Artykuł metodologiczny

Immunokompetentny mysi model do laserowej śródmiąższowej terapii termicznej glejaka

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67381

⸱

15 listopada 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Anatomy and Cell Sciences, University of Manitoba, 2Department of Pathology, University of Manitoba, 3Department of Medical Microbiology & Infectious Diseases, University of Manitoba, 4CancerCare Manitoba

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Glejak jest wyniszczającą formą pierwotnego raka mózgu, a laserowa śródmiąższowa terapia termiczna staje się obiecującą alternatywą dla konwencjonalnej chirurgicznej resekcji nieoperacyjnego glejaka. Protokół ten opisuje zoptymalizowany przedkliniczny model myszy, który można wykorzystać do badania efektów leczenia lub leczenia uzupełniającego i skojarzonego.

Streszczenie

Glejak (GB), najbardziej agresywna forma pierwotnego raka mózgu, stanowi około połowy wszystkich pierwotnych guzów mózgu wysokiego stopnia u dorosłych i nie ma na nią lekarstwa. Laserowa śródmiąższowa terapia termiczna (LITT) jest zatwierdzoną przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) metodą leczenia GB i jest stosowana u pacjentów, którzy mogą nie być kandydatami do konwencjonalnej resekcji chirurgicznej. Chociaż skuteczność kliniczna LITT została ustalona, badania wykraczające poza kliniczne studia przypadków i serie przypadków są ograniczone i utrudnione przez brak ustalonego modelu zwierzęcego. Protokół ten wykorzystuje myszy C57BL / 6 i syngeniczną linię komórkową raka glejaka CT2A do dokładnego odtworzenia ludzkiego GB, przy użyciu lasera 1064 nm z granatu itrowo-aluminiowego domieszkowanego neodymem (Nd: YAG), takiego jak stosowany w jednym z dwóch zatwierdzonych przez FDA systemów LITT, zapewniających doskonałe znaczenie przedkliniczne. Pomyślne opracowanie tego mysiego modelu LITT będzie stanowić cenną platformę do badania unikalnych cech ablacji LITT i jej wpływu na mikrośrodowisko guza, potencjalnie prowadząc do ulepszenia strategii terapeutycznych.

Wprowadzenie

Rak jest główną przyczyną zgonów w Kanadzie. Glejak wielopostaciowy (GB), najczęstsza forma agresywnego guza mózgu, stanowi od 48% do 60% wszystkich pierwotnych guzów mózgu o wysokim stopniu złośliwości u dorosłych1. Rokowanie dla GB jest szczególnie ponure, z 5-letnim przeżyciem netto wynoszącym 4,8% przy konwencjonalnym leczeniu, w tym resekcji chirurgicznej, chemio- i radioterapii1,2.

Laserowa Śródmiąższowa Terapia Termiczna (LITT) to zatwierdzona przez FDA procedura wykorzystująca laser do hipertermicznej ablacji guzów in-situ u pacjentów z nieoperacyjnymi guzami mózgu i stanowi atrakcyjną alternatywę terapeutyczną dla konwencjonalnej resekcji chirurgicznej3. Brakuje jednak szczegółowego i dobrze scharakteryzowanego mysiego modelu leczenia LITT GB, co utrudnia badania przedkliniczne.

Ten protokół ma na celu zaprezentowanie zoptymalizowanego przedklinicznego modelu mysiego do leczenia GB za pomocą LITT. Zdecydowaliśmy się użyć myszy C57BL / 6 i linii komórkowej glejaka syngenicznego CT2A do tego modelu, przede wszystkim dlatego, że CT2A ściśle rekapituluje ludzką GB o wysokim stopniu złośliwości o podobnych cechach histologicznych, inwazyjności, oporności na chemo- i radioterapię oraz cechach podobnych do łodygi z samoodnawianiem i ponownym ustanawianiem nowotworów4. Cechy te stanowią doskonałą platformę dla różnorodnych badań obejmujących odpowiedzi immunologiczne lub nowatorskie strategie terapeutyczne. Co więcej, techniczne aspekty tego protokołu LITT można również łatwo dostosować do innych modeli mysich allo- i ksenoprzeszczepów4,5,6, które zostaną omówione dalej.

Zalety tego protokołu obejmują spójne wyniki z prostym, ale skutecznym paradygmatem leczenia LITT. Zastosowany laser z granatu itrowo-glinowego (Nd:YAG) o długości fali 1064 nm jest taki sam, jak stosowany klinicznie w jednym z dwóch obecnie zatwierdzonych przez FDA systemów, co pozwala na eksperymenty, które są ściśle równoległe do klinicznego zastosowania LITT w leczeniu glejaka o wysokim stopniu złośliwości. Podstawową wadą tego protokołu jest wyjątkowa ostrożność, którą należy zachować zarówno podczas implantacji komórek nowotworowych, jak i leczenia LITT, aby osiągnąć powtarzalne wyniki. Dodatkowo, ze względu na agresywny charakter linii komórkowej CT2A, protokół jest bardzo wrażliwy na czas. Większość eksperymentów będzie musiała zostać zakończona w ciągu maksymalnie 20 dni, co może ograniczyć badania niektórych adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych lub innych mechanizmów komórkowych i molekularnych zachodzących w dłuższym okresie czasu.

