Artykuł metodologiczny

Opracowanie modelu trzody chlewnej w celu zbadania dynamicznego zachowania i przeszczepiania macicy

DOI:

10.3791/67357

⸱

20 grudnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Children's Boston, 3Plastic Surgery Research Laboratory, Department of plastic and reconstructive surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Department of Gynecology and Obstetrics, CHU de Rennes, University of Rennes, 5Division of Plastic Surgery Research, Vascularized Composite Allotransplantation Program Development, Cedars-Sinai Hospital, 6Department of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery, CHU de Rennes, University of Rennes, 7SITI Laboratory, UMR1236 INSERM, Établissement Français du Sang, University of Rennes

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegółowo opisany jest powtarzalny model macicy świni, od zabiegu chirurgicznego do rozpoczęcia perfuzji maszynowej, co pozwala na badanie zachowania macicy po przeszczepie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory przeszczep macicy jest jedyną opcją dla kobiet z całkowitą niepłodnością macicy, takich jak te z zespołem Rokitansky'ego, aby doświadczyć ciąży i urodzić. Pomimo rosnącego zainteresowania transplantacją macicy w ostatnich latach, kilka kwestii nadal wymaga dalszych badań, w tym uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne i jego wpływ na jakość przeszczepu i odrzucenie. Najnowsza literatura zwraca uwagę na częstość powikłań zakrzepowych do 20% po przeszczepieniu macicy. Ten rodzaj powikłań może wynikać z uszkodzenia komórek śródbłonka wywołanego niedotlenieniem, co często prowadzi do odrzucenia przeszczepu macicy. Niedotlenienie jest indukowane podczas statycznego przechowywania w chłodni, co pozostaje złotym standardem w konserwacji przeszczepów w przeszczepach narządów litych. Ostatnio wykazano, że dynamiczne przechowywanie za pomocą perfuzji maszynowej poprawia długoterminowe przechowywanie narządów konwencjonalnych i brzeżnych poprzez zmniejszenie uszkodzeń niedokrwiennych i niedotlenienia. W tym protokole staramy się opisać każdy krok chirurgiczny związany z pobraniem macicy świni i jej dynamicznym zachowaniem, w oparciu o obie szypułki macicy, aby umożliwić połączenie i zainicjowanie protokołu perfuzji maszynowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transplantacja macicy (UTx) znacznie się rozwinęła w ciągu ostatnich dziesięciu lat, a kilka zespołów rozpoczęło programy badań klinicznych. Do tej pory głównym wskazaniem UTx jest bezwzględna niepłodność macicy spowodowana agenezją macicy, w tym zespołem Mayera-Rokitansky'ego-Küstera-Hausera (MRKH). Zespół MRKH jest wadą wrodzoną, która występuje u jednej na 5 000 żywych urodzeń płci żeńskiej1. UTx może potencjalnie zająć się dodatkowymi przyczynami niepłodności, w tym tymi wynikającymi z histerektomii spowodowanej chorobą nowotworową, krwotokiem poporodowym, mięśniakami macicy, następstwami zakaźnymi i różnymi wadami wrodzonymi. Sugeruje to, że około 1 na 500 kobiet może kwalifikować się do UTx.

Pierwszy kliniczny UTx miał miejsce w 2000 roku w Arabii Saudyjskiej2, ale powikłania naczyniowe doprowadziły do histerektomii trzy miesiące później. Od tego czasu przeprowadzono kilka przypadków UTx, zarówno na żywych, jak i zmarłych dawcach, co dało ponad 80 żywych urodzeń3,4. Podobnie jak w przypadku transplantacji narządów litych i unaczynionych allotransplantacji kompozytowych (VCA), odrzucenie immunologiczne jest poważnym wyzwaniem w UTx. 5 Kilka czynników może prowadzić do odrzucenia przeszczepu, w tym niewydolność mikrokrążenia i zastój żylny, które mogą prowadzić do powikłań zakrzepowych. W niedawnym przeglądzie badającym unaczynienie macicy w transplantacji, Kristek i wsp. zgłosili do 15% zakrzepicy tętniczej i 5% zakrzepicy żylnej6. Dodatkowo, zimne i ciepłe niedokrwienie jest krytycznym czynnikiem, na który należy zwrócić uwagę, aby przeszczep zakończył się sukcesem, ponieważ uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (IRI) może prowadzić do dysfunkcji przeszczepu i ostrego odrzucenia7,8. Miocyty reagują na stres niedokrwienny, wytwarzając mleczan przez maksymalnie 6 h9, po czym uszkodzenie komórek mięśniowych jest nieodwracalne. Wpływ zimnego niedokrwienia na mięśniówkę macicy został udokumentowany w badaniach klinicznych, a zastosowanie wewnątrzkomórkowego roztworu University of Wisconsin podczas statycznego przechowywania w chłodni (SCS) wykazało, że poprawia konserwację dzięki lepszej odpowiedzi kurczliwej na prostaglandyny i wyższym stężeniom ATP w porównaniu z roztworem octanu Ringera10. Jednak wpływ ciepłego i zimnego niedokrwienia pozostaje słabo zbadany w UTx.

