Respirometria o wysokiej rozdzielczości w komorze o małej objętości

Podsumowanie

Tutaj pokazujemy, że komora 0,5 ml do respirometrii o wysokiej rozdzielczości pokazuje wyniki, które są zgodne z komorą 2,0 ml, jeśli zastosuje się odpowiednią instrumentalną korekcję tła_O2. Wymaga mniejszej próbki, co jest korzystne w przypadku badań o ograniczonej dostępności lub niskiej wydolności oddechowej.

Streszczenie

Badanie strumieni oddechowych ma decydujące znaczenie dla zrozumienia złożonych zależności między procesami metabolicznymi. Badania komórek i tkanek o ograniczonej dostępności próbek i niskiej częstości oddechów mogą przynieść korzyści z małych objętości eksperymentalnych. Sprawdziliśmy, czy komora o pojemności 0,5 ml daje wyniki zgodne z komorą o pojemności 2,0 ml przy identycznych stężeniach próbki stosowanych w respirometrii o wysokiej rozdzielczości z użyciem Oroboros. Strumień tła_O2 był 4-krotnie wyższy w komorach o pojemności 0,5 ml niż w komorach o pojemności 2,0 ml przy nasyceniu powietrzem, ale był powtarzalny, co pozwalało na dokładną korekcję tła. Optymalna prędkość mieszania wynosiła od 550 obrotów na minutę (rpm) do 750 obr./min w komorze 0,5 ml. Strumienie oddechowe w żywych komórkach, komórkach przepuszczalnych i izolowanych mitochondriach mierzono równolegle w komorach 0,5 ml i 2,0 ml, przy użyciu protokołów miareczkowania substrat-rozprzęgacz-inhibitor z 14 do 20 miareczkowaniami. Strumienie Ø₂ w różnych typach komór były identyczne w granicach wykrywalności. Komora o pojemności 0,5 ml, wymagająca blisko czterokrotnie mniejszej próbki niż komora o pojemności 2,0 ml, stanowi istotną zaletę w badaniach z ograniczoną ilością próbki lub niską pojemnością oddechową.

Wprowadzenie

Badanie mitochondrialnych szlaków oddechowych jest kluczem do rzucenia światła na mechanizmy metaboliczne leżące u podstaw różnych chorób, starzenia się lub reakcji na stres, dostarczając tym samym potencjalnych celów dla interwencji terapeutycznych i poprawiając możliwości diagnostyczne1^,2,3. Respirometria o wysokiej rozdzielczości (HRR) pozwala na szczegółową analizę kontroli szlaku mitochondrialnego i sprzężenia w fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w różnych typach próbek i preparatach⁴. Objętość komory doświadczalnej jest podstawową cechą konstrukcyjną przyrządów respirometrycznych. Poprzednio ustalona objętość komory wynosi 2,0 ml w Oroboros. Objętość ta została zoptymalizowana tak, aby zapewnić niski strumień tła O₂ i zapewnić jednorodność mieszanego medium. Są to jedne z kluczowych kryteriów jakości dla dokładnego pomiaru oddychania w warunkach niskiej zawartości tlenu i hiperoksyki, wymaganych odpowiednio dla kinetyki tlenu mitochondrialnego i przepuszczalnych włókien mięśniowych5^,6,7,8,9. Ponadto kilka wstawek wielosensorowych ¹⁰ wymaga przestrzeni w komorze o pojemności 2,0 ml (tabela 1).

W obecnym badaniu zbadaliśmy możliwość zmniejszenia objętości komory dla HRR z 2,0 ml do 0,5 ml. Czy w testach respirometrycznych można zastosować mniejszą liczbę komórek lub ilość tkanki w mniejszych testach bez uszczerbku dla dokładności? Wyjaśnienie tego pytania jest ważne dla badania ludzkich biopsji tkanek i płynów, komórek pierwotnych i wolno rosnących kultur komórkowych¹. Podobnie, zmniejszenie objętości komory jest potencjalnie korzystne w badaniach próbek o niskiej aktywności oddechowej w wadliwych mitochondriach¹¹ i szlakach mitochondrialnych o z natury niskich pojemnościach, takich jak utlenianie kwasów tłuszczowych w mózgu¹². Jednak rozdzielczość może być zmniejszona przy małym rozmiarze komory z powodu nieproporcjonalnie rosnących artefaktów dyfuzji wstecznej_O2 i niedokładnej kalibracji objętości^13,14. Dlatego przeanalizowaliśmy instrumentalną wydajność Oroborosa z komorą o małej objętości (sV) skalibrowaną na minimalną eksperymentalną objętość 0,5 ml, w porównaniu z klasyczną komorą objętościową (cV) skalibrowaną na 2,0 ml. W szczególności przeanalizowaliśmy instrumentalny strumień tła O₂ i optymalną prędkość mieszania.

Protokoły miareczkowania substrat-rozprzęgacz-inhibitor (SUIT) są używane do oceny częstości oddechów i stanów w analizie OXPHOS. Protokoły SUIT obejmowały od 14 do 20 miareczkowania na test respirometryczny i obejmowały strumienie oddechowe O₂ w zakresie od kilku pmol∙^s-1∙^mL-1 do setek pmol∙^s-1∙^mL-1. Stany sprzężenia-kontroli obejmują szybkość nieszczelności L, tj. rozpraszający składnik oddychania, który nie jest dostępny do fosforylacji adenozyno-5'-difosforanu (ADP) do adenozyno-5'-trifosforanu (ATP) i wynika z wycieku protonów, poślizgu protonów, cykli kationów i wycieku elektronów. Pojemność P OXPHOS odpowiada za oddychanie mitochondriów, gdy transfer elektronów mierzony jako zużycie_O2 (utlenianie) jest sprzężony z syntezą ATP (fosforylacją) w obecności ADP. Zdolność przenoszenia elektronów E w stanie rozprzężonym określa się ilościowo przez miareczkowanie protonoforu w obecności substratów mitochondrialnych¹⁵. Zużycie tlenu resztkowego rox określa się po dodaniu inhibitorów kompleksu I i kompleksu III: rotenonu i antymycyny A.

Zmierzyliśmy oddychanie komórek i preparatów mitochondrialnych w komorach sV i cV. Płytki krwi są bezjądrzastymi fragmentami cytoplazmatycznym megakariocytów i stanowią łatwo dostępne źródło ludzkich mitochondriów. W związku z tym płytki krwi zastosowano jako model dla żywych komórek (lub cząstek komórkowych) z nienaruszonymi błonami plazmatycznymi. Oddychanie komórek krwi służy jako biomarker ogólnoustrojowych chorób mitochondrialnych i koreluje ze sprawnością bioenergetyczną metabolicznie aktywnych narządów^16,17,18,19, chociaż tych wyników nie można uogólnić^20,21,22. Ludzkie fibroblasty zostały wybrane do ich zastosowania jako model komórkowy dysfunkcji mitochondriów^1,23,24,25. Nienaruszona zawartość błon plazmatycznych jest niezbędna do żywotności komórki, ale jej selektywna przepuszczalność pozwala na wymianę cząsteczek między cytozolem a otaczającym go podłożem. W związku z tym badano fibroblasty z chemicznie przepuszczalnymi błonami plazmatycznymi jako przykład przepuszczalnych komórek, w porównaniu z izolowanymi mitochondriami używanymi do oceny funkcji mitochondriów i wymaganymi do oddzielenia subpopulacji mitochondrialnych^26,27.

Protokół

W badaniu na ludzkich płytkach krwi ośmiu ochotników wyraziło pisemną zgodę na udział w badaniu, które zostało zatwierdzone przez Szwedzki Urząd ds. Oceny Etycznej (nr 2013/181). Dwie linie komórkowe fibroblastów ludzkiej skóry od noworodków płci męskiej zostały zakupione od ATCC i wykorzystane zgodnie z aprobatą etyczną Ministerstwa Zdrowia Republiki Czeskiej (projekt: AZV MZ CR NU22-07-00474). Zabiegi na myszach przeprowadzono zgodnie z austriacką ustawą o doświadczeniach na zwierzętach oraz zgodnie z Europejską konwencją o ochronie zwierząt kręgowych wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych (Tierversuchsgesetz 2012; dyrektywy 2010/63/UE; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). Zasada 3R została zastosowana w celu zminimalizowania liczby zwierząt doświadczalnych.

