Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju

2.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67491

⸱

17 stycznia 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Cancer Genetics and Comparative Genomics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół generowania organoidu ludzkiego mózgu z rezydującym mikroglejem poprzez włączenie do rozwoju organoidów komórek progenitorowych pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do rozwoju organoidów.

Streszczenie

Trójwymiarowe (3D) hodowle organoidów mózgowych pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) stanowią ważną alternatywę dla narzędzia in vitro do badania rozwoju ludzkiego mózgu i patogenezy chorób neurologicznych. Jednak brak włączenia mikrogleju do organoidów ludzkiego mózgu jest nadal główną przeszkodą dla modeli 3D zapalenia nerwów. Obecne podejścia obejmują albo włączenie w pełni zróżnicowanego mikrogleju do dojrzałych organoidów mózgowych, albo indukcję różnicowania mikrogleju od wczesnego stadium ciał zarodkowych (EB) pochodzących z iPSC. W pierwszym podejściu pomija się etap, w którym różnicowanie mikrogleju wchodzi w interakcję z sąsiednim środowiskiem neuronalnym, a drugie podejście jest technicznie trudne, co skutkuje niespójnością między końcowymi organoidami pod względem ilości i jakości mikrogleju. Aby modelować organoidy mózgowe z mikroglejem w celu zbadania wczesnych interakcji między rozwojem mikrogleju i neuronów, wysoce czyste hematopoetyczne komórki progenitorowe (HPC) zróżnicowane od ludzkich iPSC włączono do EB pochodzących z iPSC w celu wytworzenia organoidów mózgowych. Korzystając z analizy barwienia immunologicznego i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (sc-RNA-seq), potwierdziliśmy, że HPC zostały włączone do organoidów 3D, które ostatecznie rozwinęły się w organoidy mózgowe zarówno z mikroglejem, jak i neuronami. W porównaniu z organoidami mózgowymi bez HPC, takie podejście powoduje znaczną inkorporację mikrogleju w organoidach mózgowych. Ten nowatorski model organoidowy 3D, który składa się zarówno z właściwości rozwoju mikrogleju, jak i neuronów, może być wykorzystany do badania wczesnych interakcji między wrodzonym rozwojem układu odpornościowego i nerwowego oraz potencjalnie jako model zapalenia nerwów i zaburzeń neurozakaźnych.

Wprowadzenie

Mikroglej to komórki odpornościowe w mózgu, odgrywające kluczową rolę zarówno w rozwoju mózgu, jak i homeostazie1,2. Aktywacja mikrogleju powoduje produkcję czynników prozapalnych, podwyższoną fagocytozę i reaktywny stres oksydacyjny, który usuwa atakujące patogeny i uszkodzone komórki. Jednak nadmierna aktywacja lub przedłużona aktywacja mikrogleju może z drugiej strony powodować neurodegenerację jako mechanizm patogenezy w wielu zaburzeniach neurologicznych, w tym w chorobie Parkinsona3,4. Ważne jest, aby mikroglej został uwzględniony w odpowiednich modelach do badania zaburzeń neurologicznych człowieka. W ostatnich latach ludzkie komórki macierzyste zostały wykorzystane do opracowania organoidów 3D jako modeli in vitro jako alternatywy dla modeli zwierzęcych i badań z udziałem ludzi5. Idealnie byłoby, gdyby ludzkie organoidy składały się z wielu typów komórek i struktur tkankowych podobnych do odpowiadających im narządów ludzkich, lepiej reprezentujących ludzką fizjologię i patogenezę niż modele zwierzęce, ale bez obaw etycznych związanych bezpośrednio z badaniami na osobach ludzkich. Mogą one stanowić przyszłość modelowania chorób u ludzi w badaniach nad patogenezą i opracowywaniem leków oraz w prowadzeniu zindywidualizowanych terapii6. Na przykład organoidy 3D ludzkiego mózgu pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przeważają w dziedzinie badań neurobiologicznych, modelowania chorób zakaźnych neuronów, w tym ZIKA, SARS-CoV-27, oraz chorób neurodegeneracyjnych, w tym stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) i choroby Alzheimera8,9. Jednak konwencjonalne organoidy neuronalne 3D wykorzystujące hamowanie podwójnego SMAD w celu wywołania różnicowania neuronów10 wytwarzają organoidy mózgowe pozbawione mikrogleju, ponieważ pochodzą one od przodków rekrutowanych z krwi, a nie z linii neuroektodermy, z której pochodzą neurony11,12. Bez obecności mikrogleju organoidy są nieodpowiednie do modelowania infekcji OUN, stanu zapalnego i związanej z tym neurodegeneracji.

