości komórek 2 x 105 komórek na ml.
    UWAGA: Zaleca się ocenę żywotności komórek na tym etapie, aby upewnić się, że obecna jest odpowiednia liczba żywotnych komórek. Zalecana jest co najmniej 90% żywotność.
  7. Zawiesić ponownie 10 μl zawiesiny komórek w 100 μl podwielokrotności stopionej agarozy i za pomocą tej samej końcówki pipety delikatnie wymieszać i równomiernie rozprowadzić mieszaninę w jednym dołku szkiełka. W razie potrzeby powtórz ten krok dla wszystkich próbek.
    UWAGA: Unikać natychmiastowego usuwania wszystkich podwielokrotności z łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, aby zapobiec zestaleniu się agarozy. Zaleca się, aby ten etap był wykonywany w łaźni wodnej, a każda próbka jest ponownie zawieszana i rozprowadzana w sposób rozłożony w czasie. Unikaj wprowadzania pęcherzyków podczas rozprowadzania agarozy na szkiełku, ponieważ kieszenie powietrzne wpłyną na migrację warkoczy komet podczas elektroforezy (krok 4.5) i wprowadzą pęknięcia na etapie suszenia (krok 5.3)
  8. Przechowuj szkiełka w temperaturze 4 °C w ciemności przez 15-20 minut, aby upewnić się, że agaroza całkowicie zastygła (Rysunek 2A).
  9. Umieść szkiełka w słoikach Coplin i zanurz je w buforze do lizy na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  10. Jednokrotnie przepłukać szkiełka zimnym buforem TAE i zanurzyć je w zimnym buforze TAE na 30 minut w temperaturze 4 °C.

4. Elektroforeza

  1. Ustaw komorę elektroforetyczną na płaskiej powierzchni i wypoziomuj system za pomocą czterech pokręteł poziomujących na krawędziach aparatu. Włóż zimne okłady do dolnej komory, aby roztwór był zimny podczas elektroforezy.
  2. Wlej około ~850 ml zimnego buforu 1x TAE do aparatu.
  3. Wyjąć szkiełka z temperatury 4 °C i umieścić je na tacy do elektroforezy we właściwej orientacji, aby umożliwić migrację uszkodzonego DNA.
    UWAGA: Taca mieści dziesięć szkiełek 2-dołkowych. Umieść szkiełka na środku tacy, jeśli pracujesz z mniejszą liczbą próbek. Jeśli pracujesz z nieparzystą liczbą slajdów, dołącz pusty slajd, tak aby każde dołek mieścił 2 slajdy.
  4. Delikatnie umieść dostarczoną nakładkę tacy na suwaki na górze tacy, aby zakryć szkiełka.
    UWAGA: Dla poprawnego działania aparatu, objętość bufora TAE nie powinna być mniejsza niż dolna powierzchnia nakładki i nie powinna przekraczać górnej powierzchni nakładki.
  5. Po podłączeniu przewodów należy ustawić zasilanie na 21 V i wykonać elektroforezę (1 V/cm) przez 40 min.
    UWAGA: Czas elektroforezy może wymagać dostosowania w zależności od typu ogniwa używanego do analiz. Długie ogony w próbkach niepoddanych działaniu substancji wskazują na zbyt długi czas pracy. I odwrotnie, krótkie ogony w próbkach kontroli dodatniej mogą odzwierciedlać niewystarczający czas pracy.

5. Barwienie

  1. Po zakończeniu elektroforezy należy wyjąć szkiełka z aparatu i zanurzyć je w roztworze wytrącającym DNA na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Wyrzuć roztwór do wytrącania DNA i zanurz szkiełka w 70% roztworze etanolu na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Wyrzuć 70% roztwór etanolu. Wyjmij szkiełka i wysusz je w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 45 °C przez 30 minut w ciemności (Rysunek 2B).
    UWAGA: Szkiełka można pozostawić na noc w ciemnym, suchym miejscu do etapu suszenia.
  4. Inkubować studzienki ze 100 μl 1x SYBR Green roztwór przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  5. Zdekantować roztwór SYBR Green, przechylając szkiełka i usuwając nadmiar, delikatnie przecierając krawędź studzienki niestrzępiącą się chusteczką.
  6. Umieść szkiełka w szufladzie i pozostaw do wyschnięcia na 30 minut.
  7. Kontynuuj obrazowanie slajdów.

