Artykuł metodologiczny

Immunokompetentny mysi model do laserowej śródmiąższowej terapii termicznej glejaka

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67381

⸱

15 listopada 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Anatomy and Cell Sciences, University of Manitoba, 2Department of Pathology, University of Manitoba, 3Department of Medical Microbiology & Infectious Diseases, University of Manitoba, 4CancerCare Manitoba

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Glejak jest wyniszczającą formą pierwotnego raka mózgu, a laserowa śródmiąższowa terapia termiczna staje się obiecującą alternatywą dla konwencjonalnej chirurgicznej resekcji nieoperacyjnego glejaka. Protokół ten opisuje zoptymalizowany przedkliniczny model myszy, który można wykorzystać do badania efektów leczenia lub leczenia uzupełniającego i skojarzonego.

Streszczenie

Glejak (GB), najbardziej agresywna forma pierwotnego raka mózgu, stanowi około połowy wszystkich pierwotnych guzów mózgu wysokiego stopnia u dorosłych i nie ma na nią lekarstwa. Laserowa śródmiąższowa terapia termiczna (LITT) jest zatwierdzoną przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) metodą leczenia GB i jest stosowana u pacjentów, którzy mogą nie być kandydatami do konwencjonalnej resekcji chirurgicznej. Chociaż skuteczność kliniczna LITT została ustalona, badania wykraczające poza kliniczne studia przypadków i serie przypadków są ograniczone i utrudnione przez brak ustalonego modelu zwierzęcego. Protokół ten wykorzystuje myszy C57BL / 6 i syngeniczną linię komórkową raka glejaka CT2A do dokładnego odtworzenia ludzkiego GB, przy użyciu lasera 1064 nm z granatu itrowo-aluminiowego domieszkowanego neodymem (Nd: YAG), takiego jak stosowany w jednym z dwóch zatwierdzonych przez FDA systemów LITT, zapewniających doskonałe znaczenie przedkliniczne. Pomyślne opracowanie tego mysiego modelu LITT będzie stanowić cenną platformę do badania unikalnych cech ablacji LITT i jej wpływu na mikrośrodowisko guza, potencjalnie prowadząc do ulepszenia strategii terapeutycznych.

Wprowadzenie

Rak jest główną przyczyną zgonów w Kanadzie. Glejak wielopostaciowy (GB), najczęstsza forma agresywnego guza mózgu, stanowi od 48% do 60% wszystkich pierwotnych guzów mózgu o wysokim stopniu złośliwości u dorosłych1. Rokowanie dla GB jest szczególnie ponure, z 5-letnim przeżyciem netto wynoszącym 4,8% przy konwencjonalnym leczeniu, w tym resekcji chirurgicznej, chemio- i radioterapii1,2.

Laserowa Śródmiąższowa Terapia Termiczna (LITT) to zatwierdzona przez FDA procedura wykorzystująca laser do hipertermicznej ablacji guzów in-situ u pacjentów z nieoperacyjnymi guzami mózgu i stanowi atrakcyjną alternatywę terapeutyczną dla konwencjonalnej resekcji chirurgicznej3. Brakuje jednak szczegółowego i dobrze scharakteryzowanego mysiego modelu leczenia LITT GB, co utrudnia badania przedkliniczne.

Ten protokół ma na celu zaprezentowanie zoptymalizowanego przedklinicznego modelu mysiego do leczenia GB za pomocą LITT. Zdecydowaliśmy się użyć myszy C57BL / 6 i linii komórkowej glejaka syngenicznego CT2A do tego modelu, przede wszystkim dlatego, że CT2A ściśle rekapituluje ludzką GB o wysokim stopniu złośliwości o podobnych cechach histologicznych, inwazyjności, oporności na chemo- i radioterapię oraz cechach podobnych do łodygi z samoodnawianiem i ponownym ustanawianiem nowotworów4. Cechy te stanowią doskonałą platformę dla różnorodnych badań obejmujących odpowiedzi immunologiczne lub nowatorskie strategie terapeutyczne. Co więcej, techniczne aspekty tego protokołu LITT można również łatwo dostosować do innych modeli mysich allo- i ksenoprzeszczepów4,5,6, które zostaną omówione dalej.

Zalety tego protokołu obejmują spójne wyniki z prostym, ale skutecznym paradygmatem leczenia LITT. Zastosowany laser z granatu itrowo-glinowego (Nd:YAG) o długości fali 1064 nm jest taki sam, jak stosowany klinicznie w jednym z dwóch obecnie zatwierdzonych przez FDA systemów, co pozwala na eksperymenty, które są ściśle równoległe do klinicznego zastosowania LITT w leczeniu glejaka o wysokim stopniu złośliwości. Podstawową wadą tego protokołu jest wyjątkowa ostrożność, którą należy zachować zarówno podczas implantacji komórek nowotworowych, jak i leczenia LITT, aby osiągnąć powtarzalne wyniki. Dodatkowo, ze względu na agresywny charakter linii komórkowej CT2A, protokół jest bardzo wrażliwy na czas. Większość eksperymentów będzie musiała zostać zakończona w ciągu maksymalnie 20 dni, co może ograniczyć badania niektórych adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych lub innych mechanizmów komórkowych i molekularnych zachodzących w dłuższym okresie czasu.

Protokół

Etyka dotycząca zwierząt w tym protokole została zatwierdzona przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Manitoba, zgodnie z wytycznymi etycznymi ustanowionymi przez Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC). W protokole tym wykorzystano immunokompetentne myszy szczepu C57BL/6 w wieku od 8 do 12 tygodni oraz syngeniczna linię komórkową glejaka CT2A w celu stworzenia modelu przedklinicznego o szerokim zakresie zastosowań, w tym eksperymentów skoncentrowanych na analizie histologicznej, zmianach immunologicznych lub kombinowanych interwencjach terapeutycznych. Protokół można łatwo dostosować do innych gatunków myszy lub linii komórkowych w zależności od wymagań eksperymentalnych.