Protokół

Etyka zwierząt dla tego protokołu została zatwierdzona przez Komitet Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Manitoba zgodnie z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez Kanadyjską Radę Opieki nad Zwierzętami (CCAC). W protokole tym wykorzystano 8-12-tygodniowe immunokompetentne myszy C57BL/6 i linię komórkową glejaka syngenicznego CT2A do modelu przedklinicznego o szerokim zakresie zastosowań, w tym eksperymentów skoncentrowanych na analizie histologicznej, zmianach immunologicznych lub skojarzonych interwencjach terapeutycznych. Protokół można łatwo dostosować do innych gatunków myszy lub linii komórkowych w oparciu o wymagania eksperymentalne.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Graficzny schemat podstawowego projektu eksperymentalnego. Utworzono za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie komórek w skrócie (Dzień 0)

  1. Przed rozpoczęciem hodowli komórkowej upewnij się, że szafka i wszystkie wymagane pipety są całkowicie wysterylizowane promieniami UV i etanolem.
  2. Ogrzej DMEM/F12 10% pożywką FBS, solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i trypsyną do temperatury pokojowej (RT) za pomocą łaźni wodnej.
  3. Odpipetować pożywkę z kolby T25 i krótko przepłukać komórki PBS. Dodaj 1 ml trypsyny do komórek i inkubuj przez 30-60 sekund, aż komórki oderwą się od kolby.
  4. Potwierdź oderwane komórki pod mikroskopem świetlnym i dodaj 4 ml pożywki, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną trypsyny.
  5. Zliczanie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
    1. Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego, a następnie dodać 10 μl do szkiełka do liczenia komórek.
    2. Włóż szkiełko do maszyny do liczenia komórek i zapisz całkowitą liczbę komórek, liczbę komórek na żywo i procent komórek na żywo.

UWAGA: Jeśli automatyczna maszyna do liczenia komórek nie jest dostępna, można przeprowadzić ręczne liczenie za pomocą hemocytometru.

  1. Oblicz liczbę komórek potrzebnych do wszystkich planowanych wstrzyknięć.
    UWAGA: W przypadku CT2A zaleca się 5000 komórek na 1,5 μl wstrzykniętej objętości i minimum 100 μl całkowitej objętości dla każdego preparatu.
  2. Wiruj komórki w odległości 134 x g przez 5 minut, aby granulować komórki i zassać jak najwięcej pożywki.
  3. Zawiesić osad komórkowy z 5% ekstraktem z błony podstawnej w PBS na potrzebną objętość w probówce mikrowirówkowej. Podczas gdy mniejsze probówki najlepiej nadają się do przygotowania zawiesiny komórek, probówka o pojemności 2 ml jest lepsza do przechowywania podczas operacji, ponieważ komórki są mniej podatne na zlepianie się w bardziej zaokrąglone dno i łatwo rozprowadzają się z delikatnym przesuwaniem.
  4. Utrzymuj komórki na lodzie do wstrzykiwań, przygotowując świeże zawiesiny komórek co 4-5 godzin w razie potrzeby.