Aby rozwiązać ten krytyczny problem, podjęto próby włączenia zróżnicowanego mikrogleju do organoidów mózgowych13 lub indukowania różnicowania mikrogleju w organoidach od początku przy użyciu alternatywnych podejść zamiast hamowania podwójnym SMAD13. Jednak poprzez włączenie zróżnicowanego mikrogleju do organoidów mózgowych, wczesne interakcje między rozwojem neuronów i mikrogleju są pomijane. Może to być ważne w rozwoju OUN lub patogenezie zaburzeń neurozakaźnych ukierunkowanych na rozwój mózgu niemowlęcia, takich jak zakażenie wirusem ZIKA14. Z drugiej strony, różnicowanie wrodzonego mikrogleju w organoidach mózgowych pochodzących z iPSC bez przerywanych etapów wiąże się z długotrwałym procesem i ma większą zmienność w obrębie produktów końcowych15. W tym zgłoszonym protokole włączyliśmy hematopoetyczne komórki progenitorowe (HPC) pochodzące z iPSC do iPSC, aby wytworzyć ciała embrionoidalne (EB), które zostały dalej zróżnicowane w organoidy 3D, w tym zarówno neurony, jak i mikroglej.

Nasz protokół zapewnia łatwe podejście, które można zastosować do badania ludzkiego ośrodkowego układu nerwowego, w tym wczesnych interakcji neuron-mikroglej oraz patogenezy zaburzeń infekcyjnych nerwowych i zapalenia nerwów z aktywacją mikrogleju.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oryginalne próbki krwi od zdrowych dorosłych dawców zostały pobrane w Banku Krwi Medycyny Transfuzjologicznej NIH, a podpisane formularze świadomej zgody zostały uzyskane zgodnie z Instytucjonalną Komisją Rewizyjną NIH.

1. Wytwarzanie hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC) z ludzkich iPSC

UWAGA: Ludzkie komórki iPSC 510 i 507 zostały użyte do uzyskania reprezentatywnych wyników. Metody generowania i utrzymywania iPSC można znaleźć w poprzedniej publikacji16.