Schemat eksperymentu z przeszczepem CT2A przedstawiający MRI, zabieg LITT, pobieranie tkanek i etapy analizy.
Rysunek 1: Graficzny schemat podstawowego projektu eksperymentalnego. Utworzono w BioRender.com Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

1. Krótka procedura przygotowania komórek (Dzień 0)

  1. Przed rozpoczęciem hodowli komórkowej należy upewnić się, że komora oraz wszystkie wymagane pipety zostały całkowicie wysterylizowane promieniowaniem UV i etanolem.
  2. Podgrzać do temperatury pokojowej (RT) w kąpieli wodnej pożywkę DMEM/F12 z 10% FBS, roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) oraz trypsynę.
  3. Odssać pożywkę z kolby T25 i krótko przepłukać komórki roztworem PBS. Dodać do komórek 1 mL trypsyny i inkubować przez 30-60 s aż do momentu odklejenia się komórek od ścianek kolby.
  4. Potwierdzić odklejenie komórek pod mikroskopem świetlnym, a następnie dodać 4 mL pożywki, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną trypsyny.
  5. Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.
    1. Wymieszać 10 µL zawiesiny komórkowej z 10 µL błękitu trypanu, a następnie nanieść 10 µL na preparat do liczenia komórek.
    2. Włożyć preparat do licznika komórek i zapisać całkowitą liczbę komórek, liczbę komórek żywych oraz procent żywych komórek.

UWAGA: Jeśli automat do liczenia komórek nie jest dostępny, można przeprowadzić liczenie ręczne przy użyciu hemocytometru.

  1. Oblicz liczbę komórek wymaganą dla wszystkich zaplanowanych iniekcji.
    UWAGA: W przypadku CT2A zaleca się 5000 komórek na 1,5 µL objętości iniekcyjnej oraz całkowitą objętość preparatu wynoszącą minimum 100 µL.
  2. Wiruj komórki z prędkością 134 x g przez 5 min, aby uzyskać pellet komórkowy, a następnie odessij jak największą ilość medium.
  3. Resuspenduj pellet komórkowy w PBS z dodatkiem 5% ekstraktu z błony podstawnej w objętości dostosowanej do potrzeb w probówce do mikrocentryfugi. Choć mniejsze probówki najlepiej nadają się do przygotowania zawiesiny komórkowej, probówka 2 mL jest lepsza do przechowywania podczas operacji, ponieważ komórki rzadziej skupiają się przy bardziej zaokrąglonym dnie i łatwiej ulegają redystrybucji po delikatnym potrząśnięciu.
  4. Przechowuj komórki w lodzie do momentu iniekcji, przygotowując świeże zawiesiny komórkowe co 4-5 h w razie potrzeby.

