Artykuł metodologiczny

Szybkie i swoiste wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii za pomocą systemu opartego na amplifikacji polimerazy rekombinazy/Cas12a

DOI:

10.3791/67542

⸱

25 kwietnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Practice, The First Hospital of Jilin University, 2Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases, The First Hospital of Jilin University, 3Bioinformatics Laboratory, The First Hospital of Jilin University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ułatwić szybkie i precyzyjne wykrywanie Acinetobacter baumannii, przedstawiamy protokół, który wykorzystuje amplifikację polimerazy rekombinazy (RPA) w połączeniu z endonukleazą LbaCas12a do identyfikacji infekcji A. baumannii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Acinetobacter baumannii, bakteria Gram-ujemna, jest znana z powodowania ciężkich infekcji o wysokiej śmiertelności. Szybkie i dokładne wykrycie A. baumannii ma kluczowe znaczenie dla szybkiego leczenia, skutecznej kontroli zakażeń i ograniczenia oporności na antybiotyki. Nie ma jednak odpowiedniej metody szybkiego i łatwego wykrywania A. baumannii na miejscu. System CRISPR Trans Reporter (DETECTR) ukierunkowany na endonukleazę DNA oferuje szybkie, precyzyjne i czułe podejście do wykrywania A. baumannii poprzez integrację specyficznych dla celu możliwości rozpoznawania Cas12a z wydajnością amplifikacji izotermicznej amplifikacji polimerazy rekombinazy (RPA). Protokół ten szczegółowo opisuje wykrywanie A. baumannii za pomocą RPA w połączeniu z endonukleazą LbaCas12a. W artykule opisano następujące kroki: ekstrakcja DNA, wybór określonej sekwencji DNA, projektowanie startera i CRISPR RNA (crRNA), budowa dodatniego plazmidu rekombinowanego, ustawienie testu Cas12a-RPA, optymalizacja systemu amplifikacji RPA, wizualizacja testu RPA-CRISPR/Cas12a za pomocą narzędzia do wykrywania fluorescencji, takiego jak przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym, oraz ocena wrażliwości i swoistości.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W mikrobiologii klinicznej wykrywanie zakażeń Acinetobacter baumannii stanowi poważne wyzwanie. Ta bakteria Gram-ujemna może powodować infekcje z ciężkimi objawami klinicznymi, nawet przy wysokiej śmiertelności, szczególnie wśród pacjentów z obniżoną odpornością1. Tradycyjne metody wykrywania zakażeń patogenami oparte na kulturach są czasochłonne i mogą nie być czułe, co może opóźnić antybiotykoterapię i pogorszyć wyniki leczenia pacjentów. Szybka i dokładna identyfikacja A. baumannii ma kluczowe znaczenie dla skutecznego leczenia i kontroli ogniska. Aby zaspokoić tę potrzebę, zbadano techniki molekularne wykorzystujące amplifikację kwasów nukleinowych. Jednak podejścia te często wymagają zaawansowanego sprzętu do cykli termicznych i mogą być ograniczone przez dobrze wyszkolonych techników i dobrze ugruntowane laboratoria. Aby sprostać tym wyzwaniom, badania coraz częściej koncentrują się na opracowywaniu metod amplifikacji izotermicznej2,3,4.

Amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA) to metoda opracowana przez Piepenburg et al 5 i używana do amplifikacji DNA, podobnie jak w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), ale bez potrzeby cyklicznych zmian temperatury. Metoda ta obejmuje 50 mM Tris (pH 7,5), 100 mM octan potasu, 14 mM octan magnezu, 2 mM DTT, 5% PEG20000 (glikol polietylenowy o wysokiej masie cząsteczkowej), 200 μM dNTPs, 3 mM ATP, 50 mM fosfokreatyny, 100 μg/ml kinazy kreatyny, 120 μg/ml UvsX, 30 μg/ml UvsY, 900 μg/ml Gp32, 30 μg/ml Bsu LF, startery 450 nM i matryce DNA. Proces amplifikacji rozpoczyna się od związania białka rekombinazy UvsX ze starterami w obecności 3 mM ATP i 5% PEG20000 tworząc kompleks rekombinaza-starter. Kompleks ten następnie ułatwia łączenie starterów z sekwencjami homologicznymi na dwuniciowym DNA.

