Artykuł metodologiczny

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67616

⸱

24 stycznia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Streszczenie

Technologia KI, w której pośredniczy CRISPR/Cas9, pozwala na łatwiejsze znakowanie białkami fluorescencyjnymi u danio pręgowanego (Danio rerio), preferowanego organizmu modelowego do obrazowania in vivo ze względu na jego przezroczystość we wczesnej fazie rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół wykonywania wysokowydajnego genu fluorescencji KI, szybkich badań przesiewowych dla założycieli KI oraz śledzenia białek o niskiej liczebności u larw danio pręgowanego, który położy kluczowe podstawy dla późniejszych badań fizjo-patologicznych na danio pręgowanym. Obecny protokół obejmuje kompletne kroki projektowania sgRNA dla genu będącego przedmiotem zainteresowania, transkrypcji sgRNA in vitro, transkrypcji mRNA Cas9 in vitro, badania przesiewowego sgRNA in vivo dla genu o najwyższej wydajności, projektowania i budowy plazmidu dawcy, mikroiniekcji larw danio pręgowanego, badania przesiewowego założyciela KI i obrazowania na żywo danio pręgowanego. Uwzględniono i omówiono krytyczne kroki, wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów, metody kontroli jakości oraz zalety i zastosowania tego protokołu. Protokół ten zapewnia szybkie i dokładne wyniki przy niskich kosztach i został potwierdzony w wielu badaniach.

Wprowadzenie

Jako dobrze przyjęty organizm modelowy, danio pręgowany (Danio rerio) jest szeroko stosowany w badaniach naukowych nad rozwojem, regeneracją, nowotworzeniem nowotworów, infekcjami i odpornością, itd1,2,3,4,5. Danio pręgowany jest szczególnie odpowiedni do obrazowania na żywo in vivo, gdy jest traktowany PTU (1-fenyl 2-tiomocznik), toksycznym związkiem chemicznym, który hamuje melanogenezę i sprawia, że larwy danio pręgowanego są przezroczyste przez stosunkowo długi okres czasu6. Dostępne są również genetycznie modyfikowane przezroczyste szczepy danio pręgowanego, takie jak casper7 i crystal8, co pozwala na wizualizację na żywo i śledzenie linii aż do osiągnięcia dorosłości. Oprócz tych wysiłków mających na celu przezwyciężenie pigmentacji w celu lepszej wizualizacji na żywo u dorosłych ryb, nasze badania koncentrują się również na opracowaniu skutecznych strategii edycji genów, aby fluorescencyjne znakowanie białek było bardziej wydajne i mniej sztuczne.

Technologia KI oparta na mikrohomologii (MMEJ) za pośrednictwem CRISPR/Cas9 jest obecnie szeroko stosowana w modyfikacjach genetycznych w wielu organizmach, w tym u danio pręgowanego, ze względu na jej stosunkowo wysoką skuteczność KI9,10,11,12. Aby obrazowanie in vivo zakończyło się sukcesem, należy zmierzyć się z dwoma wyzwaniami. Jednym z nich są indele lub blizny powstałe w procesie rekombinacji; Drugim jest to, że niektóre geny docelowe ulegają endogenicznej ekspresji na niskim poziomie, co prowadzi do słabych sygnałów koeksprymowanego znacznika fluorescencyjnego i niepowodzenia wykrywania in vivo. Dążąc do wydajnego i dokładnego znakowania białek oraz minimalizacji zakłóceń endogennych poziomów ekspresji genów, w ramach niedawnych prac opisano zoptymalizowaną strategię łączącą metodę znakowania "VH" wzmacniającą sygnał fluorescencyjny i udoskonalony przepływ pracy przesiewowej linii zarodkowej13, która jest bardziej odpowiednia do znakowania fluorescencyjnego genów o niskiej ekspresji i bardziej wydajna niż poprzednie metody poprzez optymalizację szkieletu dawcy i połączenie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i Weryfikacje fluorescencyjne w celu wdrożenia badań przesiewowych linii zarodkowej przy najniższych kosztach czasu i wysiłku. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół krok po kroku dla zgłoszonej metody, w tym etapy przygotowania zarodków i hodowli danio pręgowanego, projektowanie sgRNA, transkrypcję sgRNA in vitro, transkrypcję mRNA Cas9 in vitro, mikroiniekcję zarodka danio pręgowanego, badanie przesiewowe in vivo pod kątem sgRNA o najwyższej wydajności, projektowanie i budowę plazmidu dawcy, genotypowanie danio pręgowanego KI, badanie przesiewowe linii zarodkowej KI oraz obrazowanie i fenotypowanie danio pręgowanego KI. Ten kompleksowy protokół, zapewniający najnowocześniejszą metodę znakowania fluorescencyjnego, bez wątpienia promowałby badania z wykorzystaniem danio pręgowanego w różnych dziedzinach nauki i przyniósłby korzyści czytelnikom z różnych środowisk akademickich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty i hodowla danio pręgowanego zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Zarządzania Zwierzętami Laboratoryjnymi i Etyki Uniwersytetu Xiamen i były ściśle zgodne z dobrymi praktykami dla zwierząt, określonymi przez Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Xiamen. Badanie było zgodne ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt.