6. Obrazowanie i analizy

  1. Ustaw mikroskop do celów obrazowania.
    UWAGA: Wszystkie obrazy zostały uzyskane przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego. Zastosowano 10-krotne powiększenie z aperturą numeryczną 0,45 z czasem naświetlania 1/40s i wzmocnieniem +6dB. Wykorzystano tryb przechwytywania monochromatycznego 8-bitowego z binningiem 2 x 2 i korekcją balansu czerni.
  2. Umieść szkiełka na stoliku mikroskopu i rozpocznij obrazowanie za pomocą filtra FITC.
    UWAGA: Najpierw użyj niepoddanej działaniu substancji próbki, aby przetestować czas ekspozycji. Większość komórek nie wykazuje warkoczy komet, ponieważ DNA jest bardziej zwarte. Przełącz się na studzienkę z komórkami poddanymi działaniu CPT i zobrazuj przy użyciu tego samego czasu ekspozycji. Warkocze komety o zwiększonej długości będą obserwowane w tej próbce ze względu na migrację uszkodzonych końców DNA.
  3. Uzyskanie obrazów dla co najmniej 100 komet z próbki przy użyciu tego samego czasu naświetlania w trzech kontrpróbach technicznych.
    UWAGA: Warkocze komet na końcach szkiełek nakrywkowych mają tendencję do nierównomiernej migracji i działają jako wartości odstające w rozkładzie próby. Większość komet uchwyconych do analiz znajduje się blisko środka szkiełka nakrywkowego (Rysunek 3).
  4. Eksportuj obrazy i oceniaj komety ręcznie (za pomocą Obrazu J) lub za pomocą bezpłatnego oprogramowania do oceny komet. Komety, które są indywidualnie rozróżnialne i w pełni zawarte w polu widzenia, są wybierane do punktacji. Nakładające się na siebie lub częściowo widoczne komety nie są brane pod uwagę w dalszych analizach (Rysunek 4).
    UWAGA: Użytkownicy mogą oceniać komety na obrazie J za pomocą następującej wtyczki: https://cometbio.org/index.html. Szczegółowe informacje na temat oceny komet za pomocą oprogramowania CometScore znajdują się w Rysunek 5.
  5. Wykreśl momenty końcowe uzyskane z analiz jako wykresy pudełkowe i wąsy przedstawiające wartości 10-90 percentyla. Wykonaj testy normalności, aby określić, czy do analiz statystycznych należy stosować testy parametryczne czy nieparametryczne.
    UWAGA: W większości przypadków testy nieparametryczne stosuje się przy użyciu testu Manna-Whitneya w przypadku porównywania tylko dwóch próbek lub testu Kruskala-Wallisa z wielokrotnymi porównaniami Dunna w przypadku porównywania trzech lub więcej prób.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza indukcji pęknięć przez odczynniki wywołujące stres replikacyjny
Komórki U2OS traktowano DMSO, 4 mM hydroksymocznikiem (HU) lub 100 nM CPT przez 4 h, a następnie przeanalizowano akumulację pęknięć za pomocą testu NC (Rycina 6A). Podczas gdy CPT indukuje pęknięcia w fazie S poprzez blokowanie topoizomerazy 113, wywołane przez HU wyczerpanie pul nucleotide'ów powoduje zatrzymanie widełek replikacyjnych, które są stopniowo przekształcane w DSB...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten przedstawia test NC do oceny pęknięć DNA w komórkach ludzkich poddawanych aktywnej replikacji. Protokół jest stosunkowo prosty do wykonania, a naukowcy mogą go łatwo dostosować do warunków wysokiego pH do analiz alkalicznych8. Obejmuje on dwa krytyczne kroki, zgodnie z opisem w krokach 3.7 i 4.5. W kroku 3.7 konieczne jest równomierne rozprowadzenie stopionej agarozy wraz z komórkami w poprzek studni, aby zapobiec nakładaniu się komet podczas analizy. Upewnij się, że agregaty komórkow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium Dungrawala za ich wkład i opinie. Ta praca została sfinansowana z grantu NIH R35GM137800 dla HD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1x DPBSGibco14190144
CamptothecinSelleckchemS1288
Comet LMAgarose (LMA)R& Systemy D4250-050-02
System elektroforezy CometAssay IIR& Systemy D4250-050-ESZawiera zbiornik do elektroforezy, pokrywę bezpieczeństwa,, tacki na suwaki 2/20 dołków i nakładkę na tacę ślizgową
Oprogramowanie CometScoreTriTek
CometSlideR& Systemy D4250-050-03
DMEM, wysoka glukozaGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO FisherSciD128-4
KeyenceBZ-X810
Płodowa surowica bydlęca - PremiumBio-TechneS11150
Gibco Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaGibco25300054
GraphPad Prism 10.0GraphPad
HEK293T komórkiATCCCRL-11268
Komórki hTERT-RPE-1ATCCCRL-4000
HydroksymocznikMilipore SigmaH8627
Inhibitor PARP OlaparibSelleckchemS8096
PowerPac FisherSciFB300Q
Sterylna płytka do hodowli tkankowej poddana obróbce powierzchniowejFisherSciFB012927
SYBR Green I Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym (10 000x)FisherSciS7567
U2OS komórkiATCCHTB-96
UVP  Inkubator hybrydyzacji HB-1000FisherSciUVP95003001
Mikroskop epifluorescencyjny