Z pomocą UvsY, rekombinaza UvsX ułatwia wymianę między starterem a nicią matrycową, co skutkuje przemieszczeniem jednej nici docelowego DNA. Gp32 pomaga w utrzymaniu jednoniciowej struktury DNA. Wreszcie rekombinaza dysocjuje, a polimeraza DNA (Bsu LF) zdolna do przemieszczania nici DNA wiąże się z końcem 3' startera, wydłużając go w obecności trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP). Proces ten powtarza się cyklicznie, osiągając wykładnicze wzmocnienie. Wszystkie procesy amplifikacji można zakończyć w ciągu 20-40 minut i w stosunkowo stałych temperaturach od 37 °C do 42 °C. Ten zakres temperatur jest w przybliżeniu identyczny z temperaturami fizjologicznymi, co pozwala na przeprowadzanie RPA w minimalistycznym środowisku, dzięki czemu RPA jest wszechstronnym i wydajnym narzędziem do wykrywania i analizy DNA.

Zgrupowany, regularnie rozmieszczony system krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) i białka związanego z CRISPR (CRISPR-Cas) funkcjonuje jako adaptacyjny mechanizm immunologiczny u bakterii i archeonów, obejmujący systemy klasy I i II. Klasa II obejmuje białka takie jak Cas12 (a, b, f), Cas13 (a, b) i Cas14, które identyfikują i rozszczepiają docelowe DNA lub RNA kierowane przez CRISPR RNA (crRNA)6,7,8 . LbaCas12a (lub Cpf1) jest endonukleazą DNA sterowaną przez crRNA. CrRNA służy jako przewodni RNA w systemie CRISPR-Cas, gdzie kompleksuje się z białkami Cas. Wykorzystuje swój region dystansowy do parowania się z docelowym DNA, skutecznie kierując kompleks białkowy do docelowych sekwencji. Sekwencja 5'-UAAUUUACUAAGUGUAGAU-3' służy jako konserwatywne powtórzenie crRNA, stały element we wszystkich crRNA LbaCas12a. Po tym powtórzeniu następuje segment specyficzny dla celu, który różni się w zależności od zamierzonego celu DNA. Ta sekwencja celująca ma długość od 18 do 24 nukleotydów.

Sekwencja PAM (Protospacer-Adjacent Motif) (TTTV, gdzie V może być A, C lub G) znajduje się na końcu 5' niekomplementarnej nici celu DNA. Cas12a tnie docelowe dwuniciowe DNA w sekwencji PAM. Następnie aktywowane białka Cas wykonują niespecyficzne trans-rozszczepienie jednoniciowego DNA (ssDNA)9,10,11,12. W ten sposób ssDNA znakowane fluoroforem i wygaszaczem ulega rozszczepieniu, co powoduje emisję sygnału fluorescencyjnego po rozszczepieniu pobocznym8,13. Intensywność fluorescencji można określić ilościowo za pomocą czytnika fluorescencji w celu precyzyjnego wykrywania kwasów nukleinowych14. Warto zauważyć, że Cas12a jest szeroko stosowany do analizy DNA, a jego wiązanie i rozszczepianie sekwencji docelowych zależy od rozpoznania motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM), podczas gdy Cas13a działa niezależnie od takiego wymogu.

CRISPR-Cas systems15,16,17 ułatwiają rozszczepienie w ramach jednej reakcji18,19,20,21. Połączenie powyższych dwóch elementów może stworzyć solidne narzędzie znane jako A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii) do wykrywania kwasów nukleinowych22,23,24. Protokół ten demonstruje zastosowanie RPA w połączeniu z aktywnością DNazy Cas12a w celu specyficznego celowania i rozszczepiania sekwencji kierowanej przez crRNA w genie 16s rDNA A. baumannii, umożliwiając w ten sposób czułe i precyzyjne wykrywanie patogenu.

Metoda A. baumannii-DETECTR ma kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi metodami wykrywania25,26. Po pierwsze, izotermiczna charakterystyka RPA usprawnia procedury operacyjne i obniża koszty dzięki mechanizmowi wzmocnienia niezależnemu od cyklera termicznego5. Po drugie, endonukleaza Cas12a zwiększa swoistość testu za pomocą celowania za pośrednictwem crRNA i parowania zasad Watsona-Cricka7. Wreszcie, zastosowanie metody jednoprobówkowej A. baumannii-DETECTR nie tylko oszczędza czas, ale także znacznie zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia amplikonem19.