SCS pozostaje złotym standardem dla zachowania VCA, w tym macicy, oraz dla większości przeszczepów narządów stałych. Jednak w ostatnich latach znaczący postęp w systemach perfuzji maszynowej i rozwiązaniach konserwujących doprowadził do zmiany paradygmatu. Obecnie istnieją mocne dowody na to, że dynamiczna perfuzja maszynowa może poprawić i przedłużyć zachowanie zdrowych i marginalnych organów stałych11,12,13,14,15. Technika ta jest obecnie powszechnie stosowana w praktyce klinicznej w transplantacji płuc, serca, wątroby i nerek14,16,17,18. Dynamiczne zachowanie narządów wykazało wiele korzyści, w tym zminimalizowanie zimnego niedokrwienia i niedotlenienia poprzez zapewnienie ciągłego dostarczania tlenu i składników odżywczych, usuwanie toksycznych metabolitów oraz poprawę parametrów jakości i żywotności przeszczepów12,19. Opracowano wiele modalności, od hipotermii do normotermicznej perfuzji maszynowej (z nośnikami tlenu lub bez), z kilkoma dostępnymi perfuzatami, ale tylko kilka z nich zostało przetestowanych na macicy20. Aby zapewnić istotny wkład takich perspektyw badawczych, kluczowe znaczenie mają odpowiednie przedkliniczne modele chirurgiczne.

W tej pracy, subnormotermiczna perfuzja maszynowa (SNMP) jest używana jako metoda dynamicznego zachowania narządów natlenionych w temperaturze pokojowej (około 20 °C) poprzez cyrkulację perfuzatu przez pompę rolkową i natleniacz. Zastosowano model świni, który jest istotny dla badań nad UTx i konserwacją ze względu na jego podobieństwa do ludzkiego układu rozrodczego pod względem anatomii, fizjologii i wielkości naczynia21,22. Macica jest pobierana po śmierci krążeniowej, co ma znaczenie dla dawstwa po śmierci sercowej i sugeruje możliwość opóźnienia pobrania po wszystkich innych istotnych narządach litych23,24. Ponadto model ten ułatwia rozwój badań nad zachowaniem macicy w uznanych laboratoriach transplantacyjnych, koncentrujących się na innych narządach, stosując zasady "3R" 25. Celem jest opracowanie nowego modelu konserwacji opartego na szypułkach macicy i ocena jego wiarygodności w zakresie dynamicznego zachowania. Wszystkie etapy procedury są szczegółowo opisane, od histerektomii po konserwację, obejmując podkreślone kluczowe punkty dotyczące korzystania z SNMP.

Protokół opisany poniżej poprzedzał wstępny eksperyment oparty na pojedynczej pompie i systemie dopływu "Y-rurki" dla obu tętnic macicznych (Rysunek uzupełniający 1). Po 4 h-SNMP narząd zyskał ponad 50% swojej początkowej masy. Przepływ, ciśnienie, opór i zmiany masy przedstawiono na rysunku uzupełniającym 2. Pojedynczy system perfuzyjny podzielony na dwa dopływy nie pozwalał na modulację każdego natężenia przepływu do ciśnienia każdej ze stron. W tym przypadku SNMP doprowadził do znacznego obrzęku w połowie narządu (ryc. 3). System ten okazał się nieodpowiedni dla modelu macicy, częściowo dlatego, że nie powinien być uważany za model idealnie symetryczny. Dlatego w tym protokole zastosowano dwa systemy perfuzji maszynowej, po jednym dla każdej tętnicy macicznej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z Przewodnikiem Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, a protokoły zostały zatwierdzone przez Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Ogółem do pobrania macic wykorzystano 6 samic miniświnek z Jukatanu o wadze 30-40 kg, przy czym cztery macice poddano SNMP. Wszystkie zwierzęta poddano heparynizacji jedną pełną dawką (100 j.m./kg) przed eutanazją. Pobranie narządów nastąpiło pośmiertnie z mniej niż 60 minutami ciepłego niedokrwienia. Inne narządy mogły zostać pobrane od tego samego dawcy do różnych badań, zgodnie z zasadami "3Rs" 25. Szczegółowe informacje na temat wszystkich odczynników i sprzętu użytego w protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie przedoperacyjne (dzień przed zabiegiem)

  1. Przygotować roztwór perfuzatu. Do subnormotermicznej perfuzji maszynowej zastosowano rozwiązanie Steen+ zoptymalizowane pod kątem VCA26,27. Użyto jednego litra roztworu na macicę, a skład jest szczegółowo opisany w tabeli 1.
    UWAGA: Do perfuzatu dodaje się dużą ilość wodorotlenku sodu w celu uzyskania pH około 7,5-7,6. Wartość ta jest wyraźnie wysoka, ale konieczna, ponieważ pH będzie miało tendencję do spadku, gdy maszyna będzie krążyć i natleniana mieszaniną karbogenów (95% tlenu; 5% dwutlenku węgla).
  2. Skonfiguruj system perfuzji maszyny (Rysunek 1). Sprawdź, czy nie ma wycieków i pęcherzyków, gdy krąży perfuzat.