  1. Dzień 0: Pokryj 12-dołkową płytkę komórkową, dodając 500 μl/basenik lodowatego roztworu Matrigel (matryca błony podstawnej [BMM]) rozcieńczonego w pożywce DMEM/F12 i inkubuj przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Całkowicie usunąć supernatant powlekający i zastąpić go 1 ml pożywki E8 Flex na studzienkę.
  3. Sprawdź hodowlę iPSC na 6-dołkowej płytce pod mikroskopem, aby potwierdzić, że iPSC są wysokiej jakości i nie wykazują oznak różnicowania. Wybierz średniej wielkości kolonię, oznaczając ją markerem pod spodem płytki.
  4. Usunąć pożywkę z hodowli iPSC i dodać 500 μl buforu dysocjacyjnego iPSC kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,5 mM EDTA, 0,45 g/l NaCl w DPBS) do studzienki.
  5. Obserwuj pod mikroskopem oznaki dysocjacji komórek, gdy trzy do czterech rzędów komórek od krawędzi kolonii zaczynają się kurczyć, a między komórkami pojawia się pusta przestrzeń. Zwykle zajmuje to 1-3 minuty.
  6. Całkowicie odrzucić roztwór EDTA. Usunąć oznaczoną kolonię iPSC, pipetując 1 ml pożywki E8 Flex z dużą siłą i bezpośrednio na nią. Upewnij się, że kolonia całkowicie odczepia się na plastry zawierające 20-50 komórek każda po 1-3 krotnym pipetowaniu.
  7. Zebrać sklarowany nad osadem zawierający łaty komórkowe i dodać go do pierwszego dołka z powlekanych studzienek na płytce 12-dołkowej.
  8. Wymieszać studzienkę, pipetując jeden lub dwa razy, a następnie przenieść 1 ml komórek do drugiej studzienki, która zawiera 1 ml pożywki.
  9. Powtórz krok 1.8 dwukrotnie, aby wykonać seryjnie rozcieńczone kultury iPSC w sumie w czterech studzienkach.
  10. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  11. Po 24 godzinach, w dniu 1, sprawdź kolonie pod mikroskopem i policz liczbę kolonii, przechodząc przez wszystkie pola w studni w sposób ciągły. Wybierz jedną studzienkę, która zawiera 10-20 kolonii iPSC.
  12. Zastąp pożywkę 1 ml pożywki A z zestawu do leczenia układu krwiotwórczego. Włożyć płytkę z powrotem do inkubatora na 48 godzin.
  13. W dniu 3 usuń 500 μl zużytej pożywki i dodaj 500 μl świeżej pożywki A.
  14. W 4 dniu obserwuj pod mikroskopem i zauważ znaczny wzrost komórek i różnicowanie się od kolonii iPSC. Zastąp pożywkę 1 ml pożywki B.
  15. Monitoruj różnicowanie komórek pod mikroskopem i wykonuj zmianę połowy pożywki za pomocą 500 μl pożywki B co drugi dzień. Komórki podobne do HPC pojawiają się w 6-7 dniu.
  16. W dniu 10 obserwuj pod mikroskopem jasne, pojedyncze okrągłe komórki o morfologii normalnych HPC unoszących się w pożywce lub luźno przyczepionych do pojedynczej dolnej warstwy płaskich komórek, z kilkoma luźnymi agregatami komórek.
    UWAGA: Zróżnicowane HPC są gotowe do zebrania w celu scharakteryzowania lub dalszych eksperymentów.
  17. Zebrać wszystkie zróżnicowane HPC, pipetując trzykrotnie w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml w celu rozbicia agregatów komórek i odłączenia HPC od powierzchni płytki.
  18. Dodać komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml pożywki B.
  19. Policz komórki i dostosuj stężenie do 1 miliona komórek/ml. Na tym etapie generowanych jest ponad 1 milion HPC. Podczas sprawdzania za pomocą cytometrii przepływowej upewnij się, że czystość wynosi więcej niż 85% komórek z CD34+/CD43+. Upewnij się, że nie zauważono żadnych znaczących martwych komórek (więcej niż 5%).

