Artykuł metodologiczny

Immunokompetentny mysi model do laserowej śródmiąższowej terapii termicznej glejaka

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67381

⸱

15 listopada 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Anatomy and Cell Sciences, University of Manitoba, 2Department of Pathology, University of Manitoba, 3Department of Medical Microbiology & Infectious Diseases, University of Manitoba, 4CancerCare Manitoba

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Glejak jest wyniszczającą formą pierwotnego raka mózgu, a laserowa śródmiąższowa terapia termiczna staje się obiecującą alternatywą dla konwencjonalnej chirurgicznej resekcji nieoperacyjnego glejaka. Protokół ten opisuje zoptymalizowany przedkliniczny model myszy, który można wykorzystać do badania efektów leczenia lub leczenia uzupełniającego i skojarzonego.

Streszczenie

Glejak (GB), najbardziej agresywna forma pierwotnego raka mózgu, stanowi około połowy wszystkich pierwotnych guzów mózgu wysokiego stopnia u dorosłych i nie ma na nią lekarstwa. Laserowa śródmiąższowa terapia termiczna (LITT) jest zatwierdzoną przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) metodą leczenia GB i jest stosowana u pacjentów, którzy mogą nie być kandydatami do konwencjonalnej resekcji chirurgicznej. Chociaż skuteczność kliniczna LITT została ustalona, badania wykraczające poza kliniczne studia przypadków i serie przypadków są ograniczone i utrudnione przez brak ustalonego modelu zwierzęcego. Protokół ten wykorzystuje myszy C57BL / 6 i syngeniczną linię komórkową raka glejaka CT2A do dokładnego odtworzenia ludzkiego GB, przy użyciu lasera 1064 nm z granatu itrowo-aluminiowego domieszkowanego neodymem (Nd: YAG), takiego jak stosowany w jednym z dwóch zatwierdzonych przez FDA systemów LITT, zapewniających doskonałe znaczenie przedkliniczne. Pomyślne opracowanie tego mysiego modelu LITT będzie stanowić cenną platformę do badania unikalnych cech ablacji LITT i jej wpływu na mikrośrodowisko guza, potencjalnie prowadząc do ulepszenia strategii terapeutycznych.

Wprowadzenie

Rak jest główną przyczyną zgonów w Kanadzie. Glejak wielopostaciowy (GB), najczęstsza forma agresywnego guza mózgu, stanowi od 48% do 60% wszystkich pierwotnych guzów mózgu o wysokim stopniu złośliwości u dorosłych1. Rokowanie dla GB jest szczególnie ponure, z 5-letnim przeżyciem netto wynoszącym 4,8% przy konwencjonalnym leczeniu, w tym resekcji chirurgicznej, chemio- i radioterapii1,2.

Laserowa Śródmiąższowa Terapia Termiczna (LITT) to zatwierdzona przez FDA procedura wykorzystująca laser do hipertermicznej ablacji guzów in-situ u pacjentów z nieoperacyjnymi guzami mózgu i stanowi atrakcyjną alternatywę terapeutyczną dla konwencjonalnej resekcji chirurgicznej3. Brakuje jednak szczegółowego i dobrze scharakteryzowanego mysiego modelu leczenia LITT GB, co utrudnia badania przedkliniczne.

Ten protokół ma na celu zaprezentowanie zoptymalizowanego przedklinicznego modelu mysiego do leczenia GB za pomocą LITT. Zdecydowaliśmy się użyć myszy C57BL / 6 i linii komórkowej glejaka syngenicznego CT2A do tego modelu, przede wszystkim dlatego, że CT2A ściśle rekapituluje ludzką GB o wysokim stopniu złośliwości o podobnych cechach histologicznych, inwazyjności, oporności na chemo- i radioterapię oraz cechach podobnych do łodygi z samoodnawianiem i ponownym ustanawianiem nowotworów4. Cechy te stanowią doskonałą platformę dla różnorodnych badań obejmujących odpowiedzi immunologiczne lub nowatorskie strategie terapeutyczne. Co więcej, techniczne aspekty tego protokołu LITT można również łatwo dostosować do innych modeli mysich allo- i ksenoprzeszczepów4,5,6, które zostaną omówione dalej.

Zalety tego protokołu obejmują spójne wyniki z prostym, ale skutecznym paradygmatem leczenia LITT. Zastosowany laser z granatu itrowo-glinowego (Nd:YAG) o długości fali 1064 nm jest taki sam, jak stosowany klinicznie w jednym z dwóch obecnie zatwierdzonych przez FDA systemów, co pozwala na eksperymenty, które są ściśle równoległe do klinicznego zastosowania LITT w leczeniu glejaka o wysokim stopniu złośliwości. Podstawową wadą tego protokołu jest wyjątkowa ostrożność, którą należy zachować zarówno podczas implantacji komórek nowotworowych, jak i leczenia LITT, aby osiągnąć powtarzalne wyniki. Dodatkowo, ze względu na agresywny charakter linii komórkowej CT2A, protokół jest bardzo wrażliwy na czas. Większość eksperymentów będzie musiała zostać zakończona w ciągu maksymalnie 20 dni, co może ograniczyć badania niektórych adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych lub innych mechanizmów komórkowych i molekularnych zachodzących w dłuższym okresie czasu.

