Ten artykuł opisuje krok po kroku procedurę tworzenia modelu niedokrwienia/nawrócenia krążenia jądra w celu wytworzenia możliwego do powtórzenia modelu skrętu jądra w badaniach nad patologicznymi mechanizmami uszkodzenia niedokrwienia-nawrócenia krążenia w jądrze.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zabezpieczenie skręconego jądra: szczurczy model uszkodzenia wywołanego niedokrwieniem-reperfuzją jądra
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Urazy ischemia-reperfuzja (IR) są związane z kilkoma patologiami, w tym z uszkodzeniem jąder. Wcześniejsze modele zwierzęce jąder IR, które polegają na skręceniu szyjki nasiennej w celu osiągnięcia niedokrwienia, obarczone są wieloma trudnościami technicznymi, które powodują niemożność konsekwentnego odtworzenia modelu. Dlatego przedstawiamy prostą metodę wywoływania jądrowego IR u szczurów, która może być łatwo powtórzona.
Ta metoda polega na oddzieleniu gubernaculum od jądra, utworzeniu torebki mosznowej, skręceniu jądra o 720° w kierunku wskazówek zegara na dolnym biegunie i zakotwiczeniu jądra u podstawy moszny. Ten model skutecznie zwęża naczynia jądrowe i wywołuje niedokrwienie jądra. Po 1 godzinie niedokrwienia szyjące szwy są usuwane, a jądro odkręcane. Przewód i towarzyszące mu naczynia są sprawdzane w celu zapewnienia przepuszczalności. Po IR jądro jest pobierane i przecinane w celu oceny histopatologicznej.
Badano histologię jąder pod kątem ogniskowych zmian krwotocznych, przekrwienia naczyniowego, poszerzonej przestrzeni międzykomórkowej i infiltracji komórek zapalnych. Ponadto oznaczono markery stresu oksydacyjnego (malonodialdejd, zmniejszone glutation, katalaza i supertlenek dysmutaza), stanu zapalnego (MPO, TNF-α, IL-1β) i apoptozy (ekspresja kaspazy 3). Ta metoda zapewnia prostszy i łatwo powtarzalny model do badania patofizjologii urazu jąder IR. Co więcej, ten model otwiera okno na badanie potencjalnych środków terapeutycznych w leczeniu urazu jąder IR.
Wprowadzenie
Torsja jąder (TT) to nagła urazowo-urologiczna sytuacja, w której się skręca worek najądrza wraz z towarzyszącymi mu naczyniami, powodując niedokrwienie jądra. Charakteryzuje się silnym bólem brzucha, mdłościami i wymiotami1. Niedokrwienie, jeśli nie zostanie usunięte przez terminową detorsję, prowadzi do martwicy i utraty zainteresowanego jądra2. Jednak terminowe wdrożenie interwencji chirurgicznej poprzez odkręcenie i przywrócenie przepływu krwi do jądra powoduje uszkodzenie jądra związane z niedokrwieniem i ponownym naczynieniem (IRI), które powoduje histologiczne i biochemiczne zaburzenia jądra i jego funkcji3,4.
Zwierzęce modele TT były szeroko stosowane do badania mechanizmów IRI, które zawsze wynikają z prób zapobiegania progresji TT do martwicy5,6. Istnieją dwa modele TT, zaciskanie woreczka najądrza i skręcanie go. Oba są wykonywane w warunkach sterylnych i odpowiedniej znieczulenia. Powszechnie stosowane środki znieczulające obejmują ketaminę samą lub w połączeniu z ksylazyną7. Inne często stosowane środki znieczulające to uretan i tiopental sodu, zwykle podawany dootrzewnowo7. Mimo to, oba modele mają swoje ograniczenia.
Chociaż bezpośrednie zaciskanie tętnicy jądrowej za pomocą mikrochirurgicznych klipsów8,9 było używane jako sposób wywołania niedokrwienia na określony czas (zwykle 1 godzinę) przed indukcją ponownego naczynienia poprzez usunięcie klipsów, metoda ta nie dokładnie odwzorowuje klinicznego obrazu torsji jądra10. Ponadto, choć chirurgiczne skręcanie woreczka najądrza w celu osiągnięcia niedokrwienia11,12 jest bardziej reprezentatywne dla prezentacji klinicznej, jest obciążone wieloma trudnościami technicznymi, które nie zostały rozwiązane przez krótkie opisy spotykane w sekcji metod artykułów na ten temat.