2. Implantacja ortotopowa (Dzień 0)

  1. Przygotuj obszar operacyjny i upewnij się, że wszystkie wymagane narzędzia są sterylne i gotowe do użycia.
  2. Znieczulij mysz za pomocą izofluranu (3% odparowanego w 1 l/minO2) w komorze, monitorując częstość oddechów (docelowo 60 uderzeń na minutę).
  3. Uzyskanie i zarejestrowanie masy ciała zwierzęcia do dawkowania leków.
  4. Ostrożnie ogol obszar operacyjny, aby uniknąć oczu, uszu i wąsów.
  5. Przenieś zwierzę do ramy stereotaktycznej.
    1. Umieść siekacze w otworze pręta gryzowego i wyreguluj nosek, aż będzie dobrze dopasowany, dokręcając mocującą, aby zabezpieczyć.
    2. Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą obustronnego szczypania palców kończyn tylnych kończyn i w razie potrzeby zabezpiecz czaszkę za pomocą zatyczek do uszu i ustaw głowę zwierzęcia w neutralnej, poziomej pozycji.
    3. Monitoruj temperaturę wnętrza zwierzęcia za pomocą nasmarowanej sondy temperatury doodbytniczej i zapewnij dodatkowe ogrzewanie w temperaturze 37 °C za pomocą poduszki grzewczej pod ciałem.
      UWAGA: Uważaj, aby nie dokręcić nosa zbyt mocno, ponieważ nawet umiarkowany nacisk na kość nosową może spowodować zatrzymanie oddechu. Jeśli używana jest elektryczna poduszka grzewcza (np. poduszka grzewcza do terrarium), upewnij się, że ustawienia temperatury są dokładne, a ustawiona temperatura pozostaje stała.
  6. Nałóż obficie maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
  7. Stosować zastrzyki profilaktyczne i sprawdzać głębokość znieczulenia.
    1. Wstrzyknąć podskórnie (s.c.) meloksykam lub inny długo działający lek przeciwbólowy zgodnie z lokalnymi wytycznymi dla zwierząt (np. 5,0 mg/kg meloksykamu) za pomocą strzykawki 28 G x 1/2".
    2. Podać wstrzyknięcie 20 mg/kg s.c. podgrzanej soli fizjologicznej w celu profilaktycznego wspomagania płynów podczas dłuższych zabiegów.
    3. Zmniejsz środek znieczulający do 1,5%-2,0% izofluranu, aby utrzymać docelową częstość oddechów.
  8. Stosując technikę aseptyczną, ułóż zwierzę i przygotuj obszar operacyjny.
    1. Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika nałóż roztwór dezynfekujący z jodonem lub chlorheksydyną. Zaczynając przyśrodkowo w miejscu nacięcia i obracając wacik po każdym przejściu, pracuj na zewnątrz, a następnie za pomocą świeżego sterylnego wacika nałóż 70% etanolu na miejsce w podobny sposób.
    2. Powtórz peeling jodem, a następnie 70% etanolem jeszcze dwa razy (łącznie 3 razy każdy).
  9. Ponownie sprawdź głębokość znieczulenia przed przystąpieniem do ekspozycji chirurgicznej. Uważnie monitoruj częstość oddechów przez cały czas trwania zabiegu i w razie potrzeby dostosuj znieczulenie.
  10. Zaczynając od linii środkowej i nieco z tyłu od oczu, wykonaj 1-1,5 cm nacięcie w połowie strzałki w kierunku ogonowym za pomocą skalpela z ostrzem #15. Alternatywnie, przedłuż krótkie nacięcie skalpela za pomocą nożyczek do tęczówki.
    UWAGA: Nacięcia powinny zaczynać się w linii środkowej, ale w przypadku wstrzyknięć jednostronnych mogą być lekko pochylone na boki, aby ułatwić jednoczesną wizualizację i dostęp do Bregmy i lokalizacji otworu w zadziorze.
  11. Za pomocą sterylnego bawełnianego wacika odbij krawędzie rany, aby uwidocznić czaszkę i delikatnie zetrzyj tkankę łączną z tego obszaru.
    1. W razie potrzeby użyj sterylnego bawełnianego wacika nasączonego nadtlenkiem wodoru, aby oczyścić powierzchnię czaszki i uwidocznić szwy czaszkowe.
  12. Zlokalizuj Bregmę w miejscu, w którym lewy i prawy szew koronalny spotykają się na linii środkowej ze szwem strzałkowym (patrz Rysunek 2).
    1. Używając nietoksycznej kolorowej żywicy akrylowej i sterylnej drewnianej wykałaczki lub podobnego, zrób bardzo mały znak na Bregma.
      UWAGA: W niektórych przypadkach lewe i prawe szwy koronalne nie są ze sobą zdublowane; W takich przypadkach należy użyć "linii najlepszego dopasowania", aby przybliżyć miejsce, w którym powinny się one przeciąć wzdłuż środkowej płaszczyzny strzałkowej.
  13. Upewnij się, że głowa zwierzęcia nie jest przechylona ani obrócona (tj. w płaskiej płaszczyźnie).
    1. Zerowe współrzędne stereotaktyczne w Bregmie. Współrzędna x odnosi się do ruchu w płaszczyźnie przyśrodkowo-bocznej (ML), współrzędna y w płaszczyźnie przednio-tylnej (AP), a współrzędna z w płaszczyźnie grzbietowo-brzusznej (DV).
    2. Upewnij się, że Lambda znajduje się w tej samej płaszczyźnie DV co Bregma (tj. z = 0 w obu punktach orientacyjnych). Podobnie, w odległości +2,0 mm (x = 2) i -2,0 mm (x = -2,0) w bok od Bregmy, upewnij się, że czaszka znajduje się w tej samej płaszczyźnie, przy czym współrzędna DV/z jest mniej więcej równa. Upewnij się, że czaszka jest bezpieczna i nie porusza się po jakichkolwiek regulacjach.
  14. Wywierć otwór na zadziory o średnicy +2,0 mm (ML) i +0,5 mm (AP) firmy Bregma (Rysunek 3).
    1. Używając nasadki do wiercenia stereotaktycznego, ostrożnie opuść końcówkę wiertła, aż zetknie się z Bregmą i wyzeruj współrzędne.
    2. Lekko podnieś wiertło i ustaw wiertło na odpowiednie współrzędne AP i ML.
    3. Powoli opuszczaj wiertło, uważając, aby zadziorać tylko czaszkę.
    4. Alternatywnie, używając mikrolitrowej strzykawki w ramce stereotaktycznej, opuść igłę, aż zetknie się z Bregmą i wyzeruj współrzędne.
    5. Lekko podnieś wskazówkę i dostosuj do odpowiednich współrzędnych AP i ML.
    6. Opuść końcówkę, aż dotknie czaszki i zanotuj dokładne położenie.
    7. Lekko podnieś igłę i zrób mały znak w miejscu docelowym za pomocą markera chirurgicznego.
    8. Podnieś lub obróć nośnik igły z drogi i za pomocą wiertarki ręcznej przebij czaszkę, uważając, aby nie uszkodzić mózgu pod spodem. UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, starsze samce myszy mają stosunkowo grubsze czaszki i wymagają bardziej intensywnego wiercenia. Wiercenie ręczne powinno być wykonywane ostrożnie, stosując minimalny nacisk, ponieważ nagłe pęknięcia w czaszce uszkodzą leżące pod nią opony mózgowe i/lub mózg.
      UWAGA: Przedłużenie otworu na zadziory jest konieczne, aby pomieścić sondę termopary podczas procedury LITT. Można to zrobić łatwiej podczas początkowej operacji iniekcji i ułatwia szybszą i bardziej usprawnioną operację LITT. Alternatywnie, otwór zadziorowy może zostać przedłużony w ten sam sposób podczas operacji LTT, co może zmniejszyć ryzyko wzrostu guza pozaczaszkowego.
  15. Utworzyć drugi otwór pod zadziorem na głębokości +3,0 mm ML i +0,5 mm AP (1,0 mm w bok miejsca wstrzyknięcia) dla termopary.
    1. Postępuj zgodnie z procedurą wiercenia, jak opisano w poprzednim kroku.
    2. Aby uniknąć trudności związanych z odrastaniem kości, usuń kość między dwoma otworami.
      UWAGA: Zaleca się użycie +2,0 mm ML, +0,5 mm AP i -2,5 mm DV firmy Bregma jako współrzędnych do implantacji guza. To umiejscowienie w górnym prążkowiu zapewnia stały wzrost guza, który jest dobrze tolerowany przez zwierzęta - jednak protokół można dostosować do innych lokalizacji.
  16. Przygotować zawiesinę komórek glejaka myszy CT2A w mikrolitrowej strzykawce (5000 komórek w 1,5 μl).
    1. Wyjmij wstępnie przygotowaną probówkę mikrowirówki z komórkami z lodu i delikatnie strzepnij opuszkiem palca, aby ponownie zawiesić.
    2. Delikatnie pobrać 2 μl do strzykawki o pojemności 5 μl lub 10 μl, uważając, aby nie powstały pęcherzyki.
    3. Odciągnij 0,5 μl, aby usunąć powietrze i upewnić się, że igła jest zagruntowana i działa prawidłowo.
    4. Przetrzyj trzon igły wacikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć odciągnięty płyn i wszelkie komórki na powierzchni zewnętrznej (co może spowodować wzrost guza opon mózgowo-rdzeniowych).
  17. Załadować strzykawkę do pompy strzykawkowej z mikrowstrzykiwaczami (lub ręcznej nasadki stereotaktycznej) i powoli opuścić igłę.
    1. Powoli opuścić igłę na głębokość (z = -3,0 mm) i zrobić przerwę na 1 minutę.
    2. Powoli cofnąć igłę na 0,5 mm (z = -2,50 mm) i wstrzyknąć komórki (≤ 0,5 μl/min). Utrzymuj obszar wokół strzykawki w suchości za pomocą gąbki mikrochirurgicznej, uważając, aby nie uszkodzić igły.
    3. Należy odczekać co najmniej 2 minuty po zakończeniu wstrzyknięcia, a następnie powoli wycofywać strzykawkę przez 3-4 minuty. Upewnij się, że pierwsze 4-5 odstępów między wycofaniem wynosi 100 μm na wycofanie, aby uniknąć wyrwania komórek z ich pierwotnego miejsca wstrzyknięcia.
    4. Za pomocą wacika nasączonego alkoholem delikatnie przetrzeć zewnętrzną część igły z krwi lub płynu, a następnie przepłukać i wyczyścić strzykawkę zgodnie z wytycznymi producenta. Pomiędzy wstrzyknięciami należy stosować PBS i wodę destylowaną, aby upewnić się, że igła nie zatka się. Po zakończeniu wstrzyknięć należy obficie przepłukać igłę 70% etanolem, aby usunąć wszelkie pozostałe komórki z igły.
      UWAGA: Nieprzepłukiwanie igły po każdym wstrzyknięciu może spowodować jej zablokowanie. W przypadku wstrzykiwania więcej niż jednego typu komórek, należy użyć oddzielnej igły dla każdego typu, aby uniknąć ewentualnego zanieczyszczenia krzyżowego.
  18. Ponownie przybliż nacięcie, uważając, aby lekko odciąć krawędzie rany, tak aby leżąca pod spodem skóra właściwa dotykała się. Zamknij ranę za pomocą klipsa do rany lub 3 przerwanych szwów ze szwem 5-0. Nanieść roztwór jodu powidonu na zamkniętą ranę.
  19. Wyjąć zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieścić je w wyłożonej papierem klatce ratunkowej na podkładce rozgrzewającej ustawionej na 37 °C. Upewnij się, że zwierzę znajduje się w pozycji leżącej na mostku przed przeniesieniem zwierzęcia z powrotem do klatki domowej z małym naczyniem z mokrą karmą umieszczoną na podłodze klatki.
  20. Obserwuj zwierzę co najmniej dwa razy dziennie, począwszy od dnia zabiegu, przez kolejne 2 dni. Podać meloksykam po 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach lub zgodnie z wytycznymi instytucji.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Graficzna ilustracja czaszki myszy i ważnych anatomicznych punktów orientacyjnych dla chirurgii stereotaktycznej. Utworzono za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Ilustracja graficzna wskazująca lokalizacje otworów na żarna i aparatury laserowej. Ilustracja przedstawiająca względne położenie punktu orientacyjnego Bregma, (A) początkowy otwór w zadziorach dla światłowodu laserowego (A') i (B) drugi lub przedłużony otwór w żarnie dla sondy termopary (B'). Po prawej stronie pokazano wycięty obraz sond światłowodowych i termopar laserowych, ilustrujący, w jaki sposób sondy są stabilizowane w stereotaktycznej stopie końcowej z wstępnie wywierconymi otworami o pożądanym rozmiarze i odstępach. Utworzono za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Monitorowanie obciążenia guzem przed LITT (Dzień 9)