Bibliografia

  1. Olive, P. L. Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids. Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).
  2. Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
  3. Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  4. Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).
  5. De Lapuente, J., et al. The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives. Front Genet. 6, 180(2015).
  6. Azqueta, A., et al. Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective. Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).
  7. Speit, G., Hartmann, A. The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage. Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).
  8. Collins, A., et al. Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols. Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).
  9. Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair. Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).
  10. Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).
  11. Cimprich, K. A., Cortez, D. Atr: An essential regulator of genome integrity. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).
  12. Cortez, D. Replication-coupled DNA repair. Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).
  13. Strumberg, D., et al. Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff. Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).
  14. Pommier, Y. Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond. Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).
  15. Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i. J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).
  16. Bryant, H. E., et al. Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  17. Helleday, T. The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings. Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).
  18. Mcglynn, A. P., et al. The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells. Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).
  19. Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay. PLoS One. 8 (8), e70391(2013).
  20. Thakar, T., et al. Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling. Nat Commun. 13 (1), 5323(2022).
  21. Vaitsiankova, A., et al. Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication. Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).
  22. Dungrawala, H., et al. Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks. Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).
  23. Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity. Cell Rep. 34 (4), 108669(2021).
  24. Lemacon, D., et al. Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells. Nat Commun. 8 (1), 860(2017).
  25. Leung, W., et al. Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms. Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).
  26. Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability. Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).
  27. Mosler, T., et al. R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability. Nat Commun. 12 (1), 7314(2021).
  28. Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair. Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).
  29. Sestili, P., Cantoni, O. Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission. Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).
  30. Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level. Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).
  31. Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).
  32. Hanada, K., et al. The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks. Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

stres replikacyjnyniestabilność genomudetekcja uszkodzeń DNAwidelce replikacyjneremodelery chromatynyjednoniciowe luki w DNApodział komórek ludzkichelektroforeza żelowa
Wykrywanie pęknięć DNA w dzielących się komórkach ludzkich za pomocą neutralnego testu komety
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.