2. Implantacja ortotopowa (Dzień 0)

  1. Przygotuj obszar operacyjny i upewnij się, że wszystkie wymagane instrumenty są sterylne i gotowe do użycia.
  2. Zpodaj myszy znieczulenie izofluranem (3% w parze w 1 L/min O2) w komorze, monitorując częstość oddechów (cel: 60 bpm).
  3. Zważ zwierzę i zapisz jego masę w celu obliczenia dawki leków.
  4. Ostrożnie ogol obszar operacyjny, unikając oczu, uszu i wibrysów.
  5. Przenieś zwierzę do ramy stereotaktycznej.
    1. Umieść siekacze w otworze poprzeczki do przytrzymywania zębów i dostosuj stożek nosowy, aż będzie przylegał ściśle, a następnie dokręć śrubę mocującą, aby go unieruchomić.
    2. Sprawdź głębokość znieczulenia, uciskając palcami palce tylnych kończyn obustronnie i, jeśli to możliwe, zabezpiecz czaszkę za pomocą pinów usznych oraz ustaw głowę zwierzęcia w neutralnej, poziomej pozycji.
    3. Monitoruj temperaturę wewnętrzną zwierzęcia za pomocą nasmarowanej sondy temperatury rektalnej i zapewnij dodatkowe ogrzewanie w 37 °C, używając podkładki grzewczej pod zwierzęciem.
      OSTRZEŻENIE: Należy uważać, aby nie dokręcać zbyt mocno stożka nosowego, ponieważ nawet umiarkowany nacisk na kość nosową może spowodować zatrzymanie oddechu. W przypadku użycia elektrycznej podkładki grzewczej (np. podkładki do terrarium), upewnij się, że ustawienia temperatury są dokładne, a zadana temperatura pozostaje stała.
  6. Obficie nałóż maść oftalmiczną na oba oczy, aby zapobiec ich wysychaniu.
  7. Podaj zastrzyki profilaktyczne i sprawdź głębokość znieczulenia.
    1. Wstrzyknij podskórnie (s.c.) meloksykam lub inny długo działający lek przeciwbólowy zgodnie z lokalnymi wytycznymi dla zwierząt (np. 5,0 mg/kg meloksykamu), używając strzykawki 28 G x ½".
    2. Podaj zastrzyk z 20 mg/kg s.c. uprzednio ogrzanej soli fizjologicznej w celu profilaktycznego wsparcia płynowego podczas dłuższych procedur.
    3. Zredukuj stężenie znieczulenia do 1,5%-2,0% izofluranu, aby utrzymać docelową częstość oddechów.
  8. Stosując technikę aseptyczną, przykryj zwierzę sterylnym obłożeniem i przygotuj obszar operacyjny.
    1. Używając sterylnego patyczka watowego, nałóż odkażający roztwór powidonu jodkowego lub chlorheksydyny. Zaczynając od środka w miejscu nacięcia i obracając patyczkiem po każdym pociągnięciu, pracuj w kierunku zewnętrznym, a następnie, używając świeżego sterylnego patyczka watowego, nałóż w podobny sposób 70% etanol.
    2. Powtórz oczyszczanie jodem, a następnie 70% etanolem jeszcze dwa razy (łącznie 3 razy dla każdego środka).
  9. Ponownie sprawdź głębokość znieczulenia przed przystąpieniem do odsłonięcia chirurgicznego. Przez cały czas trwania procedury ściśle monitoruj częstość oddechów i dostosuj znieczulenie w razie potrzeby.
  10. Zaczynając od linii środkowej i lekko za oczami, wykonaj nacięcie środkowo-strzałkowe o długości 1-1,5 cm w kierunku ogonowym za pomocą skalpela z ostrzem nr 15. Alternatywnie, rozszerz krótkie nacięcie skalpelem za pomocą nożyczek irydowych.
    UWAGA: Nacięcia powinny zaczynać się na linii środkowej, ale w przypadku wstrzykiwań jednostronnych mogą być skierowane lekko bocznie, aby ułatwić jednoczesną wizualizację i dostęp do Bregma oraz miejsca otworu trepanacyjnego.
  11. Używając sterylnego patyczka watowego, odchyl brzegi rany, aby uwidocznić czaszkę, i delikatnie usuń wszelką tkankę łączną z tego obszaru.
    1. W razie potrzeby użyj sterylnego patyczka watowego nasączonego nadtlenkiem wodoru, aby oczyścić powierzchnię czaszki i uwidocznić szwy czaszkowe.
  12. Zlokalizuj Bregma, gdzie lewy i prawy szew czołowy spotykają się na linii środkowej z szwem strzałkowym (patrz Rysunek 2).
    1. Używając nietoksycznej kolorowej żywicy akrylowej i sterylnej drewnianej wykałaczką lub podobnego narzędzia, zrób bardzo mały znak nad Bregma.
      UWAGA: W niektórych przypadkach lewy i prawy szew czołowy nie są symetryczne; w takich sytuacjach użyj „linii najlepszego dopasowania”, aby przybliżyć miejsce, w którym powinny się przeciąć wzdłuż płaszczyzny środkowo-strzałkowej.
  13. Upewnij się, że głowa zwierzęcia nie jest przechylona ani obrócona (tj. znajduje się w płaszczyźnie poziomej).
    1. Wyczerguj współrzędne stereotaktyczne w Bregma. Współrzędna x odnosi się do ruchu w płaszczyźnie przyśrodkowo-bocznej (ML), współrzędna y w płaszczyźnie przednio-tylnej (AP), a współrzędna z w płaszczyźnie grzbietowo-brzusznej (DV).
    2. Upewnij się, że Lambda znajduje się w tej samej płaszczyźnie DV co Bregma (tj. z = 0 w obu punktach orientacyjnych). Podobnie, w odległości +2,0 mm (x = 2) i -2,0 mm (x = -2,0) bocznie od Bregma upewnij się, że czaszka znajduje się w tej samej płaszczyźnie, a współrzędna DV/z jest w przybliżeniu równa. Upewnij się, że czaszka jest stabilna i nie przesuwa się po dokonaniu jakichkolwiek korekt.
  14. Wywierć otwór trepanacyjny w punkcie +2,0 mm (ML) i +0,5 mm (AP) od Bregma (Rysunek 3).
    1. Używając przystawki wiertła stereotaktycznego, ostrożnie opuść końcówkę wiertła, aż zetknie się ona z Bregma, i wyzeruj współrzędne.
    2. Lekko unieś wiertło i ustaw je na odpowiednie współrzędne AP i ML.
    3. Powoli opuszczaj wiertło, uważając, aby przebić tylko czaszkę.
    4. Alternatywnie, używając strzykawki mikrolitrowej w ramie stereotaktycznej, opuść końcówkę igły, aż zetknie się ona z Bregma, i wyzeruj współrzędne.
    5. Lekko unieś igłę i ustaw ją na odpowiednie współrzędne AP i ML.
    6. Opuszczaj końcówkę, aż dotknie czaszki i zanotuj dokładną lokalizację.
    7. Lekko unieś igłę i zrób mały znak w miejscu docelowym za pomocą markera chirurgicznego.
    8. Unieś lub odsuń uchwyt igły i za pomocą wiertarki ręcznej wykonaj otwór w czaszce, uważając, aby nie uszkodzić znajdującego się pod nią mózgu. OSTRZEŻENIE: Zazwyczaj starsze myszy samce mają stosunkowo grubsze czaszki i wymagają bardziej rozległego wiercenia. Wiercenie ręczne należy wykonywać ostrożnie, stosując minimalny nacisk, ponieważ gwałtowne przebicie się przez czaszkę uszkodzi podległe opony mózgowe i/lub mózg.
      UWAGA: Rozszerzenie otworu trepanacyjnego jest konieczne, aby pomieścić sondę termopary podczas procedury LITT. Można to zrobić łatwiej podczas pierwszej operacji wstrzykiwania, co usprawnia i przyspiesza późniejszą operację LITT. Alternatywnie, otwór trepanacyjny można rozszerzyć w ten sam sposób podczas operacji LITT, co może zmniejszyć ryzyko wzrostu guza poza czaszką.
  15. Wykonaj drugi otwór trepanacyjny w punkcie +3,0 mm ML i +0,5 mm AP (1,0 mm bocznie od miejsca wstrzyknięcia) dla termopary.
    1. Postępuj zgodnie z procedurą wiercenia opisaną w poprzednim kroku.
    2. Aby uniknąć trudności związanych z odrostem kości, usuń kość pomiędzy dwoma otworami.
      UWAGA: Jako współrzędne do implantacji guza w odniesieniu do Bregma zaleca się użycie +2,0 mm ML, +0,5 mm AP i -2,5 mm DV. Lokalizacja ta w górnym prążkowiu zapewnia spójny wzrost guza, który jest dobrze tolerowany przez zwierzęta – jednak protokół można dostosować do innych lokalizacji.
  16. Przygotuj zawiesinę komórek glejaka mysiego CT2A w strzykawce mikrolitrowej (5000 komórek w 1,5 µL).
    1. Wyjmij wcześniej przygotowaną probówkę z komórkami z lodu i delikatnie opukaj ją palcem, aby resuspenderć zawiesinę.
    2. Delikatnie pobierz 2 µL do strzykawki 5 µL lub 10 µL, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
    3. Wypchnij 0,5 µL, aby usunąć powietrze i upewnić się, że igła jest odpowietrzona i działa prawidłowo.
    4. Przetrzyj trzon igły gazikiem z alkoholem, aby usunąć wypchnięty płyn oraz wszelkie komórki z powierzchni zewnętrznej (które mogłyby spowodować wzrost guza w oponach miękkich).
  17. Załaduj strzykawkę do mikroautomatycznej pompy strzykawkowej (lub manualnej przystawki stereotaktycznej) i powoli opuść igłę.
    1. Powoli opuść igłę na głębokość (z = -3,0 mm) i odczekaj 1 min.
    2. Powoli wycofaj igłę o 0,5 mm (z = -2,50 mm) i wstrzyknij komórki (≤ 0,5 µL/min). Utrzymuj obszar wokół strzykawki w suchości, używając gąbki mikrochirurgicznej, uważając, aby nie przesunąć igły.
    3. Odczekaj minimum 2 min po zakończeniu wstrzykiwania, a następnie powoli wycofaj strzykawkę w czasie od 3 do 4 min. Upewnij się, że pierwsze 4-5 interwałów wycofywania wynosi 100 µm na krok, aby uniknąć przemieszczenia komórek z pierwotnego miejsca wstrzyknięcia.
    4. Używając gazika z alkoholem, delikatnie wytrzyj zewnętrzną stronę igły z krwi lub płynów, a następnie przepłucz i wyczyść strzykawkę zgodnie z wytycznymi producenta. Między wstrzyknięciami używaj PBS i wody destylowanej, aby zapobiec zapchaniu się igły. Po zakończeniu wstrzykiwań obficie przepłucz igłę 70% etanolem, aby usunąć z niej wszelkie pozostałe komórki.
      OSTRZEŻENIE: Brak przepłukania igły po każdym wstrzyknięciu może doprowadzić do zablokowania. W przypadku wstrzykiwania więcej niż jednego typu komórek, używaj osobnej igły dla każdego typu, aby uniknąć ewentualnej kontaminacji krzyżowej.
  18. Zbliż brzegi nacięcia, dbając o to, by lekko wywinąć je na zewnątrz, tak aby stykali się podległe warstwy skóry właściwej. Zamknij ranę za pomocą klipsa chirurgicznego lub 3 szwów przerywanych nicią 5-0. Na zamkniętą ranę nałóż roztwór powidonu jodkowego.
  19. Zdejmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść je w wyścielonej papierem klatce rekonwalescencyjnej na podkładce grzewczej ustawionej na 37 °C. Upewnij się, że zwierzę odzyskania świadomość i przyjmuje pozycję grzbietową przed przeniesieniem go z powrotem do klatki domowej, w której na dnie znajduje się mała miseczka z mokrym pokarmem.
  20. Monitoruj zwierzę co najmniej dwa razy dziennie, zaczynając od dnia operacji, przez kolejne 2 dni. Podaj ponownie meloksykam po 24 h, 48 h i 72 h lub zgodnie z wytycznymi instytucji.