2. Rozwijanie ciał embrionalnych z mieszanych iPSC i HPC

  1. Tego samego dnia zbierania HPC upewnij się, że kultura iPSC osiąga również 80% konfluencji w jednym dołku na płytce 6-dołkowej (lub dwóch studzienkach w płytce 12-dołkowej).
  2. Potraktuj jedną studzienkę z płytki do hodowli mikrodołka pod kątem tworzenia EB 500 μl roztworu do płukania zapobiegającego przyleganiu, dodając go w celu zminimalizowania pęcherzyków.
  3. Obracaj płytkę o wymiarach 2000 x g przez 5 minut w obracającym się wirniku kubełkowym wyposażonym w uchwyty na talerze, aby usunąć ewentualne pęcherzyki.
  4. Całkowicie usunąć roztwór płuczący przez pipetowanie i umyć studzienki dwukrotnie 1 ml DPBS, a następnie 1 ml DMEM/F12 bez wytwarzania pęcherzyków.
  5. Oddzielić iPSC od płytki, traktując komórki 1 ml roztworu Accutase.
  6. Obserwuj pod mikroskopem, aż komórki wykazują oznaki separacji, ale nadal są przyczepione do dna. Zwykle dzieje się to w ciągu 1-3 minut od zabiegu Accutase. Nie należy nadmiernie trawić komórek iPSC.
  7. Całkowicie usunąć roztwór Accutase bez naruszania komórek i dodać 1 ml pożywki DMEM/F12 do studzienek. Następnie rozdziel komórki na pojedyncze komórki, pipetując kilka razy w górę iw dół za pomocą końcówki o pojemności 1 ml.
  8. Zebrać komórki do probówki o pojemności 15 ml i napełnić ją do 5 ml pożywką DMEM/F12. Wiruj komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut.
  9. Usunąć supernatant przez pipetowanie i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki E8 Flex. Policz komórki i dostosuj stężenie komórek do 1 miliona komórek na ml w pożywce E8 Flex.
  10. Wymieszaj iPSC z HPC w stosunku 2:1, dodając do siebie 1 milion iPSC (1 ml) i pół miliona HPC (500 μl). Dodaj wszystkie zmieszane komórki do wcześniej potraktowanego dołka płytki hodowlanej mikrostudzienki.
  11. Dodać 1 μl roztworu podstawowego inhibitora skał Y27632 (1 mM) na 1 ml pożywki do supernatantu. Potrząśnij płytką kilka razy z boku na bok, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
  12. Obracać płytkę do hodowli mikrodołka o wymiarach 300 x g przez 5 minut w wahadłowym wirniku kubełkowym wyposażonym w uchwyty na płytki. Obserwuj pod mikroskopem, aby zobaczyć, czy komórki osiadły w mikrostudzienkach. (Rysunek uzupełniający 1A).
  13. Nie naruszając komórek, umieścić płytkę w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C i stężeniu 5%CO2.
  14. W 2 dniu, 48 godzin później, obserwuj komórki pod mikroskopem pod kątem tworzenia się EB. Gdy EB są wyraźnie uformowane, przejdź do następnego kroku (rysunek uzupełniający 1B).
  15. Na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej należy potraktować buforem do płukania zapobiegającym przywieraniu (500 μl) przez 15 minut, aby uzyskać niską płytkę mocującą.
  16. Całkowicie usunąć bufor płuczący i umyć studzienki dwukrotnie 1 ml DPBS, a następnie dodać 1 ml pożywki E8 Flex do studzienek.
  17. Ponownie zawiesić EB na płytce do hodowli mikrodołków, pipetując je kilka razy końcówką pipety z kryzą o szerokości 1 ml.
  18. Dla każdego dołka z 24-dołkowymi płytkami o niskiej adherencji zebrać i dodać 100 μl pożywki zawierającej EB. Spowoduje to 10-20 EB na odwiert. Dodaj pożywkę E8 Flex do starej studni zawierającej resztki EB jako kopie zapasowe.
  19. Inkubować płytkę w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 przez 48 godzin.