1. Kalibracja głośności

1. Zamontuj komory o małej objętości (sV) lub komory o klasycznej objętości (cV) na Oroboros (Rysunek 1A,B; Tabela 1).
2. Włącz Oroboros i połącz się z DatLab.
3. Osuszyć komory.
4. Odpipetować 0,54 ml_H2Odo sV (0,50 ml efektywnej objętości doświadczalnej plus 0,04 ml martwej objętości kapilary) lub 2,07 ml_H2Odo cV (2,00 ml efektywna objętość plus 0,07 ml martwa objętość kapilarna).
   UWAGA: Aby uniknąć utraty cieczy między górną częścią szklanego cylindra a uchwytem komory z polioksymetylenu (POM), włóż końcówkę pipety na tyle głęboko, aby dotykała ścianki szklanej komory.
5. Włączyć mieszadła.
6. Przed zamknięciem komory należy zwilżyć oringi korków, utrzymując ich kapilary w suchości. Poluzuj pierścienie kalibracji objętości i włóż korki w dół, aż płyn wypełni kapilarę korka i w pojemniku na górnym końcu kapilary pojawi się niewielka kropla (Tabela 1).
7. Dokręcić pierścienie do kalibracji objętości, aby ustalić ich położenie w taki sposób, aby skalibrowana objętość została uzyskana w kolejnych wkładkach korków.

2. Ogólne ustawienia Oroboros

1. Uruchom oprogramowanie DatLab.
2. Ustawić temperaturę doświadczalną (37 °C) i prędkość obrotową mieszania na 550 obr./min (9,2 Hz lub obrotów na s) w komorzeV lub 750 obr./min (12,5 Hz) w komorze cV. Ustaw interwał próbkowania danych na 2 s z wygładzaniem przez 80 s (40 punktów danych) w instrumentalnych testach tła O₂ lub 40 s (20 punktów danych) w przypadku respirometrii.
   UWAGA: Mieszadła magnetyczne (AlNiCo pokryte polifluorkiem winylidenu [PVDF]; Tabela 1) są mieszane przez pulsacyjne wirujące pole magnetyczne o natężeniu pola 3,5 mT na poziomie mieszadła w komorze.
3. Wykonaj kalibrację powietrza²⁸ w MiR05 lub w tym samym pożywce inkubacyjnej, która została użyta w kolejnych eksperymentach.
4. Od czasu do czasu wykonuj kalibracje zerowego tlenu, ale nigdy bezpośrednio przed rozpoczęciem eksperymentów.
   1. Przygotować świeży roztwór podstawowy Na-ditionitu, rozpuszczając proszek O_2-Zero w 50 mM buforze fosforanowym (pH 8,0) do stężenia 2,5 mM lub 10 mM odpowiednio dla komór sV lub cV.
   2. Miareczkować Na-ditionit w nadmiarze, aby uzyskać surowy sygnał R0 lub prąd zerowy [μA] przy stężeniu O₂ 0 μM^14,28.

3. Test tła instrumentalnego O₂

1. Izbas V
   1. Po kalibracji powietrza zamknij komorę. Monitorować sygnał tlenu przez około 60 minut, aż stężenie_O2 spadnie z nasycenia powietrzem do około 150 μM. Ustaw cztery znaki J°₁ do J°₄ na wykresie "Nachylenie O₂ ujemne".
      UWAGA: Wykonuj ten instrumentalny test tła O₂ codziennie przed rozpoczęciem eksperymentu.
   2. OPCJONALNIE: Za pomocą strzykawki Hamiltona miareczkować Na-ditionit przygotowany zgodnie z krokiem 2.4.1, aby osiągnąć stężenie O₂ wynoszące 100 μM (Rysunek 1C).
      UWAGA: W innym protokole Na-ditionit jest miareczkowany do komory za pomocą mikropompy miareczkowo-wtryskowej (TIP2k; Rysunek uzupełniający 1 i rysunek uzupełniający 2) dla porównania ze standardową metodą wyznaczania tła instrumentalnego O₂ flux²⁸.
2. Komora cV
   1. Po kalibracji powietrza zamknij komorę, poczekaj na ustabilizowanie się nachylenia_O2 i ustaw znak J°₁ na wykresie 'Nachylenie O2 neg.'²⁸. Za pomocą strzykawki Hamiltona miareczkować Na-ditionit przygotowany zgodnie z krokiem 2.4.1. w krokach co 0,7 μL, aby dopasować się do reżimu tlenowego w komorzeV i obniżyć stężenie_O2 do 150 μM.
   2. Dodać kolejny etap miareczkowania Na-ditionitu (ok. 7 μL), aby obniżyć stężenie_O2 do 100 μM (Rysunek 1D).
3. Instrumentalna analiza danych tła O₂
   1. Oblicz instrumentalne nachylenie tła O₂ w DatLab²⁸. Wybierz opcję Flux/Slope (Nachylenie) z górnego menu.
   2. Otwórz okno Korekcja tła O₂. Wybierz Aktywny plik jako źródło tła O₂ i wybierz znaki J°, które mają być używane do obliczania regresji liniowej. Zastosuj korekcję tła O₂
   .

Rysunek 1: Komory o małej objętości (s V) i klasycznej objętości (cV) oraz instrumentalny test tła O₂. (A) Izbas v. (B) Izba cv. (C) Reprezentatywne ślady ujemnego nachylenia i znaki J°₁, sV (0,5 ml; kolor zielony) i cV (2,0 ml; kolor niebieski). (D) Odpowiednie stężenie tlenu i oznaczenia R1. Trzy ręczne miareczkowanie Na-ditionitu (ok. 0,7 μl, 10 mM zapas; cV) i końcowe miareczkowanie 7,0 μl odpowiednio 2,5 mM i 10 mM w komorze sV i cV. Skoki spowodowane miareczkowaniem zostały wyeliminowane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Dodanie próbki do komór Oroboros

UWAGA: Próbka może być dodana do komory na dwa sposoby: częściowa wymiana objętości (płytki krwi i fibroblasty w obecnym badaniu) lub całkowita wymiana objętości (izolowane mitochondria w obecnym badaniu).

1. Częściowa wymiana woluminu
   1. Wyjmij całkowicie włożony korek. Odpipetować i wyrzucić objętość V_z MiR05. V_out wynosi 60-70 μl dla płytek krwi i 80-150 μl dla fibroblastów, obliczane na podstawie stężeń komórek w zawiesinie komórek podstawowych.
   2. Równoważnie V_out, odpipetować tę samą objętość V_J.i zawiesiny komórek podstawowych (o znanym stężeniu komórek) do komory (Rysunek 2).
   3. Obliczyć stężenie komórek doświadczalnych w rzeczywistej objętości V' (0,54 ml i 2,07 ml), większej niż efektywna objętość doświadczalna V (0,5 ml i 2,0 ml).
      UWAGA: Stężenia zawiesiny komórek podstawowych i stężenia komórek doświadczalnych powinny być zaplanowane w taki sposób, aby uzyskać objętości V_J.i = V_out, które są zgodne z małym błędem miareczkowania. W eksperymentach z płytkami krwi użyto prototypowego korka do komoryV o martwej objętości kapilarnej 0,05 ml.
2. Całkowita wymiana woluminu
   1. Odsysać całą pożywkę z komory i zastępować ją co najmniej 0,54 ml lub 2,07 ml izolowanego roztworu podstawowego mitochondriów o stężeniu próbki doświadczalnej odpowiednio w komorach sV lub cV.
   2. Zamknąć komorę i odsysać nadmiar mitochondrialnego roztworu podstawowego z pojemnika korka.
      UWAGA: Całkowita wymiana objętości wyklucza wszelkie zmiany w stężeniu mitochondrialnym, które mogą wystąpić w wyniku miareczkowania do zamkniętej komory przez kapilarnę korka za pomocą strzykawki Hamiltona. Ta ostatnia metoda ma zastosowanie do próbek o małej średnicy, przygotowanych w skoncentrowanych zawiesinach podstawowych (np. izolowanych mitochondriach); jednak naraża delikatne komórki na potencjalne uszkodzenie błon plazmatycznych przez siły ścinające wywierane na igłę o długości 51 mm strzykawki Hamiltona (średnica wewnętrzna 0,41 mm). Można tego uniknąć, usuwając korek i pipetując próbkę do komory poprzez częściową lub całkowitą wymianę objętości. Badano trzy rodzaje preparatów mitochondrialnych. Przykładowe przygotowania są opisane w pliku uzupełniającym 1^1,26,29,30.
3. Żywe komórki: ludzkie płytki krwi
   1. Umieścić kriowia zawierające płytki krwi w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i rozmrozić zawartość, aż pozostanie niewielka ilość lodu.
   2. Otwórz kriowiale i powoli dodawaj 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C) w kroplach.
   3. Delikatnie wymieszać płytki krwi i przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml o całkowitej objętości 10 ml wstępnie podgrzanego podłoża (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C). Wirować przy 1000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) za pomocą odchylanego wirnika (przyspieszenie 6, hamulec 2).
   4. Zawiesić płytki krwi w 0,25 ml DPBS + 10 mM EGTA (RT) i dodać je do komór przez częściową wymianę objętości do początkowego stężenia komórek doświadczalnych w zakresie od 157 · 10 6 do 210 · 10⁶ x·^mL-1 w komorze 0,5 ml i od 164 · 10 6 do 220 · 10⁶ x·^mL-1 w 2,0 ml Chamber (patrz31 aby uzyskać szczegółowe informacje na temat jednostki podstawowej x).
      UWAGA: Jeden Oroboros był wyposażony w komorę sV i cV odpowiednio w pozycjach A i B, używanych równolegle z innym Oroborosem wyposażonym w komorę sV i cV odpowiednio w pozycjach B i A.
4. Komórki przepuszczalne: ludzkie fibroblasty
   1. Dodać komórki do komór Oroborosa przez częściową wymianę objętości do nominalnego stężenia komórek 0,75 · 10⁶ x·^mL-1 w obu typach komór i obliczyć rzeczywiste stężenie (krok 4.1.3).
      UWAGA: Równolegle używano różnych instrumentów Oroboros, z których każdy był wyposażony w komory sV lub cV.
5. Izolowane mitochondria: serce myszy
   1. Dodaj 15 μl zawiesiny mitochondrialnej do 5985 μl mitochondrialnej pożywki oddechowej (MiR05), uzyskując podstawowe stężenie białka mitochondrialnego w zakresie 0,013-0,026 mg∙^mL-1.
   2. Dodać zawiesinę mitochondrialną do komór Oroborosa przez całkowitą wymianę objętości.
      UWAGA: Jeden Oroboros był wyposażony w komorę sV i cV odpowiednio w pozycjach A i B, używanych równolegle z innym Oroborosem wyposażonym w komory sV i cV odpowiednio w pozycjach B i A.