Schemat czaszki przedstawiający lokalizacje anatomiczne szwów czołowych, strzałkowych, lambda, bregma oraz lambda.
Rysunek 2: Ilustracja graficzna czaszki myszy i ważnych punktów orientacyjnych dla chirurgii stereotaktycznej. Utworzono w BioRender.com Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Schemat przygotowania do operacji czaszkowej z pozycjami termopary i włókna laserowego w pobliżu Bregmy.
Rysunek 3: Ilustracja graficzna wskazująca miejsca nawierceń i aparaturę laserową. Ilustracja przedstawiająca względne położenie punktu orientacyjnego Bregma, (A) pierwszego otworu trepanacyjnego dla (A') włókna laserowego oraz (B) drugiego, lub rozszerzonego, otworu trepanacyjnego dla (B') sondy termopary. Po prawej stronie przedstawiono przekrój włókna laserowego i sond termopar, ilustrujący sposób stabilizacji sond w stereotaktycznym uchwycie z nawierconymi otworami o pożądanej wielkości i rozstawie. Utworzono w BioRender.com Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Monitorowanie obciążenia nowotworowego przed LITT (dzień 9)

  1. Wykonaj obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) w obrazowaniu T2-zależnym, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, aby ocenić wzrost guza w dniu poprzedzającym LITT.
    UWAGA: Guzu powinny mieć średnicę około 1,5-2,0 mm.
    1. Uzyskaj odpowiedni skan czołowy całego mózgu myszy, stosując następujące parametry: sekwencja fast spin echo, TR = 5000 ms, TE = 45 ms, echo trains = 7, FOV = 30 x 30 mm2, rozmiar macierzy = 250 x 256, całkowita liczba przekrojów = 18, grubość przekroju = 0,3 mm, średnie = 2.
      UWAGA: Zaleca się również okresowe wykonywanie MRI począwszy od około 6. dnia po implantacji, aby potwierdzić pomyślny allograft i monitorować wzrost guza – szczególnie podczas pierwszych eksperymentów – ponieważ nawet subtelne zmiany w procedurze mogą wpłynąć na harmonogram. CT2A jest wysoce agresywny, a zwierzęta wymagają ścisłego monitorowania. Skan czołowy T2-zależny sprawdza się w tym celu. W przypadku braku dostępu do MRI dla małych zwierząt można również zastosować komórki CT2A znakowane fluorescencyjnie lub lucyferyną w połączeniu z systemem obrazowania in vivo (IVIS). Jednakże kinetyka wzrostu i inne charakterystyki guza będą różnić się od tych opisanych w niniejszym protokole.