Jedną z często spotykanych trudności technicznych było umieszczenie i zamocowanie jądra na dnie moszny, aby zapobiec jego odkręceniu podczas okresu niedokrwienia. Podczas gdy niektórzy badacze nie wspominają o zamocowywaniu jądra do ściany moszny13,14, inni polecają zamocowanie jądra do ściany moszny poprzez uszycie toniki albuginei do niej15,16,17. Opisy procesu zamocowania jądra do ściany moszny były w większości bardzo krótkie i niejasne7,18. Próby powielenia procedur opisanych w sekcjach metod poprzednich artykułów spotkały się z poważnymi trudnościami praktycznymi, takimi jak uraz jądra przez przebicie toniki albuginei i niemożność umieszczenia jądra w mosznie bez wywierania nadmiernej presji. Co więcej, z praktycznego punktu widzenia, umieszczenie jądra z powrotem w woreczku moszny po wywołaniu torsji było głównym wyzwaniem w naszych próbach chirurgicznego wywołania doświadczalnej TT. Takie trudności techniczne skutkowały brakiem możliwości skonsekwentnego odtworzenia modelu wśród różnych badaczy.
Zatem procedura opisana w niniejszym badaniu do wywołania modelu TT u szczurów identyfikuje trudności techniczne napotkane w poprzednich modelach i oferuje dla nich rozwiązania. Ten model zapewnia prostą technikę, którą łatwo jest powielić i która naśladuje ludzkie doświadczenia. Model jest zatem niezawodnym i powtarzalnym punktem wyjścia w badaniach nad patologicznymi mechanizmami wynikającymi z IRI.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Wydziału Nauk Medycznych Podstawowych, Uniwersytet Technologiczny Ladoke Akintola, Ogbomoso, Oyo State, Nigeria (ERCFBMSLAUTECH:033/05/2024). W badaniu użyto dwudziestu samców białych szczurów Wistar, w wieku 10-12 tygodni i ważących 180 ± 10 g. Szczury były aklimatyzowane przez 2 tygodnie, a następnie losowo przydzielone do grupy szamowanych (SO) lub grupy torsji/detorsji (T/D) (n = 10 szczurów w każdej grupie). Szczury SO przeszły podobną operację, jak szczury T/D, ale jądra nie zostały skręcone ani zakotwiczone, aby wywołać T/D.
1. Przygotowanie przedoperacyjne i anestezja
- Nastąpiło narażenie zwierząt (grupy SO i T/D) na nocny post przez 12 godzin przed operacją.
- W dniu operacji szczury (grupy SO i T/D) zostały znieczulone środkiem złożonym z 50 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg xylazy dootrzewnowo i potwierdzono odpowiedni poziom głębokości znieczulenia poprzez obserwację braku reakcji zwierząt na ucisk poduszeczki łapki i stymulację świetlną wąsików.
- Ogolono lewe skrotum, okolicę krocza i pachwinę u zwierząt (grupy SO i T/D) i następnie oczyszczono je metylowanym spirytusem i roztworem przeciwsepticznym povidon-jodu lub zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi dezynfekcji.
2. Wywołanie niedokrwienia jądra
- Mobilizacja jądra
- Delikatnie wywierać ucisk na brzuchu, aby przesunąć lewe jądro (zarówno z grupy SO jak i T/D) do moszny.
- Mocno chwycić lewe jądro (zarówno z grupy SO jak i T/D) i wykonać wysokie nacięcie skrotalne, o długości około 1,5 cm, aby odsłonić leżące pod nim jądro w osłonie pochwowatej jądra (TV).
- Zlokalizować dolny biegun jądra (zarówno z grupy SO jak i T/D), szczególnie ogon wyrostka jądra i wykonać małe nacięcie w osłonie pochwowatej jądra (TV) za pomocą małych nożyczek do przecinania.
- Umieścić nożyczki pod osłoną pochwowatą jądra (TV) i lekko je rozszerzyć, aby pokazać dwie krawędzie osłony pochwowatej jądra (TV), a następnie chwycić krawędzie po każdej stronie za pomocą zakrzywionych kleszczyków moskiciarskich. Odnosi się to zarówno do grupy SO jak i T/D.