UWAGA: Wszystkie dorosłe i larwy danio pręgowanego były utrzymywane zgodnie ze standardowymi protokołami w temperaturze 28,5 °C z 13/11 godzinnym cyklem światła/ciemności w systemie akwariów danio pręgowanego Uniwersytetu Xiamen. Zarodki utrzymywano w buforze zarodkowym (tab. 1) w kontrolowanym inkubatorze (temperatura, 28 ± 0,5 °C; światło, 13 godzin światła/11 godzin cyklu ciemnego). Dokarmianie i ogólny monitoring wszystkich danio pręgowanego prowadzono dwa razy dziennie (o godz. 9 i 16). Szczepem typu dzikiego (WT) użytym w tych badaniach była Tybinga (Tü).

1. Wybór interesujących genów i projektowanie przewodnika RNA

  1. Poznaj informacje o genie, który Cię interesuje. Przeszukaj bazę danych (https://zfin.org/) i upewnij się, że znana jest liczba wariantów genów. Zdecyduj, którym wariantem chcesz manipulować i pobierz informacje o genach docelowych z Ensembl (https://www.ensembl.org/), w tym sekwencję genomu, sekwencję cDNA i sekwencję kodującą (CDS). Zaznacz w sekwencjach eksony, introny, UTR-y, kodony start i kodony stop.
  2. Wybierz nie więcej niż 200 pz CDS przed kodonem stop (TAA, TAG lub TGA) docelowego genu jako region docelowy sgRNA.
    UWAGA: Lepiej jest upewnić się, że ten region nie ma polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) poprzez sekwencjonowanie DNA.
  3. Skorzystaj ze strony internetowej CRISPRscan (https://www.crisprscan.org/), aby zaprojektować potencjalne sgRNA w wybranym regionie docelowym i przewidzieć wydajność sgRNA.
    1. Wprowadź sekwencję DNA do ramki projektu.
    2. Wybierz odpowiednie informacje, w tym gatunki, maksymalne niedopasowania w niedocelowych parametrach, endonukleazę i promotor. W takim przypadku wybierz Danio pręgowany - Danio rerio, Brak niezgodności, Cas9-NGG i promotor in vitro T7.
    3. Kliknij Pobierz sgRNAs, aby uzyskać niektóre sgRNA. Wybierz 5-7 sgRNA z wysokim wynikiem skanowania CRISPR i niskim wynikiem poza celem dla badania przesiewowego in vivo.
  4. Zaprojektuj startery PCR flankujące miejsca docelowe sgRNA, których produkt wynosi około 500 pz, do późniejszej amplifikacji PCR, testu trawienia enzymatycznego i sekwencjonowania w celu sprawdzenia skuteczności nokautu po mikroiniekcji sgRNA/Cas9. Wybierz sekwencję około 20 pz w obszarach górnych i dolnych i upewnij się, że jej zawartość GC wynosi około 50%, a wartość Tm mieści się w zakresie 50-55°C.
    UWAGA: Zaprojektuj dwa podkłady przed i dwa startery za podkładem, jeśli istnieje potrzeba wykonania kombinacji.

2. Przygotowanie sgRNA

UWAGA: Wspólna sekwencja rusztowania sgRNA (Rysunek 1) została sklonowana do plazmidu (Tabela Materiałów).