2. Pośmiertne pobranie macicy

UWAGA: Aby symulować dawstwo po śmierci sercowej i/lub pośmiertnym pobraniu, zwierzę powinno zostać poddane eutanazji zgodnie z lokalnymi wytycznymi IACUC. Wykrwawienie powinno być preferowane zamiast dożylnego wstrzyknięcia pentobarbitalu, aby uniknąć toksyczności, która mogłaby zakłócić badanie.

  1. Ułóż zwierzę poddane eutanazji w pozycji leżącej. Wyszoruj okolice brzucha i umieść sterylne zasłony.
  2. Wykonaj 10-centymetrowe środkowe nacięcie podpępowinowe za pomocą ostrza #20.
  3. Otworzyć tkankę podskórną i rozcięgno za pomocą monopolarnego skalpela elektrycznego.
    UWAGA: Należy zwrócić uwagę, aby nie uszkodzić jelit poprzez otwarcie jamy brzusznej.
  4. Odłóż na bok jelito cienkie gazą chirurgiczną i odsłoń macicę.
    UWAGA: Anatomia macicy użytego modelu jest pokazana w Rysunek 2A.
  5. Postępuj podobnie dla lewej i prawej strony w następujący sposób:
    1. Zidentyfikuj naczynia maciczne.
      UWAGA: Żyła maciczna jest umieszczona bocznie w stosunku do tętnicy macicznej (Rysunek 3).
    2. Stwórz otwór w więzadle szerokim bocznie do żyły macicy za pomocą kleszczy pod kątem prostym.
    3. Przez ten otwór włóż jedwabne szwy krawatowe 2-0, aby podwiązać naczynia jajnikowe i uwolnić macicę z otaczającej tkanki łącznej w więzadle szerokim za pomocą kauteryzacji.
    4. Podwiązać naczynia maciczno-jajnikowe za pomocą jedwabnych szwów 2-0 i usunąć jajnik i rurkę.
    5. Zeszkieletuj naczynia maciczne i dziel je jak najbliżej wewnętrznych naczyń biodrowych.
      UWAGA: Należy zwrócić uwagę na utrzymanie szypułki tak długo, jak to możliwe, aby ułatwić kaniulację i przewidzieć wycofanie szypuły po jej przecięciu.
    6. Powtórz kroki 2.5.1-2.5.5 po przeciwnej stronie.
  6. Usuń macicę, przecinając szyjkę macicy monopolarnym skalpelem elektrycznym.
    UWAGA: Używaj długiego czasu kontaktu, aby zapewnić prawidłową koagulację naczyń szyjki macicy, zapobiegając wyciekom podczas perfuzji.

3. Przygotowanie do perfuzji

  1. Na bocznym stoliku rozszerz obie tętnice maciczne za pomocą mikrochirurgicznego rozszerzacza i wprowadź angiocewnik. Zabezpiecz kaniulację jedwabnymi opaskami 3-0 (Rysunek 2B).
    UWAGA: W tym przypadku do wszystkich tętnic zastosowano angiocewnik 18 G. Należy uważać, aby nie wprowadzać cewnika zbyt głęboko, aby uniknąć selektywnej kaniulacji, ponieważ rozwidlenie jest stosunkowo bliskie. Żyły macicy nie są kaniulowane, ponieważ odpływ żylny jest wystarczający, aby światło tych naczyń było otwarte, co umożliwia łatwe pobranie. Oprócz oszczędności czasu, kaniulacja pourazowa może prowadzić do uszkodzenia naczyń krwionośnych i potencjalnie wpływać na przepływ żylny.
  2. Powoli ręcznie przepłukać obie tętnice maciczne 20 ml roztworu heparyny z każdej strony, aż wszystkie naczynia zostaną wypłukane, a odpływy będą czyste.
    UWAGA: Należy zwrócić uwagę, aby nie spłukiwać wodą pod wysokim ciśnieniem, co może prowadzić do urazów mikronaczyniowych i niewydolności perfuzji.
  3. Zważ macicę.

4. Subnormotermiczna perfuzja maszynowa

UWAGA: Dla macicy wymagane są dwa niezależne systemy perfuzji maszynowej. Każda tętnica maciczna jest podłączona do systemu perfuzyjnego składającego się z pompy rolkowej, oksygenatora, pułapki pęcherzykowej i czujnika ciśnienia. Perfuzat w zbiorniku krąży przez silikonowe rurki połączone z elementami wymienionymi powyżej, a następnie przepływa przez narząd przez tętnicę maciczną do żyły macicznej z każdej strony, skąd perfuzat wychodzi i jest uwalniany w tym samym zbiorniku.