Protokół

Kwestie etyczne dotyczące zwierząt w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (Animal Care Committee) na Uniwersytecie Manitoba zgodnie z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami (Canadian Council for Animal Care, CCAC). W protokole tym wykorzystano zwierzęta w wieku od 8 do 12 tygodni Myszy immunokompetentne szczepu C57BL/6 oraz syngeniczna linia komórkowa glejaka CT2A stanowią model przedkliniczny o szerokim zakresie zastosowań, obejmującym eksperymenty skoncentrowane na analizie histologicznej, zmianach immunologicznych lub kombinowanych interwencjach terapeutycznych. Protokół ten można łatwo dostosować do innych gatunków myszy lub linii komórkowych w zależności od wymagań doświadczalnych.

figure-protocol-1
Rycina 1: Schemat graficzny podstawowego projektu eksperymentalnego. Utworzono w BioRender.com Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Przygotowanie komórek w skrócie (Dzień 0)

  1. Przed rozpoczęciem hodowli komórkowej należy upewnić się, że komora oraz wszystkie wymagane pipety zostały całkowicie wysterylizowane promieniami UV i etanolem.
  2. Podgrzać pożywkę DMEM/F12 z 10% FBS, roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) oraz trypsynę do temperatury pokojowej (RT) w kąpieli wodnej.
  3. Odpipetować pożywkę z kolby T25 i krótko przepłukać komórki roztworem PBS. Dodać 1 mL trypsyny do komórek i inkubować przez 30-60 s aż do odklejenia się komórek od ścianek kolby.
  4. Potwierdzić odklejenie komórek pod mikroskopem świetlnym i dodać 4 mL pożywki, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną trypsyny.
  5. Policzyć komórki przy użyciu automatycznego licznika komórek.
    1. Zmieszać 10 µL zawiesiny komórkowej z 10 µL błękitu trypanu, a następnie nanieść 10 µL na szkiełko do liczenia komórek.
    2. Włożyć szkiełko do licznika komórek i zapisać całkowitą liczbę komórek, liczbę żywych komórek oraz procent żywych komórek.

UWAGA: W przypadku braku automatycznego licznika komórek, można przeprowadzić liczenie ręczne przy użyciu hemocytometru.

  1. Oblicz liczbę komórek wymaganą do wszystkich planowanych iniekcji.
    UWAGA: Dla CT2A zaleca się 5000 komórek na 1.5 µL objętości iniekcyjnej oraz całkowitą objętość preparatu wynoszącą co najmniej 100 µL dla każdej partii.
  2. Wiruj komórki z prędkością 134 x g przez 5 min w celu osadzenia komórek, a następnie odessij jak największą ilość pożywki.
  3. Resuspenduj osad komórkowy w PBS z dodatkiem 5% ekstraktu z błony podstawnej w objętości dostosowanej do potrzeb, używając probówki do mikrocentryfugi. Choć mniejsze probówki najlepiej nadają się do przygotowania zawiesiny komórkowej, probówka o pojemności 2 mL jest lepsza do przechowywania podczas operacji, ponieważ komórki rzadziej skupiają się w bardziej zaokrąglonym dnie i łatwiej ulegają redystrybucji po delikatnym potrząśnięciu.
  4. Przechowuj komórki w lodzie do czasu iniekcji, przygotowując świeże zawiesiny komórkowe co 4-5 h w zależności od potrzeb.