UWAGA: Ten krok jest bardzo ważny, ponieważ ustanawia płaszczyznę tkankową, która umożliwi łatwe zwrócenie jądra do moszny po wywołaniu torsji. - Rozszerzyć nacięcie (zarówno z grupy SO jak i T/D) w osłonie pochwowatej jądra (TV) proksymalnie o około 0,5 cm.
- Wywierać delikatny ucisk na dolnej części brzucha, aby wypchnąć jądro (zarówno z grupy SO jak i T/D) na zewnątrz.
- Tylko dla grupy T/D zmobilizować jądro i zidentyfikować gubernaculum jądra, a następnie przeciąć je, aby oddzielić jądro od dna moszny.
UWAGA: Ten krok jest ważny, ponieważ pozwala na skręcenie jądra. Gubernaculum jest identyfikowane jako więzadło, które rozciąga się od końca ogonowego jądra do kanału pachwinowego i kończy się guzowatym rozszerzeniem19,20. - Chwycić jądro (u zwierząt z grupy T/D) na jego dolnym biegunie (gdzie znajduje się ogon wyrostka jądra) i skręcić je o 720° w kierunku wskazówek zegara, a następnie odnotować czas (oznaczając początek niedokrwienia).
- Zakotwiczenie niedokrwieniającego jądra
- Utworzyć torebkę skrotalną, trzymając skręcone jądro (u zwierząt z grupy T/D) na miejscu i przesuwając długie nożyczki do dołu wzdłuż płaszczyzny tkankowej pod osłoną pochwowatą jądra (TV) do moszny, aby utworzyć torebkę.
- Tylko dla zwierząt z grupy T/D, włożyć szyty kotwiczący, trzymając nożyczki w miejscu i wstawiając szyty kotwiczący za pomocą nici chromowej 2-0 od zewnątrz najniższego punktu torebki skrotalnej stworzonej wcześniej. Włożyć szyt do tkanki łącznej na dolnym biegunie jądra i wrócić z powrotem do torebki i na zewnątrz obok początkowego punktu wejścia.
- Zakotwiczać jądro do podstawy moszny, ciągnąc skręcone jądro (u zwierząt z grupy T/D) do moszny i delikatnie wywierając siłę ciągnąca na dwa końce szwu, a następnie mocno zawiązać dwa końce szwu na skórze moszny.
- Zamknij nacięcie skrotalne (u zwierząt z grupy SO i T/D) ciągłym szwem workowym za pomocą nici chromowej 2-0.
UWAGA: Zaleca się to dla łatwego usunięcia, gdy ma nastąpić reperfuzja.
3. Badania biochemiczne i histopatologiczne
UWAGA: Up
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aktywność XO, poziom MDA oraz aktywności SOD, katalazy i GPx w jądrach zostały zastosowane jako markery stresu oksydacyjnego. Torsja/destorcja (T/D) znacząco zwiększyła aktywność XO i poziom MDA oraz zmniejszyła aktywności SOD, katalazy i GPx w jądrach u szczurów T/D w porównaniu z szczurami przebytego zabiegu szamowego (Rysunek 1), co obrazuje rolę stresu oksydacyjnego w uszkodzeniu wywołanym T/D.
...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Niniejszy artykuł i towarzyszące mu wideo dają szczegółowy krok po kroku opis chirurgicznego wywołania TT do badania IRI jąder za pomocą podejścia zaczepowego. Metoda ta jest szczególnie przydatna, ponieważ eliminuje przedłużające się zewnętrzne wydobywanie jądra, które jest spowodowane technikami zacisku7 i jednocześnie bardziej dokładnie naśladuje kliniczne przedstawienie TT u ludzi10,12.
Gdy niedokrwienie zos...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zadeklarowania.