Rysunek 2: Dodanie zawiesiny komórkowej poprzez częściową wymianę objętości. (a) Dodanie do komory 0,5 ml sV i (b) 2,0 ml komory cv. (1) Zamknięta komora z objętościami medium oddechowego V i napełnioną kapilarą korka V_stc, do pomiaru strumienia tła instrumentalnego O₂ J_O2°. (2) Usunięto korek, V_stc spłynął do komory, co daje całkowitą objętość V'= V+V_stc. (3) Częściowe usunięcie pożywki V_out = -V _J.i. W komorze pozostaje objętość V''= V'+V_{na zewnątrz}. (4) Pipetowanie podpróbki o objętości V _J.i respirometrycznej zawiesiny komórek podstawowych do komory, w wyniku czego całkowita objętość V^# = V+V_stc rozcieńczonej zawiesiny komórek. (5) Zamknięta komora z napełnioną kapilarą korka (objętość martwa V_stc) do pomiaru objętościowego strumienia O₂ J_{V, O2} w objętości doświadczalnej V. Ten rysunek został zmodyfikowany z Rysunek 2A w liczbie komórek i normalizacji w HRR⁴¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Protokoły SUIT

1. Miareczkować roztwory podstawowe substancji chemicznych wymienionych w tabeli dodatkowej 1 do komór z mikrostrzykawkami Hamiltona, dostosowując objętości miareczkowania w celu uzyskania tych samych stężeń doświadczalnych w komorach sV i cV (patrz legendy na rysunkach 6, 8, 10).
2. Wybierz protokół SUIT-003_D018^32,33 (dla płytek krwi w niniejszym badaniu).
3. Wybierz protokoły SUIT-001_D004^4,15,34,35 i SUIT-002_D007^4,15,35,36 (dla fibroblastów w niniejszym badaniu).
4. Wybierz protokół SUIT-002_D005^4,15,35,37 (dla izolowanych mitochondriów w niniejszym badaniu).

6. Analiza danych SUIT

1. W DatLab ustaw znaczniki, aby zdefiniować przekroje wybranych działek.
2. Wybierz opcję Flux/Slope (Nachylenie) w górnym menu. Otwórz okno Strumień/Nachylenie. Zastosować poprawkę objętości miareczkowania dla rozcieńczania zawieszonych próbek przez każde miareczkowanie w protokole SUIT.
3. Wybierz Znaczniki z górnego menu. Otwórz statystyki znacznika, aby wyświetlić medianę zaznaczonych punktów danych skorygowaną o linię bazową przez odjęcie zużycia tlenu resztkowego (rox).
4. Oblicz punkt przecięcia i nachylenie między sparowanymi wynikami uzyskanymi w komorach sV i cV za pomocą analizy odwróconej regresji^25,28 za pomocą arkusza kalkulacyjnego.
5. Porównaj częstość oddechów w stanie rox (minimalne strumienie_O2) w komorach sV i cV za pomocą sparowanego testu t Studenta przy użyciu oprogramowania jamovi 2.3.13³⁸.
   UWAGA: Ponieważ dwie komory w instrumencie Oroboros są funkcjonalnie niezależne (z wyjątkiem temperatury i interwałów rejestracji DatLab), pomiary w każdej komorze mogą być rozpatrywane oddzielnie, podobnie jak przy użyciu różnych instrumentów. Wyniki końcowe mogą być przedstawiane jako mediany lub średnie z wielu komór wraz z informacją o ich zmienności.

Wyniki

Surowe sygnały R1 [μA] czujników tlenu (POS) powinny być niezależne od objętości fazy wodnej w równowadze z fazą gazową powietrza w "otwartej" komorze, co zostało potwierdzone w Tabeli Uzupełniającej 2. Natomiast w komorze zamkniętej instrumentalny strumień tła O₂ w pobliżu nasycenia powietrzem J°₁ [pmol∙^s-1∙^mL-1] zależy od objętości V (Tabela uzupełniająca 2). Zużycie O₂ przez czujnik [pmol∙^s-1] można przewidzieć na podstawie przepływu elektronów mierzonego jako skorygowany o zero nieprzetworzony sygnał R1-R0 [μA], liczby ładunku 4 e^-/O₂ i stałej Faradaya F = 96 485,33 C∙^mol-1. 1 μA jest równoważne przepływowi elektronów (e^-) wynoszącemu 10,36 pmol∙^s-1. Dzielenie przez liczbę ładunku daje przepływ O₂^15,39 z 2.591 pmol∙^s-1·^μA-1. Zarejestrowana mediana R1-R0 wynosiła 2,09 μA i 1,98 μA odpowiednio w komorach 0,5 ml i 2,0 ml (tabela uzupełniająca 2; R0 = 0,006 ± 0,007 μA w sV i R0 = 0,004 ± 0,003 μA w komorachc V), co odpowiada teoretycznie wskaźnikom zużycia O₂ wynoszącym 5,41 pmol∙^s-1 i 5,13 pmol∙^s-1. Przepływ O₂ czujnika jest przekształcany na oczekiwany strumień właściwy objętości przy nasyceniu powietrza (J°_R1) jako 5,41 pmol∙^s-1/0,5 ml = 10,82 pmol∙^s-1∙^mL-1 i 5,13 pmol∙^s-1/2,0 ml = 2,56 pmol∙^s-1∙^mL-1 w sV i cV Izba, odpowiednio. Przy tym samym typie polarograficznych czujników tlenu w komorze o pojemności 2,0 ml i 0,5 ml strumień tła specyficzny dla objętości O₂ - obliczony na podstawie aktualnego R1-R0 (J°_R1) - wzrasta teoretycznie 4-krotnie w odwrotnej proporcji do objętości komory. J°_powietrze (przy nasyceniu powietrza, gdzie dyfuzja wsteczna wynosi zero; porównaj tabelę 2 i tabelę uzupełniającą 3) obliczono dla stężenia_O2 przy nasyceniu powietrza na podstawie regresji liniowej eksperymentalnego testu tła (Rysunek 3). J°_air zbliżył się do teoretycznie oczekiwanych wartości J°_R1 dla obu komór (tabela 2). Stosunek J°_air / J°_R1 wynosił 0,85 ± 0,04 i 0,92 ± 0,12 odpowiednio w komorze sV i cV, zgodnie z niezależną serią 52 pomiarów w komorze 2,0 ml, w której stosunek ten wynosił 0,95 ± 0,12 (tabela uzupełniająca 4). J°_air był 3,9 razy wyższy w komorze 0,5 ml niż w komorze 2,0 ml. Dyfuzja wsteczna netto O₂ J°₅₀, obliczona przy 50 μM O₂ z regresji liniowej eksperymentalnego testu tła, była tylko trzykrotnie wyższa w komorze 0,5 ml (tabela 2). Zmienność instrumentalnych strumieni tła O₂ była prawie identyczna w dwóch różnych objętościach komory, z odchyleniem standardowym (SD) wynoszącym 0,5 i 0,3 pmol∙^s-1∙^mL-1 dla J°_air oraz 0,9 i 0,8 pmol∙^s-1∙^mL-1 dla J°₅₀ w komorze sV i cV, (tabela 2). Pomimo wyższych instrumentalnych nachyleń tła_O2 w komorze 0,5 ml, zależność strumieni tła_O2 od c_O2 była wysoce odtwarzalna w obu typach komór (Rysunek 3D). Powoduje to niskie wartości reszt <±1 pmol∙^s-1∙^mL-1 dla obu komór (Tabela uzupełniająca 5), zgodnie z granicą wykrywalności klasy Oroboros²⁸.