  1. Podłącz macicę do systemów perfuzji maszyny, podłączając kaniule tętnic macicznych do rurki dopływowej (Rysunek 1).
  2. Za pomocą pompy rolkowej wyreguluj natężenie przepływu na niskie (2,5-4,0 ml/min), aby utrzymać stałe ciśnienie tętnicze w zakresie 25-35 mmHg.
  3. Oceń parametry żywotności w każdym z góry zdefiniowanych punktach czasowych zarówno w dopływie, jak i odpływie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i analizuj próbki za pomocą urządzenia do gazometrii [np. wskaźniki gazometrii krwi (pH, pCO2, pO2, mleczan, nadmiar zasad, wodorowęglany), glukoza, sód, potas, wapń, chlorek].
    UWAGA: W tym protokole perfuzja trwa 4 godziny, a próbki z dopływu i odpływu pobierane są co 30 minut.
  4. Zważ macicę pod koniec perfuzji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas perfuzji, system był podłączony do czujnika ciśnienia, który rejestrował ciśnienie podczas eksperymentu. Ciśnienie zostało początkowo zarejestrowane dla systemu wolnego od macicy, które zostało odjęte od zapisów ciśnienia podczas perfuzji macicy w celu uzyskania rzeczywistego ciśnienia w narządzie. Natężenie przepływu było dostosowane do utrzymywania ciśnienia w żądanym zakresie i było kontrolowane przez pompę rolkową. Rezystancję obliczono za pomocą wzoru R = P / Q (R: rezystancja (mmHg.mL.min-1); P: ciśnienie (mmHg); Q: natężenie przepływu (ml / min)).

Ewolucja parametrów perfuzji jest pokazana w Rysunek 4. Średnie początkowe natężenie przepływu wynosiło 5,2 (min 2,4, maks. 10,0) ml / min po obu stronach i nie ulegało dużym wahaniom podczas eksperymentu. Na podstawie literatury i wcześniejszych eksperymentów ciśnienie docelowe ustalono na poziomie 25-35 mmHg. Średnie początkowe ciśnienie tętnicze wynosiło 26 (min 10, max 36) mmHg po lewej stronie macicy i 27 (min 16, max 39) mmHg po prawej stronie. Ponieważ przepływ i ciśnienie były nieco stabilne i niskie, wynikowy profil oporu tętniczego również wykazywał płaską krzywą przez cały czas trwania eksperymentu. Średni początkowy opór naczyniowy wynosił 8,5 (min 1, max 13,3) mmHg.mL.min-1 po obu stronach (Ryc. 4).

Zachowanie SNMP zostało ocenione na podstawie kilku parametrów metabolicznych (Rysunek 5): klirens mleczanowy (różnica między odpływem mleczanu a napływem mleczanu), zmiana masy, różnica między glukozą na wlocie a glukozą na wylocie odzwierciedlająca zużycie glukozy oraz zużycie tlenu. Zużycie tlenu obliczono za pomocą wzoru Zużycie O2= 0,0314 x Q x (pO2 dopływ - pO2 odpływ) / W (Q: natężenie przepływu (ml/min), pO2: ciśnienie parcjalne tlenu (mmHg), W: waga (g) i 0,0314 stała Henry'ego w wodzie o temperaturze 20 °C i 1 atm). Spadek poziomu mleczanu w ciągu pierwszej godziny perfuzji wskazuje, że perfuzja maszynowa umożliwiła klirens mleczanu po akumulacji podczas ciepłej fazy niedokrwiennej. Zmiana masy ciała wykazała, że żadna z macic nie miała obrzęku. Krzywa podkreśliła, że utrata masy ciała nastąpiła głównie w ciągu pierwszych dwóch godzin, a następnie waga miała tendencję do stabilizacji. Różnica glukozy między dopływem a odpływem zmniejszyła się w ciągu pierwszej godziny perfuzji, zanim ustabilizowała się na niskich wartościach. Zużycie tlenu utrzymywało się na stałym poziomie podczas perfuzji.

Po 4 godzinach SNMP, w każdej macicy wykonano angiografię, powoli przepłukując 20 ml środka kontrastowego w każdej tętnicy macicznej (Rycina 6), co umożliwiło ocenę drzewa naczyniowego po fazie konserwacji. We wszystkich narządach mikrokrążenie było dobrze zidentyfikowane wzdłuż szyjki macicy, trzonu macicy i rogów.

figure-results-1
Rysunek 1: Model chirurgiczny i system perfuzji maszynowej. (A) Schemat systemu perfuzji maszynowej używanej do SNMP macicy. (B) Reprezentatywne zdjęcie macicy świni poddanej SNMP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Diagram anatomii macicy ludzkiej (po lewej) i świni (po prawej) pokazujący główne unaczynienie przez tętnicę maciczną. Cechy anatomiczne macicy świni wynikają głównie z obecności małego ciała podzielonego na dwa duże rogi macicy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Widoki śród- i pooperacyjne. (A) Śródoperacyjny obraz macicy po zidentyfikowaniu naczyń macicy. (B) Obrazy pooperacyjne macicy po pobraniu i płukaniu heparyną i solą fizjologiczną. A: korpus; B: rogi macicy; C: szyjka macicy; D: tętnice maciczne; E: żyły maciczne; F: rurka; G: jajnik. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Profil parametrów perfuzji podczas 4-godzinnej perfuzji maszynowej po obu stronach macicy. (A) Natężenie przepływu (ml/min). (B) Ciśnienie (mmHg). (c) Obliczony opór tętniczy (mmHg.min.mL-1). Krzywe wskazują średnią dla każdej strony macicy, a słupki błędów wskazują odchylenie standardowe średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Monitorowanie głównych markerów niedotlenienia podczas perfuzji maszynowej. (A) Klirens mleczanu przez pierwsze 90 minut perfuzji przed stabilizacją. (B) Waga zmniejsza się podczas perfuzji. (C) Różnica między stężeniem glukozy na wlocie i wylocie. (D) Obliczone zużycie O2 . Dane reprezentują średnią dla obu stron każdej macicy, a słupki błędów pokazują odchylenie standardowe średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Reprezentatywna angiografia drzewa naczyniowego macicy po zachowaniu subnormotermicznym.(A) Przed wstrzyknięciem środka kontrastowego. (B) Po wstrzyknięciu środka kontrastowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