  1. PCR amplifikuje sekwencję sprzężoną promotor-sgRNA T7 za pomocą starterów i mieszaniny PCR pokazanych odpowiednio w tabeli 2 i tabeli 3. Uruchom program PCR w Tabeli 4. Uruchom elektroforezę żelową (żel agarozowy, 1,2% agarozy w buforze TAE; bufor TAE [Tabela 1]; 200 V; około 5 minut) z 2 μl produktów PCR, aby upewnić się, że produkty są prawidłowe (MW wynosi około 150 pz).
  2. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania (tabela materiałów) lub innych dostępnych w handlu zestawów zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Od teraz należy stosować odczynniki i materiały wolne od RNaz, a procedury powinny być przeprowadzane ze szczególną ostrożnością, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą (patrz Dyskusja).
    1. Dodaj bufor wiążący do produktów PCR w stosunku objętościowym 5:1 i wymieszaj. Nanieść mieszaninę na kolumnę umieszczoną w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Odwirować przy 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze 25 °C. Odrzucić przepływowy płyn i umieścić kolumnę z powrotem w tej samej probówce zbiorczej.
    2. Dodać 750 μl buforu do przemywania do kolumny i odwirować w temperaturze 17 900 × g przez 1 minutę w temperaturze 25 °C. Odrzucić przepływowy płyn i umieścić kolumnę z powrotem w tej samej probówce zbiorczej. Odwirować w temperaturze 17 900 × g przez 2 minuty w temperaturze 25 °C. Umieścić kolumnę w czystej probówce o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodać 20 μl wody wolnej od nukleaz do kolumny, odwirować przy 17 900 × g przez 2 minuty w temperaturze 25 °C, w celu elucji DNA i zmierzyć stężenie za pomocą spektrofotometru.
  3. Użyj systemu produkcji RNA T7 w tabeli materiałów lub równoważnych zestawów, aby dokonać transkrypcji in vitro 250 ng oczyszczonego DNA. Wymagane są operacje i warunki wolne od RNaz.
    1. Przygotować reakcję w probówkach do PCR (wolnych od RNaz) zgodnie z tabelą 3 i delikatnie wymieszać. Inkubować w temperaturze 37 °C w metalowej łaźni przez 2 godziny.
    2. Dodać 0,5 μl DNazy I (bez RNaz) i delikatnie wymieszać. Inkubować w temperaturze 37 °C w metalowej łaźni przez 15-20 minut.
    3. Wytrącanie etanolu
      1. Dodaj wodę wolną od RNaz do każdej reakcji, aby końcowa objętość osiągnęła 20 μl, i przenieś próbki do probówek o pojemności 1,5 ml.
      2. Dodać 50 μl 100% etanolu (2,5 V, bez RNaz), dobrze wymieszać, umieścić mieszaninę na lodzie na 10 minut i odwirować w temperaturze 21 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
      3. Odrzucić supernatant, przemyć osad 500 μl 75% etanolu (bez RNaz) i odwirować przy 21 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Odrzucić supernatant, wysuszyć osad w temperaturze 45 °C w kąpieli metalowej i rozpuścić w 40 μl wody wolnej od RNaz.
        UWAGA: W przypadku KI, sgRNA muszą być wytrącone przez LiCl (patrz poniżej), ale w przypadku KO nie jest to konieczne.
    4. Uruchom żele agarozowe (Żel agarozowy: 1,2% agarozy w buforze TAE; bufor TAE [Tabela 1]; 200 V; około 5 min) z 1-2 μl RNA w celu oszacowania jakości, a następnie zmierzenia stężenia za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: sgRNA mogą być przechowywane w temperaturze -20 °Cor -80 °C do dalszego wykorzystania.

3. Przygotowanie mRNA Cas9

  1. Przeprowadzić trawienie enzymatyczne plazmidu Cas9 (tabela materiałów) przez ponad 1,5 godziny przy użyciu XbaI zgodnie z instrukcjami producenta (mieszanina reakcyjna, patrz tabela 3). Test metodą elektroforezy żelowej (żel agarozowy: 1,2% agarozy w buforze TAE; bufor TAE [Tabela 1]; 200 V; około 10 min) z 1 μl, aby sprawdzić, czy trawienie jest dokładne.
  2. Oczyść produkty w taki sam sposób, jak produkty sgRNA PCR (kroki 2.2.1-2.2.3). Od tego momentu wymagane są materiały i operacje wolne od RNaz.
  3. Użyj zestawu do transkrypcji T3 (tabela materiałów) lub równoważnych zestawów do transkrypcji mRNA Cas9 in vitro.
    1. Przygotować reakcję w probówkach PCR bez RNaz zgodnie z tabelą 3 i delikatnie wymieszać. Inkubować w temperaturze 37 °C przez ponad 2,5 godziny.
    2. Dodać 1 μl Turbo DNazy wolnej od RNaz i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15-20 minut.
    3. Opady LiCl
      1. Przenieść próbki do probówek o pojemności 1,5 ml, dodać 30 μl LiCl (1,5 V) i delikatnie wymieszać.
      2. Umieścić mieszaninę w temperaturze -20 °C na około 30 minut, a następnie odwirować w temperaturze 21 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      3. Odrzucić sklarowany sklarat nad osadem, przepłukać granulki 500 μl 75% etanolu (bez RNaz) i odwirować przy 21 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Odrzucić sklarowany osad, wysuszyć osad w temperaturze 45 °C i rozpuścić go w 40 μl wody wolnej od RNaz.
  4. Zmierz stężenie mRNA Cas9 za pomocą spektrofotometru. Uruchom żele agarozowe (Żel agarozowy: 1,2% agarozy w buforze TAE; bufor TAE [Tabela 1]; 200 V; około 10 min) z 1-2 μL RNA w celu sprawdzenia stężenia i jakości.
    UWAGA: OD 260/280 powinien wynosić powyżej 2,0, a stężenie powinno być około lub wyższe niż 1000 ng / μL. mRNA Cas9 może być przechowywane w temperaturze -20 °Cor -80 °C do dalszego wykorzystania.