Określiliśmy ilościowo wpływ prędkości mieszania na surowy sygnał kalibracyjny R1 POS między 350 rpm (5.8 Hz) a 950 rpm (15.8 Hz) w krokach co 100 rpm (1.7 Hz) z komorą w konfiguracji 'otwartej'. W tej konfiguracji O₂ rozpuszczony w pożywce jest w równowadze z fazą gazową; w związku z tym zmiany w sygnale surowym (mikroamper [μA]) w funkcji prędkości mieszania nie odzwierciedlają rzeczywistych różnic w c_O2 . Czujniki tlenu reagowały na zmianę prędkości mieszania z niewielkim odchyleniem od R1 przy domyślnej prędkości 750 obr./min, niezależnie od objętości komory (Rysunek 4). W konfiguracji "otwartej" szum nachylenia_O2, zdefiniowany jako SD dla każdego kroku po ustabilizowaniu sygnału, był najniższy przy 850 obr./min w obu typach komór i wzrastał, gdy prędkość mieszania odbiegała od tej wartości w dowolnym kierunku (Rysunek 5A). Poniżej 550 obr./min hałas nachylenia O₂ przekraczał próg ±4 pmol∙^s-1∙^mL-1, określający minimalną praktyczną prędkość mieszania. Ze względu na ograniczenia techniczne, górna granica nie została osiągnięta, co daje 950 obr./min jako maksymalną praktyczną prędkość mieszania (Rysunek 5A). W tym zakresie odchylenie sygnału O₂ od R1 wynosiło <2,5 %. Zamknięcie komór nie zmieniło zależności między hałasem a prędkością mieszania (Rysunek 5B). Wykładnicza stała czasowa τ wynosiła 2,53 ± 0,05 s przy 550 obr./min i 2,50 ± 0,05 s przy 750 obr./min dla komory 0,5 ml (rysunek uzupełniający 3).

Protokół SUIT-003_D018 stosowany do płytek krwi obejmuje do 14 etapów miareczkowania. Jest przeznaczony do badania kontroli sprzężenia żywych komórek, przepuszczalności ce i błony plazmatycznej jako wskaźnika żywotności komórek³². Przepływ tlenu mierzony w dwóch typach komór (Rysunek 6) był ściśle dopasowany we wszystkich stanach oddechowych (Rysunek 7). Okresowe natlenianie jest wymagane w celu uniknięcia funkcjonalnego niedotlenienia lub ograniczenia eksperymentalnego stężenia_O2 do określonego zakresu. Retlenowację przeprowadzono poprzez otwarcie komory do pozycji "otwartej" po miareczkowaniu Rot. Po zamknięciu komory, strumień_O2 ustabilizował się w ciągu 4 minut w komorze 2,0 ml, ale około 10 minut było wymagane w komorze 0,5 ml przed stabilizacją i ustawieniem nowego znaku (Rysunek 6 i Rysunek uzupełniający 4). Retlenacja w stanie rox, gdy strumienie_O2 są niskie, pozwala uniknąć spadku stężenia_O2 w czasie wymaganym do stabilizacji. Rox hamowany rotenonem wynosił 0,9 ± 0,6 i 2,0 ± 0,6 pmol∙^s-1∙^mL-1 przy 98 ± 17 i 94 ± 17 μM O₂ (średnia ± SD) odpowiednio w komorze sV i cV. Rox wzrósł o 3,1 ± 0,9 i 0,9 ± 0,4 pmol∙^s-1∙^mL-1 po ponownym natlenieniu do 159 ± 8 i 147 ± 11 μM O₂ odpowiednio w komorze sV i cV. Zależność roxu od tlenu obserwowana w płytkach krwi zgadza się z wynikami na ludzkich fibroblastach i komórkach śródbłonka żyły pępowinowej⁴⁰.

Do analizy OXPHOS w permeabilizowanych fibroblastach użyliśmy dwóch protokołów SUIT z maksymalnie 17 i 20 krokami miareczkowania (odpowiednio SUIT-001 i SUIT-002³⁵; Rysunek 8); w związku z tym korekta objętości miareczkowania jest szczególnie ważna, ponieważ pod koniec SUIT-002 rozcieńczenie wynosiło maksymalnie 14 % i 10,5 % odpowiednio w komorze sV i cV. Liczba komórek fibroblastów wynosząca 0,35·10⁶ x i 1,44·10⁶ x w komorach 0,5 ml i 2,0 ml odpowiednio dała takie samo stężenie komórek 0,75·10⁶ x∙^mL-1. Kombinacja SUIT-001 i SUIT-002 dotyczyła 20 stanów oddechowych, z których wszystkie były ściśle skorelowane w typach dwukomorowych (r² = 0,950 dla SUIT-001 i r² = 0,959 dla SUIT-002). W obu protokołach kompleks IV miał stosunkowo wysoki rozrzut (Rysunek 9). Reoksygenacja nie była wymagana w SUIT-001, zaczynając od strumienia O₂ o niskiej objętości wynoszącego 18,7 ± 7,0 pmol∙^s-1∙^mL-1 w stanie rutynowym (średnia ± SD), co pozwoliło na spadek stężenia O₂ do 56 μM do sekcji protokołu powiązanej z CIV (Rysunek 8A; 8Ama). Jednak w SUIT-002 reoksygenację przeprowadzono przed miareczkowaniem rozprzęgającym, zwiększając stężenie O₂ ze 100 μM do 180 μM (Rysunek 8B; 6Gp). Biorąc pod uwagę długi czas potrzebny do ustabilizowania strumienia po ponownym natlenieniu, należy unikać ponownego natleniania podczas miareczkowania rozprzęgającego.

Skrócony protokół SUIT został zastosowany do izolowanych mitochondriów (Rysunek 10). Stężenie białka mitochondrialnego oznaczono po teście respirometrycznym, co uniemożliwiło wcześniejsze określenie dokładnego stężenia próbki w komorze. Objętościowy strumień oddechowy zmienia się w zależności od stężenia mitochondriów. W związku z tym dane przedstawiono jako strumień specyficzny dla objętości i masy białka (Rysunek 11). Obie reprezentacje pokazują ścisłą korelację między pomiarami uzyskanymi w komorach 0,5 ml i 2,0 ml (Rysunek 11).

Zużycie tlenu resztkowego mierzone po zahamowaniu Kompleksu III przez antymycynę A może być użyte jako wskaźnik wydajności instrumentalnej przy bardzo niskiej częstości oddechów. We wszystkich seriach eksperymentalnych rox był porównywalny między komorami 0,5 ml i 2,0 ml (płytki krwi: t₍₅₎ = -0,34, p = 0,74; fibroblast: SUIT-001: t₍₁₀₎ = 20,00, p = 0,06; GARNITUR-002: t₍₁₀₎ = 11,00, p = 0,96; Izolowane mitochondria: t₍₄₎ = -1,18, p = 0,27). Rozrzut danych odpowiadał w dużej mierze niepewności instrumentalnej ±1 pmol∙^s-1∙^{mL-1 13,28}, jak pokazano w Rysunek 12. Oryginalne pliki są dostępne do otwartego dostępu w repozytorium Zenodo: 10.5281/zenodo.11634408.