Protokół przedstawia kroki ekstrakcji DNA, wyboru docelowych sekwencji DNA, projektowania starterów i crRNA, budowy dodatnich rekombinowanych plazmidów, ustanawiania konfiguracji testu Cas12a-RPA, optymalizacji optymalizacji amplifikacji RPA oraz wizualizacji wyników za pomocą narzędzi do wykrywania fluorescencji, takich jak maszyna do PCR w czasie rzeczywistym, wraz z ocenami wrażliwości i swoistości.

Metoda A. baumannii-DETECTR daje nadzieję na poprawę wyników leczenia pacjentów poprzez ułatwienie szybkiego i skutecznego leczenia, solidną kontrolę infekcji i powstrzymanie rozprzestrzeniania się oporności na antybiotyki. Protokół ten może służyć jako kompleksowa wytyczna do wdrażania technologii Cas12a-RPA, zwiększając jej użyteczność w różnych warunkach opieki zdrowotnej. Należy jednak pamiętać, że każdy krok powinien być zoptymalizowany w oparciu o określone warunki laboratoryjne i różnorodność próbek, aby zapewnić spójne i wiarygodne wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa A. baumannii -DETECTR

UWAGA: Budowa A. baumannii-DETECTR to czteroetapowy proces obejmujący projektowanie startera i crRNA, budowę dodatniej konstrukcji rekombinowanego plazmidu, przygotowanie roztworów reakcyjnych, izotermiczną amplifikację DNA przez RPA oraz wizualizację testu RPA-CRISPR/Cas12a. Schemat testu DETECTR jest zilustrowany na rysunku Rysunek 1.

