Artykuł metodologiczny

Izolacja oparta na cytometrii przepływowej i ocena terapeutyczna limfocytów naciekających nowotwór w mysim modelu raka trzustki

DOI:

10.3791/67413

⸱

17 stycznia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pancreatic Cancer, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Key Laboratory of Digestive Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 2Department of Immunology and Biotherapy, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 3Research Core Facility, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 4Department of Public Laboratory, National Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy of Tianjin, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę wykorzystania limfocytów naciekających nowotwór (TIL) od myszy za pomocą cytometrii przepływowej do adoptywnego transferu komórek. Protokół ten ma na celu weryfikację specyficznej cytotoksyczności TIL wobec nowotworów w mysim modelu syngenicznego raka trzustki, dostarczając informacji na temat rozwoju adoptywnych terapii komórkowych w raku trzustki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak trzustki jest agresywnym nowotworem złośliwym o fatalnych rokowaniach i ograniczonych możliwościach terapeutycznych. Adoptywna terapia komórkowa, która polega na izolowaniu i aktywacji własnych komórek odpornościowych pacjenta, takich jak limfocyty naciekające nowotwór (TIL), przed ich ponownym wprowadzeniem, stanowi obiecujące podejście eksperymentalne. Jednak techniki adoptywnego transferu komórek w przedklinicznych modelach raka trzustki nie są dobrze poznane. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół adoptywnej terapii komórkowej z wykorzystaniem TIL z mysiego modelu syngenicznego raka trzustki. Procedura polega na wszczepieniu żywych lub napromieniowanych mysich komórek raka trzustki myszom reporterowym znakowanym fluorescencyjnie w celu zainicjowania napływu komórek odpornościowych, a następnie wyizolowaniu limfocytów z guzów pierwotnych za pomocą cytometrii przepływowej sortowania i / lub aktywacji i ekspansji komórek T reagujących na nowotwór ex vivo i adoptywnym przeniesieniu tych aktywowanych komórek T dootrzewnowo do myszy z guzem, a następnie podaniu interleukiny-2. Bioluminescencyjne obrazowanie guza pozwala na podłużne monitorowanie wzrostu guza ortotopowego i odpowiedzi na leczenie, zwłaszcza ocena efektów cytotoksycznych specyficznych dla nowotworu. Podejście to podsumowuje logistykę związaną z opracowywaniem adoptywnych terapii transferu komórek dla pacjentów z rakiem trzustki. Wyniki wskazują na zwiększoną skuteczność przeciwnowotworową adoptywnie przenoszonych limfocytów T reagujących na nowotwór w porównaniu z nieistotnymi kontrolami limfocytów. Ta wszechstronna metodologia umożliwia badanie in vivo immunoterapii adoptywnej w raku trzustki, a także optymalizację parametrów przetwarzania komórek i schematów leczenia skojarzonego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoterapia raka trzustki jest w początkowej fazie, z trwającymi badaniami przedklinicznymi i walidacją, głównie na modelach mysich1. Obecne metody leczenia raka trzustki obejmują chirurgię, chemioterapię, radioterapię i terapie celowane. Niestety, metody te często nie są w stanie całkowicie wyeliminować zmian nowotworowych, prowadząc do nawrotu i progresji. Tradycyjne metody leczenia koncentrują się na komórkach nowotworowych, ale często pomijają mikrośrodowisko guza (TME), które obejmuje zarówno komórki nowotworowe, jak i związany z nimi zrąb składający się z limfocytów naciekających nowotwór (TIL), fibroblastów i macierzy zewnątrzkomórkowej2. TIL to komórki odpornościowe w TME, w tym cytotoksyczne limfocyty T, limfocyty T pomocnicze, limfocyty T regulatorowe, limfocyty B, komórki NK, makrofagi i komórki supresorowe pochodzenia mieloidalnego3. Komórki te uczestniczą w odpowiedziach immunologicznych, które wpływają na wzrost guza i wyniki terapeutyczne4.

