Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybkie przewidywanie odpowiedzi na leki in vivo przy użyciu przeszczepów komórek białaczkowych w zarodkach danio pręgowanego

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67451

⸱

23 maja 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Charité-Universitätsmedizin Berlin, Klinik für Pädiatrie m.S. Onkologie/Hämatologie, 2German Cancer Consortium (DKTK), partner site Berlin, and German Cancer Research Center (DKFZ)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące generowania i rozwiązywania problemów z ludzkimi ksenoprzeszczepami ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) z linii komórkowych i świeżego materiału pacjenta w przejściowo immunosupresyjnych zarodkach danio pręgowanego, wraz z wytycznymi dotyczącymi oceny odpowiedzi na lek za pomocą cytometrii przepływowej. Rurociąg eksperymentalny może być również dostosowany do guzów litych.

Streszczenie

Ksenotransplantacja danio pręgowanego jest kluczową techniką do badania patogenezy ludzkiego raka i przewidywania indywidualnych reakcji na leki. Niniejszy dokument przedstawia uproszczony protokół (ZefiX) do rozszerzania próbek pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną (BCP-ALL) z pierwotnymi prekursorami komórek B (BCP-ALL) lub unieśmiertelnionych linii komórkowych w przejściowo immunosupresyjnych zarodkach danio pręgowanego, wykorzystując cytometrię przepływową do analizy odpowiedzi na leczenie pojedynczych komórek o wysokiej rozdzielczości. W porównaniu z wszczepieniami guzów litych, komórki białaczkowe czerpią znaczne korzyści z opartej na oligonukleotydach supresji makrofagów i neutrofili za pomocą antysensownych oligonukleotydów podczas testu. Analiza cytometrii przepływowej zdysocjowanych komórek przeszczepu umożliwia precyzyjną ocenę liczby komórek, szybkości proliferacji i żywotności po leczeniu w przeliczeniu na komórkę. Podejście to zostało zweryfikowane przy użyciu celowanych środków terapeutycznych, takich jak wenetoklaks i dazatynib, a wyniki leczenia porównano z dokumentacją kliniczną powiązanych próbek pacjentów i tradycyjnymi kontrolnymi hodowlami 2D. Warto zauważyć, że protokół jest gotowy w ciągu 7 dni, zgodnie z harmonogramem podejmowania decyzji klinicznych. Metodologię można dostosować do testowania wybranych leków w różnych typach nowotworów, w tym guzach litych, wspierając w ten sposób spersonalizowane strategie terapeutyczne. Należy jednak rozważyć ograniczenie liczby leków, które można ocenić, prawdopodobnie ze względu na ograniczenia farmakokinetyczne w zarodkach danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Enotransplantacja danio pręgowanego stała się kluczowym modelem in vivo dla zrozumienia patogenezy raka i przewidywania reakcji na leki1,2,3,4,5. Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie dla przedklinicznych testów leków, a model danio pręgowanego oferuje znaczące korzyści w porównaniu z innymi systemami in vivo, w tym wysoką przepustowość i opłacalność6,7,8. Model ten może również pomóc w spersonalizowanym przewidywaniu odpowiedzi na leczenie, w tym terapii ukierunkowanych molekularnie i terapii komórkami CAR-T9,10,11,12.

BCP-ALL może szczególnie skorzystać z ksenoprzeszczepu danio pręgowanego, ponieważ rozszerzanie pierwotnych komórek pacjenta w hodowli pozostaje wyzwaniem13. Istnieje niezaprzeczalne zapotrzebowanie na nowatorskie metody leczenia w ALL. Pomimo wysokiego wskaźnika remisji wynoszącego 80%-85% u dzieci z BCP-ALL, wskaźniki długoterminowego przeżycia u pacjentów z nawrotową lub oporną na leczenie chorobą wahają się tylko między około 30%-60%14,15,16. W takich przypadkach testowanie leków z wykorzystaniem proponowanej linii można zintegrować z warunkami klinicznymi w celu określenia optymalnej terapii specyficznej dla pacjenta14,15. To spersonalizowane podejście może mieć kluczowe znaczenie w przypadku wielorakiej oporności na leki, znacznie zmniejszając obciążenie pacjentów związane z leczeniem poprzez unikanie nieskutecznych lub nieoptymalnych leków o poważnych skutkach ubocznych.

Kilka cech sprawia, że ksenografacja embrionów danio pręgowanego jest odpowiednim modelem. Podobieństwa genetyczne między ludźmi a danio pręgowanym - 70% homologii genetycznej i 84% wspólnych genów związanych z chorobą - wspierają badania interakcji gen-lek17. Wykorzystanie transgenicznego zarodka gospodarza może zatem ujawnić predyspozycje genetyczne wpływające na wrażliwość na leki18. Alternatywnie, komórki ze specyficznymi modyfikacjami genetycznymi mogą być przeszczepiane w celu oceny, czy wrażliwość lub oporność na lek są zgodne z wynikami in vitro. Ksenoprzeszczepy zarodków danio pręgowanego dostarczają również informacji na temat potencjalnych skutków ogólnoustrojowych leków. Chociaż rozwój narządów w zarodkach w wieku 2-3 dni nie jest w pełni dojrzały, narządy są prawidłowo zlokalizowane i częściowo dzielą skład komórkowy ze swoimi dorosłymi odpowiednikami19.

Dalsze zalety tego modelu obejmują to, że do wszczepienia potrzebnych jest tylko kilka komórek rakowych, utrzymanie zarodków gospodarza jest proste, ponieważ nie jest wymagane karmienie w ciągu pierwszych 5 dni życia, a sukces wstrzyknięcia można szybko ocenić dzięki przezroczystości i rozmiarowi zarodków. Unikalną cechą jest to, że na tym etapie rozwoju aktywna jest tylko odporność wrodzona, co ułatwia skuteczne wszczepienie20. W opisanym tutaj protokole ZefiX (patrz podsumowanie w Rysunek 1), niedobór odporności jest dodatkowo wzmacniany przez tłumienie wrodzonego układu odpornościowego w ciągu pierwszych 4 dni życia za pomocą stabilnych oligonukleotydów antysensownych Morpholino ukierunkowanych na spi1 i csf3r, które blokują różnicowanie makrofagów i neutrofili21,22,23.