3. 3D indukcja, proliferacja i dojrzewanie organoidów nerwowych

  1. W 2 dniu po utworzeniu EB rozmrażaj porcje BMM na lodzie przez co najmniej 30 minut.
  2. Użyj wstępnie schłodzonej końcówki o pojemności 20 μl i mądrze dodaj 15 μl lodowatej kropli BMM na wierzch podłoża, aby pokryć EB. W ten sposób powstaje film BMM, do którego EB będą się przyczepiać i do którego będą rosły.
  3. Umieścić płytkę w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C i stężeniu 5%CO2.
  4. W 4 dniu, po utworzeniu EB, ostrożnie usunąć 500 μl pożywki, nie wyrzucając EB i powtórzyć powlekanie BMM, postępując zgodnie z krokiem 3.2.
  5. Natychmiast rozpocznij indukcję neuronalną, dodając 500 μl pożywki do indukcji neuronalnej PSC na wierzch komórek.
  6. W dniach 6 i 8 wykonaj połowę zmiany pożywki, ostrożnie usuwając 500 μl pożywki bez dotykania komórek i dodając 500 μl pożywki do indukcji neuronalnej.
  7. W dniach 10, 12 i 14 wykonaj połowę zmiany pożywki z pożywką z nerwowych komórek macierzystych (NSC): Knockout DMEM/F12 + 1x suplement Glutamax + 1x Suplement neuronalny + bFGF + EGF.
  8. W dniu 15 przenieś całą studzienkę kulek z pożywką na nową 12-dołkową płytkę potraktowaną roztworem do płukania zapobiegającym przywieraniu, jak opisano wcześniej. Dodać 500 μl pożywki do dojrzewania neuronów (DMEM/F12 + 1x suplement N2 + 1x suplement B27 + 1x antybiotyki przeciwgrzybicze) na wierzch hodowli.
  9. Wykonuj zmianę połowy pożywki z pożywką do dojrzewania neuronów co drugi dzień.
  10. Na etapie dojrzewania, jeśli występują oznaki wyczerpania składników odżywczych, takie jak zmiana koloru pożywki, przenieś organoid do 6 dołków, które mieszczą do 3 ml pożywki na studzienkę.
  11. Opcjonalnie 17 dni po wytworzeniu EB należy uzupełnić pożywkę dojrzewającą cytokinami (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) przez 6 dni, aby ułatwić dojrzewanie mikrogleju.
  12. W dniu 23 zbierz powstałe organoidy nerwowe w celu scharakteryzowania lub dalszych eksperymentów.

4. Usuwanie i barwienie immunologiczne organoidów nerwowych 3D

  1. Utrwalić do 10 organoidów przez zanurzenie w 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
  2. Przenieść organoidy z każdej studzienki na 96-dołkową przezroczystą płytkę denną i przemyć 200 μl DPBS 2 razy przez 1 godzinę za każdym razem, delikatnie wstrząsając.
  3. Organoidy należy przepuszczać, myjąc je raz w 50% metanolu w DPBS, 80% metanolu w wodzie podwójnie destylowanej (dd) i 100% suchym metanolu przez 10 minut każde, w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
  4. Organoidy myć seryjnie w 20% DMSO/metanolu, 80% metanolu w wodzie dd, 50% metanolu w DPBS, w 100% DPBS, a następnie w DPBS 0,2% Triton X-100, przez 10 minut każdy w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając. Staraj się całkowicie usunąć resztki buforu po każdym praniu.
  5. Inkubować w buforze przepuszczalnym (DPBS z 0,2% Triton X100, 0,3 M glicyną i 20% DMSO) z delikatnym wytrząsaniem przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Blokuj bufor blokujący (DPBS z 0,2% Triton X100, 6% kozią surowicą i 10% DMSO) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z delikatnym wstrząsaniem na wytrząsarce przy 80 obr./min.
  7. Inkubować z przeciwciałami w buforze do rozcieńczania przeciwciał (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-tubulina, 1:1000, 100 μl / basenik w DPBS z 0,2% Tween 20, 100 μg/ml heparyny, 3% surowicy koziej i 5% DMSO) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny lub w chłodni z delikatnym wstrząsaniem przy 80 obr./min przez 3 dni.
  8. Przemyć DPBS z 0,2% Tween 20, 100 μg/ml heparyny 5 razy, po 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając na wytrząsarce przy 80 obr./min.
  9. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym (1:200 koza anty-mysz Alexa488) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, a następnie RT przez noc, delikatnie wstrząsając wytrząsarką przy 80 obr./min.
  10. W przypadku barwienia z kontrastem jądrowym należy przeprowadzić barwienie DAPI razem z inkubacją przeciwciał lub w buforze do mycia.
  11. Umyć organoidy 10 razy w buforze do mycia, za każdym razem 10 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając.
  12. Obserwuj pod mikroskopem. Jeśli tło jest nadal wysokie, umyj je 5 razy.
  13. Odrzucić supernatant w jak największym stopniu. Dodać 200 μl roztworu do oczyszczania organoidów i inkubować go przez 5 minut przed obserwacją, a następnie wykonać zdjęcia za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nasz protokół opiera się na schemacie różnicowania iPSC w HPC, a następnie mieszania HPC z iPSC w celu utworzenia EB, po czym następuje indukcja neuronalna, różnicowanie i dojrzewanie (Rysunek 1). Wysoka jakość różnicowania HPC jest kluczowa dla powodzenia formowania EB i późniejszego różnicowania organoidów. W celu uzyskania odpowiedniej liczby i wielkości kolonii iPSC do rozpoczęcia różnicowania HPC stosowana jest technika hodowli z seryjnymi rozcieńczeniam...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół wytwarzania 3D organoidów nerwowych zawierających wrodzony mikroglej z EB pochodzących z mieszanych iPSC i HPC zróżnicowanych iPSC. Jest to stosunkowo krótkie i łatwe podejście, obejmujące jedynie techniki i sprzęt do hodowli komórkowych ogólnie dostępne w większości laboratoriów.