Adoptywna terapia komórkowa (ACT) polega na zbieraniu komórek odpornościowych pacjenta, modyfikowaniu ich i rozszerzaniu in vitro, a następnie ponownym wprowadzaniu ich do celu i zabijania komórek nowotworowych. Terapia TIL, rodzaj ACT, jest badana w leczeniu różnych nowotworów, w tym czerniaka, raka płuc i raka szyjki macicy. Proces ten polega na wyizolowaniu limfocytów z guza, wyhodowaniu ich za pomocą IL-2 in vitro i ponownym wprowadzeniu ich do pacjenta, często po limfodeplecji z chemioterapią lub radioterapią5.

Ponieważ badanie Rosenberga z 1986 roku wykazało skuteczność TIL u myszy6, adoptywna immunoterapia transferowa stała się punktem zapalnym badań i okazała się obiecująca w leczeniu raka7,8,9,10. Naszym celem jest wyekstrahowanie TIL od myszy, posortowanie ich pod kątem określonych limfocytów T za pomocą cytometrii przepływowej i zweryfikowanie ich działania zabijającego nowotwór poprzez transfer adoptywny.

W tym protokole opisujemy metodę wykorzystania TIL od myszy za pomocą cytometrii przepływowej do adoptywnego transferu komórek. Celem jest zweryfikowanie specyficznej cytotoksyczności TIL wobec nowotworów w mysim modelu syngenicznego raka trzustki, dostarczając informacji na temat rozwoju adoptywnych terapii komórkowych w raku trzustki. Metoda ta obejmuje wszczepianie żywych lub napromieniowanych mysich komórek raka trzustki myszom reporterowym znakowanym fluorescencyjnie w celu zainicjowania napływu komórek odpornościowych, izolowanie limfocytów z guzów pierwotnych poprzez sortowanie cytometrią przepływową lub aktywację i ekspansję limfocytów T reagujących na nowotwór ex vivo oraz adoptywne przenoszenie tych aktywowanych komórek T do myszy z nowotworem. Późniejsze podanie interleukiny-2 i bioluminescencyjne obrazowanie guza pozwala na podłużne monitorowanie wzrostu guza ortotopowego i odpowiedzi na leczenie, w szczególności ocenę specyficznego dla nowotworu działania cytotoksycznego. Podejście to podsumowuje logistykę związaną z opracowywaniem adoptywnych terapii transferu komórek dla pacjentów z rakiem trzustki. Wyniki wskazują na zwiększoną skuteczność przeciwnowotworową adoptywnie przenoszonych limfocytów T reagujących na nowotwór w porównaniu z nieistotnymi kontrolami limfocytów. Ta wszechstronna metodologia umożliwia badanie in vivo immunoterapii adoptywnej w raku trzustki, a także optymalizację parametrów przetwarzania komórek i schematów leczenia skojarzonego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolonia myszy jest przechowywana w obiekcie akredytowanym przez AAALAC International, przestrzegającym wszystkich odpowiednich przepisów i standardów USDA, HHS i NIH. Instytut Raka Uniwersytetu Medycznego w Tianjin oraz Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szpitalnych dokonały przeglądu i zatwierdziły wszystkie procedury na zwierzętach, w tym uzasadnienie wyboru szczepu, przydziały grup eksperymentalnych oraz statystyczne uzasadnienie liczby zwierząt i randomizacji.

1. Indukcja nowotworu

  1. Użyj KPC-Luc cell line11, aby wywołać ortotopowe guzy trzustki u myszy.
  2. Przygotować zawiesinę komórkową poprzez trypsynizację komórek KPC-Luc, dwukrotne przemycie ich PBS i ponowne zawieszenie w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w PBS z 30% macierzą błony podstawnej (BMM).
  3. Znieczulić mysz izofluranem w dawce indukcyjnej 4%, a następnie zmienić dawkę na podtrzymującą 2%. W razie potrzeby zapewnij wsparcie termiczne za pomocą poduszki grzewczej i monitora. Nałóż maść okulistyczną na oba oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
  4. Zdezynfekuj obszar operacyjny kilka razy okrężnymi ruchami, używając zarówno peelingu na bazie jodu, jak i alkoholu. Przed zabiegiem należy podać podskórne wstrzyknięcie karprofenu w dawce 5 mg/kg jako środek przeciwbólowy. Za pomocą sterylnego ostrza skalpela wykonaj małe lewe nacięcie brzucha (0,5-1 cm) pod lewym żebrem myszy, aby odsłonić trzustkę.
  5. Użyj kleszczy, aby przytrzymać śledzionę myszy i odsłonić trzustkę myszy, wymieszaj komórki i wstrzyknij je do trzustki myszy z 50 000 komórek na mysz. Wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórkowej bezpośrednio do trzustki za pomocą igły 29 G.
  6. Zwróć trzustkę myszy i sekwencyjnie zszyj otrzewną i skórę szwami.
  7. Pozwól myszy zregenerować się na ciepłej podkładce, aż do całkowitego obudzenia. Podawać 5 mg/kg karprofenu podskórnie jako środek przeciwbólowy po zabiegu chirurgicznym codziennie przez 3 dni.
  8. Wykonaj obrazowanie na żywo 7 dni po wstrzyknięciu, aby monitorować wzrost guza.
    UWAGA: Na tym etapie można zastosować zabiegi.
    1. Dootrzewnowo wstrzyknąć myszy sól potasową D-Lucyferyny (15 mg / ml w PBS, 60 μl na mysz).
    2. Po znieczuleniu izofluranem umieść mysz w systemie obrazowania in vivo w celu wykrycia bioluminescencji. Po zobrazowaniu wyjmij mysz z systemu i pozwól jej naturalnie wyzdrowieć ze znieczulenia.