4. Przygotowanie do mikroiniekcji

  1. Przygotuj danio pręgowanego: W noc przed mikrowstrzyknięciem umieść zdrową samicę danio pręgowanego i dwa zdrowe samce danio pręgowanego w zbiorniku godowym, używając przegrody do oddzielenia samców i samic, aby przygotować je do krycia.
  2. Przygotować 4% agarozę, bufor do lizy i bufor do zarodków (pH 8,0) (Tabela 1).
  3. Przygotuj szklane igły kapilarne do mikroiniekcji (Tabela Materiałów).
  4. Przygotuj płytki do mikroiniekcji: Wlej 35 ml stopionej 4% agarozy do 10 cm szalki Petriego i delikatnie połóż plastikową formę, aby utworzyć korytka w kształcie klina. Unikaj pęcherzyków powietrza, delikatnie stukając w formę. Po zestaleniu się dodaj do niego trochę podwójnie destylowanej wody (ddw) i umieść płytkę w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.

5. test wydajności sgRNA za pomocą mikroiniekcji

  1. W dniu wykonania mikroiniekcji należy przygotować mieszaninę do mikroiniekcji zgodnie z tabelą 5 na lodzie w środowisku wolnym od RNaz.
  2. Załadować roztwór do mikroiniekcji do igły za pomocą końcówki pipety niezawierającej RNaz (tabela materiałów). Uważaj, aby nie przynieść bąbelków.
  3. Umieść załadowaną igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikroiniektora. Przeciąć końcówkę igły iniekcyjnej pod mikroskopem za pomocą spiczastej pęsety, delikatnie ściskając końcówkę igły, aby ją złamać. Następnie należy dostosować ciśnienie wstrzykiwania, aż igła będzie konsekwentnie wyrzucać kroplę o pojemności 1 nl, którą określa się ilościowo za pomocą mikrometru stopniowego i kapilary.
  4. Usuń przegrodę i pozwól rybie rozmnażać się przez około 6 minut. Zbierz i przenieś zarodki w stadium 1-komórkowym na szalkę Petriego zawierającą bufor zarodka.
    1. Zbadaj stan zdrowia zarodków pod mikroskopem świetlnym i usuń wszelkie niezapłodnione jaja lub zanieczyszczenia. Odłożyć 20 zdrowych zarodków jako niewstrzyknięte grupy kontrolne na osobnej szalce Petriego i oznaczyć etykietą.
  5. Przenieś i delikatnie ułóż zdrowe zarodki w stadium 1-komórkowym na rowkach płytki do mikroiniekcji ogrzanej do temperatury pokojowej (RT) za pomocą małej szczoteczki. Usuń nadmiar bufora.
  6. Wszystkie kolejne operacje należy wykonywać pod mikroskopem stereoskopowym. Użyj końcówki igły, aby delikatnie wyregulować położenie zarodka tak, aby kij zwierzęcia był skierowany w stronę igły. Wstrzyknąć 1 nl zmieszanego roztworu do tyczki zwierzęcej.
  7. W przybliżeniu wystarczy wstrzyknięcie 100 zarodków na jedno sgRNA. Po wstrzyknięciu delikatnie wypłukać zarodki na sześciodołkową płytkę z buforem do zarodków. Umieść naczynie w inkubatorze o stałej temperaturze 28,5 °C. Po około 10 godzinach od zapłodnienia (hpf) należy zbadać rozwój zarodka pod mikroskopem stereoskopowym i usunąć martwe zarodki.
  8. W 24 hpf zbierz zarodki w probówkach o pojemności 1,5 ml do genotypowania (3 probówki na sgRNA i 5 zarodków na probówkę). Ostrożnie odlać nadmiar wody za pomocą pipety, dodać 100 μl buforu do lizy zawierającego proteinazę K (o końcowym stężeniu 0,5 mg/ml) do każdej probówki i inkubować w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę, a następnie w temperaturze 95 °C przez 15 minut.
  9. Dodać 200 μl etanolu (2 V), dobrze wymieszać i odwirować przy 19 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Odrzucić supernatant, przemyć osad 500 μl 70% etanolu i odwirować przy 19 000 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  11. Odrzucić sklarowany osad, wysuszyć osad w temperaturze pokojowej i rozpuścić go w 50 μl ddw. Następnie należy użyć 1 μl ekstraktów do przygotowania mieszaniny reakcyjnej do PCR (tabela 3) (dla starterów PCR, patrz krok 1.4).
  12. Uruchom żele agarozowe (Żel agarozowy: 1,2% agarozy w buforze TAE; bufor TAE [Tabela 1]; 200 V; około 10 min) z 2 μl produktów PCR w celu potwierdzenia, że PCR zakończył się sukcesem, a następnie przeprowadzić trawienie enzymatyczne (Tabela 3) w celu określenia skuteczności sgRNA. Delikatnie wymieszaj mieszankę do trawienia enzymatycznego. Inkubować w temperaturze przez okres sugerowany przez producenta.
  13. Uruchom żele agarozowe do trawionych produktów (Żel agarozowy: 1,2% agarozy w buforze TAE; bufor TAE [Tabela 1]; 200 V; około 10 min) z niestrawionymi produktami PCR jako kontrolą w celu potwierdzenia, czy zachodzi trawienie.
    UWAGA: Miejsce rozszczepienia Cas9 znajduje się około 3 pz przed PAM, więc miejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego jest najlepsze do pokrycia 6 pz przed PAM. Jeśli wydajność sgRNA jest wysoka, cięcie i błędna naprawa doprowadzą do powstania indeli, więc istnieje duże prawdopodobieństwo, że enzym restrykcyjny nie będzie już w stanie rozpoznać miejsca cięcia. Jeśli sgRNA jest nieefektywne, a miejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego jest nienaruszone, trawienie enzymatyczne może przebiegać normalnie. Dzięki elektroforezie w żelu agarozowym można stwierdzić, czy doszło do trawienia enzymatycznego.
  14. Jeśli nie ma odpowiedniego miejsca rozpoznawania enzymu restrykcyjnego, zsekwencjonuj produkty PCR i przeanalizuj wydajność sgRNA za pomocą TIDE (https://tide.nki.nl/). Pamiętaj, aby wykonać PCR, a także sekwencjonować genomowe DNA WT jako kontrolę.
    1. Otwórz stronę internetową i kliknij Start TIDE. Wprowadź sekwencję prowadzącą sgRNA w ramce w sekcji Sekwencja prowadząca.
    2. Kliknij przycisk Browse (Przeglądaj) w obszarze Chromatogram próbki kontrolnej (.ab1 lub .scf), aby wprowadzić wynik sekwencjonowania dla kontrolki WT, a następnie kliknij przycisk Browse (Przeglądaj) w obszarze Chromatogram próbki testowej (.ab1 lub .scf), aby wprowadzić wynik sekwencjonowania dla edytowanej próbki.
    3. Kliknij przycisk Aktualizuj widok. Witryna poda procent różnicy między dwiema sekwencjami. Większy odsetek wskazuje na wyższą wydajność sgRNA. SgRNA o skuteczności nokautu powyżej 80% nadaje się do kolejnych procedur KI.