2. Implantacja ortotopowa (Dzień 0)

  1. Przygotować obszar operacyjny i upewnić się, że wszystkie wymagane instrumenty są sterylne i gotowe do użycia.
  2. Zznieczylić mysz izofluranem (3% w formie oparów w przepływie 1 L/min O2) w komorze, monitorując częstotliwość oddechów (cel: 60 bpm).
  3. Zważyć zwierzę i zapisać jego masę w celu obliczenia dawkowania leków.
  4. Ostrożnie ogolić obszar operacyjny, unikając kontaktu z oczami, uszami i wibrysami.
  5. Przenieść zwierzę do zestawu stereotaktycznego.
    1. Umieścić siekacze w otworze listwy zgryzowej i dopasować stożek nosowy, aż będzie ściśle przylegać, a następnie dokręcić śrubę mocującą.
    2. Sprawdzić głębokość znieczulenia poprzez obustronne uciskanie palców kończyn tylnych i, jeśli jest to zasadne, unieruchomić czaszkę za pomocą pinsetów usznych oraz ustawić głowę zwierzęcia w neutralnej pozycji w płaszczyźnie poziomej.
    3. Monitorować temperaturę rdzeniową zwierzęcia za pomocą nasmarowanej sondy rektalnej i zapewnić dodatkowe ogrzewanie w 37 °C za pomocą podkładki grzewczej umieszczonej pod zwierzęciem.
      OSTRZEŻENIE: Należy uważać, aby nie dokręcić zbyt mocno stożka nosowego, ponieważ nawet umiarkowany nacisk na kość nosową może spowodować zatrzymanie oddechu. W przypadku użycia elektrycznej podkładki grzewczej (np. podkładki do terrarium), należy upewnić się, że ustawienia temperatury są dokładne, a temperatura zadana pozostaje stała.
  6. Obficie nałożyć maść oftalmiczną do obu oczu, aby zapobiec ich wysychaniu.
  7. Podać zastrzyki profilaktyczne i sprawdzić głębokość znieczulenia.
    1. Wstrzyknąć podskórnie (s.c.) meloksykam lub inny długo działający lek przeciwbólowy zgodnie z wytycznymi lokalnego ośrodka opieki nad zwierzętami (np. 5,0 mg/kg meloksykamu) za pomocą strzykawki 28 G x ½".
    2. Podać podskórnie 20 mg/kg podgrzanej soli fizjologicznej w celu profilaktycznego wsparcia płynowego podczas dłuższych procedur.
    3. Zredukować stężenie anestetyku do 1,5%–2,0% izofluranu, aby utrzymać docelową częstotliwość oddechów.
  8. Stosując technikę aseptyczną, założyć pole operacyjne i przygotować obszar chirurgiczny.
    1. Za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego nanieść roztwór dezynfekujący z jodopowidonom lub chlorheksydyną. Rozpocząć od środka, w miejscu nacięcia, obracając patyczek po każdym pociągnięciu i kierując się na zewnątrz, a następnie, używając nowego sterylnego patyczka bawełnianego, w podobny sposób nanieść 70% etanol.
    2. Powtórzyć mycie jodem, a następnie 70% etanolem jeszcze dwa razy (łącznie 3 razy każde z nich).
  9. Ponownie sprawdzić głębokość znieczulenia przed przystąpieniem do odsłonięcia chirurgicznego. Przez cały czas trwania procedury ściśle monitorować częstotliwość oddechów i w razie potrzeby korygować dawkę anestetyku.
  10. Zaczynając od linii środkowej, nieco za oczami, wykonać nacięcie pośrodku strzałkowe o długości 1-1,5 cm w kierunku ogonowym za pomocą skalpela z ostrzem #15. Alternatywnie, krótkie nacięcie skalpelem można poszerzyć nożyczkami irydologicznymi.
    UWAGA: Nacięcia powinny zaczynać się w linii środkowej, ale w przypadku wstrzykiwań jednostronnych mogą być skierowane lekko bocznie, aby ułatwić jednoczesną wizualizację i dostęp do Bregma oraz miejsca otworu trepanacyjnego.
  11. Za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego odchylić brzegi rany, aby odsłonić czaszkę i delikatnie usunąć z tego obszaru tkankę łączną.
    1. W razie potrzeby użyć sterylnego patyczka bawełnianego nasączonego nadtlenkiem wodoru, aby oczyścić powierzchnię czaszki i uwidocznić szwy czaszkowe.
  12. Zlokalizować Bregma w miejscu, gdzie lewy i prawy szew czołowy spotykają się w linii środkowej z szwem strzałkowym (patrz Rycina 2).
    1. Za pomocą nietoksycznej kolorowej żywicy akrylowej i sterylnego drewnianego wykałaczkę lub podobnego narzędzia, zrobić bardzo mały znak nad Bregma.
      UWAGA: W niektórych przypadkach lewy i prawy szew czołowy nie są symetryczne; w takich sytuacjach należy zastosować metodę „linii najlepszego dopasowania”, aby przybliżyć miejsce ich przecięcia w płaszczyźnie pośrodku strzałkowej.
  13. Upewnić się, że głowa zwierzęcia nie jest przechylona ani obrócona (tj. znajduje się w płaszczyźnie poziomej).
    1. Wyzerować współrzędne stereotaktyczne w punkcie Bregma. Współrzędna x odnosi się do ruchu w płaszczyźnie przyśrodkowo-bocznej (ML), współrzędna y w płaszczyźnie przednio-tylnej (AP), a współrzędna z w płaszczyźnie grzbietowo-brzusznej (DV).
    2. Upewnić się, że Lambda znajduje się w tej samej płaszczyźnie DV co Bregma (tj. z = 0 w obu punktach orientacyjnych). Podobnie, w punktach +2,0 mm (x = 2) i -2,0 mm (x = -2,0) bocznie od Bregma, upewnić się, że czaszka znajduje się w tej samej płaszczyźnie, a współrzędna DV/z jest w przybliżeniu taka sama. Upewnić się, że czaszka jest stabilna i nie przesuwa się po dokonaniu jakichkolwiek korekt.
  14. Wywiercić otwór trepanacyjny w punkcie +2,0 mm (ML) i +0,5 mm (AP) od Bregma (Rycina 3).
    1. Używając przystawki wiertła stereotaktycznego, ostrożnie opuścić końcówkę wiertła, aż zetknie się ona z Bregma, i wyzerować współrzędne.
    2. Lekko podnieść wiertło i ustawić je na odpowiednich współrzędnych AP i ML.
    3. Powoli opuścić wiertło, dbając o to, aby przewiercić wyłącznie czaszkę.
    4. Alternatywnie, używając strzykawki mikrolitrowej w zestawieniu stereotaktycznym, opuścić końcówkę igły, aż zetknie się ona z Bregma, i wyzerować współrzędne.
    5. Lekko podnieść igłę i ustawić ją na odpowiednich współrzędnych AP i ML.
    6. Opuścić końcówkę, aż dotknie czaszki i odnotować dokładną lokalizację.
    7. Lekko podnieść igłę i zaznaczyć miejsce docelowe małym punktem za pomocą markera chirurgicznego.
    8. Podnieść lub obrócić uchwyt igły, aby nie przeszkadzał, a następnie za pomocą wiertarki ręcznej wykonać otwór w czaszce, uważając, aby nie uszkodzić leżącego pod nią mózgu. OSTRZEŻENIE: Generalnie starsze samce myszy mają stosunkowo grubsze czaszki i wymagają dłuższego wiercenia. Wiercenie ręczne należy przeprowadzać ostrożnie, przykładając minimalny nacisk, ponieważ nagły przełom przez czaszkę może uszkodzić opony mózgowe i/lub mózg.
      UWAGA: Poszerzenie otworu trepanacyjnego jest konieczne w celu umieszczenia sondy termopary podczas procedury LITT. Można to zrobić łatwiej podczas pierwszej operacji wstrzykiwania, co ułatwia szybsze i bardziej usprawnione przeprowadzenie operacji LITT. Alternatywnie, otwór trepanacyjny można poszerzyć w ten sam sposób podczas operacji LITT, co może zmniejszyć ryzyko wzrostu guza poza czaszką.
  15. Wywiercić drugi otwór trepanacyjny w punkcie +3,0 mm ML i +0,5 mm AP (1,0 mm bocznie od miejsca wstrzyknięcia) dla termopary.
    1. Postępować zgodnie z procedurą wiercenia opisaną w poprzednim kroku.
    2. Aby uniknąć trudności związanych z odrostem kości, usunąć kość pomiędzy dwoma otworami.
      UWAGA: Jako współrzędne dla implantacji guza zaleca się +2,0 mm ML, +0,5 mm AP i -2,5 mm DV od Bregma. Lokalizacja ta w górnym prążkowiu zapewnia spójny wzrost guza, który jest dobrze tolerowany przez zwierzęta – jednak protokół można dostosować do innych lokalizacji.
  16. Przygotować zawiesinę komórek glejaka mysiego CT2A w strzykawce mikrolitrowej (5000 komórek w 1,5 µL).
    1. Wyjąć przygotowaną wcześniej probówkę mikrowirówkową z komórkami z lodu i delikatnie stuknąć opuszkiem palca, aby resuspendować komórki.
    2. Delikatnie nabrać 2 µL do strzykawki 5 µL lub 10 µL, dbając o uniknięcie pęcherzyków powietrza.
    3. Wypuścić 0,5 µL, aby usunąć powietrze i upewnić się, że igła jest odpowietrzona i działa prawidłowo.
    4. Przetrzeć trzpień igły gazikiem nasączonym alkoholem, aby usunąć wypuszczony płyn oraz wszelkie komórki z powierzchni zewnętrznej (co mogłoby spowodować wzrost guza w oponach miękkich).
  17. Załadować strzykawkę do mikroinjektora (lub ręcznej przystawki stereotaktycznej) i powoli opuścić igłę.
    1. Powoli opuścić igłę na głębokość (z = -3,0 mm) i odczekać 1 min.
    2. Powoli wycofać igłę o 0,5 mm (z = -2,50 mm) i wstrzyknąć komórki (≤ 0,5 µL/min). Utrzymywać obszar wokół strzykawki w suchości, używając gąbki mikroschirurgicznej, uważając, aby nie przesunąć igły.
    3. Odczekać minimum 2 min po zakończeniu wstrzykiwania, a następnie powoli wycofać strzykawkę w czasie 3-4 min. Należy upewnić się, że pierwsze 4-5 interwałów wycofania wynosi 100 µm na jeden krok, aby uniknąć wypłukania komórek z pierwotnego miejsca wstrzyknięcia.
    4. Za pomocą gazika nasączonego alkoholem delikatnie przetrzeć zewnętrzną stronę igły, usuwając krew lub płyny, a następnie przepłukać i oczyścić strzykawkę zgodnie z wytycznymi producenta. Między wstrzyknięciami używać PBS i wody destylowanej, aby zapobiec zapchaniu się igły. Po zakończeniu wstrzykiwań obficie przepłukać igłę 70% etanolem, aby usunąć z niej wszelkie pozostałe komórki.
      OSTRZEŻENIE: Brak przepłukania igły po każdym wstrzyknięciu może doprowadzić do zablokowania otworu. W przypadku wstrzykiwania więcej niż jednego rodzaju komórek, należy używać oddzielnej igły dla każdego rodzaju, aby uniknąć ewentualnego zanieczyszczenia krzyżowego.
  18. Zzbliżyć brzegi nacięcia, dbając o lekkie wywinięcie brzegów rany na zewnątrz, tak aby stykała się podległa im skóra właściwa. Zamknąć ranę za pomocą klipsa chirurgicznego lub 3 szwów przerywanych nicią 5-0. Na zamkniętą ranę nanieść roztwór jodopowidonu.
  19. Wyjąć zwierzę z zestawu stereotaktycznego i umieścić je w wyłożonej papierem klatce rekonwalescencyjnej na podkładce grzewczej ustawionej na 37 °C. Upewnić się, że zwierzę przyjęło pozycję grzbietową przed przeniesieniem go z powrotem do klatki domowej, w której na dnie powinna znajdować się mała miseczka z mokrą karmą.
  20. Monitorować zwierzę co najmniej dwa razy dziennie, zaczynając od dnia operacji, przez kolejne 2 dni. Ponownie podać meloksykam po 24 h, 48 h i 72 h lub zgodnie z wytycznymi instytucji.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Ilustracja graficzna czaszki myszy oraz ważnych punktów anatomicznych dla chirurgii stereotaktycznej. Utworzono za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Ilustracja graficzna wskazująca lokalizację otworów trepanacyjnych oraz aparatury laserowej. Ilustracja przedstawiająca względne położenie punktu orientacyjnego Bregma, (A) pierwszego otworu trepanacyjnego dla (A') włókna laserowego oraz (B) drugiego, czyli rozszerzonego otworu trepanacyjnego dla (B') sondy termopary. Po prawej stronie przedstawiono przekrój włókna laserowego i sond termopar, obrazujący sposób stabilizacji sond w stereotaktycznej stopce z nawierconymi otworami o odpowiedniej wielkości i rozstawie. Utworzono za pomocą BioRender.com Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