  1. Projektowanie startera i crRNA (patrz plik uzupełniający 1)
    1. Zaprojektuj 12 par podkładów za pomocą narzędzi projektowych w oparciu o zasady projektowania Primer. Uzyskaj cztery startery do przodu (F0-F3) i trzy startery odwrotne (R1-R3), aby skomponować dwanaście par starterów (F0R1, F0R2, F0R3, F1R1, F1R2, F1R3, F2R1, F2R2, F2R3, F3R1, F3R2, F3R3).
      1. Upewnij się, że koniec 5' startera zawiera zasady C lub T w pierwszych 3-5 nukleotydach zamiast ciągłego rozciągania G. Dodatkowo upewnij się, że ostatnie trzy nukleotydy na końcu 3' są idealnie zasadami G i C, aby zwiększyć amplifikację.
      2. Zaprojektuj podkłady bez samouzupełniających się sekwencji, aby uniknąć tworzenia się spinki do włosów i z nie więcej niż czterema komplementarnymi lub homologicznymi zasadami między nimi. Unikaj komplementarności końca 3', aby uniknąć dimeryzacji podkładu.
    2. Oceń każdą parę starterów pod kątem swoistości za pomocą narzędzia Primer-BLAST National Center for Biotechnology Information (NCBI), aby ocenić skuteczność i swoistość starterów.
      UWAGA: Primer-BLAST może wykorzystywać bazę danych NCBI do znajdowania sekwencji pasujących do zaprojektowanych starterów, pomagając użytkownikom ocenić skuteczność i swoistość starterów.
    3. Po przesiewie starterów zaprojektuj CRISPR RNA (crRNA) lub przewodnik RNA (gRNA) przy użyciu sekwencji rusztowania crRNA LbaCas12a (5'-UAAUUUACUAAGUGUAGAU-3') jako ustalonej sekwencji. Włączyć segment specyficzny dla celu (5'-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3'), upewniając się, że motyw PAM znajduje się na końcu 5' nici niekomplementarnej.
      UWAGA: Sekwencje wszystkich oligonukleotydów i crRNA przedstawiono w tabeli 1.
  2. Dodatnia budowa rekombinowanego plazmidu
    1. Amplifikuj segment rDNA 16s za pomocą zestawu starterów A. baumannii 16s rDNA-F (starter do przodu) i A. baumannii 16s rDNA-R (starter odwrotny).
      1. Dodaj 1 μl 10 μM F i 10 μM R, 10 μl 5x buforu FastpFu, 1 μl polimerazy FastpFu, 4 μl 2,5 mM dNTPs, 1 μL 10 ng/μL genomowego DNA A. baumannii i 32 μl wody wolnej od nukleaz do systemu PCR 50 μL.
      2. Ustawić warunki cykliczne PCR w następujący sposób: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 minut, następnie 33 cykle denaturacji w temperaturze 95 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 55°C przez 30 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 minutę i 20 s. Na koniec wykonaj 10 minut w temperaturze 72°C, aby uzyskać ostateczne przedłużenie.
    2. Aby oczyścić dodatni wynik testu PCR, należy użyć zestawu do oczyszczania DNA zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie sklonuj oczyszczone DNA do wektora pUC57, który został strawiony enzymami BamHI i SalI.
      UWAGA: Proces ten spowoduje utworzenie dodatniego rekombinowanego plazmidu zawierającego konserwatywny region.
    3. Rozcieńczyć dodatni rekombinowany plazmid szeregowo w dziesięciokrotnych odstępach wysterylizowanym ddH2O, aby uzyskać stężenie od jednej kopii/μl do 10-7 kopii/μl. Rozcieńczony plazmid należy przechowywać w temperaturze -20 °C do przeprowadzenia kolejnych doświadczeń.
  3. Przygotowanie roztworu
    1. Przygotuj roztwór A w następujący sposób: do każdej reakcji dodać 29,5 μl buforu do rehydratacji bez podkładu, 2,4 μl 10 μM A. baumannii-F i 10 μM A. baumannii-R oraz 12,2μl ddH2O, aby uzyskać końcową objętość 46,5 μL. Wirować i krótko wirować. Następnie dodaj mieszaninę reakcyjną do probówek do reakcji enzymatycznych z zestawu RPA. Pipeta do mieszania.