. .
Nazwa komponentuilośćNazwa komponentuilość
Woda dejonizowana1LDekstran niska frakcja (~75 kDa)5 gramów
Zawartość NaCl5,026 grAlbumina surowicy bydlęcej150 gramów
Kcl0,343 grHydrokortyzon [50 mg/ml]0,2 ml
CaCl2 . 2H200,221 grDeksametazon [1,6 g/100 mg]4 ml
NaH2PO40,187 grWodorotlenek sodu [1 mol/ml] 16 ml
NaHCO31,26 grHeparyna drobnocząsteczkowa200 j.m
MgCl2 . 6H2O0,244 gramainsulina200 j.m
D-glukoza4,3 grWankomycyna1,5 grama
PEG (35 kDa)5 gramów

Tabela 1: Skład roztworu Steen+. NaCl: chlorek sodu; KCl: chlorek potasu; CaCl2. 2H20: dwuwodny chlorek wapnia; NaH2PO4: diwodorofosforan sodu; NaHCO3: wodorowęglan sodu; MgCl2 . 6H2O: chlorek magnezu sześciowodny; CZOP; glikol polietylenowy.

Rysunek uzupełniający 1: System perfuzyjny oparty na pojedynczej pompie. (A) Schemat perfuzji maszynowej "systemu Y" użytej do wstępnego doświadczenia. (B) Reprezentatywne zdjęcie stanowiska do przeprowadzenia eksperymentu wstępnego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Profil parametrów perfuzji podczas 4,5h-SNMP dla eksperymentu wstępnego. (A) Natężenie przepływu (ml/min). (B) Ciśnienie (mmHg). (c) Obliczony opór tętniczy (mmHg.min.mL-1). (D) Wzrost masy ciała podczas perfuzji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Zdjęcie macicy na końcu wstępnego eksperymentu (4,5 h-SNMP). Widoczny jest asymetryczny rozkład obrzęku, głównie w prawym rogu (po prawej stronie obrazu). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeszczepianie macicy, często uważane za część VCA, szybko się rozwinęło w ciągu ostatnich kilku lat. Równolegle zaczęto badać perfuzję maszynową w VCA, ponieważ wykazano w niej solidne dowody na poprawę zachowania narządów stałych. Hipotermiczna i subnormotermiczna perfuzja maszynowa pozwoliła na zachowanie do 24 godzin w modelach świń mięśniowo-skórnych i zawierających kości VCA 26,27,28. Ponieważ macica stanowi wyzwanie porównywalne z VCA zawierającym kości i skórę, kluczowe znaczenie ma zbadanie podobnych technik dla UTx w celu poprawy jakości zachowania i długoterminowych wyników29. Poza poprawą jakości narządów, potencjalną korzyścią płynącą z dynamicznej konserwacji za pomocą perfuzji maszynowej jest poszerzenie puli dawców30. Pobranie macicy od żywych dawczyń wiąże się ze znacznym ryzykiem, takim jak uszkodzenie moczowodu podczas rozwarstwienia szypułki macicy, ale także zaburzenia hormonalne i wszelkie potencjalne zagrożenia związane z wczesną menopauzą z powodu wycięcia jajników, które można wykonać31,32. Cel, jakim jest poprawa jakości narządów od zmarłych dawców, pozwoliłby uniknąć konieczności przeprowadzania takich operacji w procedurach pobierania od żywych dawców. Ostatecznym celem byłoby umożliwienie pobierania macicy zarówno od dawczyń żywych, jak i zmarłych, aby zaspokoić potrzeby kobiet z całkowitą niepłodnością macicy33.