  1. Wykonaj obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) zależnego od T2, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, aby ocenić wzrost guza w dniu poprzedzającym LITT.
    UWAGA: Guzy powinny mieć średnicę ~1,5-2,0 mm.
    1. Uzyskaj odpowiedni skan koronalny całego mózgu myszy przy użyciu następujących parametrów: szybka sekwencja echa wirowego, TR = 5000 ms, TE = 45 ms, ciągi echa = 7, FOV = 30 x 30 mm2, rozmiar matrycy = 250 x 256, całkowita liczba warstw = 18, grubość warstwy = 0,3 mm, średnie = 2,
      UWAGA: Zaleca się również wykonywanie okresowego rezonansu magnetycznego rozpoczynającego się około 6 dnia po implantacji, aby potwierdzić udane przeszczepy allogeniczne i monitorować wzrost guza - szczególnie podczas początkowych eksperymentów - ponieważ nawet subtelne zmiany w procedurze mogą zmienić oś czasu. CT2A jest bardzo agresywny, a zwierzęta muszą być ściśle monitorowane. W tym celu dobrze sprawdza się skan koronalny T2-zależny. Stosowanie komórek CT2A znakowanych fluorescencyjnie lub lucyferyną w połączeniu z systemem obrazowania in vivo (IVIS) może być również odpowiednie, gdy dostęp do rezonansu magnetycznego małych zwierząt nie jest dostępny. Jednak kinetyka wzrostu i inne cechy guza będą się różnić od tego protokołu.

