Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych

Podsumowanie

Hodowla narządów ex vivo rogówki świń i gojenie ran nabłonkowych dostarczają ekonomicznego, etycznego, powtarzalnego i ilościowego sposobu testowania toksyczności ocznej chemikaliów. Pomagają również w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw regulacji nabłonka i naprawy tkanek oraz w ocenie terapii stosowanych w leczeniu keratopatii cukrzycowej i opóźnionego gojenia się ran.

Streszczenie

Ze względu na swoje anatomiczne i fizjologiczne podobieństwa do ludzkiego oka, oko świni służy jako solidny model do badań biomedycznych i oceny toksyczności ocznej. Opracowano system hodowli rogówki powietrzem/płynem z wykorzystaniem oczu świń, a gojenie ran nabłonkowych ex vivo wykorzystano jako krytyczny parametr w tych badaniach. Świeże rogówki świń poddano obróbce w celu hodowli narządów, z ranieniem nabłonka lub bez. Rogówki hodowano w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C w MEM, z użyciem lub bez środków testowych. Zmierzono przepuszczalność rogówki i szybkość gojenia się ran, a komórki nabłonkowe i/lub całe rogówki można przetworzyć do immunohistochemii, western blottingu i qPCR do analiz molekularnych i komórkowych. W niniejszym badaniu opisano szczegółowy protokół i przedstawiono dwa badania z wykorzystaniem tego systemu ex vivo. Dane pokazują, że hodowla narządów rogówki świń w połączeniu z gojeniem się ran nabłonkowych jest odpowiednim modelem ex vivo do testowania toksyczności chemicznej, badania keratopatii cukrzycowej i identyfikowania potencjalnych terapii.

Wprowadzenie

Podczas gdy modele komórkowe mają ograniczone populacje klonalne i nie są w stanie odtworzyć architektury organizmu in vivo, hodowla organów lub eksplantat oferują wgląd w funkcje narządów, rozwój, mechanizmy chorobowe i potencjalne terapie, zapewniając jednocześnie etyczne i fizjologiczne korzyści w porównaniu z innymi modelami eksperymentalnymi^1,2. Oprócz zmniejszenia liczby potrzebnych zwierząt, hodowla eksplantatów kontroluje i rozsądnie manipuluje warunkami otoczenia, co jest idealne do szczegółowej eksploracji czynników kontrolujących proliferację komórek, migrację, reakcję na rany i różnicowanie komórkowe w warunkach hodowli narządów^2,3. Spośród różnych tkanek/narządów, eksplantaty rogówki, w tym ludzkiej^4,5,6, były szeroko stosowane do oceny toksyczności dla oczu, podrażnienia7^,8, do badania molekularnych mechanizmów leżących u podstaw funkcji komórek macierzystych⁹ i gojenie się ran^10,11oraz do Pierwotnej jaskry otwartego kąta¹².

Rogówki świń mają kilka strukturalnych i fizjologicznych podobieństw do rogówek ludzkich, co czyni je doskonałym modelem do badania biologii i chorób ludzkiej rogówki. Strukturalnie oba mają warstwę Bowmana, 5-7 warstw komórek nabłonkowych oraz podobną krzywiznę i średnicę. Fizjologicznie są wysoce przezroczyste, mają podobny skład filmu łzowego i nawodnienie rogówki, wykazują porównywalne wzorce i funkcje unerwienia rogówki oraz podążają za podobnymi procesami gojenia się ran, co czyni je doskonałym modelem do badania biologii i chorób rogówki człowieka^13,14. Podczas gdy rogówki ludzkie i świńskie mają niewielkie różnice w ułożeniu włókien kolagenowych i zawartości wody, ich sygnalizacja immunologiczna i reakcje nie są identyczne. Te różnice stanowią wyzwanie dla xenotransplantation¹⁵. W związku z tym przy interpretacji danych doświadczalnych należy wziąć pod uwagę różnice specyficzne dla danego gatunku.

W porównaniu do ludzkich rogówek, oczy świń są łatwo dostępne jako produkty uboczne przemysłu mięsnego, co czyni je opłacalnymi i łatwo dostępnymi do badań¹⁴. Stosowanie rogówek od świń pomaga zmniejszyć zapotrzebowanie na rogówki od ludzkich dawców i minimalizuje obawy etyczne związane z testami na zwierzętach. Co więcej, dostępność wielu rogówek świń w tym samym czasie pozwala na spójne i powtarzalne eksperymenty, co ma kluczowe znaczenie dla wiarygodnych wyników badań.