6. Budowa plazmidu dawcy do fluorescencyjnego znakowania białek

  1. Zaprojektuj sekwencje, które najpierw zostałyby sklonowane do plazmidu, a następnie wstawione do genomu ryby, jako Rysunek 2: sekwencja 25 pz przed przewidywanym miejscem cięcia Cas9 jest zaprojektowana jako lewe ramię homologii, a sekwencja 25 pz za przewidywanym miejscem rozszczepienia Cas9 to prawe ramię homologii. Wprowadź CDS między miejsce docelowe sgRNA a kodon stop do dawcy, aby zachować integralność endogennego genu.
    UWAGA: 5' uzupełnionego CDS (pierwiastek 4 w Rysunek 2) musi być synonimicznie zmutowany, aby uniknąć wtórnego rozszczepienia rekombinowanego genomu przez kompleks sgRNA / Cas9.
  2. Użyj klonowania niezależnego od ligacji (LIC)14 przy użyciu egzonukleazy III (Tabela materiałów) do budowy plazmidu dawcy. Inne metody, takie jak montaż Gibsona, są również wykonalne. Elementarze do klonowania są zilustrowane w Rysunek 2. Pierwiastki "1", "2", "3" i "4" są przenoszone przez startery:
    1. Design Primer F1, który składa się z nakładającej się sekwencji z wektorem, elementem "1" i częścią elementu "2".
    2. Design Primer R2, który składa się z części elementu "1", elementu "2" i elementu "3".
    3. Zaprojektuj Primer F2, który składa się z pierwiastków "3", "4" i sekwencji 5' CDS podążającej za miejscem docelowym sgRNA.
    4. Zaprojektuj Primer R1, który składa się z sekwencji 3' CDS genu i sekwencji nakładającej się na wektor.
    5. Użyj cDNA danio pręgowanego jako matrycy i wykonaj PCR za pomocą starterów.
      UWAGA: Zalecane zachodzenie na siebie między starterami lub między starterem a wektorem to 15-20 pz. Te startery są specyficzne dla genu docelowego, a przykład starterów dla cx39.9 i cx44.1 podano w tabeli 2. Ten projekt został pomyślnie zastosowany zgodnie z wcześniejszym opisem13. Szczegółowe mapy plazmidowe znajdują się w Pliku Uzupełniającym 1 i Pliku Uzupełniającym 2. Zaprojektowane sekwencje DNA i białek cx39.9 i cx44.1 znajdują się w pliku uzupełniającym 3.
    6. Oczyść produkty PCR w taki sam sposób, jak produkty sgRNA PCR (kroki 2.2.1-2.2.3).
  3. Trawić wektor dawcy (Rysunek 3 i Tabela 6) za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych. W tym przykładzie enzymami są PciI i Acc65I (tabela materiałów). Postępowanie należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami producenta (tabela 3). Oczyść strawiony wektor donorowy w taki sam sposób, jak produkty sgRNA PCR (kroki 2.2.1-2.2.3).
  4. Oznacz ilościowo oczyszczone fragmenty PCR i strawiony wektor donorowy za pomocą elektroforezy żelu DNA (żel DNA: 1,2% agaroza w buforze TAE; bufor TAE [Tabela 1]; 200 V; ok. 10 min). Przygotować mieszaninę reakcyjną dla LIC zgodnie z tabelą 3.
    UWAGA: Wszystkie probówki i składniki reakcji należy umieścić na lodzie, a reakcję i wszystkie manipulacje należy wykonywać na lodzie. Dodaj 1 μl Exo III (20 jednostek) do reakcji jako ostatni składnik, a następnie natychmiast pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać wszystkie składniki. Należy pamiętać o dołączeniu jednej mieszaniny reakcyjnej bez fragmentów PCR jako kontroli, aby pokazać potencjał samoczynnego wyżarzania strawionego wektora.