Ten protokół również różni się od poprzednich protokołów ksenotransplantacji danio pręgowanego, które zostały opracowane głównie dla przeszczepów guzów litych i zazwyczaj wykorzystują metody oceny odpowiedzi leków oparte na obrazowaniu całościowym. ZefiX jest zoptymalizowany pod kątem płynnych komórek nowotworowych, takich jak komórki BCP-ALL, i jest z powodzeniem stosowany do namnażania świeżego lub świeżo mrożonego materiału pacjenta21. ZefiX może być również dostosowany do przylegających komórek nowotworowych poprzez dobór odpowiednich enzymów do dysocjacji tkanek.

Kolejną ważną zaletą jest dalsza analiza za pomocą cytometrii przepływowej, która oferuje kilka korzyści: (i) duża liczba przeszczepionych komórek może być szybko przetworzona, co pozwala na solidną analizę statystyczną na poziomie pojedynczej komórki, (ii) szybkość proliferacji i żywotność mogą być oceniane jednocześnie w pojedynczych komórkach, oraz (iii) cytometry przepływowe są powszechnie dostępne w warunkach badań klinicznych, Umożliwia ocenę odpowiedzi przeszczepionych komórek na działanie leku na poziomie pojedynczej komórki w ciągu kilku godzin. Aby zapewnić odtwarzalność, protokół ten zapewnia ustandaryzowany proces od przygotowania, przez przeszczep, aż po analizę cytometrii przepływowej, co pozwala na przewidywanie odpowiedzi na lek we WSZYSTKICH komórkach w ciągu tygodnia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z danio pręgowanym są zgodne z wytycznymi Charité-Universitätsmedizin Berlin Research Institutes for Experimental Medicine oraz oficjalnymi władzami. Wszystkie badania obejmowały zarodki danio pręgowanego < 6 dni po zapłodnieniu (dpf), co zwalnia je z ustawy o ochronie zwierząt. Danio pręgowany (Danio rerio) był hodowany i utrzymywany w obiekcie dla zwierząt Charité-Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Niemcy, zgodnie ze standardowymi protokołami. Umieszczono je w temperaturze 28 °C z 14-godzinnym cyklem światła i 10-godzinnym cyklem ciemności. Do wszystkich doświadczeń wykorzystano ryby typu dzikiego szczepów AB lub TüLF.

UWAGA: Ustalenie optymalnych warunków leczenia dla każdego pożądanego leku przed jego zastosowaniem ZefiX obejmuje kilka niezbędnych kroków. Po pierwsze, należy określić połówkowe maksymalne stężenie hamujące (IC50) każdego leku przy użyciu odpowiedniej linii komórkowej w konwencjonalnym systemie hodowli 2D. Opierając się na wcześniejszych doświadczeniach, skuteczne stężenia leków w leczeniu ZefiX mogą być 5 razy - 50 razy większe niż te stosowane w typowych warunkach hodowli komórkowych21,24. Przed przystąpieniem do leczenia przeszczepionych zarodków konieczne jest dokonanie oceny toksyczności w zarodkach gospodarza, którym nie przeszczepiono przeszczepu, przy użyciu ustalonego zakresu stężeń. Po ocenie toksyczności należy wystawić zarodki wszczepione w linię komórkową na działanie różnych stężeń leków około 50 razy większych niż wartość IC50 wcześniej określona w hodowli 2D. Jeśli przeszczepione komórki nie wykazują odpowiedzi na dawki do 100 razy większe niż IC50, lek może być uznany za nieskuteczny w przypadku ZefiX. Aby potencjalnie zwiększyć skuteczność, jedną z opcji jest wstępne kondycjonowanie przeszczepionych komórek lekiem na krótko przed ich przeszczepieniem do embrionów25. W tabeli 1 przedstawiono wszystkie zastosowane tutaj rozwiązania.

1. Dzień 1: Przygotowanie do eksperymentu

  1. Przygotowanie pożywki E3: Przygotować 2 litry autoklawizowanej pożywki E3 do wykorzystania do utrzymania zarodków.
  2. Preparat antysensownych oligonukleotydów morfolinowych (MO): Przygotować 50 μM roztwór podstawowy zawierający oba MO w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, używając wody wolnej od nukleaz. Roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT). Przygotować MO do wstrzykiwania, inkubując roztwór na bloku grzewczym w temperaturze 65 °C przez 10 min.
    UWAGA: MO są skierowane przeciwko spi1 i csf3r w celu zahamowania różnicowania makrofagów i komórek neutrofilowych, zgodnie z opisem w references22,23,26.
  3. Przygotowanie płytek iniekcyjnych
    1. Aby przygotować 4-5 płytek, rozpuść 1% agarozy w pożywce E3, aby uzyskać 100 ml roztworu. W przypadku płytek do przeszczepu wlej ~20 ml roztworu do każdej 10 cm szalki Petriego, upewniając się, że są wypełnione do połowy. Obracać, aby równomiernie rozprowadzić płyn.
    2. W przypadku płytek iniekcyjnych Morpholino umieść formę wtryskową na płynnej agarozie na dwóch szalkach Petriego, upewniając się, że nie tworzą się pęcherzyki. Przykryj naczynia, przechylając pokrywki i pozostaw je w temperaturze RT, aż agaroza stęży. Po zestaleniu wyjmij formę i przechowuj płytki do góry nogami w temperaturze 4 °C w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie.
  4. Przygotowanie igieł iniekcyjnych
    1. Do wstrzykiwań Morpholino: Wygeneruj igły z naczyń włosowatych o średnicy 10 cm za pomocą ściągacza igieł i odłam końcówki, aby osiągnąć szacunkową średnicę 10 μm (zgodnie z opisem w27).
    2. Do przeszczepu komórek: Używaj dostępnych w handlu wstępnie naciągniętych igieł iniekcyjnych z końcem o średnicy zewnętrznej 20 μm.
  5. Hodowla komórek przeszczepu: Podzielone komórki (np. Nalm6) dążące do docelowej gęstości 70%-80% w 4 dniu w kolbie do hodowli komórek T175 z pożywką RPMI uzupełnioną 10% FCS i 1% P/S (RPMI-complete). Podziel komórki 3-4 razy przed użyciem, aby zapewnić prawidłowe tempo proliferacji.
    UWAGA: Instrukcje dotyczące przygotowania świeżego lub świeżego/mrożonego materiału pacjenta do przeszczepu można znaleźć w kroku 4.3. Komórki są następnie przygotowywane w dniu przeszczepu.
  6. Hodowla danio pręgowanego: Po południu ustaw danio pręgowanego dzikiego w zbiornikach hodowlanych, oddzielając samce i samice.
    UWAGA: Danio pręgowany został wyhodowany i ustawiony zgodnie z opisem w reference28. Odniesienia czasowe (hpf lub dpf) oznaczają godziny lub dni po zapłodnieniu.

2. Dzień 2: Wstrzyknięcie morfolino

  1. Uzupełnij 500 ml autoklawizowanej pożywki E3 1% penicyliną/streptomycyną (E3/P/S) i napełnij dwie 10-centymetrowe szalki Petriego. Wyjąć płytkę wtryskową z lodówki, aby podgrzała się w temperaturze pokojowej.
  2. Stopniowe otwieranie bram zbiorników hodowlanych, tak aby nawożenie mogło odbywać się tylko w ułamku zbiorników na raz (w zależności od prędkości wstrzykiwania), aby zapewnić terminowe mikroiniekcje roztworu Morpholino do zarodków danio pręgowanego na etapie jednokomórkowym28,29. Zacznij od otwarcia jednej lub dwóch bramek w zależności od prędkości wtryskiwacza, gdy jedna partia jaj zostanie łatwo wstrzyknięta, otwórz kolejną bramę lub dwie bramki i tak dalej.
  3. Zapłodnione jaja należy przenieść w partiach po 100 sztuk z jak najmniejszą ilością płynu na wcześniej wykonaną płytkę iniekcyjną. Wyrównaj zarodki w rowkach płytki.
  4. Wstrzyknąć 1 nL mieszanki 50 μM obu Morpholinos do komórki lub woreczka żółtkowego tuż pod komórką podczas etapu jednokomórkowego29. Wstrzyknąć wystarczającą ilość komórek jajowych do kolejnych zabiegów (np. w przypadku jednej płytki 96-dołkowej należy wstrzyknąć do 200 komórek jajowych, aby mieć wystarczającą kopię zapasową na wypadek potencjalnego odpadnięcia przed przeszczepem).
  5. Przenieść wstrzyknięte jaja na szalki Petriego zawierające E3/P/S. Inkubować wstrzyknięte jaja w temperaturze 28 °C. Zachować niewstrzyknięte jaja jako ryby kontrolne do analizy metodą cytometrii przepływowej przy 5 dpf. Przechowuj pozostałą pożywkę E3/P/S w temperaturze 4 °C.

3. Dzień 3: De-chorionacja

  1. De-chorionacja zarodków danio pręgowanego: Ręcznie dekorionuj zarodki, gdy są starsze niż 24 hpf za pomocą dwóch precyzyjnych kleszczyków29.
    1. Za pomocą pipety Pasteura należy usunąć z szalek wszelkie martwe zarodki, które nie wykazują bicia serca ani ruchu i wydają się nieprzezroczyste lub zarodki o nieregularnych kształtach.
    2. Ściśnij kosmówkę precyzyjnymi kleszczami, aby utrzymać ją na miejscu. Ściśnij tuż obok końcówki precyzyjnych kleszczy, przytrzymując zarodek na miejscu za pomocą drugich kleszczy, i ostrożnie rozsuń kosmówkę, aby uwolnić zarodek
      UWAGA: Aby usunąć zarodki młodsze niż 24 hpf, należy je przechowywać na naczyniu pokrytym agarozą, aby zapobiec ich przywieraniu do plastiku. Preferowana jest ręczna dechorionacja, ponieważ jest łagodniejsza dla zarodków. Alternatywna enzymatyczna metoda de-chorionacji jest opisana w innym miejscu30.
  2. Inkubować zarodki pozbawione kosmówki w temperaturze 28 °C przez noc.

4. Dzień 4: Ksenotransplantacja i leczenie farmakologiczne

  1. Przygotowanie zarodków gospodarza: Wyjąć przygotowane płytki z agarozy i E3/P/S z lodówki i pozostawić je do osiągnięcia RT. Przebadać zarodki pod kątem odpowiedniego stadium rozwojowego przy 48 hpf za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Do przepływu pracy należy uwzględnić tylko prawidłowo sklasyfikowane i morfologicznie typowe zarodki, zgodnie z opisem w innym miejscu29. Policz wszystkie zdrowe zarodki i zaplanuj dalsze leczenie. Przechowywać nie więcej niż 100 zarodków na 10 cm szalkę Petriego w temperaturze 28 °C, aby uniknąć nierównomiernego tempa rozwoju spowodowanego niedoborem tlenu.
    UWAGA: Wykonaj krok 4.2. dla linii komórkowych. W przypadku materiału świeżego/mrożonego przejdź bezpośrednio do kroku 4.3.
  2. Przygotowanie linii komórkowych
    1. Aby przygotować znakowane fluorescencyjnie komórki BCP-ALL do cytometrii przepływowej i przeszczepu, przemyj komórki (od kroku 1.5.) 1x PBS: odwiruj przy 350 x g przez 5 minut i ponownie zawieś w 20 ml PBS.
    2. Policz komórki i przenieś 3 x 105 niebarwionych komórek do probówki FACS w celu przeprowadzenia analizy cytometrii przepływowej dnia 0 (0 dni po wstrzyknięciu, dpi). Przechowywać na lodzie.
    3. Płytka 3 x 105 komórek w 3 ml RPMI-complete w jednym dołku płytki 6-dołkowej i utrzymywać w temperaturze 37 °C dla kontroli 3 dpi.
    4. Przenieś 1 x 107 komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w celu etykietowania CTV. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, wylać supernatant (do reszty użyć pipety) i ponownie zawiesić osad w 2,5 ml PBS (RT) z 1 μl roztworu podstawowego CTV.
    5. Inkubować przez 5 minut w ciemności w temperaturze 37 °C, zatrzymać reakcję z 12,5 ml RPMI-complete, a następnie inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze 37 °C.
    6. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przemyć raz 10 ml RPMI-complete. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić w 10 ml RPMI-complete.
    7. Przefiltrować komórki za pomocą filtra 10 μm, wirując przy 350 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad, policzyć komórki i przenieść 3 x 105 komórek znakowanych CTV do probówki FACS. Umieść 3 x 10 ^ 5 komórek z 3 ml RPMI-complete w jednym dołku 6-dołkowej płytki i utrzymuj w temperaturze 37 ° C w celu kontroli proliferacji 3 dpi. Pozostałe komórki należy przechowywać w 1 ml PBS na lodzie do czasu przeszczepienia.
  3. Przygotowanie świeżego/mrożonego materiału pacjenta
    1. Podgrzać dwie probówki wirówkowe o pojemności 15 ml z 10 ml RPMI-complete każda w temperaturze 37 °C. Rozmrozić fiolkę zawierającą 5-10 x10 6 komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Gdy pozostanie tylko niewielka ilość lodu, przenieś komórki do probówki wirówkowej ze wstępnie podgrzanym podłożem. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w drugiej probówce z wstępnie podgrzanym RPMI-complete.
    3. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego. Podwielokrotność 1 x 10^5 komórek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować tę podwielokrotność komórek w probówce FACS o stężeniu 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 300 μl PBS.
    4. Zawiesinę zawiesiny należy przechowywać na lodzie jako niepoddaną działaniu substancji kontrolną do analizy metodą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Jeśli pozwala na to wystarczająca wielkość próbki, należy utrzymać kontrolę w hodowli bez traktowania w celu pomiaru cytometrii przepływowej w dniu 7.
    5. Dodać 1 μl roztworu podstawowego CTV do 2,5 ml PBS (RT) na każde 1 x 106 komórek. Dostosuj objętość roztworu podstawowego CTV, jeśli dostępnych jest mniej komórek.
    6. Inkubować komórki z CTV przez 5 minut w temperaturze 37 °C w ciemności, zatrzymać reakcję przez dodanie 12,5 ml wstępnie ogrzanego (37 °C) kompletnego RPMI-complete i inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze 37 °C.
    7. Odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i raz przemyć komórki 10 ml RPMI-complete. Ponownie odwirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić komórki w 10 ml RPMI-complete.
    8. Przefiltrować zawiesinę komórkową do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą filtra 10 μm i odwirować przy ciśnieniu 350 x g przez 5 minut.
    9. Nie należy wyrzucać supernatantu. Ponownie zawiesić osad i policzyć komórki. Przenieś 3 x 105 komórek znakowanych CTV do jednej probówki FACS.
    10. Odwirować pozostałe komórki o stężeniu 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Pozostałe komórki należy zawiesić w 1 ml PBS i przechowywać na lodzie do czasu wykorzystania w przeszczepie.
      UWAGA: Jeśli pozostanie wystarczająca ilość komórek CTV-dodatnich, można je utrzymać w hodowli 2D równolegle z ksenoprzeszczepami w celu porównania szybkości proliferacji.
  4. Pomiar cytometrią przepływową
    UWAGA: Cytometria przepływowa przy 0 dpi powinna być wykonywana przez drugą osobę, aby zminimalizować czas pozostawania komórek na lodzie przed przeszczepem. Przed pierwszym pomiarem cytometrii przepływowej przy użyciu wyznaczonego panelu barwiącego (CTV, CD19-Alexa488, APC-Annexin V i 7AAD) należy wykonać test kompensacyjny zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Przygotować dwie probówki FACS w następujący sposób: Rura 1: Niebarwione komórki kontrolne; Rurka 2: Komórki barwione CTV, CD19, 7AAD i Annexin.
      UWAGA: Barwienie i etykiety: CellTrace Violet (CTV) identyfikuje znakowane komórki przeszczepu w porównaniu z komórkami ryb gospodarza i ocenia szybkość proliferacji po 3 dniach. Przeciwciało CD19, marker powierzchni komórki, służy jako dodatkowy marker do identyfikacji ludzkich komórek przeszczepu BCP-ALL. W przypadku innych typów nowotworów mogą być wymagane alternatywne przeciwciała markerowe. Aneksyna V oznacza apoptozę we wczesnym stadium oceny żywotności komórek. 7AAD oznacza późne stadium apoptozy lub martwicy w ocenie żywotności komórek.
      2. Probówki wirówkowe
    2. (jedna zawierająca komórki barwione CTV, a druga niebarwione) o masie 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant z probówki 1. Zawiesić osad w 310 μl buforu wiążącego aneksynę (ABB).
    3. Probówka 2: Wykonaj barwienie przeciwciał i żywotności zgodnie z opisem poniżej.
      UWAGA: Ten protokół barwienia jest zoptymalizowany pod kątem barwienia komórek B CD19. W przypadku innych ludzkich przeciwciał stosowanych do znakowania różnych typów komórek protokół może wymagać dostosowania.
      1. Dodać 98 μl ABB do probówki 2 (zawierającej komórki znakowane CTV). Dodać 2 μl przeciwciała CD19-Alexa488 (rozcieńczenie 1:50) do 98 μl dodanego ABB. Dobrze wymieszaj.
      2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez 30 minut i dodać 500 μl ABB w celu zatrzymania reakcji. Odwirować probówkę o sile 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć sklarowany osad i powtórzyć etap mycia.
      3. Zawiesić osad komórkowy w 100 μl ABB i przejść do barwienia 7AAD i APC-Annexin V. Wykonaj pomiar barwienia 7AAD i APC Annexin V oraz cytometrii przepływowej, jak opisano poniżej.
      4. Dodać 5 μl 7AAD i 5 μl APC-Aneksyny V do ponownie zawieszonych komórek. Delikatnie zmieszaj. Inkubować probówkę przez 15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej temperatury. Dodać 200 μl ABB, aby osiągnąć końcową objętość 310 μl.
      5. Przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej w dniu przeszczepu w następującej kolejności, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego: Niebarwione komórki kontrolne (probówka 1), komórki znakowane CTV barwione Alexa488-CD19, APC-Aneksyna V i 7AAD (probówka 2). Zarejestruj co najmniej 10 000 zdarzeń na próbkę, aby uzyskać wystarczającą analizę.

5. Transplantacja

  1. Płytka do przesadzania: Przygotować dwie 10-centymetrowe szalki Petriego wypełnione E3/P/S i umieścić w inkubatorze w temperaturze 28 °C na co najmniej 30 minut do podgrzania.
  2. Przygotowanie komórek: Odwirować komórki przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i usunąć pozostały płyn za pomocą mikropipety. Dodać PBS, aby uzyskać końcową objętość 20 μl. Skoncentrowaną zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie.
    UWAGA: Komórki nie powinny pozostawać na lodzie dłużej niż 2 godziny podczas zabiegu przeszczepu.
  3. Przygotowanie igły transplantacyjnej i zarodka gospodarza
    1. Przenieść 25-30 zarodków na jedną z podgrzanych szalek Petriego zawierających E3/P/S za pomocą szklanej pipety Pasteura, która ma służyć jako kontrola. Załaduj 4 μl zawiesiny komórek do igły transplantacyjnej za pomocą końcówki do mikroładowania.
      UWAGA: Załadunek powinien przebiegać bezproblemowo w ciągu 1-2 minut. Jeśli tak nie jest, ostrożnie dodaj więcej PBS do zawiesiny komórek.
    2. Skalibruj ciśnienie wtrysku i długość impulsu, regulując mikrowtryskiwacz. Regulować, aż jedno wstrzyknięcie wyrzuci około 1000 komórek ALL lub 2 nL zawiesiny komórek (dla 1 x 107 komórek w 20 μl). Aby oszacować liczbę 1000 komórek, należy wyrzucić objętość zawiesiny na powierzchnię agarozy pokrytą pożywką. Policz 100 komórek na małym obszarze, ekstrapoluj ich rozmieszczenie na całą populację komórek i oszacuj całkowitą liczbę.
    3. Przygotować 50 ml E3 zawierającego trikainę (końcowe stężenie: 80 mg/l). Przenieść zarodki gospodarza do roztworu tricainy i inkubować przez co najmniej 2 minuty, aby zapewnić prawidłowe znieczulenie. Zarodek jest prawidłowo znieczulony, gdy nie obserwuje się żadnej reakcji motorycznej
      UWAGA: Końcówka mikroładowarki lub kleszcze mogą być używane do ostrożnego zbliżania się i/lub dotykania zarodka.
    4. Przenieś 15-20 zarodków z odciętą kosmówką do naczynia do wstrzykiwań pokrytego agarozą (patrz wcześniejsza instrukcja przygotowania), używając jak najmniejszej ilości płynu, aby zapobiec ślizganiu się zarodków.
    5. Ułóż zarodki tak, jak pokazano na rysunku Rysunek 2A. Wstrzyknąć około 1,000 CTV-dodatnich komórek BCP-ALL do jamy osierdzia. Wprowadzić igłę pod kątem 45° od kierunku grzbietowo-ogonowego, jak pokazano w Rysunek 2B, aby wstrzyknąć komórki.
      UWAGA: Używaj dostępnych w handlu wstępnie naciągniętych, tępo zakończonych igieł o średnicy otworu 20 μm, specjalnie zaprojektowanych dla małych komórek białaczkowych (patrz lista materiałów). Jeśli igła zostanie zablokowana, należy ją przyciąć w razie potrzeby, ale później należy ponownie skalibrować objętość wstrzyknięcia i liczbę komórek.
    6. Po wstrzyknięciu wszystkich 15-20 zarodków przenieść je na podgrzaną szalkę Petriego wypełnioną E3/P/S i utrzymywać w temperaturze 28 °C.
    7. Powtarzaj te kroki, aż około 100 - 150 zarodków zostanie przeszczepionych do jednego testu leczenia farmakologicznego, który powinien obejmować trzy stężenia leku i jedną kontrolę.
    8. Inkubować zarówno przeszczepione zarodki, jak i nieprzeszczepione grupy kontrolne w temperaturze 28 °C przez 1-3 godziny przed rozpoczęciem leczenia farmakologicznego.
  4. Leczenie farmakologiczne in vivo (płytka 96-dołkowa)
    1. Za pomocą stereomikroskopii fluorescencyjnej przebadaj zarodki, aby potwierdzić pomyślne wszczepienie (Ryc. 2C). Upewnij się, że żółtko jest nienaruszone, ponieważ środowisko żółtka może być toksyczne dla komórek przeszczepu21. Wyrzuć zarodki z komórkami w żółtku.
    2. Przygotuj 2,5 ml 2x stężonego roztworu dla każdego stanu leku, który ma być badany w E3/P/S z 0,5% DMSO. Dodatkowo należy przygotować 5 ml roztworu kontrolnego nośnika zawierającego 0,5% DMSO w E3/P/S.
    3. Dodaj 100 μl E3/P/S + 0,5% DMSO do każdego dołka na 96-dołkowej płytce. Ten krok zapobiega niezamierzonemu przenoszeniu minimalnych ilości leku między studzienkami.
    4. Ostrożnie przenieś jeden przeszczepiony zarodek do każdej studzienki. Użyj szklanej pipety Pasteura, aby pobrać każdy zarodek z jak najmniejszej ilości pożywki E3.
    5. Pozwól zarodkowi opaść na dno końcówki pipety, delikatnie przechylając pipetę i uwolnij ją do studzienki za pomocą sił kapilarnych. Unikaj dotykania pożywki w studzience podczas przenoszenia.
    6. Dodać roztwory leku do płytki: Napełnij 24 dołki (2 rzędy) płytki 96-dołkowej 100 μl roztworu kontrolnego nośnika lub jednego z trzech 2x stężonych roztworów leku.
      UWAGA: Skuteczne stężenia leku muszą być określone we wcześniejszych eksperymentach specyficznych dla każdego testowanego leku.
    7. Utrzymuj zarodki w temperaturze 35 °C przez 72 godziny, w tym zarodki nieprzeszczepione, które posłużą jako kontrola do analizy cytometrii przepływowej w dniu 7.

6. Dzień 7

  1. Dysocjacja zarodka/przeszczepu
    1. Przeprowadź badanie przesiewowe 96-dołkowej płytki za pomocą stereomikroskopii, aby zidentyfikować i wybrać zdrowe zarodki danio pręgowanego. Losowo zbierz 10 zdrowych zarodków gospodarza z każdego stanu w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (najlepiej uzyskać 2 probówki na stan).
    2. Usuń jak najwięcej płynu z każdej probówki zawierającej zarodki i poświęć zarodki za pomocą szoku hipotermicznego, inkubując probówki na lodzie przez 1 godzinę.
    3. Do każdej probówki dodaj 500 μl zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) bez wapnia i magnezu. Mechanicznie rozdzielić zarodki i przeszczepione komórki poprzez rozcieranie za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 200 μl, pipetując w górę i w dół około 15 razy.
    4. Osadzać fragmenty tkanek przez odwirowanie przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie przygotuj probówki FACS z nasadką sitową o drobnych oczkach 35 μm, zawierającą 2 ml PBS na warunek (łącznie 4 probówki).
    5. Zawiesić każdą osadkę w 500 μl mieszanki enzymów (0,01% papainy, 0,1% dyspazy II, 0,01% dezoksyrybonukleazy I i 12,4 mMMgSO4 w HBSS bez wapnia i magnezu) w celu dysocjacji enzymatycznej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
    6. Podczas inkubacji należy kilkakrotnie pipetować mieszaninę w górę i w dół co 5 minut, używając tej samej końcówki pipety do każdej pojedynczej probówki, aby uniknąć utraty tkanki.
  2. Pomiar metodą cytometrii przepływowej
    1. Przenieść zdysocjowane komórki do nasadki sitka filtra o drobnych oczkach 35 μm w probówkach FACS i odwirować przy 350 x g przez 5 minut.
    2. Podczas wirowania przygotuj mieszankę wzorcową do barwienia powierzchni komórek B CD19. Połącz 98 μl ABB z 2 μl przeciwciała anty-ludzkiego CD19 Alexa Fluor 488 dla każdego stanu.
    3. Odrzucić supernatant ze zdysocjowanej osadu komórkowego i ponownie zawiesić osad w 100 μl głównej mieszanki barwiącej CD19.
    4. Wykonaj protokół barwienia CD19, 7AAD i APC Annexin V dla wszystkich próbek ZefiX, w tym 3 x 105 komórek CTV-dodatnich z równoległej hodowli komórkowej, jeśli są dostępne.
    5. Przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej zgodnie z kolejnością i zapisać liczbę zdarzeń opisanych w tabeli 2. Uruchom wszystkie próbki zawierające komórki gospodarza i przeszczepu tak szczegółowo, jak to możliwe, aby ocenić całkowitą liczbę przeszczepionych komórek.
  3. Analiza wyników za pomocą komercyjnego oprogramowania.
    1. Strategia bramkowania dla próbki hodowli komórkowej: Otwórz oprogramowanie i załaduj pliki FCS do obszaru roboczego. Utwórz wykres punktowy z CD19 i CTV, aby upewnić się, że sygnał nakłada się na siebie i potwierdzić obecność komórek rakowych. Następnie utwórz wykres punktowy z FSC-A (oś x) i SSC-A (oś y), aby odróżnić nienaruszone komórki (Q2) od szczątków (Q4; Rysunek 3A').
    2. Użyj populacji nienaruszonych komórek, aby utworzyć nowy wykres z SSC-H (oś x) i SSC-A (oś y) w celu zidentyfikowania pojedynczych komórek (Rysunek 3A'').
    3. Utwórz kolejny wykres punktowy z załącznikiem V (oś x) i 7AAD (oś y) przy użyciu populacji pojedynczych komórek (Rysunek 3A'''). Rozróżnij komórki na cztery populacje: Komórki żywotne: aneksyna V ujemna, 7AAD ujemna (Q4); Wczesne komórki apoptotyczne: aneksyna V dodatnia, 7AAD ujemna (Q3); Późne komórki apoptotyczne/martwicze: aneksyna V dodatnia, 7AAD dodatnia (Q2); Komórki martwicze: aneksyna V ujemna, 7AAD dodatnia (Q1).
    4. Powtórz te kroki dla próbek o rozdzielczości 3 dpi (Rysunek 3B).
    5. Strategia bramkowania dla komórek zarodka przeszczepu i gospodarza
      1. Oddziel ludzkie komórki przeszczepu od komórek gospodarza za pomocą wykresu kropkowego z CTV (oś x) i CD19 (oś y). Zidentyfikuj i wyizoluj podwójnie dodatnie komórki przeszczepu CTV/CD19 (Rysunek 3C).
      2. Zastosuj tę samą strategię bramkowania opisaną dla komórek hodowlanych o 3 dpi (Rysunek 3B' - B''') do populacji komórek przeszczepu. Skopiuj strategię bramkowania, aby zachować spójność.
      3. Połącz wszystkie populacje komórek V- i 7AAD ujemnych aneksyny w histogram z wartościami CTV na osi x (Rysunek 3D). Oblicz średnią geometryczną dla wszystkich pięciu próbek, aby określić tempo proliferacji.
  4. Obliczenia do oceny odpowiedzi na leczenie
    1. Aby określić liczbę podziałów komórkowych po 3 dniach, użyj wzoru:
      n = log2 (I0/I)