Rysunek 3: Instrumentalne tło strumienia O₂ dla komory sV (0,5 ml; zielony i) i cV (2,0 ml; niebieski). Stężenie_O2 mieści się w zakresie od nasycenia powietrzem (ok. 180 μM) do ok. 50 μM. Symbole otwarte: Stężenia_O2 uzyskane bez Na-ditionitu. Symbole stałe: stężenia O₂ kontrolowane za pomocą ręcznego miareczkowania Na-ditionitu. Czarne kręgi: stężenia O₂ kontrolowane przez miareczkowanie Na-ditionitu przy użyciu TIP2k w komorze 0,5 ml (N = 8). Wyniki instrumentalnych testów tła zebrano z (A) serii 1 (sV: N = 2; cV: N = 2) przed użyciem żywych komórek (ce); b) seria 2 (sV: N = 38; cV: N = 50) przed użyciem komórek przepuszczalnych (pce); (C) Seria 3 (sV: N = 10; cV: N = 10) przed użyciem izolowanych mitochondriów (imt). (D) Nałożone dane z paneli A-C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wpływ prędkości obrotowej mieszania na sygnał POS przy nasyceniu powietrzem (komora 'otwarta') w komorze 0,5 ml (zielona) i komorze 2,0 ml (niebieska). Odpowiedź [%] względem sygnałów kalibracji powietrza z korekcją R0 R1-R0 [μA] przy 750 obr./min (sV: N = 4; cV: N = 4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Szum nachylenia O₂ jako funkcja prędkości obrotowej mieszania. hałas wyrażony jako odchylenie standardowe w (A) "otwartej" komorze; (B) zamknięta komora (0,5 ml w kolorze zielonym; 2,0 ml w kolorze niebieskim). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: O₂ zużycie kriokonserwowanych ludzkich płytek krwi w komorze 0,5 ml. Reprezentatywne ślady stężenia_O2 [μM] (niebieskie linie) i przepływu_O2 na komórkę [amol∙^s-1∙^x-1] obliczone jako strumień O₂ [pmol∙^s-1∙^mL-1] podzielone przez stężenie komórkowe 157∙10⁶ x∙^mL-1 (czerwone linie, skorygowane o tło instrumentalne O₂ topnik; Skoki spowodowane miareczkowaniem zostały wyeliminowane). Stężenie_O2 utrzymywano powyżej 50 μM poprzez przerywane natlenianie (powietrze, komora 'otwarta', odcień niebieski). Sekwencja stanów oddechowych (miareczkowanie i częstość; protokół SUIT-003_D018): ce1, rutynowe oddychanie R żywych komórek. ce1P, pirogronian 5 mM jako podłoże zewnętrzne. ce2Omy10 (tablica A), miareczkowanie Omy w krokach co 5 nM; oddychanie nieszczelne L. ce3U0,3 (panel A) i ce3U0,1 (panel B), miareczkowanie rozprzęgające do optymalnego stężenia CCCP wynoszącego odpowiednio 0,3 i 0,1 μM; Zdolność ET E. ce3Glc, glukoza 11 mM; E stopniowo hamowane przez rozprzęgacz. ce4Zgnilizna, rotenon 0,5 μM hamujący CI; Zużycie tlenu resztkowego Rox. ce5S, bursztynian 10 mM; stymulacja E w komórkach przepuszczalnych przez błonę plazmatyczną. 1Dig15 (panel A) i 1Dig10 (panel B), miareczkowanie digitoniny w krokach co 5 μg·^mL-1 do optymalnych stężeń odpowiednio 15 i 10 μg·^mL-1, w celu całkowitej przepuszczalności błony komórkowej; zdolność ET szlaku bursztynianowego S_E. 1c, cytochrom c 10 μM; badanie integralności błony zewnętrznej mitochondriów. 2Ama, antymycyna A 2,5 μM hamująca CIII; rox. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Korelacja oddychania kriokonserwowanych ludzkich płytek krwi mierzonych w komorze 0,5 ml i 2,0 ml. Skorygowany o Rox przepływ_O2 oceniono w protokole SUIT-003_D018 (Rysunek 6); N = 6. a) z oligomycyną Omy; (B) bez Omy. Średnie nachylenia i punkty przecięcia odwróconej regresji metodą najmniejszych kwadratów i współczynniki determinacji r² obliczone na podstawie wszystkich danych. Przerywane czarne linie reprezentują linie tożsamości. Czerwone linie reprezentują obliczone linie regresji. Przepływy O₂ w stanie po dodaniu glukozy zostały wykluczone (patrz Rysunek 6). Protokoły z oligomycyną i bez niej są rozdzielone w panelach A i B, aby uniknąć nakładania się punktów danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Zużycie O₂ fibroblastów w komorze 0,5 ml. Reprezentatywne ślady przepływu c_O2 (niebieskie linie [μM]) i O₂ na komórkę obliczone jako strumień O₂ [pmol∙^s-1∙^mL-1] podzielone przez stężenie komórki (0,75·10⁶ x∙^mL-1), skorygowane o instrumentalny strumień tła O₂ (wyeliminowano czerwone linie, skoki spowodowane miareczkowaniem). Stężenie_O2 utrzymywano powyżej 50 μM poprzez przerywane natlenianie (powietrze, komora 'otwarta', odcień niebieski). Sekwencja stanów oddechowych (miareczkowanie i częstość). (A) Protokół SUIT-001_D004: ce1, rutynowe oddychanie R. +Digitonina 10 μg·^mL-1 (ce do pce), resztkowe oddychanie endogenne ren. 1PM, pirogronian 5 mM i jabłczan 2 mM; Oddychanie nieszczelne drogą N_L. 2D, ADP 2,5 mM; Zdolność szlaku N OXPHOS N_P. 2c, cytochrom c 10 μM; badanie integralności błony zewnętrznej mitochondriów. 3U1,5, miareczkowanie rozprzęgające do optymalnego stężenia CCCP 1,5 μM; Zdolność ET powiązana z NADH N_E. 4G, glutaminian 10 mM; N(PGM)_E. 5S, bursztynian 10 mM; Zdolność szlaku NS ETS NS_E. 6Rot, rotenon 0,5 μM; zdolność ET szlaku bursztynianowego S_E. 7Gp, glicerofosforan 10 mM; SGp_E. 8Ama, antymycyna A 2,5 μM; rox. 9AsTm, askorbinian 2 mM i TMPD 0,5 mM; podłoża do stymulacji CIV; Komora była otwarta przez 20 minut, aby umożliwić równowagę redoks bez zubożenia tlenu⁴; O₂ strumień z kamienia po zamknięciu komory (205 amol·^s-1·^x-1). 10Azd, azydek 100 mM; Zależny od tlenu chemiczny strumień tła CHB. (B) Protokół SUIT-002_D007: ce1, R. +Kopać, ren. +D, stymulujący ren. +M.1, jabłczan 0,1 mM i 1Oct, oktanoilokarnityna 0,5 mM; Pojemność OXPHOS szlaku F_P = J(1Oct)-J(+M.1). 1c. 2M2, jabłczan 2 mM wspierający anaplerotyczny szlak N; F(N)_P. 3P i 4G, progresywna aktywacja do FN_P. 5S, FNS_P. 6Gp, FNSGp_P. 7U1.5, FNSGp_E. 8Rot, SGp_E. 9Ama, rox. 10AsTm O₂ strumień poza skalą 207 amol·^s-1·^x-1. 11Azd, rozdz. Ogólnie rzecz biorąc, aktywność kompleksu IV to różnica szybkości, J(AsTm)-J(Azd) przy ściśle dopasowanych stężeniach_O2. Zobacz Rysunek 6, aby uzyskać więcej informacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Korelacja oddychania permeabilizowanych fibroblastów w komorze 0,5 ml i 2,0 ml. Skorygowany o rox przepływ_O2 w (A) SUIT-001_D004 i (B) SUIT-002_D007 (N = 6). Średnie nachylenie i przecięcie odwróconej regresji metodą najmniejszych kwadratów i współczynnika determinacji r² obliczonego na podstawie wszystkich danych. Przerywana linia reprezentuje linię tożsamości. Czerwone linie reprezentują obliczone linie regresji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10: O₂ zużycie izolowanych mitochondriów serca myszy w komorach 0,5 ml (zielona) i 2,0 ml (niebieska). Reprezentatywne ślady (A) swoistego masowo strumienia_O2 przy stężeniu białka mitochondrialnego 0,023 mg∙^mL-1 (skorygowane o strumień O₂ w tle instrumentalnym, skoki spowodowane miareczkowaniem zostały wyeliminowane) i (B) stężenie_O2 [μM]. Sekwencja stanów oddechowych (miareczkowanie i częstość) zgodnie z protokołem SUIT-002_D005: imt, resztkowe oddychanie endogenne ren. +D, ADP 2,5 mM; Stymulujący ren. +M.1, jabłczan 0,1 mM i 1Oct, oktanoilokarnityna 0,5 mM; Pojemność OXPHOS szlaku F_P = J(1Oct)-J(+M.1). 1c, cytochrom c 10 μM; badanie integralności błony zewnętrznej mitochondriów. 2M2, wysoki jabłczan 2 mM wspierający anaplerotyczny szlak N; F(N)_P. 3P, pirogronian 5 mM; FN_P. 4G, glutaminian 10 mM; FN_P. 5S, bursztynian 10 mM; FNS_P. 6Gp, glicerofosforan 10 mM; FNSGp_P. 7U0,5, miareczkowanie rozprzęgacza do optymalnego stężenia CCCP 0,5 μM; FNSGp_E. 8Rot, rotenon 0,5 μM hamujący CI; SGp_E. 9Ama, antymycyna A 2,5 μM hamująca CIII; Zużycie tlenu resztkowego Rox. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11: Korelacja oddychania izolowanych mitochondriów serca myszy mierzona w komorach 0,5 ml i 2,0 ml. Strumień O₂ w protokole pokazanym na rysunku 10 (N = 4). (A) Strumień O₂ właściwy dla objętości. (B) Skorygowany o rox strumień_O2 podzielony przez stężenie białka mitochondrialnego (0,013 - 0,026 mg∙mL-1). Średnie nachylenie i przecięcie odwróconej regresji metodą najmniejszych kwadratów i współczynnika determinacji r² obliczonego na podstawie wszystkich danych. Przerywane czarne linie reprezentują linię tożsamości. Czerwone linie reprezentują obliczoną linię regresji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 12: Zużycie tlenu resztkowego w komorach 0,5 ml i 2,0 ml. Strumień na objętość mierzony po dodaniu antymycyny A, w połączeniu z eksperymentami z żywymi komórkami (ce, kwadraty), komórkami przepuszczalnymi (pce, koła) i izolowanymi mitochondriami (imt, trójkąty). Średnie nachylenie i przecięcie odwróconej regresji metodą najmniejszych kwadratów. Linia przerywana: linia tożsamości. Czerwona linia: obliczona linia regresji. Cień: instrumentalny zakres rozdzielczości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