      UWAGA: Startery A. baumannii-F i R są używane w teście ukierunkowanym na gen A. baumannii. Proszę zapoznać się z tabelą 1, aby zapoznać się z sekwencją.
    2. Przygotuj roztwór B w następujący sposób: dla każdej reakcji dodać 0,24 μl 10 μM reportera ssDNA, 2 μl 10x buforu reakcyjnego Cas12a, 1 μl 1 μM crRNA, 1 μL 1 μM Cas12a i 10,76μL ddH2O, aby uzyskać końcową objętość 15 μL.
      UWAGA: Sondy (reporter ssDNA) zostały zakupione i składały się z jednoniciowego reportera DNA, który był oznaczony fluoroforem 5-karboksyfluoresceiny (FAM) na końcu 5' i wygaszaczem Black Hole Quencher 1 (BHQ1) na końcu 3'. W przypadku wielu próbek wymagających wykrycia należy przygotować znaczną ilość roztworu B, a następnie podzielić próbki na podwielokrotności.
  4. Izotermiczna amplifikacja DNA (RPA)
    1. Dodać 1 μl dodatniego rekombinowanego plazmidu o stężeniu10-7 kopii/μl do roztworu A z różnymi parami starterów; dokładnie wymieszać. Następnie dodaj 2,5 μl 280 mM octanu magnezu (MgOAc) do roztworu i dobrze wymieszaj.
      UWAGA: Reakcje RPA rozpoczynają się zaraz po dodaniu MgOAc.
    2. Inkubować w temperaturze 39 °C przez 20 minut. Po 20 minutach oczyść produkty amplifikowane różnymi starterami za pomocą RPA z zestawem do oczyszczania, a następnie uruchom czyste amplikony na 1% żelu agarozowym przy 120 V przez 10 minut, aby wybrać najjaśniejsze i najszersze pasmo jako najlepszą parę starterów.
      UWAGA: W przypadku małej liczby kopii szablonu, po 4 minutach wyjmij rurkę EP, odwiruj i krótko obróć; Następnie umieść go w urządzeniu grzewczym na kolejne 16 minut. Po amplifikacji lampy należy otwierać ze szczególną ostrożnością, aby uniknąć zanieczyszczenia powierzchni roboczych amplikonami. Ten środek ostrożności zmniejszy ryzyko wywołania wyników fałszywie dodatnich w kolejnych procedurach eksperymentalnych.
  5. Optymalizacja systemu amplifikacji RPA
    UWAGA: Optymalna para starterów F3R3 wybrana w poprzednim kroku została ustawiona na różne stężenia końcowe dla reakcji amplifikacji RPA, aby odsiać optymalne stężenie i czas startera. NC jest ślepą próbą kontrolną dla odpowiedniego stężenia startera.
    1. Utrzymać stałe stężenia pozostałych składników i całkowitą objętość 46,5 μl w roztworze A. Odpowiednio dostosować objętość ddH2O wolnego od RNaz, aby osiągnąć końcowe stężenia startera 10 μM F3 i 10 μM R3 przy 0,40 μM (2,0 μL), 0,44 μM (2,2 μL), Odpowiednio 0,48 μM (2,4 μL) i 0,52 μM (2,6 μL).
    2. Inkubować w temperaturze 39 °C przez różne czasy: 10 min, 20 min, 30 min.
    3. Oczyść produkty RPA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA i wykonuj elektroforezę na 1% żelu agarozowym przy 120 V przez 10 minut, aby określić optymalne stężenie startera i czas inkubacji poprzez analizę charakterystyki prążków.
  6. Wizualizacja testu RPA-CRISPR/Cas12a
    1. Dodać 5 μl produktu RPA do roztworu B i dokładnie wymieszać do uzyskania jednorodnej konsystencji.
    2. Umieść próbki w ilościowym przyrządzie do fluorescencji PCR, ustaw kanał FAM i odczytuj wartości co minutę przez 60 minut w temperaturze 37 °C, 60 razy, co daje łącznie 60 minut
      UWAGA: Zielony sygnał fluorescencji może trwać kilka dni. Aby upewnić się, że system działa skutecznie, lepiej jest wykonać test wolny od DNA i RNazy.