2. Żniwo guzów

  1. Poddaj eutanazji myszy dawcy za pomocą komory CO2. Wysterylizuj całe ciało 75% etanolem.
  2. Umieść mysz w sterylnym kapturze. Użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby otworzyć jamę brzuszną.
  3. Usuń guzy i umieść je w PBS na lodzie. Zmierz rozmiar guza suwmiarką z noniuszem i oblicz objętość guza za pomocą wzoru (π x długość × szerokość × szerokość)/6.

3. Trawienie guza

  1. Przygotuj roztwór wytrawiający, sporządzając 0,125 mg/l kolagenazy, 0,125 mg/l Dispazy II i 10 μg/ml DNazy I w RPMI 1640 o stężeniu 1x. Dodaj 1-2 ml roztworu wytrawiającego na dołek w 12-dołkowej płytce.
  2. Zmiel guzy na małe kawałki za pomocą sterylnych nożyczek. Trawić kawałki guza w temperaturze 37°C, wstrząsając z prędkością 70 obr./min przez 30 minut.

4. Kolekcja komórek

  1. Zakończ trawienie, dodając 2-4 ml 10% płodowej surowicy bydlęcej. Przenieś wszystkie komórki do probówki zbiorczej.
  2. Umyj studzienki dwukrotnie PBS, aby zebrać pozostałe komórki. Przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm lub 70 μm.
  3. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 5% BSA w celu barwienia metodą cytometrii przepływowej.

5. Przygotowanie do cytometrii przepływowej

  1. Przygotuj komórki jednojądrzaste śledziony lub krwi obwodowej (PBMC) od myszy niebędących nosicielami nowotworu jako kontrole.
    UWAGA: Opcjonalnie: PBMC od myszy z nowotworem mogą być również używane jako kontrole.
  2. Wybarwić komórki blokerami Fc (<1 μg na milion komórek) i przeciwciałami przepływowymi (CD3-APC, CD45-APC/Fire750 w rozcieńczeniu 1:100).
  3. Inkubować na lodzie w ciemności przez 30 minut. Przemyć dwukrotnie zimnym PBS i ponownie zawiesić komórki w 1% BSA w PBS.

6. Sortowanie komórek

  1. Sortuj komórki CD45 + CD3 + za pomocą cytometru przepływowego. Bramki na żywo oparte na FSC-A i SSC-A (P1). Następnie bramkują pojedyncze komórki z P1 w oparciu o FSC-A i FSC-H (P2).
  2. Na koniec posortuj CD45 + CD3 + od P2 za pomocą bramkowania CD45 i CD3 i zbierz je do probówek zbiorczych. Zapewnić prawidłowe zawieszenie i utrzymanie żywotności komórek podczas sortowania.

7. Przygotowanie komórek do transferu

  1. Odwirować posortowane komórki w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w surowicy myszy w końcowym stężeniu 1 x 106 komórek/ml. Utrzymuj komórki na lodzie.
    UWAGA: Można przeprowadzić hodowlę ex vivo lub aktywację posortowanych komórek.