moduł	sV	cV
Komora doświadczalna tom V	0,5 ml	2,0 ml
Średnica wewnętrzna szklanego cylindra	12,0 mm	16,0 milimetr
Średnica zewnętrzna szklanego cylindra	24,0 milimetr	24,0 milimetr
Grubość szklanej ścianki	6,0 mm	4,0 mm
Mieszadło z powłoką PVDF	11,5 x 6,2 mm	15,0 x 6,0 mm
Średnica kapilary korka	1,00 mm	1,30 mm
Pole przekroju poprzecznego kapilary korka	0,79 mm2	1,33 mm2
Długość kapilary korka	50,64 milimetra	48,86 milimetra
Korek objętość kapilar	39,8 μl	64,9 μL
Korek kapilarny martwa objętość Vstc z małąkroplą a	0,04 ml	0,07 ml
Objętość V' do kalibracji objętości	0,54 ml	2,07 ml

^aKropla powinna odpowiadać 5 μL dla Komory cV i blisko 0 μL dla Komorys V.
Tabela 1: Wymiary modułów o małej objętości (s V) i klasycznej objętości (c V) z korkami z polieteroeteroketonu (PEEK).

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. jezdnego pkt. pkt.

	J°air / [pmol∙s-1∙mL-1]		J°50 / [pmol∙s-1∙mL-1]
Komora doświadczalna tom V	0,5 ml	2,0 ml	0,5 ml	2,0 ml
znaczyć	Godzina 9,22	Godzina 2,37	-3,17	-1,17
mediana	Godzina 9,25	Klasa 2,36	-3,08	-1,04
odchylenie standardowe	0,49	0,34	0,93	0,83
minimum	Godzina 8.20	Pytanie 1,79	-5,11	-3,72
maksimum	Godzina 10.41	Rejon 3,42	-0,82	0,67

Tabela 2: J°_powietrze ekstrapolowane na nasycenie powietrzem i J°₅₀ obliczone przy stężeniu 50 μM O₂. Zbiorcze dane z instrumentalnych testów tła w seriach 2 (pce) i 3 (imt) oraz przed miareczkowaniem TIP2k (0,5 ml: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 ml: N = 60).