System hodowli narządów rogówki u świń został początkowo użyty do zastąpienia testów na zwierzętach chemikaliów kosmetycznych i leków do oczu⁷. System ten został wykorzystany do badania gojenia się ran nabłonka rogówki i identyfikacji kilku ważnych szlaków sygnałowych, takich jak wydzielanie ektodomeny HB-EGF, stymulacja kwasem lizofosfatydowym mediatorem lipidowym i aktywacja EGFR w celu gojenia ran rogówki^16,17. Wykorzystując wysoki poziom glukozy jako czynnik patologiczny, ustalono model hiperglikemii ex vivo z opóźnionym gojeniem się ran nabłonkowych, aby naśladować ludzką keratopatię cukrzycową. Korzystając z tego modelu, wykazano, że wyrażenia równowagi IL-1β w porównaniu z IL-1Ra¹⁸ i TGFβ3 w porównaniu z TGFβ1¹⁹ są ważnymi czynnikami prawidłowego gojenia się ran w rogówce, a manipulacja tymi równowagami może być stosowana w leczeniu keratopatii cukrzycowej. W związku z tym hodowla narządów świń stanowi istotny, ekonomiczny i manipulacyjny system eksperymentalny o różnych zastosowaniach w testach toksyczności chemicznej, badaniach biomedycznych, odkrywaniu leków oraz ocenie uszkodzeń i naprawy tkanek w odpowiedzi na narażenie oczu na broń chemiczną.

W tym artykule opisano szczegółowy protokół hodowli narządów rogówki u świń, a jego zastosowania do oceny potencjalnego wpływu kropli do oczu z NLPZ (NS) na zdrowie rogówki oraz do określania szlaków sygnałowych i procesów biologicznych związanych z patogenezą keratopatii cukrzycowej.

Protokół

Ponieważ świeże rogówki wieprzowe są produktem ubocznym przemysłu spożywczego, Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt nie musiał zatwierdzać ich użycia do badań. W przeciwieństwie do ludzkich rogówek wykorzystywanych w badaniach, nie ma obaw o zagrożenie biologiczne, a niewykorzystane części oczu świni można wyrzucić jak zwykłe śmieci. Odczynniki i sprzęt używany do tego badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie do hodowli organów

1. Przed użyciem dodać penicylinę-streptomycynę do minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) jako suplementy.
2. Przygotować pożywkę hodowlaną o wysokiej zawartości glukozy, dodając 3,6 g D-glukozy do 1 litra suplementowanego MEM, który zawiera 5 mM glukozy (równej 90 mg/dl), aby osiągnąć końcowe stężenie glukozy 25 mM (równe 450 mg/dl), naśladując hiperglikemię u pacjentów z cukrzycą.
3. Przygotuj 1% agarozy w uzupełnionym MEM z 5 mM lub 25 mM glukozy, dodając 0,2 g agarozy do 20 ml MEM i podgrzewając w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści.
4. Przenieść roztwór zawierający agarozę do łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 48 °C.
5. Przed eksperymentem należy w autoklawie umieścić w autoklawie wszystkie odczynniki eksperymentalne, takie jak woda destylowana, PBS oraz sprzęt chirurgiczny: hemostat, kleszcze, trzonek skalpela, nożyczki i trepaninę, a także zlewki, ręczniki papierowe, niestrzępiące się chusteczki, rękawiczki i końcówki do pipet. Namocz silikonową formę, żyletkę i uchwyt ostrza w 70% alkoholu przez 30 minut i trzykrotnie umyj sterylnym PBS.