2. Ocena swoistości platformy detekcyjnej opartej na RPA-CRISPR/Cas12a

UWAGA: Aby przetestować specyficzność A. baumannii-DETECTR, kwasy nukleinowe A. baumannii, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Rickettsia mooseri, Enterobacter, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Chlamydia psittaci, Legionella, Coxiella burnetii, Serratia oraz próbki ludzkie zostały poddane testowi DETECTR.

  1. Użyj matryc DNA uzyskanych od różnych gatunków za pomocą wspomnianego zestawu DNA lub izolując je poprzez gotowanie bakterii w wodzie. Upewnij się, że wszystkie szablony mają równe stężenia. Użyj wody jako kontroli negatywnej.
  2. Dodać 10 ng lub 1 μl matryc DNA do roztworu A zawierającego startery F3R3. Dodać 2,5 μl MgOAc, dokładnie wymieszać i inkubować mieszaninę w temperaturze 39 °C przez 20 minut.
  3. Po 20 minutach dodać 5 μl produktu z poprzedniego etapu do roztworu B i wymieszać.
  4. Umieścić w ilościowym przyrządzie do fluorescencji PCR, ustawić kanał na FAM i odczytywać wartość raz na minutę w temperaturze 37 °C, w sumie 60 razy przez 60 minut.

3. Ocena czułości platformy detekcyjnej opartej na RPA-CRISPR/Cas12a

  1. Jako matrycę do reakcji należy użyć dodatniego rekombinowanego plazmidu, który został przygotowany do stężenia 1-107 kopii/μl. Do kontroli ujemnej należy użyć wody.
  2. Wykonaj metodę, wykonując kroki 2.2-2.4.
    UWAGA: Zestaw starterów RPA-F3 i RPA-R3 jest przeznaczony do amplifikacji krótszego fragmentu 174 par zasad z dodatniego rekombinowanego plazmidu.

4. Przygotowanie próbki pod wpływem światła UV i detekcji LFS

  1. Wyjmij wymaganą liczbę pasków testowych i odpowiednio je oznacz.
  2. Przenieść 10 μl amplifikowanych produktów z etapów 2 i 3 odpowiednio do oddzielnych probówek PCR. Następnie dodaj 40 μl ddH2O do każdej probówki.
    UWAGA: W przypadku korzystania z samodzielnie przygotowanego systemu reakcyjnego zaleca się zbadanie optymalnego stosunku rozcieńczenia.
  3. Wykonaj test.
    1. Poddaj probówkę PCR zawierającą amplifikowane produkty działaniu transiluminatora w celu oceny obecności fluorescencji.
    2. Włóż paski testowe do probówek do PCR końcem podkładki do próbki skierowanym w dół.
    3. Odstaw w temperaturze pokojowej na 5-10 minut, aby odczytać wynik. Po tym czasie upewnij się, że poziom cieczy nie przekracza linii maksymalnej, zanim przejdziesz dalej.
    4. Zinterpretuj wyniki jako ujemne, jeśli linia T nie pokazuje koloru. Zinterpretuj wyniki jako pozytywne, jeśli linia T jest widoczna gołym okiem, co wskazuje, że sonda kwasu nukleinowego została rozszczepiona przez enzym Cas, a enzym Cas został aktywowany. Uznaj, że wynik jest nieprawidłowy, jeśli ani linia C, ani linia T nie mają koloru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu wprowadzamy nową, przenośną platformę diagnostyczną o nazwie A. baumannii-DETECTR, która integruje efektywność amplifikacji izotermicznej systemu RPA i CRISPR-Cas12a w celu szybkiej i niezawodnej identyfikacji terenowej A. baumannii. Schemat testu DETECTR jest zilustrowany na rysunku Rysunek 1.