Podziękowania
Niniejszym wyrażamy uznanie dla pomocy pana Ojenirana, szefa jednostki audio-wizualnej Kolegium Nauk o Zdrowiu, który pomagał w filmowaniu i montażu procedury.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 cc syringes | Nie dotyczy | Nie dotyczy | na anestetyk |
| 2-0 chromic suture | Nie dotyczy | Nie dotyczy | Do zabiegu |
| Bard Parker knife handle | Nie dotyczy | Nie dotyczy | Do zabiegu |
| Curved Mosquito artery forceps | Nie dotyczy | Nie dotyczy | Do zabiegu |
| Dissecting scissors | Nie dotyczy | Nie dotyczy | Do zabiegu |
| GraphPad Prism (version 8.0.2) | |||
| Ketamine injection | Swiss Parenterals LTD Gujarat India | 2321154 | Anestetyk |
| Paracetamol injection | Shanxi Zhongbao Pharmaceuticals, China | 220637 | Środek przeciwbólowy |
| Povidone | JAWA International limited Nigeria | 135S | Płukanka antyseptyczna |
| Procaine penicillin powder | Anhui Chengshi Pharmaceutical Co Ltd China | 201906 | Do zabiegu |
| Surgical blade | Nie dotyczy | Nie dotyczy | Do zabiegu |
| Surgical gloves | Zhenjiang huayang latex products China | 210325 | |
| Stitch scissors | Nie dotyczy | Nie dotyczy | Do zabiegu |
| Toothed dissecting forceps | Nie dotyczy | Nie dotyczy | Do zabiegu |
| Xylazine injection | Bioveta Czech Republic | 396228A | Anestetyk |
| Light Microscope | Novel Microscope, China | Nie dotyczy | Do oceny histopatologicznej |
| Digital Camera | Hayear, China | Nie dotyczy | Do oceny histopatologicznej |
| TNF-α kit | Elabscience, USA | E-EL-H0109 | Do badania |
| Thermo Fischer kit (anti-mouse caspase 3 monoclonal for caspase 3 expression ) | Thermo Fischer Scientific Inc., USA | Nie dotyczy | Do immunohistologii (kaspaza 3) |
Bibliografia
- Obi, A. O., Okeke, C. J., Ugwuidu, E. I. Acute testicular torsion: A critical analysis of presentation, management, and outcome in southeast Nigeria. Niger J Clin Pract. 23 (11), 1536-1541 (2020).
- Yang, C., Song, B., Tan, J., Liu, X., Wei, G. H. Testicular torsion in children: a 20-year retrospective study in a single institution. Sci World J. 14 (11), 362-368 (2011).
- Ganjiani, V., Ahmadi, N., RaayatJahromi, A. Protective effects of Stevia rebaudiana aqueous extract on experimental unilateral testicular ischaemia/reperfusion injury in rats. Andrologia. 52 (2), e13469(2020).
- Afolabi, O., Alabi, B., Omobowale, T., Oluranti, O., Iwalewa, O. Cysteamine mitigates torsion/detorsion-induced reperfusion injury via inhibition of apoptosis, oxidative stress and inflammatory responses in experimental rat model. Andrologia. 54 (1), e14243(2022).
- Taskinen, S., Taskinen, M., Rintala, R. Testicular torsion: orchiectomy or orchiopexy. J Ped Urol. 4 (3), 210-213 (2008).
- Cost, N. G., Bush, N. C., Barber, T. D., Huang, R., Baker, L. A. Pediatric testicular torsion: demographics of national orchiopexy versus orchiectomy rates. J Urol. 185 (6S), 2459-2463 (2011).
- Akhigbe, R. E., Odetayo, A. F., Akhigbe, T. M., Hamed, M. A., Ashonibare, P. J. Pathophysiology and management of testicular ischemia/reperfusion injury: Lessons from animal models. Heliyon. 10, e27760(2024).
- Kehinde, E. O., et al. Significance of determining the point of reperfusion failure in experimental torsion of testis. Int J Urol. 12 (1), 81-89 (2005).
- Dokmeci, D., et al. Protective effect of L-carnitine on testicular ischaemia-reperfusion injury in rats: Cellular biochemistry and its modulation by active agents or disease. Cell Biochem Funct. 25 (6), 611-618 (2007).
- Ellati, R. T., Kavoussi, P. K., Turner, T. T., Lysiak, J. J. Twist and shout: a clinical and experimental review of testicular torsion. Kor J Urol. 50 (12), 1159-1167 (2009).
- Ranade, A. V., et al. Effect of vitamin E administration on histopathological changes in rat testes following torsion and detorsion. Sing Med J. 52 (10), 742-746 (2011).