8. Przeniesienie adopcyjne

  1. Wykonaj indukcję nowotworu dla myszy biorcy na 7 dni przed dniem transferu.
  2. Wstrzyknąć 2 x 105 komórek na mysz dootrzewnowo myszom biorcom za pomocą strzykawki insulinowej 29 G x 1/2". Podawać IL-2 (50 j.m. na mysz) dootrzewnowo przez trzy kolejne dni.

9. Monitorowanie guza

  1. Wykonaj obrazowanie na żywo w 4. i 7. dniu po transferze, aby ocenić wzrost guza, z dodatkowym obrazowaniem na żywo co tydzień zgodnie z tą samą procedurą opisaną w kroku 1.8.
  2. Śledź przeżycie myszy biorcy. Pod koniec eksperymentu poddaj mysz eutanazji zgodnie z powyższym opisem. Użyj nożyczek okulistycznych i kleszczy, aby usunąć guzy, a następnie umieść je w PBS na lodzie w celu szybkiego pomiaru wielkości guza i możesz kontynuować kolejne eksperymenty w razie potrzeby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy biorcze są podzielone na siedem grup, aby dokładnie ocenić skuteczność transferu TIL: (a) Kontrola soli fizjologicznej (ślepa kontrola): Myszy otrzymujące zastrzyki z soli fizjologicznej, które służą jako punkt odniesienia. (b) Tylko IL-2 (ślepa kontrola): Myszy otrzymujące zastrzyki z IL-2 w celu uwzględnienia wszelkich skutków działania samej cytokiny. c) To samo pojedyncze leczenie, co w przypadku leczonych myszy dawców (kontrola pozytywna): Myszy otrzymujące takie samo leczenie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Potencjalna immunoterapia raka trzustki może wzmocnić układ odpornościowy w celu celowania i eliminowania komórek nowotworowych, obejmując immunoterapię adoptywną, inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych i szczepionki przeciwnowotworowe12. Terapia TIL polega na ekstrakcji i namnażaniu limfocytów z guzów, które są następnie ponownie podawane pacjentom. W porównaniu z innymi adoptywnymi terapiami komórkowymi, terapia TIL charakteryzuje się zróżnicowaną klonalnością TCR, doskonałą zdolnością ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczyli, że nie mają konfliktu interesów. Używając ChatGPT i Claude-3 do edycji języka, autorzy dokładnie przejrzeli i zweryfikowali słowa i zdania wygenerowane przez ChatGPT lub Claude-3 przed włączeniem ich do artykułu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC), grant numer 82272767 i 82072691 dla Y.M. Autorzy dziękują członkom swojego zespołu za dyskusję i współpracę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
System obrazowania bioluminescencyjnegoPerkinElmerIVIS SpectrumDo monitorowania wzrostu guza
Surowica bydlęca Albumina VSolarbioA8020Do ponownego zawieszania komórek
Sitko do komórek (40 μ m lub 70 μ m)JetCSS013040Do filtrowania zawiesin komórkowych
WirówkaEppendorf5810RDo pobierania i przygotowania komórek
Komora CO2Tianjin LiliangN/A Doeutanazji myszy
KolagenazaSigma-AldrichC5138Do roztworu trawiącego
Przeciwciało CD3-APCBiolegend100236Do cytometrii przepływowej barwienie
przeciwciała CD45-APC/Fire750Biolegend100154Do barwienia metodą cytometrii przepływowej
C57BL/6 myszy albinosówJackson Laboratory58Myszy dawcy i biorcy
Dispase IIGibco17105-041Do roztworu trawiącego
DNase ISparkJadeAC1711Do roztworu trawiącego
Sól potasowaD-LucyferynyBeyotimeST198-10gDo obrazowania na żywo
Etanol (75%)N/ADo sterylizacji
Blokery FcBD Biosciences553142Do barwienia metodą cytometrii przepływowej
Surowica bydlęcapłodu GibcoA5669701Do hodowli komórkowych
Cytometr przepływowyBD BiosciencesFACSAria IIIDo sortowania komórek
IL-2 (Interleukina-2)PeproTech200-02Do podawania po transferze
IsofluraneShandong AnteN/ANa narkotyzm
Linia komórkowa KPC-LucPI generowana laboratoryjnieNie dotyczy Doindukowania ortotopowych guzów trzustki
Matrigel MatrixCorning356234Do implantacji ortotopowej
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)ServicebioG4207-500MLDo mycia i ponownego zawieszania komórek
RPMI 1640 mediumGibco11875093Do przygotowania roztworu trawiącego
Sterylny kapturESCON/ADo sterylnego usuwania i przetwarzania guzów
Sterylne nożyczki i kleszczeNie dotyczyDo ekstrakcji guza
Szew (4-0, szew wchłanialny PGA)Jinhuan MedicalR413Do zamykania ran
StrzykawkaJiangxi Fenglin1 ml 0,45 &razy; 16RWLBDo wstrzykiwań
Płytka do hodowli tkankowej 12-dołkowaJet TCP001012Do trawienia guza