  5. Natychmiast umieścić mieszaninę reakcyjną na lodzie i inkubować przez 60 minut.
  6. Dodać 1 μl 0,5 M EDTA (pH 8,0) w celu zatrzymania reakcji, pipetować w górę i w dół, aby dobrze wymieszać, a następnie inkubować w temperaturze 60 °C przez 5 minut, a następnie na lodzie przez 5 minut.
  7. Przekształć kompetentne komórki, takie jak DH5α, za pomocą produktów LIC i hoduj bakterie na płytkach LB (tabela materiałów i tabela 1) za pomocą odpowiednich antybiotyków (w tym przypadku ampicyliny) przez 16 godzin.
  8. Upewnij się, że istnieją rzędy wielkości różnic między liczbą kolonii na płytkach zawierających fragmenty PCR a liczbą kolonii na płytce kontrolnej. Wybierz pojedyncze kolonie z płytek LIC do analizy trawienia enzymatycznego i sekwencjonowania DNA.
  9. Ekstrahuj i oczyść prawidłowe plazmidy dawcy za pomocą zestawu do oczyszczania w taki sam sposób, jak produkty sgRNA PCR (kroki 2.2.1-2.2.3). Upewnij się, że końcowe stężenie przekracza 300 ng/μl.

7. Mikroiniekcja zarodków danio pręgowanego dla genu KI

  1. Wykonać wszystkie czynności związane z mikroiniekcjami opisane powyżej, z wyjątkiem przygotowania roztworu do mikroiniekcji zgodnie z tabelą 7.

8. Badania przesiewowe i identyfikacja potomstwa znakowanego białkiem fluorescencyjnym

  1. Obserwuj fluorescencję pod mikroskopem stereofluorescencyjnym 12-48 godzin po mikroiniekcji.
  2. Zastosuj nowo utworzoną metodę screen13. Jeśli zaobserwujesz wyraźną fluorescencję, wybierz fluorescencyjne larwy i hoduj je. Jeśli zaobserwuje się tylko ślad fluorescencji lub nawet brak fluorescencji, należy wyhodować wszystkie wstrzyknięte larwy.
  3. W wieku 1 miesiąca znieczulić danio pręgowanego z mikrowstrzyknięciem 0,02% trikainy (Tabela 1). Dla każdego danio pręgowanego należy zebrać mały kawałek płetwy ogonowej do oznakowanej probówki PCR i przechowywać odpowiednią znieczuloną danio pręgowaną w jednym dołku sześciodołkowej płytki zawierającej przefiltrowaną wodę sterylizowaną promieniami UV (pH 7,2) z tą samą etykietą.
  4. Do ekstrakcji genomowego DNA należy zastosować metodę lizy alkalicznej (bufor do lizy w tabeli 1)15 do ekstrakcji genomowego DNA, a następnie PCR z 5'-złączem. Zaprojektuj przednią spłonkę przed lewym ramieniem homologii i odwrotną starter na wkładce (Rysunek 4). Wielkość produktu PCR wynosi około 500 pz. Przykłady starterów znajdują się w tabeli 2.
    UWAGA: W przypadku fluorescencyjnego danio pręgowanego ten PCR służy do weryfikacji dokładności KI, więc produkt PCR jest następnie poddawany sekwencjonowaniu. W przypadku danio pręgowanego bez fluorescencji ten PCR służy do sprawdzenia, czy występuje KI. Wybierz ryby z dodatnim wynikiem PCR i wychowaj je do dorosłości jako F0.
  5. Zbadaj zarodki F1 uzyskane z krycia przesiewowego F0 z WT pod kątem wzorców ekspresji GFP i genotypowanych przez PCR.
    UWAGA: Jeśli insercja celu występuje w F1 (niezależnie od tego, czy jest idealna, czy nie), odpowiadający jej F0 definiuje się jako dziedziczny F0, którego produkt PCR jest następnie sekwencjonowany. Jeśli wstawienie jest dokładne, odpowiadające mu F0 jest definiowane jako pożądane F0.
  6. Po uzyskaniu pożądanego F0 należy użyć potomstwa do obrazowania, aby obserwować i śledzić docelowe białko.