3. Monitorowanie obciążenia nowotworowego przed LITT (Dzień 9)

  1. Dzień przed LITT przeprowadzić obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI) w obrazach T2-zależnych, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, aby ocenić wzrost guza.
    UWAGA: Guzu powinny mieć średnicę ok. 1,5-2,0 mm.
    1. Wyonać odpowiedni skan czołowy całego mózgu myszy, stosując następujące parametry: sekwencja fast spin echo, TR = 5000 ms, TE = 45 ms, echo trains = 7, FOV = 30 x 30 mm2, rozmiar macierzy = 250 x 256, całkowita liczba warstw = 18, grubość warstwy = 0,3 mm, średnia = 2.
      UWAGA: Zaleca się również okresowe wykonywanie MRI, zaczynając od około 6. dnia po implantacji, aby potwierdzić pomyślne przeszczepienie allograftu i monitorować wzrost guza – szczególnie podczas pierwszych eksperymentów – ponieważ nawet subtelne zmiany w procedurze mogą wpłynąć na harmonogram. CT2A jest linią wysoce agresywną, dlatego zwierzęta wymagają ścisłego monitorowania. W tym celu dobrze sprawdza się skan czołowy T2-zależny. W przypadku braku dostępu do MRI dla małych zwierząt można zastosować komórki CT2A znakowane fluorescencyjnie lub lucyferyną w połączeniu z systemem obrazowania in vivo (IVIS). Należy jednak pamiętać, że kinetyka wzrostu i inne cechy guza będą różnić się od opisanych w niniejszym protokole.