2. Przygotowanie gałek ocznych świni do posiewu rogówki

1. Pozyskać gałki oczne świń z lokalnej rzeźni i przetransportować je do laboratorium na lodzie w wilgotnej komorze.
   UWAGA: Oczy bydlęce mogą być również używane w podobny sposób. Jednak bydlęce oczy i rogówki różnią się od ludzkich oczu/rogówek bardziej znacząco. Na przykład rogówki ludzkie i świńskie mają 5-7 warstw komórek nabłonkowych, podczas gdy rogówki bydlęce mają około 20 warstw^13,14. Co więcej, oczy bydła są bardziej narażone na zanieczyszczenie podczas hodowli narządów rogówki; W związku z tym do analizy statystycznej potrzeba więcej oczu bydlęcych.
2. Umieścić oczy świni w 1-litrowej zlewce zawierającej wysterylizowany PBS.
   UWAGA: Gałki oczne świni są zbierane w ciągu 1 godziny po uboju i transportowane do laboratorium w ciągu około 2 godzin. Ogólnie rzecz biorąc, oczy zużyto w ciągu 4 godzin (krok 2.3).
3. Przytrzymaj gałkę oczną pęsetą i usuń tkanki zewnątrzgałkowe nożyczkami na sterylnej płytce Petriego.
4. Przepłukać gałki oczne raz wodą destylowaną i dwukrotnie PBS.
5. Przepłukać bańki oka roztworem antyseptycznym powidonu i jodu przez 10 s, a następnie trzykrotnie wysterylizować PBS.
6. Inkubować gałki oczne w PBS zawierającym 20 μg/ml gentamycyny przez 30 minut i przepłukać je dwukrotnie PBS.

3. Zranienie nabłonka

1. Przytrzymaj gałkę oczną ze sterylizowanymi, niestrzępiącymi się chusteczkami i zaznacz środek rogówki trepanacją 6 mm.
2. Delikatnie zeskrob komórki nabłonka w okręgu oznaczonym trepanacją małym skalpelem lub stępioną w rogu miękką żyletką, usuń wszystkie resztki komórek, ale pozostaw nienaruszoną błonę podstawną i oczyść obszar rany bawełnianymi wacikami.
   UWAGA: Skalpel z zebranymi komórkami nabłonka można przenieść do probówki mikrowirówkowej umieszczonej na lodzie. Komórki mogą być natychmiast poddane lizie lub przechowywane w zamrażarce o temperaturze -20 °C, aby służyły jako kontrole.

4. Posiew narządów rogówki i modelowanie hiperglikemii ex vivo

1. Wypreparować gałkę oczną, przecinając wzdłuż brzegów rogówki i twardówki skalpelem i nożyczkami, a następnie przepłukać rogówki w wysterylizowanej zlewce o pojemności 1000 ml zawierającej PBS (pH 7,4).
2. Umieść wycięte rogówki do góry nogami w sterylnej formie wykonanej z nietoksycznego płynnego silikonu do produkcji pleśni.
   UWAGA: Wlej nietoksyczny płyn silikonowy do wytwarzania form do otworów stojaka na hodowle tkankowe/probówki o pojemności 50 ml, używając dna probówki ultrawirówki o pojemności 30 ml do wykonania półokrągłej formy.
3. Wypełnić śródbłonek rogówki MEM zawierającym 1% agarozy w temperaturze 48 °C i pozostawić mieszaninę do żelowania w temperaturze pokojowej.
4. Odwróć i przenieś rogówkę do szalki o średnicy 35 mm i dodaj kroplami 2 ml MEM z czynnikiem testowym (czynnikami) testowym lub bez niego na powierzchnię środkowej rogówki, aby pokryć obszar spojówki rąbkowej, pozostawiając nabłonek wystawiony na działanie powietrza (Ryc. 1).
5. Umieścić szalki hodowlane w nawilżonym inkubatorze z 5% stężeniem_{CO2 w} temperaturze 37 °C i codziennie przez 2 dni zastępować pożywkę świeżą pożywką MEM z lub bez środka(-ów) testowego(-ych).
6. Ustal model hiperglikemii ex vivo, dodając L-glukozę do MEM, aby osiągnąć łącznie 25 mM glukozy, która jest używana do przygotowania 1% żelu agarozowego i jako pożywka hodowlana.