4. Operacja LITT (Dzień 10)

  1. Zgodnie z sekcją 2 powyżej, powtórz kroki 2.1-2.13, aby przygotować zwierzę do zabiegu LITT.
    UWAGA: Gojenie rany po poprzedniej operacji może znajdować się na różnych etapach w zależności od gatunku i różnic w harmonogramie eksperymentu. Należy uważać na cieńsze lub bardziej delikatne tkanki podczas ponownego wykonywania nacięcia.
  2. Za pomocą sterylnego patyczka z watą delikatnie oczyść czaszkę, usuwając wszelkie tkanki zasłaniające Bregma lub wcześniej wykonany otwór trepanacyjny. W razie potrzeby ponownie wywierć otwór trepanacyjny, choć ze względu na szybkość formowania się guza CT2A spodziewa się niewielkiego lub żadnego odrostu kości.
  3. Po zamontowaniu przystawki LITT w aparacie stereotaktycznym, ustaw zerowe współrzędne w punkcie Bregma dla końcówki włókna laserowego.
    OSTRZEŻENIE: Włókno laserowe jest bardzo kruche i pęknie w przypadku zgięcia. Należy zachować ostrożność i zatrzymać ruch natychmiast po zetknięciu końcówki włókna laserowego z czaszką.
  4. Lekko unieś końcówkę i przesuń ją do pożądanych współrzędnych ML i AP, a następnie powoli opuść sondy do docelowej współrzędnej DV, aby dotrzeć do celu (2.0 mm ML, 0.5 mm AP, -2.0 mm DV).
  5. Ustaw parametry zabiegu LITT: Tryb: ciągły; Moc: 1 W
  6. Przełącz laser z trybu Standby na Active i uruchom laser na 60 s za pomocą pedału nożnego. Jeśli temperatura wzrośnie powyżej 46 °C, przerwij na chwilę, a następnie uruchom ponownie, starając się utrzymać temperaturę jak najbliżej 46 °C.
  7. Powoli wycofaj zespół laserowy i delikatnie przetrzyj włókno laserowe oraz termoparę gazikiem nasączonym alkoholem. Odsuń zespół, uważając, aby sondy nie dotknęły ramy aparatu.
  8. Zamknij ranę i przeprowadź rekonwalescencję zwierzęcia, zgodnie z opisem w krokach 2.18-2.20 po implantacji guza opisaną powyżej.

5. Ocena po zabiegu LITT (Dzień 11)

  1. W dniu następującym po zabiegu LITT wykonaj obrazowanie MRI T2-zależne w celu oceny skuteczności ablacji guza, stosując sekwencję i parametry opisane w kroku 3.1 powyżej.
    UWAGA: Dodatkowo pomocna w ocenie obrzęku pooperacyjnego może być sekwencja FLAIR (fluid-attenuated inversion recovery).
  2. Przed zakończeniem badania wykonaj skany kontrolne, aby monitorować zmiany potreatmentowe lub nawrót guza.

6. Zakończenie badania (Dzień 11/Dzień 15/Dzień 20)

  1. Uśmierc zwierzęta w wybranych punktach końcowych eksperymentu zgodnie z wytycznymi instytucji.
    UWAGA: Punkty końcowe po 20. dniu nie są możliwe do osiągnięcia w przypadku CT2A, nawet przy ekstremalnie niskiej liczbie inokulowanych komórek, ponieważ zwierzęta kontrolne (np. po operacji pozorowanej lub bez leczenia) oraz niektóre zwierzęta z grup leczonych mogą znajdować się w stanie agonalnym i wymagać uśmiercenia. W przypadku dłuższych eksperymentów należy rozważyć alternatywne modele komórkowe glejaka mysiego.
  2. Pobierz tkanki do utrwalenia i dalszej obróbki.
    1. Wykonaj perfuzję sercową za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) i pobierz interesujące tkanki.
    2. Przeprowadź dofixację tkanki mózgowej poprzez zanurzenie w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotuj próbki zgodnie ze standardowymi procedurami dla analizy tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) lub analizy tkanek utrwalonych i zamrożonych.

7. Analiza

  1. Zweryfikować powodzenie ablacji LITT za pomocą MRI w obrazowaniu T2-zależnym i potwierdzić wynik, stosując podstawowe techniki histologiczne, takie jak barwienie hematoksyliną i eozyną.
  2. Przeprowadzić wszelkie dodatkowe analizy wymagane dla eksperymentów (np. immunohistochemię, immunofluorescencję).

Wyniki

Pomyślną implantację guza CT2A oraz zabiegi LITT można scharakteryzować za pomocą MRI ważonego w czasie T2, co przedstawiono na Rysunku 4, Rysunku 5 oraz Rysunku 6. Obrazy MR uzyskano przy użyciu beztlenowego nadprzewodzącego magnesu 7T z otworem o średnicy 17 cm i kwadraturową cewką do głowy myszy, stosując parametry sekwencji określone w powyższym protokole. Ścisłe przestrzeganie tej metody powinno skutkować wskaźnikiem przyjęcia przeszczepu zbliżonym do 100%, spójną lokalizacją guza oraz formowaniem się guzów o kształcie zbliżonym do sferycznego, co zademonstrowano na Rysunku 4. Cechy te stanowią optymalną podstawę do późniejszych zabiegów LITT i dalszych analiz. Podobnie, jak widać na Rysunku 5, ablacje LITT powinny być spójne zarówno pod względem wielkości, jak i lokalizacji. Centralny rdzeń ablbowanej tkanki będzie składać się z martwicy koagulacyjnej i rozpływczej i będzie łatwo widoczny jako obszar hipointensywny (tzn. czarny) w MRI ważonym w czasie T2. W dniach bezpośrednio następujących po zabiegu LITT, w zależności od przeprowadzonej procedury, typowe jest również wystąpienie obszaru hiperintensywnego (tzn. białego) w obrębie i wokół zmiany, co odpowiada obrzękowi okołozabiegowemu. Rysunek 6 przedstawia nieprawidłowy wynik i zwraca uwagę na niektóre potencjalne pułapki podczas wykonywania tego protokołu.