4. Operacja LITT (dzień 10)

  1. Zgodnie z sekcją 2 powyżej, powtórz kroki 2.1-2.13, aby przygotować zwierzę do zabiegu LITT.
    UWAGA: Gojenie rany po poprzedniej operacji może być na różnym etapie w zależności od gatunku oraz różnic w harmonogramie eksperymentalnym. Należy zwrócić uwagę na cieńsze lub bardziej delikatne tkanki podczas ponownego wykonywania nacięcia.
  2. Używając sterylnego patyczka bawełnianego, delikatnie oczyść czaszkę, usuwając wszelkie tkanki zasłaniające punkt Bregma lub wcześniej wykonany otwór trepanacyjny. W razie potrzeby ponownie wykonaj otwór trepanacyjny, choć ze względu na szybkość formowania się guza CT2A, nie spodziewamy się znacznego odrostu kości.
  3. Po zamontowaniu przystawki LITT w ramie stereotaktycznej, wyzeruj współrzędne w punkcie Bregma dla końcówki włókna laserowego.
    OSTRZEŻENIE: Włókno laserowe jest bardzo kruche i pęknie w przypadku zgięcia. Należy zachować ostrożność i zatrzymać ruch natychmiast po zetknięciu końcówki włókna laserowego z czaszką.
  4. Lekko unieś końcówkę i przemieść ją do pożądanych współrzędnych ML oraz AP, a następnie powoli opuść sondy do docelowej współrzędnej DV, aby dotrzeć do celu (2.0 mm ML, 0.5 mm AP, -2.0 mm DV).
  5. Ustaw parametry zabiegu LITT: Tryb: ciągły; Moc: 1 W
  6. Przełącz laser z trybu Standby na Active i uruchom laser na 60 s za pomocą pedału. Jeśli temperatura wzrośnie powyżej 46 °C, przerwij zabieg na chwilę, a następnie uruchom go ponownie, starając się utrzymać temperaturę jak najbliżej 46 °C.
  7. Powoli wycofaj zespół laserowy i delikatnie przemyj włókno laserowe oraz termoparę gazikiem nasączonym alkoholem. Odsuń zespół, uważając, aby sondy nie dotknęły ramy.
  8. Zamknij ranę i poddaj zwierzę rekonwalescencji zgodnie z opisem w krokach 2.18-2.20 po wcześniejszej implantacji guza.

5. Ocena po zabiegu LITT (Dzień 11)

  1. W dniu następującym po zabiegu LITT wykonaj obrazowanie MRI T2-zależne po LITT w celu oceny skuteczności ablacji guza za pomocą sekwencji i parametrów opisanych w kroku 3.1 powyżej.
    UWAGA: Dodatkowo pomocna w ocenie obrzęku pooperacyjnego może być sekwencja FLAIR (fluid-attenuated inversion recovery).
  2. Przed zakończeniem badania wykonaj skany kontrolne w celu monitorowania zmian po leczeniu lub nawrotu guza.

6. Zakończenie badania (Dzień 11/Dzień 15/Dzień 20)

  1. Uśmierć zwierzęta w wybranych punktach końcowych eksperymentu zgodnie z wytycznymi instytucji.
    UWAGA: Punkty końcowe po 20. dniu nie są możliwe do osiągnięcia w przypadku CT2A, nawet przy ekstremalnie niskiej liczbie inokulowanych komórek, ponieważ zwierzęta kontrolne (np. po operacji pozorowanej lub bez leczenia) oraz niektóre zwierzęta z grup terapeutycznych mogą być w stanie agonalnym i wymagać eutanazji. W przypadku dłuższych eksperymentów należy rozważyć alternatywne modele komórek glejaka mysiego.
  2. Pobierz tkanki do utrwalenia i dalszego przetwarzania.
    1. Wykonaj perfuzję serca 4% paraformaldehydem (PFA) i pobierz interesujące tkanki.
    2. Przeprowadź post-utrwalanie tkanki mózgowej poprzez zanurzenie w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Przygotuj próbki zgodnie ze standardowymi procedurami dla analizy materiałów utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafnie (FFPE) lub utrwalonych i zamrożonych.

7. Analiza

  1. Zweryfikuj skuteczność ablacji LITT za pomocą obrazowania MRI ważonego T2 i potwierdź wynik, stosując podstawowe techniki histologiczne, takie jak barwienie hematoksyliną i eozyną.
  2. Wykonaj wszelkie dodatkowe analizy wymagane dla eksperymentów (np. immunohistochemię, immunofluorescencję).

Wyniki

Prawidłową implantację guza CT2A oraz zabiegi LITT można scharakteryzować za pomocą MRI w obrazowaniu T2-zależnym, co przedstawiono na  Rysunku 4, Rysunku 5 oraz Rysunku 6. Obrazy MR uzyskano przy użyciu wolnego od kriogenów nadprzewodzącego magnesu 7T z otworem o średnicy 17 cm i kwadraturową cewką głowy myszy, stosując parametry sekwencji opisane w powyższym protokole. Ścisłe przestrzeganie tej metody powinno zapewnić odsetek przyjęć guza bliski 100%, spójną lokalizację guza oraz jego w przybliżeniu sferyczny kształt, co zaprezentowano na Rysunku 4. Cechy te stanowią optymalną podstawę do późniejszych zabiegów LITT i wszelkich dalszych analiz. Podobnie, jak widać na Rysunku 5, ablacje LITT powinny być spójne zarówno pod względem wielkości, jak i lokalizacji. Centralny rdzeń ablacyjnej tkanki będzie składał się z martwicy koagulacyjnej i rozpływczej, co będzie łatwo widoczne jako obszar hipointensywny (tj. czarny) w obrazowaniu MRI T2-zależnym. W dniach bezpośrednio następujących po zabiegu LITT, w zależności od przeprowadzonej procedury, typowe jest również zaobserwowanie obszaru hiperintensywnego (tj. białego) w obrębie i wokół zmiany, odpowiadającego obrzękowi okołooperacyjnemu. Rysunek 6 przedstawia niepomyślny rezultat i zwraca uwagę na niektóre potencjalne problemy mogące wystąpić podczas realizacji tego protokołu.