4. Operacja LITT (Dzień 10)

  1. Jak powyżej w sekcji 2, powtórz kroki 2.1-2.13, aby przygotować zwierzę do LITT.
    UWAGA: Gojenie się ran po poprzedniej operacji może przebiegać na różnych etapach w zależności od gatunku i różnic w harmonogramie eksperymentu. Uważaj na cieńszą lub delikatniejszą tkankę podczas wykonywania nacięcia.
  2. Za pomocą sterylnego wacika z bawełnianą końcówką delikatnie oczyść czaszkę, usuwając wszelkie tkanki zasłaniające Bregmę lub wcześniej wykonany otwór w zadziorach. Jeśli to konieczne, ponownie wywierć otwór w zadziorach, chociaż ze względu na szybkość tworzenia się guza CT2A oczekuje się niewielkiego lub żadnego odrostu kości.
  3. Po umieszczeniu mocowania LITT w ramce stereotaktycznej, wyzeruj współrzędne w Bregma dla końcówki światłowodu laserowego.
    UWAGA: Włókno laserowe jest bardzo delikatne i pęka w przypadku zgięcia. Uważaj, aby przestać, gdy tylko końcówka włókna laserowego zetknie się z czaszką.
  4. Lekko podnieś końcówkę i przejdź do żądanych współrzędnych ML i AP, a następnie powoli opuść sondy do docelowej współrzędnej DV, aby dotrzeć do celu (2.0 mm ML, 0.5 mm AP, -2.0 mm DV).
  5. Ustaw parametry leczenia LITT: Tryb: ciągły; Moc: 1 W
  6. Przełącz laser z trybu gotowości na aktywny i włącz laser na 60 s za pomocą pedału nożnego. Jeśli temperatura wzrośnie powyżej 46 °C, zatrzymaj się na chwilę, a następnie włącz ponownie, próbując utrzymać temperaturę jak najbliżej 46 °C.
  7. Powoli schuj zespół lasera i delikatnie wytrzyj włókno lasera i termoparę do czysta wacikiem nasączonym alkoholem. Obróć zespół na bok, uważając, aby sondy nie stykały się z ramą.
  8. Zamknij ranę i odzyskaj zwierzę zgodnie z opisem w krokach 2.18-2.20 po implantacji guza powyżej.

5. Ocena po LITT (Dzień 11)

  1. Wykonaj rezonans magnetyczny po LITT T2 zależny następnego dnia po leczeniu LITT, aby ocenić powodzenie ablacji guza LITT przy użyciu sekwencji i parametrów z kroku 3.1 powyżej.
    UWAGA: Dodatkowo sekwencja odzyskiwania inwersji atenuowanej płynem (FLAIR) może być również pomocna w ocenie obrzęku pooperacyjnego.
  2. Wykonaj badania kontrolne przed zakończeniem badania w celu monitorowania zmian po leczeniu lub odrastania guza.

6. Koniec badania (Dzień 11/Dzień 15/Dzień 20)

  1. Poddaj eutanazji zwierzęta w wybranych eksperymentalnych punktach końcowych zgodnie z wytycznymi instytucji.
    UWAGA: Punkty końcowe późniejsze niż 20 dzień nie są możliwe do osiągnięcia w przypadku CT2A, nawet przy bardzo niskiej liczbie inokulacji komórek, ponieważ zwierzęta kontrolne (tj. pozorowana operacja lub brak leczenia), a niektóre zwierzęta z grupy leczonej mogą być w stanie agonalnym i wymagać eutanazji. W przypadku dłuższych eksperymentów rozważ alternatywne modele komórek glejaka myszy.
  2. Zbierz tkanki do utrwalenia i przetworzenia.
    1. Wykonaj perfuzję serca za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) i zbierz interesujące Cię tkanki.
    2. Po utrwaleniu tkanki mózgowej przez zanurzenie w 4% PFA na noc w temperaturze 4 °C.
    3. Próbki należy przetworzyć przy użyciu standardowych praktyk analizy zatopionej w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE) lub analizy zamrożonej w utrwalonym roztworze.

7. Analiza

  1. Sprawdź powodzenie ablacji LITT za pomocą rezonansu magnetycznego T2-zależnego i zwaliduj za pomocą podstawowych technik histologicznych, takich jak barwienie hematoksyliną i eozyną.
  2. Wykonać wszelkie dodatkowe analizy wymagane do eksperymentów (np. immunohistochemia, immunofluorescencja).

Wyniki

Udane wszczepienie guza CT2A i leczenie LITT można scharakteryzować za pomocą T2-zależnego rezonansu magnetycznego, jak pokazano na Rysunek 4, Rysunek 5, oraz Rysunek 6. Obrazy MR uzyskano przy użyciu bezkriogenicznego magnesu nadprzewodzącego 7T z otworem 17 cm i kwadraturową cewką głowicy myszy przy użyciu parametrów sekwencji opisanych w powyższym protokole. Staranne przestrzeganie tej metody powinno skutkować wskaźnikami przyjmowania zbliżającymi się do 100%, stałą lokalizacją guza i mniej więcej sferycznym tworzeniem guza, jak pokazano na Rysunek 4. Cechy te stanowią optymalną podstawę dla kolejnych zabiegów LITT i wszelkich dalszych analiz. Podobnie, jak widać na Rysunek 5, ablacje LITT powinny być również spójne zarówno pod względem rozmiaru, jak i lokalizacji. Centralny rdzeń tkanki, której poddano ablacji, będzie składał się z martwicy koagulacyjnej i upłynniającej i będzie łatwo uwidoczniony jako hipointensywność (tj.) na rezonansie magnetycznym T2-zależnym. W dniach bezpośrednio po leczeniu LITT typowe jest również, w zależności od zastosowanego leczenia LITT, bardzo intensywny (tj. biały) obszar w zmianie i wokół niej, odpowiadający obrzękowi okołooperacyjnemu. Rysunek 6 pokazuje słaby wynik i podkreśla niektóre z potencjalnych pułapek podczas korzystania z tego protokołu.