Sekwencja obrazów MRI mózgu podkreślająca wzrost guza, etapy analizy obrazowania diagnostycznego A-C.
Rycina 4: Obrazy MR w płaszczyźnie czołowej, ważone T2, przedstawiające prawidłowy wzrost guza CT2A. Reprezentatywne obrazy tworzenia się guza u trzech myszy C57BL/6 (A, B, C) w 12. dniu po implantacji. Białe strzałki wskazują granicę guza. Zwróć uwagę na spójną lokalizację guza i jego w przybliżeniu sferyczny kształt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Skanowanie MRI mózgu pokazuje progresję guza w trzech etapach; schemat zaznacza obszary guza strzałkami.
Rycina 5: Koronalne obrazy MR ważone T2 po idealnej ablacji LITT (1 dzień po LITT). Reprezentatywne obrazy ablacji guza metodą LITT u trzech myszy C57BL/6 (A, B, C) w 13. dniu po implantacji. Zwróć uwagę na spójny rozmiar i lokalizację rdzenia zmiany martwiczej. Wykonanie badań MRI przed LITT oraz samych ablacji LITT nieco wcześniej zapewniłoby lepszą równowagę między optymalnym rozmiarem guza do celowania laserowego a możliwością uzyskania późniejszych punktów końcowych po leczeniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przekroje mózgu MRI z guzem; widok strzałkowy; analiza obrazowania medycznego; narzędzie diagnostyczne.
Rycina 6: Koronalne obrazy MR ważone T2 w ramach zabiegów LITT przed optymalizacją. Obrazy z trzech myszy C57BL/6 (A, B, C) leczonych przy użyciu identycznych parametrów laserowych i celów stereotaktycznych przed optymalizacją protokołu, jako przykład nieidealnego wyniku. Białe strzałki wskazują granicę guza. Obramowane obszary pokazują region obrzęku. Widoczna jest znaczna zmienność, w tym mniej jednolity wzrost guza oraz niedokładne celowanie ablacją laserową, co skutkuje niespójnym uszkodzeniem tkanki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Istnieje szybko rozwijająca się literatura dotycząca LITT; Jednak przede wszystkim ogranicza się do klinicznych studiów przypadków lub serii przypadków u ludzi. Rzeczywiście, wykazano kilka potencjalnych korzyści dla LITT, w tym niższe wskaźniki powikłań pooperacyjnych i koszty przy jednoczesnym zapewnieniu porównywalnego przeżycia wolnego od progresji 7,8,9,10,11. Obserwuje się również zmniejszenie liczby nawrotów miejscowych przy większym sukcesie ogólnoustrojowego leczenia farmakologicznego, chociaż przyczyny nie są jeszcze dobrze poznane12. Ponadto obiecujące wyniki do zastosowań klinicznych poza Wielką Brytanią obejmują leczenie przerzutów i innych typów nowotworów 3,12, martwicy popromiennej13, padaczki opornej na leczenie14, malformacji naczyniowych15, a nawet zaburzeń obsesyjno-kompulsywnych16. I odwrotnie, badania z wykorzystaniem modelu mysiego są jak dotąd bardzo ograniczone, z kilkoma godnymi uwagi wyjątkami, które mogą być trudne do powtórzenia. Na przykład w niedawnym badaniu dotyczącym zmian przepuszczalności bariery krew-mózg po leczeniu LITT wykorzystano generator laserowy sprzedawany w Europie do użytku klinicznego, ale instrument ten nie został zatwierdzony w Ameryce Północnej17. Chociaż taki system wydaje się dobrze pasować do ich badań, uzyskanie urządzenia jest prawdopodobnie zbyt kosztowne dla większości badaczy, a wszelkie zastrzeżone lub wysoce zaawansowane technologicznie funkcje są trudne do odtworzenia. W związku z tym szczegółowy protokół dostępnego i zoptymalizowanego przedklinicznego modelu zwierzęcego zapewni cenne możliwości badawcze.

Kluczowe kroki w protokole obejmują dokładną identyfikację szczepionki Bregma w celu powtarzalnego celowania zarówno podczas przeszczepu allogenicznego, jak i późniejszej operacji ablacji LITT. Dodatkowo, zwrócenie szczególnej uwagi na etapy iniekcji w stosunku do szybkości podawania i przerw ma kluczowe znaczenie dla udanych przeszczepów komórek nowotworowych, a niewykonanie tego znacznie zwiększa ryzyko wzrostu guza pozaczaszkowego i większej zmienności guza. Ważne jest również, aby podkreślić, że operacja LITT powinna być zaplanowana, gdy guz jest jeszcze stosunkowo mały (tj. ~1,5-2,0 mm średnicy). Z naszego doświadczenia wynika, że guzy CT2A często stają się bardziej zmienne w kształcie, gdy są duże, a bardzo duże guzy również zwiększają trudność ekstrakcji mózgu, zwłaszcza jeśli guz wyrósł przez powierzchnię kory mózgowej. Należy również zauważyć, że zaledwie 24 godziny, takie jak między rezonansem magnetycznym przed leczeniem a operacją LITT, to wystarczający czas na znaczny wzrost glejaka CT2A.