5. Ocena funkcji rogówki

1. Określ szybkość gojenia się ran nabłonkowych, barwiąc zranione rogówki barwieniem Richardsona20, aby zaznaczyć pozostały obszar rany i sfotografować go (ryc. 2 i ryc. 3). Określ ilościowo rozmiar rany za pomocą oprogramowania Image-J lub Photoshop (histogram).
2. Przetwarzaj rogówki do analiz histologicznych, histochemicznych i immunohistochemicznych (Rysunek 2 i Rysunek 3), osadzając je w OCT i sekcji kriostatu. Utrwal skrawki lodowatym acetonem, zabarwić barwieniem H&E lub zablokować 1% BSA przez 1 godzinę w celu barwienia TUNEL lub immunohistochemii w celu wykrycia białek i cząsteczek sygnałowych (takich jak fosforylowane Erk i ATK).
   UWAGA: Większość dostępnych na rynku przeciwciał nie została przebadana na obecność antygenów świń. Jeśli jednak przeciwciało rozpoznaje zarówno antygeny ludzkie, jak i mysie, można je najczęściej wykorzystać do wykrywania odpowiedniego antygenu świńskiego Western blot i immunohistochemii.
3. Umyj poplamione rogówki PBS i użyj trepanacji tej samej wielkości, aby oznaczyć oryginalną ranę i zeskrobać komórki nabłonka w okręgach znacznikowych.
   1. Zbierz komórki nabłonka za pomocą małego skalpela, zanurz skalpel z zebranymi komórkami w probówce wirówkowej wstępnie schłodzonej na lodzie.
   2. Przechowuj pobrane komórki w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub natychmiast je wyekstrahuj i przeprowadź lizę w celu Western blotting i/lub ELISA lub w buforze do ekstrakcji RNA do PCR (jeśli jest to wymagane)^10,16,21.

Wyniki

Operacja zaćmy jest jednym z najczęściej wykonywanych zabiegów na świecie, a krople do oczu odgrywają kluczową rolę w opiece pooperacyjnej. Stosowanie kropli do oczu po operacji zaćmy pomaga zapobiegać takim powikłaniom jak infekcje oka, stany zapalne oraz obrzęk plamki żółtej. Krople do oczu zawierające NLPZ (NS), w tym ketorolak, bromfenak i nepafenak, są powszechnie stosowane w celu łagodzenia bólu i obrzęku oka przed, w trakcie i po operacji zaćmy. Długotrwałe stosowanie tych kropli, które zawierają różne ilości kons...

Dyskusja

Hodowane rogówki bydlęce, a głównie wieprzowe, wykorzystano do oceny toksyczności chemikaliów kosmetycznych, leków na jaskrę i niesteroidowych leków przeciwzapalnych^21,26. Rogówki świń były również wykorzystywane jako model ex vivo ludzkiej keratopatii cukrzycowej. W przeciwieństwie do oczu królika, oko świni przypomina oko ludzkie anatomicznie, fizjologicznie i biomechanicznie27, stąd jest używane do ksenotrans...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki 1,7 ml	Axygen	AXYMCT175SP
Agaroza	Thermo Scientific	R0491
Bromfenac (Prolensa) 0.09%
Aparat	Canon	PowerShot A620
Naczynie do hodowli komórkowych	Corning	430165
D-glukoza	Sigma	50-99-7
Mikroskop preparacyjny	Kleszcze Zeiss	Stemi 2000c
	FisherScientific	10-316A
Hemostat	FisherScientific	13-812-14
Ketorolac (Acular) 0,45%		Kresge Clinic
Kimwipes Kimtech		34155
LL-37	Tocris	5213/1
Minimalne niezbędne podłoże (MEM)	Gibco	A1048901
Nepafenac (Ilevro) 0.1%
Penicylina-streptomycyna	Gibco	15070063
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem	Sigma	P4417
Oczy wieprzowe	Bernthal Packing Inc.
Końcówki do pipet	VWR	76322-164
Rogówki dla świń	Bernthal Packing , Inc. Frankenmuth, MI
Powidon-Jod	Waciki bawełniane Betadine
Q-Tips	Q-Tips
Żyletka	Mikroskopia elektronowa Sciences	72002-01
Uchwyt na żyletkę	Stotz
Scalpel	Bard-Parker	377112
Rękojeść skalpela	Bard-Parker	#3
Nożyczki	FisherScientific	08-951-20
Forma
Obudowa do kultywowania tkanek	Labconco	5100000
Trephine	Acu.Punch	3813775
Kąpiel wodna	VWR	1235

silikonowa