Najważniejszym czynnikiem decydującym o powodzeniu tego protokołu jest jakość zróżnicowania HPC. Przyjęliśmy opublikowaną metodę17 przy użyciu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie jest wspierane przez wewnętrzne fundusze badawcze NINDS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
12-dołkowe płytki do hodowli komórkowychCorning #3512
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowejSARSTEDT#83.3922
AccutaseThermoA1110501
Płytki Aggrewell 400Technologie komórek macierzystych#34411Określane jako płytka do hodowli mikrodołkowej 
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysieTechnologie życiaA110011:400 rozcieńczenie
Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-królikoweTechnologie życiaA110121:400 rozcieńczenie
Allegra X-30R Wirówka z wirnikiem S6069Beckman Couler
Anti-adherence  Roztwór do płukaniaStem Cell Technologies#07010
przeciwciało anty-CD34Technologie komórek macierzystych#600131:100 rozcieńczenie
przeciwciało anty-ludzkie CD43Stem Cell Technologies#600851:100 rozcieńczenie
przeciwciało anty-IBA1 rabbbitFujifilm019-197412,5 i mikro; g/mL
anty-TREM2  szczur pAbRD Systemsmab172912,5 &mikro; g/mL
Antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczyGibco15240-0621x
suplement B27Technologie życiowe17504-0441x
bFGFPeprotech100-18B20 ng/mL
CD200NovoproteinC311 
Fiolki CryoTubeThermo#368632
CX3CL1Peprotech300-31  100 ng/ml
DAPISigmaD95421 &mikro; g/mL
DMEM/F12Life technologies12400-0241x
DMSOSigmaD2650
DPBSGibco#41901361x
E8 Flex medium kitThermoA2858501
EDTAMediatech46-034-Cl 0,5 mM
EGFPeprotechAF-100-1520 ng/mL
EVOS FL Auto MicroscopeMikroskop termofluorescencyjny
FastStart Uniwersalny SYBR Green PCR master mixRoche#4913850001
GlutamaxGibco#35050079
Serum kozieSigmaG90234%
IL-34Peprotech200-34  100 ng/ml
ImageXpress Micro Konfokalneurządzenia
Knockout DMEM/F12Gibco#10829018
M-CSFPeprotech300-25  25 ng / ml
MatrigelCorning#354277Macierz membrany podstawnej (BMM)
Mysz anty-β Przeciwciało III-tubulinowePromegaG712Arozcieńczenie 1:1000
Mr. Frosty pojemnikThermo5100-0001
Suplement N2Technologie życia17502-0481x
ParaformadehydeSigmaP61484%
PSC Pożywka do indukcji neuronówGibcoA1647801
Inhibitor skały Y27632Komórka macierzysta technologie#72304mM zapas
RT LTS 1000 ul końcówki do pipetRAININ#30389218  do przenoszenia organoidów
STEMdiff Cerebral OrganoidKit Stem Cell Technologies#08570
STEMdiff Hematopoietic KitStemCell Technologies#5310Określany jako zestaw krwiotwórczy
StemPro Neural SupplementGibcoA1050801Określany jako suplement neuronowy
TGF-β 1Peprotech100-2150 ng/ml
Total RNA Purification PlusKit Norgen#48400
TritonX-100SigmaT92840.10%
Visikol Histo-Starter KitVisikolHSK-1Zawiera roztwór do oczyszczania organoidów HISTO-M, bufor myjący
Zeiss LSM 510-META Mikroskop konfokalnyZeiss
100 ng/ml  molekularne 1