- Jafari, A., Ghasemnejad-Berenji, H., Nemati, M., Ghasemnejad-Berenji, M. Topiramate: A novel protective agent against ischemia reperfusion-induced oxidative injury after testicular torsion/detorsion. Am J Em Med. 44, 257-261 (2021).
- Turner, T. T. Acute experimental testicular torsion: no effect on the contralateral testis. J Androl. 6 (1), 65-72 (1985).
- Baker, L. A., Turner, T. T. Leydig cell function after experimental testicular torsion despite loss of spermatogenesis. J Androl. 16 (1), 12-17 (1995).
- Salmasi, A. H., et al. Effect of morphine on ischemia-reperfusion injury: experimental study in testicular torsion rat model. Urology. 66 (6), 1338-1342 (2005).
- Karakaya, E., Ateş, O., Akgür, F. M., Olguner, M. Rosuvastatin protects tissue perfusion in the experimental testicular torsion model. Int Urol Nephrol. 42 (2), 357-360 (2010).
- Ikebuaso, A. D., Yama, O. E., Duru, F. I., Oyebadejo, S. A. Experimental testicular torsion in a rat model: effects of treatment with Pausinystalia macroceras on testis functions. J Repro Infertil. 13 (4), 218(2012).
- Esmaeilsani, Z., Barati, F., Mohammadi, R., Shams-Esfandabadai, N., Karimi, I. Effects of curcumin nanoparticles on the tissue oxidative stress following testicular torsion and detorsion in rat model. Iran J Vet Surg. 14 (2), 97-104 (2019).
- Samy, A., et al. The potential protective and therapeutic effects of platelet-rich plasma on ischemia/reperfusion injury following experimental torsion/detorsion of testis in the Albino rat model. Life Sci. 256, 117982(2020).
- Schumacher, J. Testis. Equine Surgery. Auer,, Stick, J. A., Saunders, J. A. W. B. , 775-810 (2006).
- Desser, R. K., et al. Guinea pig heterophil and eosinophil peroxidase. Arch Biochem Biophys. 148 (2), 452-465 (1972).
- Hp, M. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. J Biol Chem. 247, 3170-3175 (1972).
- Euler, H. V., Josephson, K. Uber catalase. IS European. J Org Chem. 452, 158-181 (1972).
- Rotruck, J. T., et al. Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science. 179 (4073), 588-590 (1973).
- Akhigbe, R. E., et al. Testicular toxicity in cisplatin-treated Wistar rats is mitigated by Daflon and associated with modulation of Nrf2/HO-1 and TLR4/NF-kB signaling. J Trace Elem Med Biol. 85, 127489(2024).
- Ricken, A. M., Hamed, M. A., Akhigbe, R. E. Histopathological evaluation of infertility: Lessons from laboratory rodents. Histol Histopathol. 39, 671-690 (2024).
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. In vivo exposure to codeine induces reproductive toxicity: role of HER2 and p53/Bcl-2 signaling pathway. Heliyon. 6 (11), e05589(2020).
- Ricken, A. M., Hamed, M. A., Akhigbe, R. E. Histopathological evaluation of infertility: Lessons from laboratory rodents. Histol Histopathol. 39, 671-690 (2024).
- Aldhabaan, S., Hudise, J. Y., ALqarny, M., Alarfaj, A. Catgut versus polypropylene sutures for transcolumellar incision closure in open rhinoplasty: a retrospective cohort study. Cureus. 8, e9769(2020).
- Afolabi, O. A., et al. Atorvastatin-mediated downregulation of VCAM-1 and XO/UA/caspase 3 signaling averts oxidative damage and apoptosis induced by ovarian ischaemia/reperfusion injury. Redox Rep. 27 (1), 212-220 (2022).
- Akhigbe, R. E., et al. Omega-3 fatty acid rescues ischaemia/perfusion-induced testicular and sperm damage via modulation of lactate transport and xanthine oxidase/uric acid signaling. Biomed Pharmacother. 142, 111975(2021).
- Wei, S. M., Yan, Z. Z., Zhou, J. Curcumin attenuate ischemia-reperfusion injury in rat testis. Fertil Steril. 91, 271-277 (2009).
- Ritchey, M. L., Bloom, D. A. Modified dartos pouch orchiopexy. Urology. 45 (1), 136-138 (1995).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