Dwanaście par podkładów zostało zaprojektowanych przy użyciu narzędzi proj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjne metody diagnostyczne zakażeń A. baumannii mają różne ograniczenia, które sprawiają, że są one mniej dostępne i mniej wykonalne w przypadku badań przyłóżkowych27. Na przykład PCR ma dobrą czułość i specyficzność, ale wymaga specjalistycznego sprzętu do cykli termicznych i złożonych przepływów pracy, które muszą być obsługiwane przez profesjonalistów. Przedstawiona tu nowatorska metoda, która łączy edycję genomu RPA i CRISPR-LbaCas12a z rekombineracją, znana jako test A. baum...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Projekt Planu Rozwoju Nauki i Technologii prowincji Jilin, Chiny (20240305027YY) oraz Departament Finansów Prowincji Jilin (JLSWSRCZX2023-55, JLSWSRCZX2021-041).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
 -20 ° C ZamrażarkaHaierHYCD-290Chiny
Agaroza BasicBioFroxx1110GR100Chiny
Wszystkie oligonukleotydy i crRNA zostały zsyntetyzowane przez firmęwww.comatebio.com
Substrat tnący Cas12a - ssDNA - fluorescencyjny typEZassay Biotech. Co., Ltd.DNA-FAM-BHQChiny
Podłoże do cięcia Cas12a - ssDNA - papier testowy typuEZassay Biotech. Co., Ltd.DNA-FAM-BIOChiny
Aparatura do elektroforezyBIO-RADPOWERUSA
Fluorescencyjny ilościowy instrument do PCRBIO-RADCFX ConnectUSA
System obrazowania żeliBIO-RADGel Doc 2000USA
https://ezassay.com/rna
https://www.ezassay.com/primer  
Pasek papieru z przepływem bocznym (Biotyna/FAM)EZassay Biotech. Co., Ltd.HD-FMBOChiny
LbaCas12a (Cpf1) wzmocnione białkoEZassay Biotech. Co., Ltd.CAS-12E-001Chiny
Transformator LEDLABGICBL-20Chiny
Octan magnezu, MgOAcTwistDxTABAS03KITWielka Brytania
MikrowirówkaallshengMini-6kChiny
Probówki paskowe doPCR Probówki paskowe doPCR PST-0208-FT-CChiny
Inkubator do suchej kąpieli TGradeTechnologia biochemiczna Tiangen OSE-DB-01Chiny
Zestaw DNA bakterii TianampTechnologia biochemiczna Tiangen DP302-02Zestaw
DNA bakterii China TIANamp TIANGEN BIOTECH  (PEKIN) CO.; Ltd.DP302  Chiny 
TransStart  FastPfu  Polimeraza DNA TransGen Biotech. Co., Sp. z o.o.AP221  Chiny 
TwistAmp Basic KitTwistDXTABAS03KITUK
Uniwersalny zestaw do oczyszczania DNATechnologia biochemiczna Tiangen DP214-03Chiny
PAC1000 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenie, D., Alexandr, N., Harald, S. An increasing threat in hospitals: Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nat Rev Microbiol. 5 (12), 939-951 (2007).
  2. Li, P., et al. Rapid detection of Acinetobacter baumannii and molecular epidemiology of carbapenem-resistant A. baumannii in two comprehensive hospitals of Beijing, China. Front Microbiol. 6, 997(2015).
  3. Wu, X., et al. A diagnostic test that uses isothermal amplification and lateral flow detection sdaA can detect tuberculosis in 60 min. J Appl Microbiol. 130 (6), 2102-2110 (2020).
  4. Huang, B., et al. A cas12a-based fluorescent microfluidic system for rapid on-site human papillomavirus diagnostics. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (20), 6287-6297 (2023).
  5. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
  6. Abudayyeh, O. O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), aaf5573(2016).
  7. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), eaar6245(2018).
  8. Xiong, D., et al. Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas12a. PLoS Biol. 18 (12), e3000978(2020).
  9. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with crispr-Cas13a/C2C2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  10. Harrington, L. B., et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science. 362 (6416), 839-842 (2018).
  11. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA. Cell Res. 28 (4), 491-493 (2018).
  12. Wang, B., et al. Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic acid detection. Anal Chem. 91 (19), 12156-12161 (2019).
  13. Huang, Z., et al. Ultra-sensitive and high-throughput crispr-p owered COVID-19 diagnosis. Biosens Bioelectron. 164, 112316(2020).
  14. Zhang, W. S., et al. Reverse transcription recombinase polymerase amplification coupled with CRISPR-Cas12a for facile and highly sensitive colorimetric SARS-CoV-2 detection. Anal Chem. 93 (8), 4126-4133 (2021).
  15. Marraffini Luciano, A. CRISPR-Cas immunity in prokaryotes. Nature. 526 (7571), 55-61 (2015).
  16. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), aad5147(2016).
  17. Makarova, K. S., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. 13 (11), 722-736 (2015).
  18. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discovery. 4 (1), 20(2018).
  19. Li, L., Li, S., Wu, N., Wu, J., Wang, J. Holmesv2: A CRISPR-Cas12b-assisted platform for nucleic acid detection and DNA methylation quantitation. ACS Synth Biol. 8 (10), 2228-2237 (2019).
  20. Liang, M., Li, Z., Wang, W., Liu, J., Zhang, L. X. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nat Communications. 10 (1), 3672(2019).
  21. Aquino-Jarquin, G. CRISPR-Cas14 is now part of the artillery for gene editing and molecular diagnostic. Nanomedicine. 18, 428-431 (2019).
  22. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  23. Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  24. Swarts, D. C., John, V. D. O., Jinek, M. Structural basis for guide RNA processing and seed-dependent DNA targeting by CRISPR-Cas12a. Mol Cell. 66 (2), 221-233 (2017).
  25. Jiang, Y., et al. CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum. Nat Commun. 8, 15179(2017).
  26. Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted recombineering in bacteria. Appl Environ Microbiol. 83 (17), e00947-e01017 (2017).
  27. Ashraf, A., et al. A novel multiplex pcr assay for simultaneous detection of nine clinically significant bacterial pathogens associated with bovine mastitis. Mol Cell Probes. 33, 57-64 (2017).
  28. Zhu, L., et al. A rapid on-site visualization platform based on RPA coupled with CRISPR-Cas12a for the detection of genetically modified papaya 'huanong no.1'. Talanta. 277, 126437(2024).
  29. Zheng, C., et al. Rapid developments in lateral flow immunoassay for nucleic acid detection. Analyst. 146 (5), 1514-1528 (2021).
  30. Wang, Y., et al. Establishment and clinical application of a RPA-LFS assay for detection of capsulated and non-capsulated Haemophilus influenzae. Front Cell Infect Microbiol. 12, 878813(2022).
  31. Wang, F., et al. Rapid and sensitive recombinase polymerase amplification combined with lateral flow strips for detecting Candida albicans. Anal Biochem. 633, 114428(2021).
  32. Ma, B., et al. A simple and efficient method for potential point-of-care diagnosis of human papillomavirus genotypes: Combination of isothermal recombinase polymerase amplification with lateral flow dipstick and reverse dot blot. Anal Bioanal Chem. 411 (28), 7451-7460 (2019).
  33. Sun, Y., Yu, L., Liu, C., Ye, S., Huang, W. One-tube SARS-CoV-2 detection platform based on RT-RPA and CRISPR/Cas12a. J Transl Med. 19 (1), 74(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Acinetobacter Baumannii DetectionRecombinase Polymerase AmplificationCRISPR Cas12aRapid Pathogen DetectionDNA ExtractionPrimer DesignFluorescence PCRLateral Flow AssaySpecificity EvaluationSensitivity Evaluation

Powiązane artykuły