W tym artykule przedstawiono powtarzalny model pobierania i konserwacji macicy świń za pomocą perfuzji maszynowej. Poprawa jakości i czasu przechowywania jest istotna dla rozszerzenia puli dawców, umożliwiając dawcom w stanie śmierci mózgowej bycie wiarygodnym źródłem pobierania macicy. Klinicznie większość UTx wykonywano na podstawie żywych dawców, głównie członków rodziny lub bliskich przyjaciół. Czas niedokrwienia jest kluczowym czynnikiem wpływającym na ostateczną żywotność narządu, szczególnie u dawców ze śmiercią mózgu. IRI definiuje się jako uszkodzenie komórek spowodowane następującym niedokrwieniem (przerwanie krążenia krwi w drzewie naczyniowym narządu) i reperfuzją (powrót dopływu tlenu), często związanym ze wzrostem temperatury, przyczyniającym się do uszkodzenia komórek. Ta kaskada zdarzeń wytwarza reaktywne formy tlenu, co ostatecznie prowadzi do przewlekłego stanu zapalnego, apoptozy, uwalniania antygenu i odrzucenia przeszczepu 7,8,34. Ciepły (WIT) i zimny czas niedokrwienia są krytycznymi czynnikami w procesie IRI, ale tylko kilku autorów badało go w macicy. W badaniu badającym wpływ długotrwałego zachowania SCS u myszy z UTx, przeszczep przeprowadzono po 24 godzinach SCS, a ciąże rozwinęły się pomyślnie u pięciu z sześciu zwierząt. Jednak po 48 godzinach SCS wszystkie przeszczepy wykazały martwicę35. W innym badaniu porównującym UTx u 14 owiec po 3 godzinach SCS (n = 7) i 24 godzinach SCS (n = 7), tylko 7 zwierząt żyło 8 dni po przeszczepie, przy czym 35% macicy uznano za zdolną do życia w odniesieniu do obrzęku i martwicy, 2 macice w grupie 3 godzin SCS i 3 macice w 24-godzinnej grupie SCS36. Co ciekawe, skurcz mięśniówki macicy utrzymywał się w żywotnych macicach, ale ocena metody nie została sprecyzowana. Podkreśla to kluczowe znaczenie rozważenia, że udany przeszczep macicy obejmuje nie tylko żywotny przeszczep, ale także funkcjonalną miesiączkę i udaną ciążę. W związku z tym zmniejszenie IRI i ich negatywnych konsekwencji jest niezbędne, aby umożliwić poprawę jakości przeszczepów i lepsze wskaźniki powodzenia żywych urodzeń. Aby zapewnić spójność, upewniliśmy się, że wszystkie organy są pobierane po porównywalnym WIT. Wszystkie naczynia w obrębie więzadła szerokiego zostały poddane koagulacji lub podwiązaniu, aby zapewnić odpowiedni pomiar ciśnienia i odpowiednią perfuzję kapilarową do całego narządu. Cewnikowanie to kolejny kluczowy punkt, w którym należy zwrócić uwagę, aby zabezpieczyć kaniulę, unikając jednocześnie uszkodzenia naczyń.

Wstępny eksperyment z "systemem Y" doprowadził do optymalizacji dwóch niezależnych systemów perfuzyjnych, adresujących każdą tętnicę maciczną z osobna. Rzeczywiście, jednym z krytycznych parametrów jest natężenie przepływu i ciśnienie perfuzji 26,27, które prowadzą do dostosowania natężenia przepływu, odzwierciedlającego ogólny opór naczyniowy narządu. Zoptymalizowany dopływ obustronny umożliwił usuwanie mleczanu z każdej strony narządu, jak podkreślono w naszych wynikach (ryc. 5), a także ciągłe pomiary różnic tętniczo-żylnych dla wszystkich parametrów metabolicznych. W temperaturze subnormotermicznej dotlenienie komórek przez perfuzję maszynową pozwala na eliminację mleczanów nagromadzonych podczas beztlenowej fazy metabolicznej związanej z niedotlenieniem i hipoperfuzją podczas pobierania i kaniulacji, utrzymując aktywność metaboliczną na niskim poziomie i unikając nawrotu mleczanu. Podobne wyniki uzyskano w przypadku tylnych kończyn szczurów19. W innym modelu anatomicznym Dion i wsp. pokazali inne podejście, pobierając macicę z aortą w badaniu perfuzji hipotermicznej37. Byłoby bardzo interesujące dla przyszłych badań, aby prawidłowo porównać pojedynczą perfuzję opartą na aorcie z modelem opracowanym w naszym protokole.