figure-results-1
Rysunek 4: Obrazy MR w płaszczyźnie czołowej obciążone T2, przedstawiające prawidłowy proces tworzenia guza CT2A . Reprezentatywne obrazy tworzenia guza u trzech myszy C57BL/6 (A, B, C) w 12. dniu po implantacji. Białe strzałki wskazują granicę guza. Należy zwrócić uwagę na spójną lokalizację guza i jego w przybliżeniu sferyczny kształt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 5: Obrazy MR w płaszczyźnie czołowej, ważone T2, przedstawiające idealną ablację LITT (1 dzień po zabiegu LITT). Reprezentatywne obrazy ablacji guza metodą LITT u trzech myszy C57BL/6 (A, B, C) w 13. dniu po implantacji. Zwróć uwagę na spójną wielkość i lokalizację rdzenia zmiany martwiczej. Wykonanie badań MR przed LITT oraz samej ablacji LITT nieco wcześniej zapewniłoby lepszą równowagę między optymalną wielkością guza dla celowania laserem a możliwością uzyskania późniejszych punktów końcowych po leczeniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 6: Koronalne obrazy MR ważone T2 z zabiegów LITT przed optymalizacją. Obrazy trzech myszy C57BL/6 (A, B, C) poddanych działaniu identycznych parametrów laserowych i celów stereotaktycznych przed optymalizacją protokołu, jako przykład nieidealnego wyniku. Białe strzałki wskazują granicę guza. Obramowane obszary wskazują region obrzęku. Widoczna jest znaczna zmienność, w tym mniej jednolity wzrost guza oraz niedokładne celowanie ablacją laserową, co skutkuje niespójnym uszkodzeniem tkanki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Istnieje szybko rozwijająca się literatura dotycząca LITT; Jednak przede wszystkim ogranicza się do klinicznych studiów przypadków lub serii przypadków u ludzi. Rzeczywiście, wykazano kilka potencjalnych korzyści dla LITT, w tym niższe wskaźniki powikłań pooperacyjnych i koszty przy jednoczesnym zapewnieniu porównywalnego przeżycia wolnego od progresji 7,8,9,10,11. Obserwuje się również zmniejszenie liczby nawrotów miejscowych przy większym sukcesie ogólnoustrojowego leczenia farmakologicznego, chociaż przyczyny nie są jeszcze dobrze poznane12. Ponadto obiecujące wyniki do zastosowań klinicznych poza Wielką Brytanią obejmują leczenie przerzutów i innych typów nowotworów 3,12, martwicy popromiennej13, padaczki opornej na leczenie14, malformacji naczyniowych15, a nawet zaburzeń obsesyjno-kompulsywnych16. I odwrotnie, badania z wykorzystaniem modelu mysiego są jak dotąd bardzo ograniczone, z kilkoma godnymi uwagi wyjątkami, które mogą być trudne do powtórzenia. Na przykład w niedawnym badaniu dotyczącym zmian przepuszczalności bariery krew-mózg po leczeniu LITT wykorzystano generator laserowy sprzedawany w Europie do użytku klinicznego, ale instrument ten nie został zatwierdzony w Ameryce Północnej17. Chociaż taki system wydaje się dobrze pasować do ich badań, uzyskanie urządzenia jest prawdopodobnie zbyt kosztowne dla większości badaczy, a wszelkie zastrzeżone lub wysoce zaawansowane technologicznie funkcje są trudne do odtworzenia. W związku z tym szczegółowy protokół dostępnego i zoptymalizowanego przedklinicznego modelu zwierzęcego zapewni cenne możliwości badawcze.

Kluczowe kroki w protokole obejmują dokładną identyfikację szczepionki Bregma w celu powtarzalnego celowania zarówno podczas przeszczepu allogenicznego, jak i późniejszej operacji ablacji LITT. Dodatkowo, zwrócenie szczególnej uwagi na etapy iniekcji w stosunku do szybkości podawania i przerw ma kluczowe znaczenie dla udanych przeszczepów komórek nowotworowych, a niewykonanie tego znacznie zwiększa ryzyko wzrostu guza pozaczaszkowego i większej zmienności guza. Ważne jest również, aby podkreślić, że operacja LITT powinna być zaplanowana, gdy guz jest jeszcze stosunkowo mały (tj. ~1,5-2,0 mm średnicy). Z naszego doświadczenia wynika, że guzy CT2A często stają się bardziej zmienne w kształcie, gdy są duże, a bardzo duże guzy również zwiększają trudność ekstrakcji mózgu, zwłaszcza jeśli guz wyrósł przez powierzchnię kory mózgowej. Należy również zauważyć, że zaledwie 24 godziny, takie jak między rezonansem magnetycznym przed leczeniem a operacją LITT, to wystarczający czas na znaczny wzrost glejaka CT2A.