W protokole można łatwo wprowadzić kilka modyfikacji, aby dostosować go do innych projektów eksperymentalnych. W szczególności protokół ten koncentruje się na krokach technicznych niezbędnych do udanej implantacji ortotopowej i operacji LITT w syngenicznym modelu myszy C57BL/6 CT2A. Jednak opisany model można łatwo zastąpić, aby dostosować go do różnych celów eksperymentalnych. Mniej agresywne syngeniczne linie komórkowe raka, takie jak K1491, mogą być wykorzystywane do przeprowadzania eksperymentów wymagających dłuższych punktów czasowych, takich jak te obejmujące wrodzoną i nabytą odpowiedź immunologiczną. Alternatywnie, w przypadku eksperymentów, które nie koncentrują się na adaptacyjnych odpowiedziach guza-gospodarza, linie komórkowe pochodzące od pacjenta lub inne modele ksenoprzeszczepów w modelach myszy z obniżoną odpornością są inną realną opcją. Dla zainteresowanego czytelnika Haddad i in. (2021) zapewniają kompleksowy przegląd mocnych stron i ograniczeń kilku powszechnych modeli myszy z przeszczepem allogenicznym i ksenoprzeszczepem4. Inną prostą modyfikacją, w zależności od dostępności instytucjonalnej i wytycznych, jest zastąpienie wziewnego środka znieczulającego alternatywami do wstrzykiwań, takimi jak połączenie ketaminy i ksylazyny ± acepromazyny. Jednakże, gdy dostępne są środki wziewne i wymagany sprzęt (np. nosek stereotaktyczny), zalecamy ich stosowanie z kilku powodów. Po pierwsze, uważamy, że wziewne środki znieczulające są bezpieczniejszą alternatywą, ponieważ nie wymagają wstrzyknięcia dootrzewnowego, nie wymagają wielokrotnego dawkowania w przypadku dłuższych lub trudniejszych operacji i można je łatwo miareczkować z dużym marginesem bezpieczeństwa18. Ponadto znieczulenie wziewne nie wymaga stosowania substancji kontrolowanych i zapewnia szybkie wybudzenie i powrót do zdrowia po zabiegu.

Rozwiązywanie problemów związanych z tym protokołem powinno być minimalne, a większość problemów wynika ze złej techniki wstrzykiwania, co skutkuje nieregularnym tworzeniem się guza lub wzrostem pozaczaszkowym. Problemy z celowaniem LITT można rozwiązać dzięki właściwej identyfikacji punktów orientacyjnych, odpowiedniej stabilizacji światłowodu laserowego i uważnej obserwacji włókna laserowego podczas wprowadzania, aby upewnić się, że nie uderza on w bok otworu w zadziorach i nie zostaje zepchnięty z kursu.

Ograniczenia metody obejmują średni i zaawansowany poziom umiejętności chirurgicznych i technicznych wymaganych do wykonywania zabiegów, dostęp do specjalistycznego sprzętu, takiego jak aparat do rezonansu magnetycznego małych zwierząt, oraz długi protokół implantacji ortotopowej, który ogranicza liczbę zastrzyków, które można wykonać w ciągu jednego dnia. Ponieważ protokół ten ma być przedklinicznym modelem glejaka o wysokim stopniu złośliwości, istnieją również nieodłączne ograniczenia związane z bardziej agresywnym charakterem niektórych linii komórkowych glejaka, takich jak CT2A. Szczepienia o niskiej liczbie komórek, głębokie miejsce wstrzyknięcia w prążkowiu, ostrożna technika wstrzykiwania i wczesne leczenie pomogą złagodzić te problemy, ale sporadyczny pozaczaszkowy lub nieregularny wzrost guza może nadal występować, a krótkie projekty eksperymentalne są uzasadnione. Jak wspomniano, modyfikacja tego protokołu za pomocą mniej agresywnej linii komórkowej jest również łatwa do osiągnięcia.

Ponieważ protokół ten jest, według naszej wiedzy, jedynym szczegółowym opisem przedklinicznego modelu mysiego dla LITT of GB, jest to znaczący krok w kierunku zapewnienia dobrze ugruntowanego modelu dla przyszłych badań z zakresu nauk podstawowych.

Oświadczenia

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony Monteris Medical, w tym za darowiznę rzeczową w postaci sprzętu laserowego.

Podziękowania

Źródła finansowania tego projektu to m.in. Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC)-Alliance, Mitacs-Accelerate, Research Manitoba-IPOC, Canadian Institutes for Health Research (CIHR) CGS-M oraz University of Manitoba Graduate Fellowship. Linia komórkowa glejaka CT2A hojnie podarowana przez dr Petera Fecci z Duke University, Durham, NC. Chcielibyśmy również podziękować Laboratorium Usług Histologicznych oraz Ośrodku Obrazowania Małych Zwierząt i Materiałów na Uniwersytecie Manitoba za ich doskonałą pomoc techniczną w tym projekcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Włócznie absorpcyjneFST18105-01Gąbki hemostatyczne.
Kleszczyki do tkanek AdsonFST11006-12
C57BL/6 myszyJackson LaboratoriesStrain #0006646 do 12 tygodni męskie i żeńskie
aplikatory z bawełnianą końcówką (6 ")Mikroskopia elektronowa Sciences72308
LiniaHojnie podarowana od dr Petera Fecci, Duke University.
Ekstrakt z błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu Cultrex, PathClearBiotechne, R& Systemy D3433-010-01
DMEM/F-12, HEPESGibco, ThermoFisher Scientific11330032
Prowadnice dwukomorowe BIO-RAD1450003
Probówki Eppendorf Safe-Lock 2,0 mlEppendorf22363352
Bezwodny alkohol etylowyGreenfield GlobalP016EAANRozcieńczony do 70% z ddH2O
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, KanadaGibco, ThermoFisher Scientific12483020
Glad Press-n-Sealfolia
Wiertarka szybkoobrotowaKopf InstrumentsModel 1474
K & J Termopara miernik temperaturyOmegaHH509R
Metacam (meloksykam)WDDC114424
Pompa strzykawkowa do mikroiniekcjiWPIUMP3T-1
Strzykawka mikrolitrowa (seria 700)Hamilton87908Dostępne są niestandardowe igły. Stromy skos igły pomaga w precyzyjnym podawaniu, a krótsza długość igły pomaga w stabilności.
Sterownik igły/uchwyt igłyFST12500-12Cienka końcówka jest najbardziej odpowiednia ze względu na ograniczoną przestrzeń roboczą, ale wiele stylów jest odpowiednich w zależności od preferencji uchwytu.
Maść okulistyczna Opixcare PlusWDDC135941
buforowana fosforanem (10x)Odczynniki FisherBP399-4Rozcieńczyć do 1x z ddH2O
Powidon-jodThermoFisher Scientific3955-16Aliquat do mniejszych tubek do stosowania z aplikatorami z bawełnianą końcówką.
Sól fizjologiczna (normalna)Skalpel WDDC126588
, jednorazowego użytku (#15 Ostrze)Nożyczkipiór Feather NO15
, drobne chirurgiczneFST91460-11Cienkie nożyczki studenckie, Iris lub Bonn są odpowiednie.
Ramka stereotaktycznaKopf InstrumentsModel 940Z cyfrowym wyświetlaczem, konsolą i stożkiem myszy oraz nausznikami.
Stereotaktyczny uchwyt na strzykawkęKopf InstrumentsModel 1772-FJeśli nie używasz pompy wtryskowej.
Nici (5-0 monofilament)EthiconMCP463GMonocryl fioletowa żyłka z odwróconą końcówką tnącą
Strzykawka, 28 G  (0,5 ml) BDBD 329461Strzykawki insulinowe BD Lo-Dose U-100
TC20 Automatyczny licznik komórekBIO-RAD1450102
Sonda termopary, drobna średnica (Typ K)OmegaTJM-CA316-IM025G-150
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco, ThermoFisher Scientific25200072
Vetbond firmy 3M, klej do tkanek weterynaryjnych WDDC126125
Maszynka do strzyżenia orzechów ziemnych WahlWDDC/Wahl100963Dostępny również bezpośrednio od producenta.
Podkładka rozgrzewającaBensen Medical70308/121873Można użyć dowolnego podobnego przedmiotu.
Webcol Alcohol prepsMikroskopia elektronowa Sciences71005-20Chusteczka nasączona alkoholem, 2-warstwowa, średniej wielkości.
komórkowa glejaka CT2A plastikowa Amazon.ca 12587704417 Sól fizjologiczna z