Chociaż opisano tutaj powtarzalny model maszynowej perfuzji macicy świni, jednym z głównych problemów jest przydatność do dalszego przeszczepu. Aby potwierdzić skuteczność protokołów zachowawczych, przeszczep ma kluczowe znaczenie, ponieważ odtwarza warunki kliniczne. Wymaga to zespoleń mikrochirurgicznych tętniczych i żylnych. Kilka badań wykazało, że żyła maciczno-jajnikowa może być używana w klinicznym UTx, gdy żyła maciczna jest niewystarczającej jakości, aby zapewnić drenaż żylny38,39. Jednym z ograniczeń w tym modelu jest brak zachowania żyły maciczno-jajnikowej. Nie stwierdzono jednak większego obrzęku po 4 h SNMP we wszystkich włączonych kontrpróbach, a ze wszystkich żył macicznych odnotowano ciągły odpływ żylny. Sugeruje to różnicę między modelem ludzkim a świńskim z potencjalnym uproszczeniem procedur UTx u świnek miniaturowych z Jukatanu. Dalsze badania powinny obejmować wydłużenie czasu perfuzji powyżej 4 godzin w celu wyznaczenia granic zachowania dynamicznego. Podsumowując, w artykule tym opisano odtwarzalny model macicy świni do badania konserwacji opartej na perfuzji maszynowej i stanowi cenne źródło informacji na temat IRI w celu zwiększenia ogólnej liczby dostępnych narządów dla UTx.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy nie mają żadnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została częściowo sfinansowana przez National Institute of Health w ramach nagrody nr R01AR082825 (BEU) i Shriners Children's 84308 (YB). HO i YB otrzymały dofinansowanie od Fondation des Gueules Cassées. Podziękowania dla YB ze strony Société Française de Chirurgie Plastique, Reconstructrice et Esthétique (SOFCPRE, Francja) oraz CHU de Rennes (Francja) dla YB.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Affinity Pixie Oxygenation SystemMedtronicBBP241Dotleniacz
Albumina surowicy BovinSigma-AldrichA9647Składnik perfuzyjny
Dwuwodny chlorek wapniaSigma-Aldrich223506Składnik perfuzyjny
Dwutlenek węgla TlenAirgasUN3156Dwutlenek węgla Mieszanina tlenu  gaz 
D-(+)-Glukoza jednowodnaSigma-Aldrich49159Składnik perfuzatu
DeksametazonSigma-AldrichD2915Składnik perfuzatu
DextranThermo scientific406271000Składnik perfuzatu
Heparyna sodowa do wstrzykiwańEugia Pharma63739-953-25Składnik perfuzyjny
Humulin Regular Insulina ludzkaLilly0002-8215-01Składnik perfuzyjny
Hydrokortyzon bursztynian soduPfizer0009-0011-03Składnik perfuzyjny
Chlorek magnezu sześciowodnySigma-AldrichM9272Składnik perfuzyjny
MasterFlex L/SCole-Parmer77200-32Pompa rolkowa
Glikol polietylenowy 35000Sigma-Aldrich25322-68-3Składnik perfuzyjny
Chlorek potasuSigma-Aldrich7447-40-7Składnik perfuzyjny
Monitor ciśnienia, przenośny, PM-P-1Oprzyrządowanie systemów żywychPM-P-1Czujnik ciśnienia
Radnoti  Komora zgodności pułapki bąbelkowejRadnoti130149Pułapka bąbelkowa
RAPIDPoint500System gazometriiSiemens500
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761Składnik perfuzatu
Chlorek soduSigma-AldrichS9888Składnik perfuzatu
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich72068Składnik perfuzyjny
Sodu fosforan monobasowy dwuwodny Sigma-Aldrich71505ze składnikiem perfuzatu
1 mlBD309659Pobieranie próbek
Chlorowodorek wankomycynyŁupek run pharmaceuticals70436-021-82Składnik perfuzatu
Strzykawka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ejzenberg, D., et al. Livebirth after uterus transplantation from a deceased donor in a recipient with uterine infertility. Lancet. 392 (10165), 2697-2704 (2019).
  2. Fageeh, W., Raffa, H., Jabbad, H., Marzouki, A. Transplantation of the human uterus. Int J Gynaecol Obstet. 76 (3), 245-251 (2002).
  3. Lavoue, V., et al. Which donor for uterus transplants: brain-dead donor or living donor? A systematic review. Transplantation. 101 (2), 267-277 (2017).
  4. Brännström, M., et al. Registry of the International Society of Uterus Transplantation: First report. Transplantation. 107 (1), 172-181 (2023).
  5. Van Dieren, V., et al. Acute rejection rates in vascularized composite allografts: A systematic review of case reports. J Surg Res. 298, 33-44 (2024).
  6. Kristek, J., et al. Human uterine vasculature with respect to uterus transplantation: A comprehensive review. J Obs Gynaecol Res. 46 (11), 1999-2007 (2020).
  7. He, J., Khan, U. Z., Qing, L., Wu, P., Tang, J. Improving the ischemia-reperfusion injury in vascularized composite allotransplantation: Clinical experience and experimental implications. Front Immunol. 13, 998952(2022).
  8. Ponticelli, C. Ischaemia-reperfusion injury: A major protagonist in kidney transplantation. Nephrol Dial Transplant. 29 (6), 1134-1140 (2014).
  9. Harris, K., et al. Metabolic response of skeletal muscle to ischemia. Am J Physiol. 250 (2 Pt 2), H213-H220 (1986).
  10. Wranning Almen, C., et al. Short-term ischaemic storage of human uterine myometrium--basic studies towards uterine transplantation. Hum Reprod. 20 (10), 2736-2743 (2005).
  11. Bodewes, S. B., et al. Oxygen transport during ex situ machine perfusion of donor livers using red blood cells or artificial oxygen carriers. Int J Mol Sci. 22 (1), 235(2020).
  12. Boncompagni, E., et al. Decreased apoptosis in fatty livers submitted to subnormothermic machine-perfusion respect to cold storage. Eur J Histochem. 55 (4), e40(2011).