figure-results-1
Rysunek 4: T2-ważone koronalne obrazy MR idealnego guza CT2A formacja. Reprezentatywne obrazy powstawania guza u trzech myszy C57BL / 6 (A, B, C) po 12 dniach od implantacji. Białe strzałki wskazują granicę guza. Zwróć uwagę na stałą lokalizację guza i mniej więcej kulistą formację. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 5: T2-zależne obrazy koronalnej MR idealnej ablacji LITT (1 dzień po LITT). Reprezentatywne obrazy ablacji guza LITT u trzech myszy C57BL/6 (A, B, C) po 13 dniach od implantacji. Zwróć uwagę na stałą wielkość i lokalizację rdzenia zmiany martwiczej. Wykonanie rezonansu magnetycznego przed LITT i ablacji LITT nieco wcześniej zapewniłoby lepszą równowagę między optymalną wielkością guza do celowania laserowego a możliwością uzyskania późniejszych punktów końcowych po leczeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 6: T2-zależne obrazy koronalnego MR wstępnie zoptymalizowanych zabiegów LITT. Obrazy z trzech myszy C57BL/6 (A, B, C) potraktowane identycznymi parametrami lasera i celami stereotaktycznymi przed optymalizacją protokołu, jako przykład nieidealnego wyniku. Białe strzałki wskazują granicę guza. Obszary graniczące pokazują obszar obrzęku. Obserwuje się znaczną zmienność, w tym mniej równomierny wzrost guza i słabe ukierunkowanie ablacji laserowej, co skutkuje niespójnym uszkodzeniem tkanki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Istnieje szybko rozwijająca się literatura dotycząca LITT; Jednak przede wszystkim ogranicza się do klinicznych studiów przypadków lub serii przypadków u ludzi. Rzeczywiście, wykazano kilka potencjalnych korzyści dla LITT, w tym niższe wskaźniki powikłań pooperacyjnych i koszty przy jednoczesnym zapewnieniu porównywalnego przeżycia wolnego od progresji 7,8,9,10,11. Obserwuje się również zmniejszenie liczby nawrotów miejscowych przy większym sukcesie ogólnoustrojowego leczenia farmakologicznego, chociaż przyczyny nie są jeszcze dobrze poznane12. Ponadto obiecujące wyniki do zastosowań klinicznych poza Wielką Brytanią obejmują leczenie przerzutów i innych typów nowotworów 3,12, martwicy popromiennej13, padaczki opornej na leczenie14, malformacji naczyniowych15, a nawet zaburzeń obsesyjno-kompulsywnych16. I odwrotnie, badania z wykorzystaniem modelu mysiego są jak dotąd bardzo ograniczone, z kilkoma godnymi uwagi wyjątkami, które mogą być trudne do powtórzenia. Na przykład w niedawnym badaniu dotyczącym zmian przepuszczalności bariery krew-mózg po leczeniu LITT wykorzystano generator laserowy sprzedawany w Europie do użytku klinicznego, ale instrument ten nie został zatwierdzony w Ameryce Północnej17. Chociaż taki system wydaje się dobrze pasować do ich badań, uzyskanie urządzenia jest prawdopodobnie zbyt kosztowne dla większości badaczy, a wszelkie zastrzeżone lub wysoce zaawansowane technologicznie funkcje są trudne do odtworzenia. W związku z tym szczegółowy protokół dostępnego i zoptymalizowanego przedklinicznego modelu zwierzęcego zapewni cenne możliwości badawcze.

Kluczowe kroki w protokole obejmują dokładną identyfikację szczepionki Bregma w celu powtarzalnego celowania zarówno podczas przeszczepu allogenicznego, jak i późniejszej operacji ablacji LITT. Dodatkowo, zwrócenie szczególnej uwagi na etapy iniekcji w stosunku do szybkości podawania i przerw ma kluczowe znaczenie dla udanych przeszczepów komórek nowotworowych, a niewykonanie tego znacznie zwiększa ryzyko wzrostu guza pozaczaszkowego i większej zmienności guza. Ważne jest również, aby podkreślić, że operacja LITT powinna być zaplanowana, gdy guz jest jeszcze stosunkowo mały (tj. ~1,5-2,0 mm średnicy). Z naszego doświadczenia wynika, że guzy CT2A często stają się bardziej zmienne w kształcie, gdy są duże, a bardzo duże guzy również zwiększają trudność ekstrakcji mózgu, zwłaszcza jeśli guz wyrósł przez powierzchnię kory mózgowej. Należy również zauważyć, że zaledwie 24 godziny, takie jak między rezonansem magnetycznym przed leczeniem a operacją LITT, to wystarczający czas na znaczny wzrost glejaka CT2A.