Bibliografia

  1. Canadian Cancer Society. Cancer Statistics 2023. , Canadian Cancer Statistics Advisory Committee in collaboration with the Canadian Cancer Society, Statistics Canada and the Public Health Agency of Canada. Toronto, ON. http://cancer.ca/Canadian-Cancer-Statistics-2023-EN (2023).
  2. Glioblastoma Research Organization. Glioblastoma Research Organization. , https://www.gbmresearch.org (2024).
  3. Carpentier, A., et al. Laser thermal therapy: Real-time MRI-guided and computer-controlled procedures for metastatic brain tumors. Lasers Surg Med. 43 (10), 943-950 (2011).
  4. Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neurooncol Adv. 3 (1), vdab100(2021).
  5. Chokshi, C. R., Savage, N., Venugopal, C., Singh, S. K. A patient-derived xenograft model of glioblastoma. STAR Protoc. 1 (3), 100179(2020).
  6. Alcaniz, J., et al. Clinically relevant glioblastoma patient-derived xenograft models to guide drug development and identify molecular signatures. Front Oncol. 13, 1129627(2023).
  7. Muir, M., et al. Laser interstitial thermal therapy for newly diagnosed glioblastoma. Lasers Med Sci. 37 (3), 1811-1820 (2022).
  8. Muir, M., Traylor, J. I., Gadot, R., Patel, R., Prabhu, S. S. Repeat laser interstitial thermal therapy for recurrent primary and metastatic intracranial tumors. Surg Neurol Int. 13, 311(2022).
  9. De Groot, J. F., et al. Efficacy of laser interstitial thermal therapy (LITT) for newly diagnosed and recurrent IDH wild-type glioblastoma. Neurooncol Adv. 4 (1), vdac040(2022).
  10. Holste, K. G., Orringer, D. A. Laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdz035(2020).
  11. Leuthardt, E. C., Voigt, J., Kim, A. H., Sylvester, P. A single-center cost analysis of treating primary and metastatic brain cancers with either brain laser interstitial thermal therapy (LITT) or craniotomy. Pharmacoecon Open. 1 (1), 53-63 (2017).
  12. Bastos, D. C. D. A., et al. Predictors of local control of brain metastasis treated with laser interstitial thermal therapy. Neurosurgery. 87 (1), 112-122 (2020).
  13. Darbinyan, A., Leelatian, N., Fomchenko, E. I. Histological changes associated with laser interstitial thermal therapy for radiation necrosis: illustrative cases. J Neurosurg Case Lessons. 4 (1), CASE21373(2022).
  14. Grant, G. A., Porter, B. E., Li, D., Barros Guinle, M. I., Kaur, H. Approach, complications, and outcomes for 37 consecutive pediatric patients undergoing laser ablation for medically refractory epilepsy at Stanford Children's Health. J Neurosurg Pediatr. 33 (1), 1-11 (2023).
  15. Ogasawara, C., et al. Laser interstitial thermal therapy for cerebral cavernous malformations: A systematic review of indications, safety, and outcomes. World Neurosurg. 166, 279-287.e1 (2022).
  16. Satzer, D., Mahavadi, A., Lacy, M., Grant, J. E., Warnke, P. Interstitial laser anterior capsulotomy for obsessive-compulsive disorder: lesion size and tractography correlate with outcome. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 93 (3), 317-323 (2022).
  17. Salehi, A., et al. Therapeutic enhancement of blood-brain and blood-tumor barriers permeability by laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa071(2020).
  18. Navarro, K. L., Huss, M., Smith, J. C., Sharp, P., Marx, J. O., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mysi model glejaka wielopostaciowegoablacja guza mózguchirurgia stereotaktycznakomórki glejaka CT2Amikrośrodowisko guzatermiczna ablacja tkanekobrazowanie MRIimplantacja guzamartwica tkanek
Immunokompetentny mysi model do laserowej śródmiąższowej terapii termicznej glejaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.