  13. Czigany, Z., et al. Hypothermic oxygenated machine perfusion reduces early allograft injury and improves post-transplant outcomes in extended criteria donation liver transplantation from donation after brain death: Results from a Multicenter Randomized Controlled Trial (HOPE ECD-DBD). Ann Surg. 274 (5), 705-712 (2021).
  14. Markmann, J. F., et al. Impact of portable normothermic blood-based machine perfusion on outcomes of liver transplant: The OCS Liver PROTECT randomized clinical trial. JAMA Surg. 157 (3), 189-198 (2022).
  15. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New Eng J Med. 364 (15), 1431-1440 (2011).
  16. Roesel, M. J., Ius, F., Knosalla, C., Iske, J. The role of ex-situ perfusion for thoracic organs. Curr Opin Organ Transplant. 27 (5), 466-473 (2022).
  17. Michel, S. G., et al. Twelve-hour hypothermic machine perfusion for donor heart preservation leads to improved ultrastructural characteristics compared to conventional cold storage. Ann Transplant. 20, 461-468 (2015).
  18. Ghoneima, A. S., Sousa Da Silva, R. X., Gosteli, M. A., Barlow, A. D., Kron, P. Outcomes of kidney perfusion techniques in transplantation from deceased donors: A systematic review and meta-analysis. J Clin Med. 12 (12), 3221(2023).
  19. Charlès, L., et al. Effect of subnormothermic machine perfusion on the preservation of vascularized composite allografts after prolonged warm ischemia. Transplantation. 108 (5), e280-e290 (2024).
  20. Duru, Ç, et al. Review of machine perfusion studies in vascularized composite allotransplant preservation. Front Transplantation. 2, 103-111 (2023).
  21. Brännström, M., Diaz-Garcia, C., Hanafy, A., Olausson, M., Tzakis, A. Uterus transplantation: Animal research and human possibilities. Fertil Steril. 97 (6), 1269-1276 (2012).
  22. Wranning, C. A., et al. Auto-transplantation of the uterus in the domestic pig (Sus scrofa): Surgical technique and early reperfusion events. J Obstet Gynaecol Res. 32 (4), 358-367 (2006).
  23. Croome, K. P., et al. American Society of Transplant Surgeons recommendations on best practices in donation after circulatory death organ procurement. Am J Transplant. 23 (2), 171-179 (2023).
  24. Dickens, B. M. Legal and ethical issues of uterus transplantation. Int J Gynaecol Obstet. 133 (1), 125-128 (2016).
  25. Díaz, L., et al. Ethical considerations in animal research: The Principle of 3R's. Rev Invest Clin. 73 (4), 199-209 (2020).
  26. Goutard, M., et al. Machine perfusion enables 24-h preservation of vascularized composite allografts in a swine model of allotransplantation. Transpl Int. 37 (1), 102-111 (2024).
  27. Berkane, Y., et al. Towards optimizing sub-normothermic machine perfusion in fasciocutaneous flaps: A large animal study. Bioengineering (Basel). 10 (12), 1545(2023).
  28. Brouwers, K., et al. 24-hour perfusion of porcine myocutaneous flaps mitigates reperfusion injury: a 7-day follow-up study. Plast Reconstr Surg Glob Open. 10 (2), e4123(2022).
  29. Richter, O., et al. Extracorporeal perfusion of the human uterus as an experimental model in gynaecology and reproductive medicine. Human Reprod. 15 (6), 1235-1240 (2000).
  30. O'Neill, K., et al. Availability of deceased donors for uterus transplantation in the United States: Perception vs Reality. Transplantology. 5 (1), 27-36 (2024).
  31. Chan, J. K., Morrow, J., Manetta, A. Prevention of ureteral injuries in gynecologic surgery. Am J Obstet Gynecol. 188 (5), 1273-1277 (2003).
  32. Rocca, W. A., et al. Accelerated accumulation of multimorbidity after bilateral oophorectomy: A population-based cohort study. Mayo Clin Proc. 91 (11), 1577-1589 (2016).
  33. Dion, L., et al. Procurement of uterus in a deceased donor multi-organ donation National Program in France: A scarce resource for uterus transplantation. J Clin Med. 11 (3), 730(2022).
  34. Agarwal, A., et al. Clinicopathological analysis of uterine allografts including proposed scoring of ischemia reperfusion injury and t-cell-mediated rejection-dallas uterus transplant study: A pilot study. Transplantation. 106 (1), e10-e20 (2022).
  35. Díaz-García, L., et al. Pregnancy in transplanted mouse uterus after long-term cold ischaemic preservation. Hum Reprod. 18 (10), 2142-2150 (2003).
  36. Tricard, J., et al. Uterus tolerance to extended cold ischemic storage after auto-transplantation in ewes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 214, 162-167 (2017).
  37. Dion, L., et al. Hypothermic machine perfusion for uterus transplantation. Fertil Steril. 120 (6), 1259-1261 (2023).
  38. Brännström, M., et al. Experimental uterus transplantation. Hum Reprod Update. 16 (3), 329-340 (2010).
  39. Ozkan, O., Ozkan, O., Dogan, N. U. The Ozkan technique in current use in uterus transplantation: from the first ever successful attempt to clinical reality. J Clin Med. 12 (8), 2812(2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przeszczep macicyperfuzja maszynowaniedokrwienie i reperfuzjagraft macicystatyczne przechowywanie w ch odzieuszkodzenie kom rek r db onkakonserwacja organ wpobieranie macicy
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły