Proponowana konfiguracja umożliwia kontrolowaną wentylację mechaniczną i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego ruchu klatki piersiowej 3D u myszy i szczurów. Wykorzystaliśmy tę konfigurację do zbadania patofizjologii leżącej u podstaw dysfunkcji mięśni oddechowych wywołanej wentylacją mechaniczną.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie 3D Cine Magnetic Resonance ruchu oddechowego u myszy i szczurów wentylowanych mechanicznie
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Patofizjologia dysfunkcji przepony u pacjentów wentylowanych mechanicznie nie została jeszcze w pełni poznana i potrzebne są odpowiednie modele zwierzęce, aby umożliwić dalsze badania. Ustawienia wentylacji mechanicznej, takie jak poziom dodatniego ciśnienia końcowo-wydechowego (PEEP), odgrywają kluczową rolę. Celem było opracowanie metody obrazowania 3D ruchu klatki piersiowej podczas wentylacji mechanicznej myszy i szczurów przy różnych ustawieniach ciśnienia oddechowego. Szczury (Wistar) i myszy (C57BL/6) znieczulono mieszanką ketaminy, atropiny i deksmedetomidyny. Znieczulenie utrzymywano poprzez ciągłą infuzję przez cewnik otrzewnowy. Następnie wykonano tracheostomię w celu umożliwienia wentylacji mechanicznej zwierząt. Zwierzęta umieszczono w systemie MR 7T, podczas gdy były wentylowane respiratorem kompatybilnym z MR. Obrazowanie 3D klatki piersiowej przeprowadzono przy użyciu gradientowej sekwencji echa 3D z pseudospiralnym wypełnieniem k-space. Sygnał nawigatora, generowany przez gradient przewijarki wyboru wycinka, był rejestrowany co TR. Retrospektywne kategoryzowanie i rekonstrukcja danych w 12 przedziałach czasowych oddechowych cine została przeprowadzona przy użyciu opracowanego przez nas oprogramowania. Udało nam się zobrazować ruch klatki piersiowej w 3D u obu gatunków podczas wentylacji mechanicznej, umożliwiając badanie zmian w geometrii klatki piersiowej w całym cyklu oddechowym przy różnych poziomach PEEP. Stwierdziliśmy, że retrospektywne binowanie ram oddechowych było znacznie ułatwione dzięki stałemu częstemu oddychaniu. Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do badania geometrii i ruchu serca i klatki piersiowej u myszy i szczurów wentylowanych mechanicznie.
Wprowadzenie
Wentylacja mechaniczna jest podstawą leczenia ostrej niewydolności oddechowej na oddziale intensywnej terapii. Niestety, może to również spowodować obrażenia. Uszkodzenie płuc wywołane respiratorem, uszkodzenie mózgu związane z respiratorem i dysfunkcja przepony wywołana respiratorem są przykładami jatrogennych powikłań związanych z ostrą wentylacją mechaniczną 1,2,3. Patofizjologia leżąca u podstaw tych mechanizmów urazów pozostaje słabo poznana. Prace eksperymentalne na zwierzętach pozwoliły zidentyfikować ważne mechanizmy leżące u podstaw powikłań wentylacji mechanicznej, co pozwoliło na przełożenie ich na praktykę kliniczną poprzez zastosowanie nowych strategii wentylacji4. Niedawnym przykładem są badania nad wpływem dyssynchronizacji respiratorów na funkcję przepony w modelach ARDSświń 5. Takie badania na mechanicznie wentylowanych modelach zwierzęcych są niezbędne do wyjaśnienia mechanizmów urazów, nawet przy obecnej tendencji do odchodzenia od testów na zwierzętach. Badania nad skutkami wentylacji mechanicznej wymagają nienaruszonego układu krążeniowo-oddechowego i zdolności do symulacji patofizjologii powszechnie obserwowanej na OIT4. Duże modele zwierzęce są często używane, ponieważ naśladują ludzką fizjologię bardziej niż gryzonie i mogą być wentylowane za pomocą maszyn używanych na OIOM-ie4. Głównymi wadami są duże koszty związane z wykorzystaniem dużych zwierząt oraz brak genetycznie modyfikowanych modeli dużych zwierząt do badania molekularnych mechanizmów choroby 6,7. W związku z tym eksperymenty na gryzoniach wentylowanych mechanicznie są nieuniknione, o ile nie są dostępne alternatywne rozwiązania, takie jak zaawansowane hodowle tkankowe lub modele narządów na chipie.
Różne interwencje, które poprawiły wyniki u zwierząt, nie przełożyły się na ludzi 4,6, co podkreśla znaczenie zrozumienia, w jaki sposób powszechnie stosowane zwierzęce modele wentylacji mechanicznej różnią się od ludzkich. Wpływ ustawień respiratora na układ oddechowy zależy od wielu czynników, które mogą być specyficzne dla gatunku, takich jak elastyczność tkanek, napięcie mięśniowe i zmienność odpowiedzi na powszechnie stosowane środki znieczulające 8,9,10,11. Różnice te mogą prowadzić do kontrastujących skutków dla ruchu i geometrii klatki piersiowej i płuc, co może wyjaśniać rozbieżności między ludźmi a zwierzętami. Badanie wpływu ustawień wentylacji na geometrię i ruch układu krążeniowo-oddechowego może wyjaśnić różnice między gatunkami i może pomóc w przełożeniu pojęć patofizjologicznych pochodzących z badań na zwierzętach na warunki kliniczne. Postęp techniczny w zakresie rezonansu magnetycznego układu sercowo-naczyniowego z rozdzielczością ruchu umożliwił obrazowanie bijącego serca w modelach gryzoni, dostarczając wglądu w kształt, funkcję i patofizjologię w modelach chorób sercowo-naczyniowych gryzoni12,13. Metody te nie są w wystarczającym stopniu wykorzystywane do obrazowania klatki piersiowej i ruchu podczas cyklu oddechowego u zwierząt wentylowanych mechanicznie.
W tym miejscu przedstawiamy metodę badania geometrii i ruchów klatki piersiowej u gryzoni wentylowanych mechanicznie za pomocą rezonansu magnetycznego 3D. Pozwala to na badanie ostrego wpływu wielu ustawień respiratora lub innych interwencji na geometrię klatki piersiowej i ruch u gryzoni wentylowanych mechanicznie. Zastosowaliśmy nowatorską pseudospiralną, bramkowaną oddechowo akwizycję 3D cine MRI dla wentylowanych małych zwierząt13,14. W tym początkowym badaniu zbadaliśmy wpływ dodatniego ciśnienia wydechowego (PEEP), ale ta metoda może być również wykorzystana do zbadania wpływu innych interwencji lub ustawień oddechowych, takich jak stosunek I: E, objętość oddechowa i częstość oddechów. Metoda ta otworzy szereg możliwości w zakresie obrazowania przedklinicznego modeli gryzoni wymagających wentylacji mechanicznej w dziedzinie badań nad intensywną terapią i nie tylko.
Protokół
Wszystkie opisane procedury zostały wykonane zgodnie z dyrektywą Unii Europejskiej WE 86/609. Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Radę Etyki Zwierząt UMC w Amsterdamie, lokalizację VUmc i AMC. Myszy C57BL/N i szczury Wistar uzyskano z laboratoriów Charles River. Do wszystkich eksperymentów wykorzystano samce i samice myszy w wieku 3-6 miesięcy o wadze 25-32 g oraz samce i samice szczurów w wieku 3-6 miesięcy o wadze 200-400 g. Żywność i wodę dostarczano ad libitum. Wszystkie zwierzęta były zaaklimatyzowane przez co najmniej 1 tydzień przed rozpoczęciem eksperymentów.
1. Przygotowanie konfiguracji
- Przygotuj leki znieczulające zgodnie z dawkami wymienionymi w kroku 2.
- Skalibruj wentylator mechaniczny, przewijając menu respiratora i klikając Setup > More Ventilator > Calib&Tests. Wykonaj wszystkie cztery wymienione tam testy i kalibracje: Test szczelności, Rurka przedmuchująca, Pomiar martwej przestrzeni i Rurka przedmuchująca.
- Umieść respirator mechaniczny kompatybilny z MR w pomieszczeniu MR i przeciągnij kable podłączone do respiratora kompatybilnego z MR przez otwór urządzenia MR. Można użyć płuca testowego (na przykład małego balonu), aby sprawdzić wentylację pochodzącą z respiratora kompatybilnego z MR.
- Podłącz wentylator mechaniczny kompatybilny z MR do sprężarki i źródła przepływu tlenu.
- Przygotuj kolumnę PEEP, napełniając kolumnę miarową o pojemności 10 ml wodą i oznaczając głębokość wody w centymetrach. Umieść rurkę wydechową respiratora kompatybilnego z MR w kolumnie PEEP. Ponadview konfiguracji jest pokazany na rysunku 1.
- Przyklej luźno poduszkę oddechową do kołyski MR w miejscu, w którym będzie znajdowała się klatka piersiowa zwierzęcia.
2. Znieczulenie i rozpoczęcie wentylacji mechanicznej
- Rozpocznij uspokojenie zwierzęcia (myszy lub szczura) od umieszczenia go w komorze gazowej wypełnionej 4% izofluranem w 100%O2.
- Zważ zwierzę, aby określić dawkę znieczulenia. Wstrzyknąć w miejsce operowane (okolicę krtani) bupiwakainą w dawce 3 mg/kg mc. i nałożyć maść do oczu w obu oczach.
- Umieść zwierzę na poduszce grzewczej, spontanicznie wdychając 2%-4% izofluranu w 100% tlenu przez stożek nosowy. Zapewnij monitorowanie tętna, saturacji tlenem i temperatury, umieszczając pulsoksymetr na jednej z łap zwierzęcia i wkładając sondę termometru doodbytniczego.
- Zbadać pod kątem braku odruchów przed nacięciem. Podnieś skórę pokrywającą krtań i tchawicę za pomocą kleszczy chirurgicznych i wykonaj nacięcie za pomocą zgiętych nożyczek.
- Tępo wypreparuj gruczoły ślinowe i leżące pod nimi mięśnie, aż tchawica będzie widoczna.
- Za pomocą zgiętych, ostrych kleszczy rozetnij grzbietową stronę tchawicy i umieść kleszcze pod tchawicą, aby naciągnąć niewchłanialny pleciony jedwabny szew (rozmiar 6/0) wokół tchawicy.
- Chwyć tchawicę na pierścieniu chrząstki i otwórz tchawicę bezpośrednio pod pierścieniem za pomocą nożyczek sprężynowych.
- Kankaniutuj tchawicę za pomocą 20G (mysz) lub 14G (szczur) Abbocath, przyciętego na około 1-1,5 cm długości. Zawiąż szew wokół kaniulowanej tchawicy, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie.
- Rozpocznij wentylację zwierzęcia od objętości oddechowej 7 ml / kg, częstotliwości 150 uderzeń na minutę dla myszy i 80 uderzeń na minutę dla szczurów, 2 cmH2O PEEP z 3% izofluranem w 100% tlenu.
- Wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie dawki indukcyjnej znieczulenia iniekcyjnego (myszy: ketamina 126 mg/kg, deksmedetomidyna 0,1 mg/kg, atropina 0,5 mg/kg; szczur: ketamina 90 mg/kg, deksmedetomidyna 0,25 mg/kg, atropina 0,05 mg/kg) i po 5 minutach stopniowo zmniejszać przepływ izofluranu (3% do 0% w ciągu 10 min), aby umożliwić płynne przejście od znieczulenia gazowego do iniekcyjnego.
- Umieścić 24G Abbocath dootrzewnowo i podłączyć do perfuzora z następującymi dawkami myszy: ketamina 36 mg/kg/h, deksmedetomidyna 0,02 mg/kg/h, atropina 0,075 mg/kg/h; szczur: ketamina 30 mg/kg/h, deksmedetomidyna 0,015 mg/kg/h, atropina 0,075 mg/kg/h. Rozpocząć infuzję.
UWAGA: Wykonaliśmy tracheostomię, aby przewietrzyć zwierzęta zamiast intubacji ustnej, ponieważ umożliwiło nam to założenie szwu wokół tchawicy. Było to konieczne, aby zapobiec wyciekom powietrza, co ma kluczowe znaczenie dla utrzymania wystarczającego PEEP.
3. Rezonans magnetyczny w wentylacji mechanicznej
- Umieść zwierzę w dedykowanej kołysce do rezonansu magnetycznego w pozycji leżącej na plecach i umieść nad nią odpowiednią cewkę rezonansu magnetycznego dla myszy lub szczurów, obserwując rurkę tracheotomijną.
- Zatrzymać i odłączyć respirator mechaniczny używany w ppkt. 1.2 oraz pompę anestezjologiczną i przetransportować zwierzę do pomieszczenia rezonansu magnetycznego. Ponownie podłącz zwierzę do respiratora kompatybilnego z rezonansem magnetycznym i rozpocznij wentylację z objętością oddechową 10 ml/kg i częstotliwością 150 uderzeń na minutę dla myszy i 80 uderzeń na minutę dla szczurów. Objętość oddechowa jest większa niż w przypadku respiratora użytego w 1,2 do rekrutacji tkanki płucnej, która mogła się zapaść podczas transportu.
- Podłącz ponownie pompę anestezjologiczną z wyżej wymienionymi szybkościami, aby utrzymać głębokość znieczulenia. W zależności od systemu MR należy umieścić przewody anestezjologiczne wewnątrz lub na zewnątrz otworu MR.
- Umieść czujnik saturacji i czujnika pracy serca na tylnej kończynie zwierzęcia i włóż sondę termometru doodbytniczego. Podłącz system monitorowania oddechu do poduszki oddechowej. Sprawdź wszystkie sygnały i upewnij się, że tętno, nasycenie tlenem i temperatura mieszczą się w zakresie fizjologicznym.
UWAGA: Monitorowanie oddechu powinno wskazywać częstotliwość oddechową ustawioną w respiratorze kompatybilnym z MR i służy wyłącznie do wykrywania wysiłku oddechowego zwierzęcia. W przypadku wysiłku oddechowego zwierzęcia krzywa oddechowa wykazuje dodatkowe szczyty. Wymaga to podania dodatkowej dawki znieczulenia (1/3 początkowej dawki indukcyjnej). - Umieść zwierzę w skanerze MR z cewką wyśrodkowaną nad klatką piersiową i podłącz kable o częstotliwości radiowej do cewki. Istnieje oddzielna cewka i kołyska, aby dostosować się do różnicy wielkości między myszami a szczurami (cewka i kołyska szczura mają większą średnicę w porównaniu z cewką myszy). Zanurzyć rurkę wydechową na 6 cm w słupie wody, podając 6 cmH2O PEEP.
- Miareczkować objętość oddechową do 7-9 ml/kg w zależności od nasycenia tlenem (wybierz najniższą objętość oddechową, która jest możliwa przy nasyceniu 100%).
4. Akwizycja skanów
UWAGA: Tabela 1 zawiera przegląd ustawień skanowania.
- Użyj metod określonych przez dostawcę, aby przeprowadzić kalibrację RF i podkładkowanie.
- Uzyskaj SCOUT z pięcioma obrazami w orientacji czołowej i osiowej i upewnij się, że cała klatka piersiowa znajduje się w polu widzenia (FOV). SCOUT to szybki skan używany do planowania innych płaszczyzn obrazowania i zwykle obejmuje większe pole widzenia niż inne obrazy. W razie potrzeby dostosuj pozycję zwierzęcia w kołysce i przerób SCOUT.
- Zaplanuj skany 2D (patrz Tabela 1 i Rysunek 2) na obrazach SCOUT. Upewnij się, że płaszczyzna czołowa i strzałkowa pokrywają całą klatkę piersiową.
UWAGA: Płaszczyzna strzałkowa jest umieszczona w górnej części prawej półprzepony, aby ograniczyć część serca wewnątrz pola widzenia. Uzyskując SCOUT przy 6 cmH2O PEEP, upewniamy się, że membrana jest obrazowana w najbardziej ogonowej pozycji. - Wykonaj skany 2D przy 6 cmH2O PEEP i natychmiast zrekonstruuj obrazy, aby sprawdzić pozycję zwierzęcia i zapewnić jakość obrazu (wykonaj krok 6). W razie potrzeby dostosuj położenie pola widzenia lub zwierzęcia i ponownie wykonaj skanowanie.
- Zaplanuj skan 3D (ryc. 2), umieszczając FOV wokół całej klatki piersiowej i zakrywając skany 2D. Upewnij się, że około 20% pola widzenia w kierunku plastra znajduje się na zewnątrz zwierzęcia, aby zapobiec składaniu artefaktów.
UWAGA: Skany 2D są dodawane do protokołu, ponieważ czas akwizycji jest krótszy niż w przypadku skanów 3D, dzięki czemu nadają się do szybkiego testowania efektu interwencji. - Uzyskanie skanu 3D z wymaganym schematem próbkowania pseudospirali k-space (rysunek 3), co pozwala na solidne retrospektywne kategoryzowanie danych i wizualizację ruchu oddechowego14.
- Powtórz skany 2D i 3D przy 3 i 0 cmH2O PEEP. Całkowity czas skanowania wynosił 2,5 minuty na skan 2D i 15 minut na skan 3D.
UWAGA: W tym przypadku dostosowaliśmy PEEP podczas eksperymentów. Wybraliśmy 0, 3 i 6 cmH2O PEEP, ponieważ wiemy z eksperymentów (poprzednich badań i trwających badań) na zwierzętach długotrwale wentylowanych, że te poziomy PEEP powodują istotne zmiany w geometrii przepony i klatki piersiowej15. Dodatkowo zdecydowaliśmy się na użycie zerowego, średniego i wysokiego poziomu PEEP w tej pracy, aby pokazać efekt PEEP. W zależności od pytania badawczego możliwe są inne interwencje. Na przykład można badać wpływ środków zwiotczających mięśnie lub innych leków na geometrię klatki piersiowej. Protokół pozwala nam na badanie wewnątrzobiektowych skutków interwencji.
Rysunek 1: Przegląd konfiguracji. (A) Schematyczny przegląd konfiguracji, (B) układ cewki dla myszy, (C) układ cewki dla szczura, z większym otworem niż cewka myszy, (D) układ cewki w odniesieniu do skanera MR, (E) kolumna PEEP z rurką wydechową umieszczoną na 3 cmH2O PEEP i (F) zbliżenie zaworu regulującego wentylację, wskazujące, które rurki należy umieścić w kolumnie PEEP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Planowanie obrazów MR dla formatów 2D i 3D. Rysunek przedstawiający, w jaki sposób ustawiono pole widzenia dla skanów 2D w orientacji strzałkowej i czołowej (górny i środkowy rząd) oraz skanów 3D w orientacji strzałkowej (dolny rząd). Lewa kolumna reprezentuje jeden z wycinków SCOUT w orientacji osiowej na poziomie serca, środkowa kolumna pokazuje wycinek SCOUT w orientacji koronalnej, a prawa kolumna pokazuje wycinek w orientacji osiowej na poziomie wątroby. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Schemat próbkowania pseudospirali MR. Wzorzec próbkowania jest w kierunku kodowania fazowego ky/kz z rozmiarem matrycy 80 x 80 zoptymalizowanym pod kątem retrospektywnego grupowania ruchów oddechowych. Spirale są tworzone przez rozpoczęcie od środka k-przestrzeni, a następnie obracanie się na zewnątrz i ponownie, powtarzając w ten sposób każdą spiralę. Cały schemat próbkowania jest wykonywany z 25 powtórzeniami w celu wygenerowania wystarczających danych w każdym układzie oddechowym. Każda spirala ma inny kolor. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
5. Koniec eksperymentu
- Po zakończeniu wszystkich skanów wyjmij zwierzę ze skanera. Zwierzęta nie mogą przeżyć eksperymentu z powodu tracheostomii. Eutanazja myszy ze zwichnięciem szyjki macicy i szczury przez wykrwawienie.
- Zapisz wszystkie surowe i zrekonstruowane pliki MR.
| Typ skanowania | SCOUT echa gradientowego | Echo gradientu 2D | Echo gradientu 3D |
| Orientacja | Koronalny i strzałkowy | Koronalny i strzałkowy | Strzałkowej |
| Schemat próbkowania k-Space | Kartezjański | Kartezjański | Pseudo-spirala |
| Liczba plasterków | 10 | 1 | 80 |
| Grubość plastra (mm) | 1 (Mysz) | 1 (Mysz) | 0.38 (Mysz) |
| 1 (Szczur) | 1 (Szczur) | 0.81 (Szczur) | |
| Odstęp między warstwami (mm) | 2 (Mysz) | 0 (Mysz) | 0 (Mysz) |
| 5 (Szczur) | 0 (Szczur) | 0 (Szczur) | |
| Pobieranie próbek z wycinków* | 0.8 | 0.8 | 0.8 |
| FOV (odczyt x faza x wycinek; mm) | 35 x 35 (mysz) | 30 x 23 (mysz) | 30 x 23 x 30 (mysz) |
| 80 x 80 (Szczur) | 65 x 49 (Szczur) | 65 x 49 x 65 (Szczur) | |
| Rozmiar matrycy (częstotliwość x faza) | Rozdzielczość 256 x 192 | Rozdzielczość 256 x 192 | Wymiary: 211 x 80 x 80 |
| TR / TE (ms) | 45328 | 45330 | 45328 |
| Kąt odwrócenia (°) | 15 | 15 | 10 |
| Liczba powtórzeń | 80 | 70 | 25 |
| Wyzwalanie oddechowe | Nie | Tak, z perspektywy czasu | Tak, z perspektywy czasu |
| Czas obrazowania (min:s) | 2:02 | 2:23 | 16:00 |
| Poziomy PEEP (cmH2O) | 6 | 6, 3, 0 | 6, 3, 0 |
Tabela 1: Parametry akwizycji dla wszystkich skanów. * Próbkowanie warstwy wskazuje, jaki procent impulsu wyboru warstwy jest używany do obrazowania
6. Rekonstrukcja obrazu
- Aby wykonać rekonstrukcję obrazu, użyj opracowanego przez nas oprogramowania dostępnego na GitHub16. Wykonaj te kroki dla wszystkich skanów za pomocą nawigatora wymagającego retrospektywnego bramkowania oddechowego.
UWAGA: Zostało to wcześniej opisane przez Daal i wsp., ale praca ta koncentrowała się na obrazowaniu serca13. W tym miejscu opisujemy metodę rekonstrukcji obrazów bramkowanych oddechowych całej klatki piersiowej. - Załaduj plik z danymi pierwotnymi, klikając przycisk Załaduj MRD. To wizualizuje surowy sygnał nawigatora i jego widmo w lewym górnym panelu. Jeśli sygnał oddechowy nie jest wyraźnie widoczny, dostosuj główny nawigator w zakładce Ustawienia.
- W polu Filtry serca/oddechu wpisz częstość oddechów ustawioną w respiratorze mechanicznym zgodnym z rezonansem magnetycznym i ustaw szerokość na 15. Ustawienia w pozostałych polach nie mają znaczenia dla tego typu rekonstrukcji. Naciśnij przycisk Filtruj , aby zastosować ustawienia, co spowoduje wyświetlenie sygnału nawigatora z bramką, jak pokazano na rysunku 4. Upewnij się, że czerwony sygnał w polu Nawigator oddechu i Częstość oddechów podążają za niebieskim, surowym sygnałem nawigatora.
- W trybie Cine wybierz film oddechowy i ustaw liczbę klatek na 12, a liczbę dynamiki na 1. W zakładce Geometria włącz PCA (poziom 8) i Filtr dzwonka. Naciśnij Sortuj k-spację , aby zastosować ustawienia.
- W parametrach CS reco zastosuj następujące ustawienia: WVxyz 0.0010, TVxyz 0.0000, LLRxyz 0.0050, TVcine 0.015, TVdyn 0.000. Naciśnij Reco Movies , aby rozpocząć rekonstrukcję.
- Sprawdź rekonstrukcję w prawym dolnym panelu, przewijając ramki i (jeśli dotyczy) plasterki. Wyeksportuj zrekonstruowane obrazy, naciskając przycisk Eksportuj DCM i/lub Eksportuj GIF.
7. Analiza obrazu
UWAGA: W zależności od pytania badawczego, na podstawie obrazów filmowych można obliczyć kilka parametrów wyniku. Tutaj skupiamy się na parametrach, które określają ilościowo geometrię klatki piersiowej, objętość płuc i wychylenie.
- Otwórz odpowiednią przeglądarkę DICOM, na przykład oprogramowanie wymienione w Tabeli materiałów i załaduj film 2D, klikając Plik > Otwórz i wybierając pliki cine 2D. Zidentyfikuj ramkę o najwyższym położeniu membrany (ramka końcowo-wydechowa). Zaznacz ramkę i otwórz ją w przeglądarce DICOM.
- Zmierz przednio-tylne i czaszkowo-ogonowe wymiary płuc (ryc. 5) w strzałkowym obrazie 2D i wymiar lewo-prawy w koronalnym filmie 2D ręcznie za pomocą przycisku pomiaru w microdicom. Powtórz te pomiary dla wszystkich poziomów PEEP lub innych interwencji. Pomiary te mogą być również wykonywane w jednej klatce filmu 3D, w zależności od wyboru skanów.
- Załaduj obraz 3D do programu do analizy obrazu 3D i umieść obraz we właściwej orientacji, klikając Narzędzia > Zmień orientację obrazu. Wpisz SPL jako kod RAI. Zaznacz klatkę końca wydechu, przewijając dynamikę w Narzędziach > Inspektorze warstw , a następnie zwiększ liczbę komponentów.
- Zainicjuj segmentację, ręcznie konturując środkową część płuc w dwóch warstwach dla każdej orientacji (ryc. 6). Użyj trybu pędzla i w razie potrzeby dostosuj rozmiar pędzla.
- Rozpocznij segmentację 3D, naciskając Aktywny kontur na głównym pasku narzędzi. Upewnij się, że czerwone pole (ROI) zakrywa całą klatkę piersiową. Włącz opcję Inicjuj z bieżącą segmentacją i naciśnij przycisk Segmentuj 3D.
- Wybierz opcję Thresholding (Określanie progów ) jako tryb wstępnej segmentacji i użyj tylko górnego progu, wybierając tryb progu po prawej stronie. Naciśnij Dalej. Następnie pomiń krok dodawania bąbelków, ponownie naciskając Dalej. Ponieważ segmentacja została już zainicjowana w kroku 7.5, nie ma potrzeby dodawania żadnych bąbelków.
- Rozpocznij aktywne konturowanie, naciskając przycisk Play i zatrzymaj je, gdy tylko segmentacja dotrze do krawędzi płuca. Przewiń obrazy, aby sprawdzić segmentację. Naciśnij przycisk Zakończ , aby sfinalizować segmentację.
- Naciśnij przycisk Aktualizuj , aby wyświetlić segmentację 3D w lewym dolnym panelu, a następnie sprawdź ją i obróć.
- Zapisz segmentację jako NiFTI, klikając Segmentacja > Zapisz obraz segmentacji i plik siatki STL, klikając opcję Segmentacja > Eksportuj siatkę segmentacji.
- Zapisz objętość płuc, którą można znaleźć na stronie Segmentacja, objętość i statystyka.
- Zarejestruj obrazy innych stanów oddechowych do dynamiki końca wydechu za pomocą skryptu dostarczonego w dodatkowym pliku kodowania 1. Zastosuj obliczone przekształcenia do segmentacji, co spowoduje segmentację dla każdej dynamiki. Te segmentacje służą do obliczania parametrów wyniku, takich jak przesunięcia we wszystkich kierunkach.
Wyniki
Korzystając z protokołu opisanego w tym badaniu, z powodzeniem przeskanowaliśmy grupę 8 zdrowych myszy C57BL / 6 WT i 8 szczurów Wistar WT za pomocą skanera MRI 7 Tesli. Byliśmy w stanie mechanicznie wentylować zwierzęta na różnych poziomach PEEP i monitorować podstawowe parametry fizjologiczne podczas skanowania (ryc. 7).
Na rycinie 5 pokazano przykład trzech skanów 2D w klatce wydechowej myszy i szczura w orientacji strzałkowej. Jak widać, PEEP wprowadza ogonowe przemieszczenie przepony u obu zwierząt, ale u myszy towarzyszy temu również poszerzenie klatki piersiowej, na co wskazuje wzrost średnicy przednio-tylnej.
Te wysokiej jakości skany pokazują, że za pomocą tej techniki możemy zmierzyć rozmiar różnych części klatki piersiowej i pokazać wpływ różnych ustawień wentylacji na ruch klatki piersiowej i przepony. Krótki czas skanowania pozwala na porównanie parametrów wynikowych w obrębie obiektów, które są interesujące, zmniejszając wymaganą liczbę zwierząt. Tabela 2 przedstawia parametry wyników dla wszystkich zwierząt.
Rycina 8 przedstawia segmentacje płuc dynamiki schyłkowo-wydechowej na trzech poziomach PEEP z odpowiadającą im objętością płuc. Zgodnie z oczekiwaniami, zwiększenie PEEP spowodowało zwiększenie objętości płuc. Filmy 3D są również wyświetlane jako film w filmach uzupełniających 1 i 2.
Rysunek 4: Zrzut ekranu oprogramowania używanego do rekonstrukcji obrazów z retrospektywnym bramkowaniem danych. Bramkowanie danych opiera się na sygnale nawigatora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rycina 5: Reprezentatywne wyniki obrazów 2D u szczura i myszy na trzech poziomach PEEP, z wymiarami płuc przednio-tylnych i czaszkowo-ogonowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rysunek 6: Zrzut ekranu przedstawiający oprogramowanie używane do segmentacji płuc w pierścieniach 3D. W lewym górnym panelu pokazany jest widok osiowy filmu 3D z płucami podzielonymi na czerwone segmenty. W prawym górnym panelu pokazany jest widok strzałkowy z płucem podzielonym na czerwone segmenty. W lewym dolnym panelu pokazany jest render 3D podzielonego na segmenty płuca. W lewym i prawym panelu pokazany jest widok koronalny z płucem podzielonym na czerwono. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rycina 7: Parametry życiowe zwierząt podczas eksperymentów. N = 8 myszy (niebieski), N = 8 szczurów (pomarańczowy). Dane są wyświetlane jako średnia z SD. Zwróć uwagę na spadek częstości akcji serca, gdy zwierzęta wchodzą w chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Rycina 8: Segmentacja 3D płuc na trzech poziomach PEEP wraz z odpowiadającymi im objętościami płuc. Segmentacja płuca szczura w PEEP 0 (lewa kolumna), PEEP 3 (środkowa kolumna) i PEEP 6 (prawa kolumna). W górnym rzędzie pokazana jest tylna strona płuc. W środkowym rzędzie pokazana jest przednia strona płuc. Objętości pokazane w dolnym rzędzie są mierzone w płucach renderowanych w 3D, które są widoczne na tym rysunku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Film uzupełniający 1: Film 3D z myszką. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.
Film uzupełniający 2: Film 3D szczura. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.
Dodatkowy plik kodowania 1: Skrypt do rejestracji segmentacji do innych przejęć. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Badanie to pokazuje, że obrazowanie MR 3D z bramkowaniem retrospektywnym pozwala na pomiar ruchu klatki piersiowej w dwóch modelach zwierzęcych podczas wentylacji mechanicznej. Techniki te mogą zostać wykorzystane w przyszłych badaniach obejmujących obrazowanie serca i klatki piersiowej u myszy i szczurów wentylowanych mechanicznie. Stwierdziliśmy, że ze względu na stałą częstotliwość oddychania, retrospektywne kategoryzowanie było bardzo solidne.
Kluczowym etapem protokołu jest ustawienie prawidłowego ułożenia zwierząt w cewkach MR. Podczas skanowania nie ma możliwości zmiany położenia zwierząt. Ponadto utrzymanie normotermii jest bardzo ważne, aby zapewnić, że pomiary są wykonywane w warunkach fizjologicznych, ponieważ środki znieczulające mogą powodować hipotermię poprzez rozszerzenie naczyń obwodowych, a impulsy o częstotliwości radiowej w tym protokole MRI mogą powodować hipertermię17,18. Na rycinie 7 można zaobserwować wahania temperatury ciała w krótkim okresie wokół przeniesienia zwierząt do skanera (około 1 godziny), w którym nie jest stosowane ciepło z zewnętrznego źródła. Kolejnym krytycznym krokiem jest miareczkowanie znieczulenia, szczególnie u myszy. Płaszczyzna znieczulenia, w której myszy nie wykazują wysiłku oddechowego, ale utrzymują stabilne parametry życiowe, jest wąska i wymaga uważnego monitorowania sygnału oddechowego i dostosowania szybkości infuzji znieczulenia. U szczurów nie spotkaliśmy się z takimi problemami w zakresie zastosowanej sedacji. Jakość obrazu będzie miała negatywny wpływ, jeśli zwierzę będzie miało wpływ na wysiłek oddechowy z powodu retrospektywnej rekonstrukcji obrazów na podstawie ustawionej częstotliwości oddechowej. Możliwe jest zastosowanie innego schematu znieczulenia, takiego jak znieczulenie wziewne izofluranem lub alternatywne środki znieczulające do iniekcji, które powodują większe zahamowanie wysiłku oddechowego. Respirator CWE-MRI-1 dla małych zwierząt zastosowany w tym protokole jest kompatybilny ze środkami znieczulającymi wziewnymi19.
Istnieją trzy kluczowe etapy odtwarzania metody MRI zaproponowanej w tym badaniu. Po pierwsze, należy użyć tej samej podstawowej sekwencji MRI (tj. 3D FLASH). Taka sekwencja jest dostępna w zasadzie we wszystkich systemach MRI. Po drugie, trajektoria k-przestrzeni wspomniana w tej pracy (pseudo-spirala) może wymagać poprawki oprogramowania, która może wykonywać zdefiniowane przez użytkownika trajektorie k-przestrzeni. Zachęcamy czytelników do skontaktowania się z autorem korespondencyjnym, jeśli chcą powtórzyć przejęcie. Istnieje doświadczenie w wdrażaniu tego typu akwizycji na systemach od innych dostawców. Wreszcie, proces rekonstrukcji, który udostępniamy jako oprogramowanie typu open source, jest niezależny od dostawcy, a zatem ma zastosowanie do wszystkich systemów przedklinicznych.
Wybraliśmy wyzwalanie retrospektywne i kategoryzowanie zamiast wyzwalania prospektywnego z kilku powodów. Przede wszystkim wyzwalanie retrospektywne i binowanie danych w przestrzeni k oferują pełną elastyczność w liczbie zrekonstruowanych ramek CINE układu oddechowego, co pozwala nam zoptymalizować rozdzielczość czasową, rozdzielczość przestrzenną i stosunek sygnału do szumu. Dodatkowo, wyzwalanie prospektywne wprowadza martwy czas na końcu każdego cyklu oddechowego, gdy skaner czeka na następny wyzwalacz, co może zakłócić stan ustalony i spowodować niepełny cykl. W przypadku wentylacji mechanicznej ten martwy czas jest minimalny, ale nadal obecny.
Głównym ograniczeniem tego protokołu jest brak możliwości pomiaru ciśnienia w drogach oddechowych lub przełyku. O ile nam wiadomo, na rynku nie ma kompatybilnych z MR czujników ciśnienia w płucach lub przełyku dla małych zwierząt. Kolejnym ograniczeniem jest brak ciągłych pomiarów ciśnienia krwi w ramach rezonansu magnetycznego. Protokół znieczulenia został oparty na wcześniejszych badaniach instytucjonalnych. Atropina została dodana ze względu na częste występowanie bradykardii i niedociśnienia obserwowane wcześniej. Chociaż ciągłe monitorowanie ciśnienia krwi nie było możliwe ze względu na ograniczenia środowiska MR, nadciśnienie jest mało prawdopodobne, ponieważ nie zaobserwowano tachykardii (ryc. 7). Monitorowanie zastosowane w tym protokole składało się z częstości akcji serca, saturacji tlenem, temperatury i sygnału oddechowego opartego na ruchu ściany klatki piersiowej. Korzystając z tych pomiarów, przegląd parametrów życiowych zwierząt może pomóc w podaniu znieczulenia, ale odczyt ciśnienia krwi może zapobiec przedawkowaniu zwierząt wykazujących wysiłek oddechowy. Nie opublikowano żadnych innych badań MRI dotyczących fizjologii układu oddechowego gryzoni wentylowanych mechanicznie, ale metoda ta może być stosowana do szerokiego zakresu pytań badawczych poza badaniami układu oddechowego. Wspomniany w manuskrypcie program rekonstrukcyjny (Retrospektywa) może być również wykorzystywany do rekonstrukcji obrazów w całym cyklu pracy serca, umożliwiając w ten sposób badaczowi uzyskanie obrazów serca i naczyń w wysokiej rozdzielczości bez artefaktów ruchowych. Protokół ten może być zastosowany w każdym projekcie, który wymaga wentylacji mechanicznej szczurów lub myszy podczas skanowania. Można na przykład rozważyć zbadanie związku między ustawieniami wentylacji mechanicznej a czynnością serca. Inne opcje obejmują obrazowanie zwierząt z otwartą klatką piersiową lub po operacjach wymagających wentylacji mechanicznej.
Oświadczenia
Ruslan Garipov jest pracownikiem MR Solutions Ltd., Guildford, Wielka Brytania.
Podziękowania
Prace te były wspierane przez ZonMW Grant 09120011910004 (GS, CO, LH) oraz grant NIH 5R01HL121500 (CO).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sprzęt | |||
| 11 Plus Cyfrowa podwójna pompa strzykawkowa | Aparatura Harvarda (USA) | 229193-2 | Podwójna pompa strzykawkowa z programowalnymi funkcjami dla laboratoriów |
| Jedno- i wielokanałowy kondycjoner sygnału AccuSens | Opsens solutions inc. (Kanada) | ACS-P4-N-62SC | Używany ze światłowodowym czujnikiem temperatury do monitorowania temperatury ciała |
| Światłowodowy czujnik temperatury | Opsens solutions inc. (Kanada) | OTP-M | |
| Kołyska na mysz | &ostry; ekwipunek Vé t&eaostry; rinaire Minerve (Francja) | ||
| Mousestat Jr. | Kent-scientific (Stany Zjednoczone) | MSTAT-JR | MouseSTAT Jr. zapewnia dokładna pulsoksymetria zarówno u myszy, jak i szczurów. |
| Skaner MR | MR Solutions Lt. (Wielka Brytania) | MRS-7024 powiedział: | |
| Monitorowanie kompatybilne z MR i System bramkowania dla małych zwierząt | SA Instruments, Inc. (Stany Zjednoczone) | 1030 | Moduł RT (moduł interfejsu oddechowego), moduł sterujący/bramkujący ERT, zestaw akumulatorów |
| Respirator kompatybilny z MRI-1 | CWE (Stany Zjednoczone) | 12-07000 | Wentylator mechaniczny odpowiedni do wentylacji małych zwierząt w środowiskach rezonansu magnetycznego. Wentyluje się na zasadzie przepływu i czasu z regulacją objętości za pomocą zaworów pneumatycznych. |
| Wielostanowiskowa jednostka sterująca temperaturą i High Flow PCA | &ostry; ekwipunek Vé t&eaostry; rinaire Minerve (Francja) | ||
| Kolumna PEEP | Kolumna pomiarowa płynu o zmienionym przeznaczeniu | ||
| Respirator mechaniczny Physiosuite | Kent-scientific (Stany Zjednoczone) | Wentylator mechaniczny odpowiedni do wentylacji małych zwierząt. Wentylacja odbywa się na zasadzie regulowanej objętości i ciśnienia. | |
| Pulsoksymetryczne czujniki łapowe, kompatybilne z MRI | Kent-scientific (Stany Zjednoczone) | SPO2-MSE-MRI | Czujnik łapy kompatybilny z MRI dla Mousestat Jr. |