W protokole można łatwo wprowadzić kilka modyfikacji, aby dostosować go do innych projektów eksperymentalnych. W szczególności protokół ten koncentruje się na krokach technicznych niezbędnych do udanej implantacji ortotopowej i operacji LITT w syngenicznym modelu myszy C57BL/6 CT2A. Jednak opisany model można łatwo zastąpić, aby dostosować go do różnych celów eksperymentalnych. Mniej agresywne syngeniczne linie komórkowe raka, takie jak K1491, mogą być wykorzystywane do przeprowadzania eksperymentów wymagających dłuższych punktów czasowych, takich jak te obejmujące wrodzoną i nabytą odpowiedź immunologiczną. Alternatywnie, w przypadku eksperymentów, które nie koncentrują się na adaptacyjnych odpowiedziach guza-gospodarza, linie komórkowe pochodzące od pacjenta lub inne modele ksenoprzeszczepów w modelach myszy z obniżoną odpornością są inną realną opcją. Dla zainteresowanego czytelnika Haddad i in. (2021) zapewniają kompleksowy przegląd mocnych stron i ograniczeń kilku powszechnych modeli myszy z przeszczepem allogenicznym i ksenoprzeszczepem4. Inną prostą modyfikacją, w zależności od dostępności instytucjonalnej i wytycznych, jest zastąpienie wziewnego środka znieczulającego alternatywami do wstrzykiwań, takimi jak połączenie ketaminy i ksylazyny ± acepromazyny. Jednakże, gdy dostępne są środki wziewne i wymagany sprzęt (np. nosek stereotaktyczny), zalecamy ich stosowanie z kilku powodów. Po pierwsze, uważamy, że wziewne środki znieczulające są bezpieczniejszą alternatywą, ponieważ nie wymagają wstrzyknięcia dootrzewnowego, nie wymagają wielokrotnego dawkowania w przypadku dłuższych lub trudniejszych operacji i można je łatwo miareczkować z dużym marginesem bezpieczeństwa18. Ponadto znieczulenie wziewne nie wymaga stosowania substancji kontrolowanych i zapewnia szybkie wybudzenie i powrót do zdrowia po zabiegu.

Rozwiązywanie problemów związanych z tym protokołem powinno być minimalne, a większość problemów wynika ze złej techniki wstrzykiwania, co skutkuje nieregularnym tworzeniem się guza lub wzrostem pozaczaszkowym. Problemy z celowaniem LITT można rozwiązać dzięki właściwej identyfikacji punktów orientacyjnych, odpowiedniej stabilizacji światłowodu laserowego i uważnej obserwacji włókna laserowego podczas wprowadzania, aby upewnić się, że nie uderza on w bok otworu w zadziorach i nie zostaje zepchnięty z kursu.

Ograniczenia metody obejmują średni i zaawansowany poziom umiejętności chirurgicznych i technicznych wymaganych do wykonywania zabiegów, dostęp do specjalistycznego sprzętu, takiego jak aparat do rezonansu magnetycznego małych zwierząt, oraz długi protokół implantacji ortotopowej, który ogranicza liczbę zastrzyków, które można wykonać w ciągu jednego dnia. Ponieważ protokół ten ma być przedklinicznym modelem glejaka o wysokim stopniu złośliwości, istnieją również nieodłączne ograniczenia związane z bardziej agresywnym charakterem niektórych linii komórkowych glejaka, takich jak CT2A. Szczepienia o niskiej liczbie komórek, głębokie miejsce wstrzyknięcia w prążkowiu, ostrożna technika wstrzykiwania i wczesne leczenie pomogą złagodzić te problemy, ale sporadyczny pozaczaszkowy lub nieregularny wzrost guza może nadal występować, a krótkie projekty eksperymentalne są uzasadnione. Jak wspomniano, modyfikacja tego protokołu za pomocą mniej agresywnej linii komórkowej jest również łatwa do osiągnięcia.

Ponieważ protokół ten jest, według naszej wiedzy, jedynym szczegółowym opisem przedklinicznego modelu mysiego dla LITT of GB, jest to znaczący krok w kierunku zapewnienia dobrze ugruntowanego modelu dla przyszłych badań z zakresu nauk podstawowych.

Oświadczenia

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie ze strony Monteris Medical, w tym za darowiznę rzeczową w postaci sprzętu laserowego.

Podziękowania

Źródła finansowania tego projektu to m.in. Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC)-Alliance, Mitacs-Accelerate, Research Manitoba-IPOC, Canadian Institutes for Health Research (CIHR) CGS-M oraz University of Manitoba Graduate Fellowship. Linia komórkowa glejaka CT2A hojnie podarowana przez dr Petera Fecci z Duke University, Durham, NC. Chcielibyśmy również podziękować Laboratorium Usług Histologicznych oraz Ośrodku Obrazowania Małych Zwierząt i Materiałów na Uniwersytecie Manitoba za ich doskonałą pomoc techniczną w tym projekcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Włócznie absorpcyjneFST18105-01Gąbki hemostatyczne.
Kleszczyki do tkanek AdsonFST11006-12
C57BL/6 myszyJackson LaboratoriesStrain #0006646 do 12 tygodni męskie i żeńskie
aplikatory z bawełnianą końcówką (6 ")Mikroskopia elektronowa Sciences72308
LiniaHojnie podarowana od dr Petera Fecci, Duke University.
Ekstrakt z błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu Cultrex, PathClearBiotechne, R& Systemy D3433-010-01
DMEM/F-12, HEPESGibco, ThermoFisher Scientific11330032
Prowadnice dwukomorowe BIO-RAD1450003
Probówki Eppendorf Safe-Lock 2,0 mlEppendorf22363352
Bezwodny alkohol etylowyGreenfield GlobalP016EAANRozcieńczony do 70% z ddH2O
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, KanadaGibco, ThermoFisher Scientific12483020
Glad Press-n-Sealfolia
Wiertarka szybkoobrotowaKopf InstrumentsModel 1474
K & J Termopara miernik temperaturyOmegaHH509R
Metacam (meloksykam)WDDC114424
Pompa strzykawkowa do mikroiniekcjiWPIUMP3T-1
Strzykawka mikrolitrowa (seria 700)Hamilton87908Dostępne są niestandardowe igły. Stromy skos igły pomaga w precyzyjnym podawaniu, a krótsza długość igły pomaga w stabilności.
Sterownik igły/uchwyt igłyFST12500-12Cienka końcówka jest najbardziej odpowiednia ze względu na ograniczoną przestrzeń roboczą, ale wiele stylów jest odpowiednich w zależności od preferencji uchwytu.
Maść okulistyczna Opixcare PlusWDDC135941
buforowana fosforanem (10x)Odczynniki FisherBP399-4Rozcieńczyć do 1x z ddH2O
Powidon-jodThermoFisher Scientific3955-16Aliquat do mniejszych tubek do stosowania z aplikatorami z bawełnianą końcówką.
Sól fizjologiczna (normalna)Skalpel WDDC126588
, jednorazowego użytku (#15 Ostrze)Nożyczkipiór Feather NO15
, drobne chirurgiczneFST91460-11Cienkie nożyczki studenckie, Iris lub Bonn są odpowiednie.
Ramka stereotaktycznaKopf InstrumentsModel 940Z cyfrowym wyświetlaczem, konsolą i stożkiem myszy oraz nausznikami.
Stereotaktyczny uchwyt na strzykawkęKopf InstrumentsModel 1772-FJeśli nie używasz pompy wtryskowej.
Nici (5-0 monofilament)EthiconMCP463GMonocryl fioletowa żyłka z odwróconą końcówką tnącą
Strzykawka, 28 G  (0,5 ml) BDBD 329461Strzykawki insulinowe BD Lo-Dose U-100
TC20 Automatyczny licznik komórekBIO-RAD1450102
Sonda termopary, drobna średnica (Typ K)OmegaTJM-CA316-IM025G-150
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco, ThermoFisher Scientific25200072
Vetbond firmy 3M, klej do tkanek weterynaryjnych WDDC126125
Maszynka do strzyżenia orzechów ziemnych WahlWDDC/Wahl100963Dostępny również bezpośrednio od producenta.
Podkładka rozgrzewającaBensen Medical70308/121873Można użyć dowolnego podobnego przedmiotu.
Webcol Alcohol prepsMikroskopia elektronowa Sciences71005-20Chusteczka nasączona alkoholem, 2-warstwowa, średniej wielkości.
komórkowa glejaka CT2A plastikowa Amazon.ca 12587704417 Sól fizjologiczna z