      gdzie, I0 = początkowa intensywność fluorescencji CTV (średnia geometryczna, 0 dpi), I = intensywność fluorescencji CTV po 72 godzinach, n = liczba podziałów komórkowych.
      Przykład: Świeżo zamrożone komórki pacjenta podzielone 2,6x w logarytmie ZefiX2(88317/14644) = 2,6
      i 2,8x w logarytmie hodowli 2D2(88317/12992) = 2,8
    2. Aby określić całkowitą liczbę przeszczepionych komórek na rybę po 3 dniach, podziel całkowitą liczbę komórek rakowych (w tym komórek apoptotycznych, ale z wyłączeniem szczątków) przez liczbę ryb zebranych w próbce (zwykle n = 10).
    3. Aby określić żywotność komórek przeszczepu CTV-dodatnich po 3 dniach, użyj wzoru:
      V = (C/100) x A
      gdzie: V = żywotność, C = frakcja nienaruszonych pojedynczych komórek bez zanieczyszczeń (w procentach), A = frakcja komórek anekcyny V i 7AAD ujemnych (w procentach).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Szczegółową ocenę naukową protokołu ZefiX, obejmującą ksenoprzeszczepy oraz leczenie preparatami farmakologicznymi świeżo zamrożonych, pierwotnych próbek komórek BCP-ALL, można znaleźć w wcześniej opublikowanej pracy21. Zgoda na wykorzystanie próbek pacjentów w badaniach do przedklinicznych testów leków została udzielona przez lokalne komisje etyki badań medycznych w ramach badań uzupełniających do badania ALL-REZ BFM 2002 (NCT00114348) oraz rejestru i biobanku ALL-REZ BFM (EA2/055/12), a także pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zarodki danio pręgowanego stają się coraz bardziej popularnym modelem ksenoprzeszczepu do badań przesiewowych leków i badań nad rakiem ze względu na ich wysoką przepustowość i opłacalność. Te ksenoprzeszczepy są obiecujące jako kluczowy filar medycyny translacyjnej, wspomagający badania przedkliniczne i podejmowanie decyzji 9,21. Jednak modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego do ekspansji i leczenia komórek białaczki u ludzi pozostają niedostatecznie reprezent...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) w ramach Collaborative Research Center CRC1588, numer projektu 493872418 oraz Dr. Kleist Stiftung, Berlin, a także przez Deutsche José Carreras Leukämie Stiftung (R03/2016), Berliner Krebsgesellschaft (HEFF201633KK) i Niemieckie Konsorcjum Walki z Rakiem (DKTK, Joint Funding Call 2016). Dziękujemy Julii Köppke i Mareike Wolff za krytyczną lekturę rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
szalka Petriego  (10 cm)GreinerP7237
7-AAD roztwór do barwienia żywotności Invitrogen00-6993-50
Agaroza (LE, gatunek analityczny)Biozym 
Wtryskiwacz ciśnienia powietrzaNarishigeIM400  z zewnętrznym zasilaniem
gazem Alexa Fluor  488 przeciwciało anty-ludzkie CD19 Biolegend302219
Annexin bufor wiążącyBiolegend422201Lub zobacz roztwory do przygotowania
APC annexin V Biolegend640941
Kapilary (10 cm, OD 1,0 mm, z włóknami)WPIINCTW100F-41,0 OD; 0,75 ID
Kolba do hodowli komórkowych (T-175)Sarstedt83,39,12,002
CellTrace Fioletowy InvitrogenC34557
Sulfoxide dimetylu (DMSO)RothA994.1
Dyspaza II Sigma AldrichD4693-1g
DNase IAppliChem GmbHA3778
Probówki Eppendorf (1,5 ml)Probówka Eppendorf30120086
FACS (polistyrenowa okrągła rurka dolna z nasadką sitkową, 5 ml)Probówki Falcon352235
Falcon (50 ml)Falcon352070
Surowica cielęca płodu (FCS)Sigma AldrichC8056
Filtr o drobnych oczkach ( 10 &mikro; m)PluriStrainer435001050
Filtr o drobnych oczkach ( 20 &mikro; m)PluriStrainer431002040
cytometr przepływowy Becton DickinsonBD LSRFortessa X-20
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowyLeica
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy z kamerąKamera LeicaM165 FC: DFC7000
T Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS, bez wapnia i magnezu)Sigma Aldrich88284
Forma wtryskowa (Danio pręgowany MI/Zestaw do przeszczepów)World Precision Instruments Z-MOLDS
VZIPbl-20-10-55Pipeta iniekcyjna danio pręgowanego,, OD: 20μ m ± 1, TL: ~ 10mm, PL: 55mm, Szkło: BM100T-10P
MakrowirówkaEppendorf
Mikrowirówka
Morpholino (csf3r)Gene Tools LLCcsf3r (GAAGCACAAGCGA
GACGGATGCCA)
Morpholino (spi1)Gene Tools LLCspi1(GATATACTGATAC
TCCATTGGTGGT)
PapainaSigma AldrichP3125
Penicylina-Streptomycyna (Penstrep; 10.000  U/ml)Płytki Gibco15140122
(4-dołkowe)Greiner Bio one 657160
Płytki (96-dołkowe)Greiner Bio one 657180
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumGibco21875-034
Tricaine  (MS-222)Sigma AldrichE10521-50GMetanosulfenian aminobenzoesanu ety-3
840004 Igły iniekcyjne (bez filamentu)Instrumenty biomedyczne