Plik uzupełniający 1: Preparaty próbek. Ludzkie płytki krwi, ludzkie fibroblasty i mitochondria wyizolowane z serc myszy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 1: Instrumentalny test tła O₂ z wykorzystaniem TIP2k. Reprezentatywne ślady testu przeprowadzonego przy użyciu TIP2k do miareczkowania Na-ditionitu (2,5 mM) w komorze 0,5 ml. Medium: MiR05, temperatura: 37 °C, prędkość mieszania: 750 obr/min. Skoki spowodowane miareczkowaniem zostały wyeliminowane. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Tło instrumentalne Strumień O₂ J_°1 jako funkcja stężenia O₂. Komora s V (0,5 ml; zielona, N = 48) i Komora cV (2,0 ml; niebieska, N = 60) w serii 2 (pce, koła) i 3 (imt, trójkąty), a przed miareczkowaniem TIP2k w komorze 0,5 ml (czarne kółka, N = 8). Czerwone linie: mediana ± SD. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Wykładnicza stała czasowa τ w funkcji prędkości obrotowej mieszania. Indywidualne wartości τ dla komory 0,5 ml w temperaturze 37 °C (N = 2). W komorze 0,5 ml τ wynosiło 2,53 ± 0,05 s przy 550 obr./min, 2,50 ± 0,05 s przy 750 obr./min i 2,47 ± 0,04 s przy 850 obr./min. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: O₂ zużycie kriokonserwowanych ludzkich płytek krwi w komorze 2,0 ml. Reprezentatywny ślad protokołu SUIT-003_D018, w tym miareczkowanie oligomycyny (Omy). Strumień [pmol∙^s-1∙^mL-1] skorygowano o instrumentalny strumień tła O₂ i podzielono przez stężenie komórek (164∙10⁶ x∙^mL-1). Skoki spowodowane miareczkowaniem zostały wyeliminowane. c_O2 utrzymywano powyżej 60 μM poprzez przerywane natlenianie (powietrze, komora 'otwarta', odcień niebieski). Sekwencja stanów oddechowych (miareczkowanie i częstość): ce1, rutynowe oddychanie R żywych komórek. ce1P, pirogronian jako podłoże zewnętrzne. ce2Omy10, miareczkowanie Omy w krokach co 5 nM; oddychanie nieszczelne L. ce3U2.0, miareczkowanie rozprzęgacza do optymalnych stężeń 2 μM; Zdolność ET E. ce3Glc, glukoza 11 mM; E stopniowo hamowane przez rozprzęgacz. ce4Rot, rotenon 0,5 μM hamujący CI; Zużycie tlenu resztkowego Rox. ce5S, bursztynian 10 mM; stymulacja E w komórkach przepuszczalnych przez błonę plazmatyczną. 1Dig20, miareczkowanie digitoniny do optymalnych stężeń 20 μg·^mL-1, w celu całkowitej przepuszczalności błony komórkowej; zdolność ET szlaku bursztynianowego S_E. 1c, cytochrom c 10 μM; badanie integralności błony zewnętrznej mitochondriów. 2Ama, antymycyna A 2,5 μM hamująca CIII; rox. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Substancje chemiczne stosowane w protokołach SUIT (substrate-inhibitor-uncouplingr-titration). Skróty i stężenia roztworu podstawowego dla komór sV i cV. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Porównanie R1-R0 i J°₁ w komorach 0,5 ml i 2,0 ml. Zbiorcze dane z instrumentalnych testów tła w seriach 2 (pce) i 3 (imt) oraz przed miareczkowaniem TIP2k (0,5 ml: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 ml: N = 60). Dane uśredniono tylko z eksperymentalnych serii 2 (pce) i 3 (imt), które przeprowadzono przy średnim ciśnieniu atmosferycznym 94,9 kPa (Innsbruck, Austria), z wyłączeniem danych z serii 1 (ce) uzyskanych na poziomie morza. Ten sam typ, ale różne indywidualne POS zastosowano w komorach 0,5 ml i 2,0 ml. Dlatego przy porównywaniu komór sV i cV należy wziąć pod uwagę zmienność między czujnikami. Podczas gdy J°₁ = 2,26 ± 0,41 pmol∙^s-1∙^mL-1 uzyskany doświadczalnie dla komory 2,0 ml odpowiadał ściśle obliczonej wartości, eksperymentalny J°₁ = 8,48 ± 0,53 pmol∙^s-1∙^mL-1 dla komory 0,5 ml był niższy niż oczekiwano. Wyjaśniono to w następujących obserwacjach. Po zamknięciu komory, wyższy strumień tła_O2 w komorze 0,5 ml obniża stężenia_O2 na znakach dla J°₁ ustawionych w porównywalnych odstępach czasu (Rysunek 1). Stężenie tlenu w J°₁ było średnio o 4,06% i 1,72% niższe od nasycenia powietrza odpowiednio w komorze 0,5 ml i 2,0 ml (rysunek uzupełniający 2, tabela uzupełniająca 2). Przy niższym c_O2 zmniejszone zużycie_O2 przez czujnik i pewna dyfuzja zwrotna_O2 zmniejszają eksperymentalnie wyznaczoną J°₁. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 3: Stężenie tlenu [μM], przy którym uzyskano kalibrację (R1) i J°₁ oraz ich procentowa różnica. Zbiorcze dane z instrumentalnych testów tła w seriach 2 (pce) i 3 (imt) oraz przed miareczkowaniem TIP2k (0,5 ml: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 ml: N = 60). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 4: Zmierzone i oczekiwane J°₁ w komorze 2,0 ml. Niezależna seria instrumentalnych testów tła z O2k seria A (z tytanowymi korkami13), V = 2,0 ml (37 °C, roztwór NaCl o współczynniku rozpuszczalności_O2 0,92; N = 52). n_O2/Q_e = 10⁶/(96485.33·4) = 2.591 pmol∙^μC-1 = 2.591 pmol∙^s-1∙^μA-1. Opiera się na założeniu, że dyfuzja wsteczna O₂ jest pomijalna przy c_O2,1, co jest prawdziwe tylko przy c_O2,1 ~ c_O2*. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 5: Reszty regresji liniowej (wartości bezwzględne [pmol O₂∙^s-1∙^mL-1]) obliczone dla każdego instrumentalnego testu tła O₂. Zbiorcze dane z instrumentalnych testów tła w seriach 2 (pce) i 3 (imt) oraz przed miareczkowaniem TIP2k. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Ilość próbki dostępnej do respirometrii jest często ograniczona, np. w badaniach biopsji, komórek pierwotnych lub wolno rosnących kultur komórkowych o niskiej liczbie komórek¹. Co więcej, aktywność układu oddechowego jest obniżona z powodu urazów mitochondrialnych¹¹ lub podczas badania szlaków mitochondrialnych o niskiej wydajności, takich jak utlenianie kwasów tłuszczowych¹². W takich przypadkach niska objętość komory respirometrycznej zapewnia korzyści w zakresie rozdzielczości strumienia_O2. Jednak instrumentalne strumienie tła_O2 zwiększają się przy niższych objętościach komory i wywołują błędy, gdy nie są mierzone wiarygodnie i nie są odpowiednio korygowane w funkcji stężenia_O2. Powtarzalność instrumentalnych testów tła_O2 i korekcji tła są szczególnie ważne w przypadku małych objętości komory. Prawie identyczne wartości teoretycznego (J°_R1) i eksperymentalnego (J°_air) strumienia_O2 dostarczają dowodów na dokładność pomiaru polarograficznego z 4 e^-/O₂ w reakcji katodowej POS. Różnica między J°_R1 i J°_air wynosiła 1,64 ± 0,43 i 0,22 ± 0,31 pmol∙^s-1∙mL-1 odpowiednio w komorze sV i cV, co wskazuje na precyzję pomiarów, która mieści się w granicy wykrywalności komory 2,0 ml (±1 pmol∙^s-1∙^mL-1)²⁸. Przy tym samym typie polarograficznych czujników tlenu w komorze 2,0 ml i 0,5 ml, strumień tła o objętości O₂ wzrósł 4-krotnie odwrotnie proporcjonalnie do objętości komory, a zmienność była prawie identyczna w dwóch objętościach komory, z SD wynoszącym 0,5 i 0,3 pmol∙^s-1∙mL-1 dla J°_air oraz 0,9 i 0,8 pmol∙^s-1∙^mL-1 dla J°₅₀ odpowiednio w komorze sV i cV (tabela 2). Przy minimalnych czynnościach oddechowych - do których zaprojektowano komorę o małej objętości - nawet niewielkie efekty tła stają się znaczące (tabela uzupełniająca 3; Rysunek uzupełniający 2). W związku z tym wymagana jest rutynowa ocena strumienia O₂ w tle instrumentalnym (rysunek 1) w celu zastosowania właściwej korekcji²⁸.

Wysokie i ciągłe mieszanie pożywki jest wymagane do utrzymania jednorodnego systemu i zagwarantowania stabilnego sygnału tlenowego. Prędkość mieszania 750 obr./min ustalono dla komory o pojemności 2,0 ml, ale optymalna prędkość nie była znana w komorze o pojemności 0,5 ml. Różne geometrie szklanej komory i mieszadła (tabela 2) wymagają niezależnej oceny optymalnej prędkości mieszania. Czujniki tlenu reagowały na zmiany prędkości mieszania w zakresie od 550 obr./min do 950 obr./min, z niewielkim odchyleniem od sygnału O₂ R1 przy 750 obr./min, niezależnie od objętości komory. Wykładnicza stała czasowa τ obliczona dla komorys V była zgodna z τ zgłoszoną dla komory 2,0 ml przy tej samej prędkości mieszania¹³. Wyniki te sugerują, że mieszanie jest równie skuteczne w obu geometriach komory i że domyślna prędkość mieszania 750 obr./min (komora 2,0 ml) może być zastosowana do komory 0,5 ml. Zarówno w konfiguracji komory "otwartej", jak i "zamkniętej", komora o pojemności 0,5 ml miała wyższy stosunek sygnału do szumu, co sugeruje wyższą dokładność jako zaletę komory o pojemności 0,5 ml (ilustracja 5), chociaż nie można wykluczyć wpływu zmienności poszczególnych punktów sprzedaży. Ponieważ hałas nie wzrastał przy zmniejszaniu prędkości mieszania z 750 obr./min do 550 obr./min, zmniejszenie prędkości mieszania do 550 obr./min w komorze 0,5 ml może być korzystne dla zminimalizowania naprężeń ścinających bez uszczerbku dla stosunku sygnału do szumu.

Prawie identyczne wskaźniki zużycia_O2 mierzono w komorach 0,5 ml i 2,0 ml w trzech modelach eksperymentalnych, gdy zastosowano odpowiednią korekcję tła. Wyniki uzyskane z małymi płytkami krwi o średnicy 2 μm⁴², żywymi i przepuszczalnymi fibroblastami oraz izolowanymi mitochondriami sugerują, że można oczekiwać uzyskania stałej częstości oddechów w komorach 0,5 ml i 2,0 ml w szerokim zakresie typów komórek i preparatów mitochondrialnych. Przepuszczalne włókna mięśniowe nie zostały jednak przetestowane w niniejszym badaniu. Dokładny pomiar rox wymaga kontroli poziomu tlenu⁴⁰ i wysokiej rozdzielczości instrumentalnej¹. Specyficzny objętościowo strumień O₂ rox może być tak niski, jak granica wykrywalności. Reoksygenacja nie jest konieczna, gdy w eksperymencie używa się małej liczby komórek lub ogólnie niewielkich ilości próbek. W razie potrzeby zaleca się jednak wykonanie reoksygenacji w stanach oddechowych o niskim strumieniu_O2, aby uniknąć gwałtownego spadku stężenia_O2 w okresie wymaganym do stabilizacji strumienia_O2. Stabilizacja strumienia_O2 po ponownym natlenieniu trwa dłużej w komorze 0,5 ml.