W protokole można łatwo wprowadzić kilka modyfikacji, aby dostosować go do innych projektów eksperymentalnych. W szczególności protokół ten koncentruje się na krokach technicznych niezbędnych do udanej implantacji ortotopowej i operacji LITT w syngenicznym modelu myszy C57BL/6 CT2A. Jednak opisany model można łatwo zastąpić, aby dostosować go do różnych celów eksperymentalnych. Mniej agresywne syngeniczne linie komórkowe raka, takie jak K1491, mogą być wykorzystywane do przeprowadzania eksperymentów wymagających dłuższych punktów czasowych, takich jak te obejmujące wrodzoną i nabytą odpowiedź immunologiczną. Alternatywnie, w przypadku eksperymentów, które nie koncentrują się na adaptacyjnych odpowiedziach guza-gospodarza, linie komórkowe pochodzące od pacjenta lub inne modele ksenoprzeszczepów w modelach myszy z obniżoną odpornością są inną realną opcją. Dla zainteresowanego czytelnika Haddad i in. (2021) zapewniają kompleksowy przegląd mocnych stron i ograniczeń kilku powszechnych modeli myszy z przeszczepem allogenicznym i ksenoprzeszczepem4. Inną prostą modyfikacją, w zależności od dostępności instytucjonalnej i wytycznych, jest zastąpienie wziewnego środka znieczulającego alternatywami do wstrzykiwań, takimi jak połączenie ketaminy i ksylazyny ± acepromazyny. Jednakże, gdy dostępne są środki wziewne i wymagany sprzęt (np. nosek stereotaktyczny), zalecamy ich stosowanie z kilku powodów. Po pierwsze, uważamy, że wziewne środki znieczulające są bezpieczniejszą alternatywą, ponieważ nie wymagają wstrzyknięcia dootrzewnowego, nie wymagają wielokrotnego dawkowania w przypadku dłuższych lub trudniejszych operacji i można je łatwo miareczkować z dużym marginesem bezpieczeństwa18. Ponadto znieczulenie wziewne nie wymaga stosowania substancji kontrolowanych i zapewnia szybkie wybudzenie i powrót do zdrowia po zabiegu.

Rozwiązywanie problemów związanych z tym protokołem powinno być minimalne, a większość problemów wynika ze złej techniki wstrzykiwania, co skutkuje nieregularnym tworzeniem się guza lub wzrostem pozaczaszkowym. Problemy z celowaniem LITT można rozwiązać dzięki właściwej identyfikacji punktów orientacyjnych, odpowiedniej stabilizacji światłowodu laserowego i uważnej obserwacji włókna laserowego podczas wprowadzania, aby upewnić się, że nie uderza on w bok otworu w zadziorach i nie zostaje zepchnięty z kursu.

Ograniczenia metody obejmują średni i zaawansowany poziom umiejętności chirurgicznych i technicznych wymaganych do wykonywania zabiegów, dostęp do specjalistycznego sprzętu, takiego jak aparat do rezonansu magnetycznego małych zwierząt, oraz długi protokół implantacji ortotopowej, który ogranicza liczbę zastrzyków, które można wykonać w ciągu jednego dnia. Ponieważ protokół ten ma być przedklinicznym modelem glejaka o wysokim stopniu złośliwości, istnieją również nieodłączne ograniczenia związane z bardziej agresywnym charakterem niektórych linii komórkowych glejaka, takich jak CT2A. Szczepienia o niskiej liczbie komórek, głębokie miejsce wstrzyknięcia w prążkowiu, ostrożna technika wstrzykiwania i wczesne leczenie pomogą złagodzić te problemy, ale sporadyczny pozaczaszkowy lub nieregularny wzrost guza może nadal występować, a krótkie projekty eksperymentalne są uzasadnione. Jak wspomniano, modyfikacja tego protokołu za pomocą mniej agresywnej linii komórkowej jest również łatwa do osiągnięcia.

Ponieważ protokół ten jest, według naszej wiedzy, jedynym szczegółowym opisem przedklinicznego modelu mysiego dla LITT of GB, jest to znaczący krok w kierunku zapewnienia dobrze ugruntowanego modelu dla przyszłych badań z zakresu nauk podstawowych.

Oświadczenia

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony Monteris Medical, w tym za darowiznę rzeczową w postaci sprzętu laserowego.

Podziękowania

Źródła finansowania tego projektu to m.in. Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC)-Alliance, Mitacs-Accelerate, Research Manitoba-IPOC, Canadian Institutes for Health Research (CIHR) CGS-M oraz University of Manitoba Graduate Fellowship. Linia komórkowa glejaka CT2A hojnie podarowana przez dr Petera Fecci z Duke University, Durham, NC. Chcielibyśmy również podziękować Laboratorium Usług Histologicznych oraz Ośrodku Obrazowania Małych Zwierząt i Materiałów na Uniwersytecie Manitoba za ich doskonałą pomoc techniczną w tym projekcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Włócznie absorpcyjneFST18105-01Gąbki hemostatyczne.
Kleszczyki do tkanek AdsonFST11006-12
C57BL/6 myszyJackson LaboratoriesStrain #0006646 do 12 tygodni męskie i żeńskie
aplikatory z bawełnianą końcówką (6 ")Mikroskopia elektronowa Sciences72308
LiniaHojnie podarowana od dr Petera Fecci, Duke University.
Ekstrakt z błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu Cultrex, PathClearBiotechne, R& Systemy D3433-010-01
DMEM/F-12, HEPESGibco, ThermoFisher Scientific11330032
Prowadnice dwukomorowe BIO-RAD1450003
Probówki Eppendorf Safe-Lock 2,0 mlEppendorf22363352
Bezwodny alkohol etylowyGreenfield GlobalP016EAANRozcieńczony do 70% z ddH2O
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, KanadaGibco, ThermoFisher Scientific12483020
Glad Press-n-Sealfolia
Wiertarka szybkoobrotowaKopf InstrumentsModel 1474
K & J Termopara miernik temperaturyOmegaHH509R
Metacam (meloksykam)WDDC114424
Pompa strzykawkowa do mikroiniekcjiWPIUMP3T-1
Strzykawka mikrolitrowa (seria 700)Hamilton87908Dostępne są niestandardowe igły. Stromy skos igły pomaga w precyzyjnym podawaniu, a krótsza długość igły pomaga w stabilności.
Sterownik igły/uchwyt igłyFST12500-12Cienka końcówka jest najbardziej odpowiednia ze względu na ograniczoną przestrzeń roboczą, ale wiele stylów jest odpowiednich w zależności od preferencji uchwytu.
Maść okulistyczna Opixcare PlusWDDC135941
buforowana fosforanem (10x)Odczynniki FisherBP399-4Rozcieńczyć do 1x z ddH2O
Powidon-jodThermoFisher Scientific3955-16Aliquat do mniejszych tubek do stosowania z aplikatorami z bawełnianą końcówką.
Sól fizjologiczna (normalna)Skalpel WDDC126588
, jednorazowego użytku (#15 Ostrze)Nożyczkipiór Feather NO15
, drobne chirurgiczneFST91460-11Cienkie nożyczki studenckie, Iris lub Bonn są odpowiednie.
Ramka stereotaktycznaKopf InstrumentsModel 940Z cyfrowym wyświetlaczem, konsolą i stożkiem myszy oraz nausznikami.
Stereotaktyczny uchwyt na strzykawkęKopf InstrumentsModel 1772-FJeśli nie używasz pompy wtryskowej.
Nici (5-0 monofilament)EthiconMCP463GMonocryl fioletowa żyłka z odwróconą końcówką tnącą
Strzykawka, 28 G  (0,5 ml) BDBD 329461Strzykawki insulinowe BD Lo-Dose U-100
TC20 Automatyczny licznik komórekBIO-RAD1450102
Sonda termopary, drobna średnica (Typ K)OmegaTJM-CA316-IM025G-150
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco, ThermoFisher Scientific25200072
Vetbond firmy 3M, klej do tkanek weterynaryjnych WDDC126125
Maszynka do strzyżenia orzechów ziemnych WahlWDDC/Wahl100963Dostępny również bezpośrednio od producenta.
Podkładka rozgrzewającaBensen Medical70308/121873Można użyć dowolnego podobnego przedmiotu.
Webcol Alcohol prepsMikroskopia elektronowa Sciences71005-20Chusteczka nasączona alkoholem, 2-warstwowa, średniej wielkości.
komórkowa glejaka CT2A plastikowa Amazon.ca 12587704417 Sól fizjologiczna z