| Kołyska dla szczurów | &ostry; ekwipunek Vé t&eaostry; rinaire Minerve (Francja) | ||
| Cewka RF, Mysz | MR Solutions Lt. (Wielka Brytania) | Cewka RF o objętości myszy 38 mm do badań ciała myszy | |
| Cewka RF, Szczur | MR Solutions Lt. (Wielka Brytania) | 65mm cewka RF objętości szczura do badań ciała szczura | |
| Narzędzia chirurgiczne | |||
| Abbocath 14G, 20G, 22G, 24G | Abbocath powiedział: | 14G, 20G, 22G do stosowania jako rurka dotchawicza, 24G do dootrzewnowej infuzji znieczulenia | |
| Ethilon 3-0 Szew FD-1 z igłą | Ethicon (Stany Zjednoczone) | 663 godz. | |
| Kleszcze #55 | Dumont (Szwajcaria) | 55 | |
| Nożyczki Metzenbaum | Narzędzia precyzyjne (Niemcy) | 14017-14 | |
| Uchwyt na igłę | Narzędzia precyzyjne (Niemcy) | 12005-15 | |
| Jedwabny szew pleciony niewchłanialny 6/0 | Narzędzia precyzyjne (Niemcy) | 18020-60 | |
| Nożyczki sprężynowe | Narzędzia precyzyjne (Niemcy) | 15033-09 | |
| Nożyczki do tenotomii Stevensa | Narzędzia precyzyjne (Niemcy) | 14064-11 | |
| Kleszcze do wiązania szwów | Narzędzia precyzyjne (Niemcy) | 18025-10 | |
| Taśma medipore | 3M (Stany Zjednoczone) | ||
| Lek | |||
| Atropina 0,25 mg/ml | |||
| Deksmedetomidyna 0,5 mg/ml Dexdormitor | Orion pharma (Finlandia) | ||
| Duratears maść do oczu | Alcon Nederland BV (Holandia) | ||
| Izofluran | AST pharma (Francja) | ||
| Ketamina 100 mg/ml Ketexx | Alfasan (Holandia) | ||
| Wazelina wazelina naftowa | Unilever (Holandia) | ||
| Software | |||
| Elastix | Instytut Nauk o Obrazie, UMC Utrecht (Holandia) | ||
| Swędzenie | Uniwersytet Pensylwanii (Stany Zjednoczone) | ||
| Matlab 2019a | Wolfram Research Inc (Stany Zjednoczone) | ||
| Mikrodicom | Microdicom (Bułgaria) | ||
| Retropektywny | Amsterdam UMC (Holandia) |
Bibliografia
- Bassi, T., Taran, S., Girard, T. D., Robba, C., Goligher, E. C. Ventilator-associated brain injury: A new priority for research in mechanical ventilation. Am J Respir Crit Care Med. 209 (10), 1186-1188 (2024).
- Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-induced lung injury. N Engl J Med. 369 (22), 2126-2136 (2013).
- Levine, S., et al. Rapid disuse atrophy of diaphragm fibers in mechanically ventilated humans. N Engl J Med. 358 (13), 1327-1335 (2008).
- Silva, P. L., Scharffenberg, M., Rocco, P. R. M. Understanding the mechanisms of ventilator-induced lung injury using animal models. Intensive Care Med Exp. 11 (1), 82(2023).
- Damiani, L. F., et al. Impact of reverse triggering dyssynchrony during lung-protective ventilation on diaphragm function: An experimental model. Am J Respir Crit Care Med. 205 (6), 663-673 (2022).
- Guillon, A., et al. Preclinical septic shock research: why we need an animal ICU. Ann Intensive Care. 9 (1), 66(2019).
- Larsson, L. Experimental animal models of muscle wasting in intensive care unit patients. Crit Care Med. 35 (9), S484-S487 (2007).
- Schwarte, L. A., Zuurbier, C. J., Ince, C. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Leith, D. E. Comparative mammalian respiratory mechanics. Am Rev Respir Dis. 128 (2 Pt 2), S77-S82 (1983).
- Vinegar, A., Sinnett, E. E., Leith, D. E. Dynamic mechanisms determine functional residual capacity in mice, Mus musculus. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 46 (5), 867-871 (1979).
- Oh, S. S., Narver, H. L. Mouse and rat anesthesia and analgesia. Curr Protoc. 4 (2), e995(2024).
- Li, H., et al. Technical aspects of small animal CMR imaging. Front Phys. 8, ARTN 183(2020).
- Daal, M. R. R., et al. Quantification of mouse heart left ventricular function, myocardial strain, and hemodynamic forces by cardiovascular magnetic resonance imaging. J Vis Exp. (171), e62595(2021).
- Gottwald, L. M., et al. Pseudo-spiral sampling and compressed sensing reconstruction provides flexibility of temporal resolution in accelerated aortic 4D flow MRI: A comparison with k-t principal component analysis. NMR Biomed. 33 (4), e4255(2020).
- Sudy, R., et al. Different contributions from lungs and chest wall to respiratory mechanics in mice, rats, and rabbits. J Appl Physiol (1985). 127 (1), 198-204 (2019).
- Strijkers, G. J. Retrospective-v9.7: Self-gated cine MRI reconstruction. , Available from: https://github.com/Moby1971/Retrospective-v9.8 (2023).
- Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (5), 577-583 (2013).
- Tang, M., Yamamoto, T. Progress in Understanding Radiofrequency Heating and Burn Injuries for Safer MR Imaging. Magn Reson Med Sci. 22 (1), 7-25 (2023).
- Munting, L. P., et al. Influence of different isoflurane anesthesia protocols on murine cerebral hemodynamics measured with pseudo-continuous arterial spin labeling. NMR Biomed. 32 (8), e4105(2019).
Przedruki i uprawnienia