W celu zapewnienia kontroli jakości należy zwrócić szczególną uwagę na rozcieńczenie próbki w zawiesinie podczas częściowej wymiany objętości. Po wyjęciu całkowicie włożonego korka, całkowita objętość V' medium oddechowego w komorze jest podawana przez eksperymentalną objętość V i objętość kapilary V _stc zatyczki (tabela 2). W związku z tym objętość materiału wyjściowego V _J.i rozcieńcza się w rzeczywistej objętości V', która jest większa niż V, co daje współczynnik rozcieńczenia V/V' wynoszący 0,5/0,54 = 0,926 i 2,0/2,07 = 0,966 odpowiednio w komorach 0,5 ml i 2,0 ml (rysunek 2). W eksperymentach z płytkami krwi zastosowano prototypowy korek do komory V o martwej objętości kapilarnej 0,05 ml, co odpowiada współczynnikowi rozcieńczenia 0,909.

W komorze 0,5 ml wymagana jest prawie czterokrotnie mniejsza ilość żywych komórek, komórek przepuszczalnych i izolowanych mitochondriów niż w komorze 2,0 ml przy identycznych stężeniach próbki (ilość na objętość), co daje ilościowo porównywalne wyniki zużycia O₂ w oddychaniu znormalizowane dla liczby komórek lub masy białka. Wskazuje to, że komora V jest cennym narzędziem do badań, w których ilość dostępnych próbek jest ograniczona. Z drugiej strony, zastosowanie identycznej ilości próbki w komorzes V zwiększa objętościowy strumień_O2, a tym samym zmniejsza niepewność pomiarów, gdy aktywność oddechowa jest niska.

Reżim tlenowy w niniejszym badaniu był ograniczony do zakresu nasycenia powietrza_O2 do 30 μM. Zastosowanie przy poziomach tlenu poza tym zakresem wymaga dalszej oceny w celu zbadania funkcji mitochondriów w normoksji tkankowej lub hipoksji⁴³ i przepuszczalnych tkanek w hiperoksji⁹. Kilka konfiguracji wielosensorowych modułów NADH i Q firmy Oroboros; Elektrody pH, NO i TPP^{+ 10,44} - nie mogą być umieszczone w komorzeV i wymagają komory 2,0 ml.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anaconda3	Anaconda Software Distribution	https://www.anaconda.com/	software
ADP	Merck, Niemcy	117105
Antybiotyki-leki przeciwgrzybicze 100x	Biosera, Francja	XC-A4110	UWAGA H317 Może powodować reakcję alergiczną skóry
Antymycyna A	Sigma-Aldrich, USA	A8674	UWAGA H300  Połknięcie grozi śmiercią, H400 krótkotrwałe (ostre) zagrożenie dla środowiska wodnego
Askorbinian	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	A7631
ATP	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone&	nbsp; A 2383
BSA bez kwasów tłuszczowych	Sigma-Aldrich, USA	A 6003	albumina surowicy bydlęcej
CaCO3	Sigma-Aldrich, USA	C 4830
CCCP	Sigma-Aldrich, USA	C2759	cyjanek karbonylu m-chlorofenylohydrazon UWAGA H301 + H311 + H331 Działa toksycznie po połknięciu, w kontakcie ze skórą lub w następstwie wdychania
Hrabina Automatyczny licznik komórek	Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone	AMQAX100
Cytochrom c	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	C7752
DatLab	Oroboros Instruments, Austria	Wersja 7.4 Oprogramowanie	do akwizycji i analizy danych
DatLab	Oroboros Instruments, Austria	Wersja 8.1 Oprogramowanie	do pozyskiwania i analizy danych
Test białka DC	Bio-Rad, USA	5000112	Zestaw do oznaczania białek; UWAGA H314 Powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu
Digitonina	Sigma-Aldrich, USA	D5628	UWAGA H301 Działa toksycznie po połknięciu
Ditiothreitol	Sigma-Aldrich, USA	D 0632	UWAGA H318 Powoduje poważne uszkodzenie oczu
DMEM	Pan Biotech, Niemcy	P04-05551	Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium
DMSO	Sigma-Aldrich, USA	D2650	dimetylosulfotlenek
DPBS	Lonza Bioscience, Szwajcaria	LONBE17-512F	Bez wapnia Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami
EGTA	Sigma-Aldrich, USA	E 4378
FBS	Thermo Fisher Scientific, USA	A5256701	płodowa surowica bydlęca
Glukoza	Sigma-Aldrich, USA&	nbsp; G7528
Glutaminian	Sigma-Aldrich, USA	G1626
Glicerofosforan	Santa Cruz Biotechnology	sc-215789
Heraeus Multifuge 3s Large	Thermo Fisher Scientific, USA	Wirówka	HM3S
Hettich Rotina 380R	Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Niemcy	1701	wirówka
Imidazol	Honeywell Fluka, Austria	56750	UWAGA H302 Działa szkodliwie po połknięciu, H314 Powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, H360D Może uszkodzić nienarodzone dziecko
jamovi	Projekt jamovi	Wersja 2.3.13	oprogramowanie
K+-MES	Sigma-Aldrich, USA	M 8250
Rurka Leucosep	Greiner Bio-One GmbH, Austria	Z642843-300EA	probówka wirówkowa z barierą polietylenową
Malate	Sigma-Aldrich, USA	M1000	UWAGA H319 Działa drażniąco na oczy.
Mannitol	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	M 4125
MgCl2	Scharlau, Hiszpania	MA 0036
MiR05-Kit	Oroboros Instruments, Austria	60101-01	mitochondrialne podłoże oddechowe
Mikser	Swelab Instruments, Szwecja	Stół bujany	440S
Mr. Frosty Pojemnik do zamrażania	Thermo Fisher Scientific, USA	5100-0001	pojemnik do zamrażania
Oroboros	Oroboros Instruments, Austria		NextGen-O2k i O2k są określane zbiorczo terminem " Oroborosa
Komora Oroboros cV	Oroboros Instruments, Austria	23100-01	klasyczna komora objętościowa
Komora Oroboros sV	Oroboros Instruments, Austria	33100-01	komora o małej objętości
Oroboros TIP2k-Module	Oroboros Instruments, Austria	11100-03	Mikropompa miareczkowo-wtryskowa
O2-Zero Powder	Oroboros Instruments, Austria	26600-02	Na-ditionit UWAGA H251 Samonagrzewanie się: może się zapalić, H302 Działa szkodliwie po połknięciu, H319 Działa drażniąco na oczy
oktanoilokarnityna	Biotrend - APExBIO Technology, Niemcy	B6371
Oligomycyna	Sigma-Aldrich, USA	O4876
Fosfokreatyna	Sigma-Aldrich, USA	P 7936
Pirogronian	Sigma-Aldrich, USA	P2256	UWAGA H317 Może powodować reakcję alergiczną skóry
Rotenon	Sigma-Aldrich, USA	R8875	UWAGA H300 Połknięcie grozi śmiercią
Linie komórkowe fibroblastów skóry	ATCC, Stany Zjednoczone
Azydek sodu	Sigma-Aldrich, USA	S2002	UWAGA H300 + H310 + H330 Śmiertelne w przypadku połknięcia, kontaktu ze skórą lub wdychania
Subtylizyna A	Sigma-Aldrich, USA	P 5380	UWAGA H318 - Powoduje poważne uszkodzenie oczu, H334 - Może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu w następstwie wdychania
Bursztynian	Sigma-Aldrich, USA	S2378
Sacharoza	Sigma-Aldrich, USA	S 7903
Licznik komórek krwi Swelab Alfa	Boule Diagnostics AB, Szwecja	1420041
Tauryna	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	T 0625
Tecan Infinite TM F200	Tecan, Szwajcaria		spektrofotometr
TMPD	Sigma-Aldrich, USA	T3134	Dichlorowodorek N,N,N',N'-tetrametylo-p-fenylenodiaminy UWAGA H315 Działa drażniąco na skórę, H319 Działa drażniąco na oczy
Trypsyna	Sigma-Aldrich, USA	T4799	UWAGA H334 Wdychanie może powodować objawy alergii lub astmy lub trudności w oddychaniu
Vacuette	Greiner Bio-One GmbH, Austria	15452520