Bibliografia

  1. Canadian Cancer Society. Cancer Statistics 2023. , Canadian Cancer Statistics Advisory Committee in collaboration with the Canadian Cancer Society, Statistics Canada and the Public Health Agency of Canada. Toronto, ON. http://cancer.ca/Canadian-Cancer-Statistics-2023-EN (2023).
  2. Glioblastoma Research Organization. Glioblastoma Research Organization. , https://www.gbmresearch.org (2024).
  3. Carpentier, A., et al. Laser thermal therapy: Real-time MRI-guided and computer-controlled procedures for metastatic brain tumors. Lasers Surg Med. 43 (10), 943-950 (2011).
  4. Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neurooncol Adv. 3 (1), vdab100(2021).
  5. Chokshi, C. R., Savage, N., Venugopal, C., Singh, S. K. A patient-derived xenograft model of glioblastoma. STAR Protoc. 1 (3), 100179(2020).
  6. Alcaniz, J., et al. Clinically relevant glioblastoma patient-derived xenograft models to guide drug development and identify molecular signatures. Front Oncol. 13, 1129627(2023).
  7. Muir, M., et al. Laser interstitial thermal therapy for newly diagnosed glioblastoma. Lasers Med Sci. 37 (3), 1811-1820 (2022).
  8. Muir, M., Traylor, J. I., Gadot, R., Patel, R., Prabhu, S. S. Repeat laser interstitial thermal therapy for recurrent primary and metastatic intracranial tumors. Surg Neurol Int. 13, 311(2022).
  9. De Groot, J. F., et al. Efficacy of laser interstitial thermal therapy (LITT) for newly diagnosed and recurrent IDH wild-type glioblastoma. Neurooncol Adv. 4 (1), vdac040(2022).
  10. Holste, K. G., Orringer, D. A. Laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdz035(2020).
  11. Leuthardt, E. C., Voigt, J., Kim, A. H., Sylvester, P. A single-center cost analysis of treating primary and metastatic brain cancers with either brain laser interstitial thermal therapy (LITT) or craniotomy. Pharmacoecon Open. 1 (1), 53-63 (2017).
  12. Bastos, D. C. D. A., et al. Predictors of local control of brain metastasis treated with laser interstitial thermal therapy. Neurosurgery. 87 (1), 112-122 (2020).
  13. Darbinyan, A., Leelatian, N., Fomchenko, E. I. Histological changes associated with laser interstitial thermal therapy for radiation necrosis: illustrative cases. J Neurosurg Case Lessons. 4 (1), CASE21373(2022).
  14. Grant, G. A., Porter, B. E., Li, D., Barros Guinle, M. I., Kaur, H. Approach, complications, and outcomes for 37 consecutive pediatric patients undergoing laser ablation for medically refractory epilepsy at Stanford Children's Health. J Neurosurg Pediatr. 33 (1), 1-11 (2023).
  15. Ogasawara, C., et al. Laser interstitial thermal therapy for cerebral cavernous malformations: A systematic review of indications, safety, and outcomes. World Neurosurg. 166, 279-287.e1 (2022).
  16. Satzer, D., Mahavadi, A., Lacy, M., Grant, J. E., Warnke, P. Interstitial laser anterior capsulotomy for obsessive-compulsive disorder: lesion size and tractography correlate with outcome. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 93 (3), 317-323 (2022).
  17. Salehi, A., et al. Therapeutic enhancement of blood-brain and blood-tumor barriers permeability by laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa071(2020).
  18. Navarro, K. L., Huss, M., Smith, J. C., Sharp, P., Marx, J. O., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mysi model glejaka wielopostaciowegoablacja guza m zguchirurgia stereotaktycznakom rki glejaka CT2Amikro rodowisko guzatermiczna ablacja tkanekobrazowanie MRIimplantacja guzamartwica tkanek

Powiązane artykuły