9. Obrazowanie i przetwarzanie danych

  1. Określ etap rozwoju, który ma zostać zobrazowany. Przygotuj rybę z wyprzedzeniem. Dodać rozcieńczony 1-fenyl-2-tiomocznik (PTU; 0,003%, tabela materiałów) do ryby, aby w razie potrzeby usunąć pigmenty.
    UWAGA: PTU byłby mniej skuteczny, gdyby został zastosowany po 24 hpf. W tym przykładzie PTU dodano do bufora zarodka przed 24 hpf i utrzymywano w buforze do 48 hpf, kiedy larwy danio pręgowanego zostały przetworzone do obrazowania.
  2. Dodaj 2 ml stopionej 4% agarozy (Tabela 1) do naczynia o średnicy 35 mm i odstaw do stężenia. Przenieść rybę do buforu zarodkowego zawierającego 0,02% trikainy (Tabela 1).
  3. Rozcieńczyć 200 μl stopionej 4% agarozy w 1 ml ddw. Przenieś znieczuloną rybę do rozcieńczonej agarozy za pomocą pipety o pojemności 1 ml, gdy agaroza ostygnie. Delikatnie wymieszać i przenieść agarozę do naczynia zawierającego zestalony 4% żel agarozowy przygotowany w kroku 9.2.
  4. Ustaw rybę tak, aby interesująca Cię część znajdowała się na górze.
  5. Do obrazowania i przetwarzania danych należy używać pionowego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Połączenia szczelinowe składające się z białek polimerowych zwanych koneksynami są niezbędne do wymiany metabolitów i jonów o niskiej masie cząsteczkowej między kontaktującymi się komórkami. Opisana powyżej metoda znakowania białek fluorescencyjnych została wykorzystana do oznaczenia odpowiednio koneksyny 39.9 (Figura 5A) i koneksyny 44.1 ( Figura 5B). Poprawność KI została zweryfikowana za pomocą PCR złączy (Rysunek 6). Zgodnie z opublikowanym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby przeprowadzić ten eksperyment sprawnie i skutecznie, należy zwrócić większą uwagę na kilka ważnych aspektów. Optymalnym etapem rozwojowym danio pręgowanego do wstrzyknięcia powinno być stadium jednokomórkowe. Zakończenie iniekcji na tym etapie może zapewnić, że wszystkie komórki wytworzone w wyniku późniejszego podziału zawierają niezbędne składniki dla KI, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo jednoczesnego wystąpienia KI we wszystkich komórkach i poprawiając ogólny wskaźnik powodzenia KI. Obniżenie temperatur...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy deklarują, że nie mają sprzecznych interesów w tym artykule.