Bibliografia

  1. Canadian Cancer Society. Cancer Statistics 2023. , Canadian Cancer Statistics Advisory Committee in collaboration with the Canadian Cancer Society, Statistics Canada and the Public Health Agency of Canada. Toronto, ON. http://cancer.ca/Canadian-Cancer-Statistics-2023-EN (2023).
  2. Glioblastoma Research Organization. Glioblastoma Research Organization. , https://www.gbmresearch.org (2024).
  3. Carpentier, A., et al. Laser thermal therapy: Real-time MRI-guided and computer-controlled procedures for metastatic brain tumors. Lasers Surg Med. 43 (10), 943-950 (2011).
  4. Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neurooncol Adv. 3 (1), vdab100(2021).
  5. Chokshi, C. R., Savage, N., Venugopal, C., Singh, S. K. A patient-derived xenograft model of glioblastoma. STAR Protoc. 1 (3), 100179(2020).
  6. Alcaniz, J., et al. Clinically relevant glioblastoma patient-derived xenograft models to guide drug development and identify molecular signatures. Front Oncol. 13, 1129627(2023).
  7. Muir, M., et al. Laser interstitial thermal therapy for newly diagnosed glioblastoma. Lasers Med Sci. 37 (3), 1811-1820 (2022).
  8. Muir, M., Traylor, J. I., Gadot, R., Patel, R., Prabhu, S. S. Repeat laser interstitial thermal therapy for recurrent primary and metastatic intracranial tumors. Surg Neurol Int. 13, 311(2022).
  9. De Groot, J. F., et al. Efficacy of laser interstitial thermal therapy (LITT) for newly diagnosed and recurrent IDH wild-type glioblastoma. Neurooncol Adv. 4 (1), vdac040(2022).
  10. Holste, K. G., Orringer, D. A. Laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdz035(2020).
  11. Leuthardt, E. C., Voigt, J., Kim, A. H., Sylvester, P. A single-center cost analysis of treating primary and metastatic brain cancers with either brain laser interstitial thermal therapy (LITT) or craniotomy. Pharmacoecon Open. 1 (1), 53-63 (2017).
  12. Bastos, D. C. D. A., et al. Predictors of local control of brain metastasis treated with laser interstitial thermal therapy. Neurosurgery. 87 (1), 112-122 (2020).
  13. Darbinyan, A., Leelatian, N., Fomchenko, E. I. Histological changes associated with laser interstitial thermal therapy for radiation necrosis: illustrative cases. J Neurosurg Case Lessons. 4 (1), CASE21373(2022).
  14. Grant, G. A., Porter, B. E., Li, D., Barros Guinle, M. I., Kaur, H. Approach, complications, and outcomes for 37 consecutive pediatric patients undergoing laser ablation for medically refractory epilepsy at Stanford Children's Health. J Neurosurg Pediatr. 33 (1), 1-11 (2023).
  15. Ogasawara, C., et al. Laser interstitial thermal therapy for cerebral cavernous malformations: A systematic review of indications, safety, and outcomes. World Neurosurg. 166, 279-287.e1 (2022).
  16. Satzer, D., Mahavadi, A., Lacy, M., Grant, J. E., Warnke, P. Interstitial laser anterior capsulotomy for obsessive-compulsive disorder: lesion size and tractography correlate with outcome. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 93 (3), 317-323 (2022).
  17. Salehi, A., et al. Therapeutic enhancement of blood-brain and blood-tumor barriers permeability by laser interstitial thermal therapy. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa071(2020).
  18. Navarro, K. L., Huss, M., Smith, J. C., Sharp, P., Marx, J. O., Pacharinsak, C. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mysi model glejaka wielopostaciowegoablacja guza m zguchirurgia stereotaktycznakom rki glejaka CT2Amikro rodowisko guzatermiczna ablacja tkanekobrazowanie MRIimplantacja guzamartwica tkanek

Powiązane artykuły