Bibliografia

  1. Sabate-Soler, S., et al. Microglia integration into human midbrain organoids leads to increased neuronal maturation and functionality. Glia. 70 (7), 1267-1288 (2022).
  2. Lazarov, T., Juarez-Carreño, S., Cox, N., Geissmann, F. Physiology and diseases of tissue-resident macrophages. Nature. 618 (7966), 698-707 (2023).
  3. Wang, T., Liu, B., Zhang, W., Wilson, B., Hong, J. S. Andrographolide reduces inflammation-mediated dopaminergic neurodegeneration in mesencephalic neuron-glia cultures by inhibiting microglial activation. J Pharmacol Exp Ther. 308 (3), 975-983 (2004).
  4. Qian, L., Flood, P. M., Hong, J. S. Neuroinflammation is a key player in Parkinson's disease and a prime target for therapy. J Neural Transm (Vienna). 117 (8), 971-979 (2010).
  5. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  6. Fakıoğlu, D. M., Altun, B. New therapeutic approaches in cystic fibrosis. Turk J Pharm Sci. 17 (6), 686-697 (2020).
  7. Mcmillan, R. E., Wang, E., Carlin, A. F., Coufal, N. G. Human microglial models to study host-virus interactions. Exp Neurol. 363, 114375(2023).
  8. Scopa, C., et al. Jun upregulation drives aberrant transposable element mobilization, associated innate immune response, and impaired neurogenesis in Alzheimer's disease. Nat Commun. 14 (1), 8021(2023).
  9. Tamaki, Y., et al. Spinal cord extracts of amyotrophic lateral sclerosis spread TDP-43 pathology in cerebral organoids. PLoS Genet. 19 (2), e1010606(2023).
  10. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and IPS cells by dual inhibition of smad signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  11. Kim, S. H., Chang, M. Y. Application of human brain organoids-opportunities and challenges in modeling human brain development and neurodevelopmental diseases. Int J Mol Sci. 24 (15), 12528(2023).
  12. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  13. Ormel, P. R., et al. Microglia innately develop within cerebral organoids. Nat Commun. 9 (1), 4167(2018).
  14. Abdelmalek, C. M., et al. Building a growing genomic data repository for maternal and fetal health through the ping consortium. medRxiv. , (2024).
  15. Wei, Z., et al. Human IPSC-derived brain organoids: A 3D mini-brain model for studying HIV infection. Exp Neurol. 364, 114386(2023).
  16. Wang, T., et al. Regulation of stem cell function and neuronal differentiation by HERV-K via mTOR pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (30), 17842-17853 (2020).
  17. Mcquade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Mol Neurodegener. 13 (1), 67(2018).
  18. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  19. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 7302(2021).
  20. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  21. Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
  22. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126.e20 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy m zguindukowane pluripotencjalne kom rki macierzystehematopoetyczne kom rki progenitorowecia a embrionalneindukcja neuronalnainkorporacja mikroglejusekwencjonowanie RNA pojedynczych kom rekmodel neuroinflamacjidojrzewanie neuronalne
Wyprowadzenie organoidu ludzkiego mózgu z rozwojem mikrogleju
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.