Bibliografia

  1. Fontana, C. M., Van Doan, H. Zebrafish xenograft as a tool for the study of colorectal cancer: a review. Cell Death Dis. 15, 1-12 (2024).
  2. Sturtzel, C., et al. Refined high-content imaging-based phenotypic drug screening in zebrafish xenografts. NPJ Precis Oncol. 7 (1), 1-16 (2023).
  3. Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24, 2288(2023).
  4. Gamble, J. T., Elson, D. J., Greenwood, J. A., Tanguay, R. L., Kolluri, S. K. The zebrafish xenograft models for investigating cancer and cancer therapeutics. Biology. 10 (4), 252(2021).
  5. Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. Zebrafish avatars towards personalized medicine-A comparative review between avatar models. Cells. 9 (2), 293(2020).
  6. Wang, W., et al. Progress in building clinically relevant patient-derived tumor xenograft models for cancer research. Animal Model Exp Med. 6 (5), 381-398 (2023).
  7. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trend Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  8. Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nat Rev Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
  9. Costa, B., et al. Zebrafish avatar-test forecasts clinical response to chemotherapy in patients with colorectal cancer. Nat Comm. 15 (1), 4771(2024).
  10. Grissenberger, S., et al. Chapter 8 - Preclinical testing of CAR T cells in zebrafish xenografts. Method Cell Biol. 167, 133-147 (2022).
  11. Yan, C., et al. Single-cell imaging of T cell immunotherapy responses in vivo. J Exp Med. 218 (10), 20210314(2021).
  12. Pascoal, S., et al. A preclinical embryonic zebrafish xenograft model to investigate CAR T cells in vivo. Cancers. 12 (3), 567(2020).
  13. Pal, D., et al. Long-term in vitro maintenance of clonal abundance and leukaemia-initiating potential in acute lymphoblastic leukaemia. Leukemia. 30 (8), 1691-1700 (2016).
  14. Beneduce, G., et al. Blinatumomab in children and adolescents with relapsed/refractory B cell precursor acute lymphoblastic leukemia: A real-life multicenter retrospective study in seven AIEOP (Associazione Italiana di Ematologia e Oncologia Pediatrica) Centers. Cancers. 14 (2), 426(2022).
  15. Xie, J., et al. Short-course blinatumomab for refractory/relapse precursor B acute lymphoblastic leukemia in children. Front Pediatr. 11, 1187607(2023).
  16. Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era. Front Pediatr. 10, 923419(2022).
  17. Howe, K. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  18. Lee, H. C., Lin, C. Y., Tsai, H. J. Zebrafish, an in vivo platform to screen drugs and proteins for biomedical use. Pharmaceuticals. 14 (6), 500(2021).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  20. Miao, K. Z., Kim, G. Y., Meara, G. K., Qin, X., Feng, H. Tipping the scales with zebrafish to understand adaptive tumor immunity. Front Cell Dev Biol. 9, 660969(2021).
  21. Gauert, A., et al. Fast, in vivo model for drug-response prediction in patients with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Cancers. 12 (7), 1883(2020).
  22. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  23. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Current Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
  24. Wijk, R. C. V., et al. Mechanistic and quantitative understanding of pharmacokinetics in Zebrafish larvae through nanoscale blood sampling and metabolite modeling of paracetamol. J Pharmacol Exp Ther. 371 (1), 15-24 (2019).
  25. Lázaro-Navarro, J., et al. Inhibiting casein kinase 2 sensitizes acute lymphoblastic leukemia cells to venetoclax via MCL1 degradation. Blood Advances. 5 (24), 5501(2021).
  26. Rhodes, J., et al. Interplay of pu.1 and gata1 determines myelo-erythroid progenitor cell fate in zebrafish. Developmental Cell. 8 (1), 97-108 (2005).
  27. Zakaria, Z. Z., Eisa-Beygi, S., Benslimane, F. M., Ramchandran, R., Yalcin, H. C. Design and microinjection of Morpholino antisense oligonucleotides and mRNA into zebrafish embryos to elucidate specific gene function in heart dvelopment. J Vis Exp. (186), e63324(2022).
  28. ZFIN: Zebrafish Book: Contents. , https://zfin.org/zf_info/zfbook/cont.html (2025).
  29. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  30. Hasegawa, E. H., Gist H Farr, I. I. I., Maves, L. Comparison of pronase versus manual dechorionation of zebrafish embryos for small molecule treatments. J Dev Biol. 11 (2), 16(2023).
  31. Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: the hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Adv. 2 (21), 3063-3069 (2018).
  32. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukocyte Biol. 98 (4), 523-537 (2015).
  33. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
  34. Nguyen-Chi, M., et al. TNF signaling and macrophages govern fin regeneration in zebrafish larvae. Cell Death Dis. 8 (8), e2979-e2979 (2017).
  35. Rosowski, E. E. Determining macrophage versus neutrophil contributions to innate immunity using larval zebrafish. Dis Models Mech. 13 (1), dmm041889(2020).
  36. Rebelo de Almeida, C., et al. Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy. Comm Biol. 3 (1), 1-13 (2020).
  37. Pringle, E. S., et al. The zebrafish xenograft platform-A novel tool for modeling KSHV-associated diseases. Viruses. 12 (1), 12(2020).
  38. Pype, C., et al. Incubation at 32.5 °C and above causes malformations in the zebrafish embryo. Reprod Toxicol. 56, 56-63 (2015).
  39. Xu, X., et al. Adeno-associated virus (AAV)-based gene therapy for glioblastoma. Cancer Cell Int. 21 (1), 76(2021).
  40. Siebert, J., et al. Rhabdomyosarcoma xenotransplants in zebrafish embryos. Pediat Blood Cancer. 70 (1), e30053(2023).
  41. van Bree, N., et al. Development of an orthotopic medulloblastoma zebrafish model for rapid drug testing. Neuro-Oncol. noae210, (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ksenotransplantacja u danio pr gowanegocytometria przep ywowakom rki BCP ALLanaliza pojedynczych kom rekwstrzykiwanie morfolinoproliferacja kom rekkom rki pochodz ce od pacjent wterapia personalizowana
Szybkie przewidywanie odpowiedzi na leki in vivo przy użyciu przeszczepów komórek białaczkowych w zarodkach danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.