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, Y., et al. Combination of PD-1 inhibitor and OX40 agonist induces tumor rejection and immune memory in mouse models of pancreatic cancer. Gastroenterology. 159 (1), 306-319.e12 (2020).
  2. Pitt, J. M., et al. Targeting the tumor microenvironment: Removing obstruction to anticancer immune responses and immunotherapy. Ann Oncol. 27 (8), 1482-1492 (2016).
  3. Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: Understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell Mol Immunol. 17 (8), 807-821 (2020).
  4. Tay, C., Tanaka, A., Sakaguchi, S. Tumor-infiltrating regulatory t cells as targets of cancer immunotherapy. Cancer Cell. 41 (3), 450-465 (2023).
  5. Betof Warner, A., et al. Expert consensus guidelines on management and best practices for tumor-infiltrating lymphocyte cell therapy. J Immunother Cancer. 2 (2), e008735(2024).
  6. Rosenberg, S. A., Spiess, P., Lafreniere, R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science. 233 (4770), 1318-1321 (1986).
  7. Leidner, R., et al. Neoantigen t-cell receptor gene therapy in pancreatic cancer. N Engl J Med. 386 (22), 2112-2119 (2022).
  8. Lowery, F. J., et al. Molecular signatures of antitumor neoantigen-reactive t cells from metastatic human cancers. Science (New York, N.Y.). 375 (6583), 877-884 (2022).
  9. Rosenberg, S. A., Parkhurst, M. R., Robbins, P. F. Adoptive cell transfer immunotherapy for patients with solid epithelial cancers. Cancer Cell. 41 (4), 646-648 (2023).
  10. Yossef, R., et al. Phenotypic signatures of circulating neoantigen-reactive cd8+ t cells in patients with metastatic cancers. Cancer Cell. 41 (12), 2154-2165.e5 (2023).
  11. Ma, Y., Hwang, R. F., Logsdon, C. D., Ullrich, S. E. Dynamic mast cell-stromal cell interactions promote growth of pancreatic cancer. Cancer Res. 73 (13), 3927-3937 (2013).
  12. Mahadevan, K. K., et al. Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer. Science. 384 (6703), eadh4567(2024).
  13. Mullard, A. FDA approves first tumour-infiltrating lymphocyte (til) therapy, bolstering hopes for cell therapies in solid cancers. Nat Rev Drug Discov. 23 (4), 238(2024).
  14. Morotti, M., et al. PGE2 inhibits til expansion by disrupting IL-2 signalling and mitochondrial function. Nature. 629 (8011), 426-434 (2024).
  15. Chupp, D. P., et al. A humanized mouse that mounts mature class-switched, hypermutated and neutralizing antibody responses. Nat Immunol. 25 (8), 1489-1506 (2024).
  16. Stress response in tumor-infiltrating T cells is linked to immunotherapy resistance. Nat Med. 29 (6), 1336-1337 (2023).
  17. Wang, A. Z., et al. Glioblastoma-infiltrating CD8+ T cells are predominantly a clonally expanded GZMK+ effector population. Cancer Discov. 14 (6), 1106-1131 (2024).
  18. Chen, Y., et al. A transformable supramolecular bispecific cell engager for augmenting natural killer and t cell-based cancer immunotherapy. Adv Mater. 36 (3), e2306736(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tumor Infiltrating LymphocytesFlow CytometryAdoptive Cell TherapyPancreatic Cancer ModelTIL IsolationTumor Reactive T CellsBioluminescent ImagingCell SortingInterleukin 2 AdministrationOrthotopic Tumor

Powiązane artykuły