Podziękowania

Dziękujemy Lu Zhou (Uniwersytet Xiamen) za korektę i redakcję tego manuskryptu. Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant 82388201 dla J.H.; grant 31801158 dla Y.Z.), National Key R&D Program of China (2020YFA0803500 dla J.H.), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2019-I2M-5-062 dla J.H.), Specjalny Program Centralny dla Lokalnego Rozwoju Nauki i Technologii w prowincji Fujian (2022L3079 dla J.H.), oraz Program Współpracy Dystryktu FuXia-Quan Zi-Chuang (3502ZCQXT2022003 do J.H.). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowywaniu manuskryptów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1000 &mikro; L  końcówkiDowolna markaNie dotyczyDo wszystkich manipulacji
Probówki 1,5 mlDowolna markaNie dotyczy Doprzechowywania i wirowania różnych roztworów
Probówki 1,5 ml (bez RNaz)Dowolna markaNieDo przechowywania i odwirowywania roztworów wolnych od RNaz
10 i mikro; L końcówkiDowolna markaNie dotyczy Dowszystkich manipulacji
10 i mikro; Końcówki L (bez RNaz)Dowolna markaNie dotyczy Domanipulacji bez RNaz
1000 i mikro; L  wskazówki (bez RNaz)Dowolna markaNie dotyczy Domanipulacji bez RNaz
1-fenylo 2-tiomocznik (PTU)SigmaP7629Aby zahamować melanogenezę i utrzymać przezroczystość larw
200 &mikro; L końcówkiDowolna markaNie dotyczy Dowszystkich manipulacji
200 i mikro; Końcówki L (bez RNaz)Dowolna markaNieDo manipulacji bez RNaz
2x Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)VazymeP213-03PCR do testów wydajności sgRNA
Szalki 35 mmCorning430165Do
obrazowania płytek 6-dołkowychDowolna markaNieDo indywidualnego i tymczasowego chowu danio pręgowanego
Acc65INEBR0599SDla trawienie enzymatyczne
Kwas octowySigma 695092Do przygotowania buforu TAE
AgarBiofroxx8211GR500Do płytek LB
Ampicylina, sól sodowaSangonA610028Do płytek LB
CaCl2SigmaC5080Do przygotowania buforu zarodka
Rurki kapilarneAparatHarvarda30-0016Do igieł do wstrzykiwań
Rurki kapilarneDowolnyidentyfikator marki (średnica wewnętrzna) = 0,1 mmDo ilościowego oznaczania kropli 1-nL
CRISPRscan  http://www.crisprscan.org/Do projektu sgRNA
DH5 i alfa;TIANGENCB101Do transformacji
EDTASigmaE6758Do przygotowania buforu do lizy i buforu TAE
Ensembl Ensembl  https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/IndexAby znaleźć informacje o genach
EtanolHUSHI64-17-5Do oczyszczania i ekstrakcji DNA
Egzonukleaza IIITakara2170ALIC
Mikrowtryskiwacz zasilany gazemWarner InstrumentsPLI-100ADo mikroiniekcji
System elektroforezy żelowejWIXWIX-EP3000Do żelu Rękawice do elektroforezy
Dowolna markaNie dotyczy Dowszystkich manipulacji
Glukozasgdbio10010518Do płytek LB
GlicerolSangonA501745Do płytek LB
gRNA-pMD19-TChińskie Centrum Zasobów Zebry (CZRC)CZP3plazmid sgRNA zawierający rusztowanie sgRNA
KClSigmaP5405Dla zarodka przygotowanie buforu
Roztwór do wytrącania chlorku lituThermofisherAM9480Wytrącanie sgRNA, wolne od RNaz
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaA600015 SangonDo przygotowania 4% żeli agarozowych
Siarczan magnezusgdbio20025118Do płyt LB
Wanna metalowaDowolna markaNieDo inkubacji w stałej temperaturze
Błękit metylenowySigmaM9140Do przygotowania bufora zarodków
Forma mikroinekcyjnaDomowej robotyNie dotyczyDo generowania rowków do przechowywania zarodków podczas mikroiniekcji
Mikroładowarka, końcówka do napełniania Femtotips i innych mikrokapilar szklanych, sterylna, 0,5 – 20 µ L, 100 mm, jasnoszary, 192 szt. (2 stojaki i czasy; 96 szt.)Eppendorf5242956003Do ładowania roztworu do mikroiniekcji do igły iniekcyjnej, Ściągacz do mikropipet bez RNaz
Sutter InstrumentP-97Do generowania igieł do
wstrzykiwań MikropipetyEppendorfN/ADo wszystkich manipulacji
Kuchenka mikrofalowaDowolna markaNie dotyczyDo odlewania płytki iniekcyjnej i żeli agarozowych
MinElute PCR Zestaw do oczyszczania (50)QIAGEN28004Do oczyszczania produktów PCR i produktów trawienia, mMESSAGE mMESSAGE T3 bez RNaz
Zestaw do transkrypcjiInvitrogenAM1348Transkrypcja in vitro mRNA Cas9, bez RNaz
N2AnyDomikroiniekcji
NaClSigma S5886Do przygotowania buforu zarodka i buforu do lizy
NaHCO3SigmaS5761Do przygotowania buforu zarodków
NaOHSangonA100173Do przygotowania buforu TAE
Woda wolna od nukleazThermofisherR0581Manipulacje związane z RNA, wolne od RNaz
PciINEBR0655SDo maszyny PCR do trawienia enzymatycznego
Dowolna markaNie dotyczyAmplifikacja PCR
Probówki paskowe PCRDowolna markaNie dotyczy Do
probówek PCR PCRFEITONGKANGBLP-200Do PCR
Szalka PetriegoDowolna markaNie dotyczyDo hodowli larw danio pręgowanego itp.
Czerwień fenolowaSigmaP0290Do mikroiniekcji, bez RNaz
Uchwyt na pipetyWarner InstrumentsPLI-PH1Do mikroiniekcji
PrimeStar (Premix)TakaraDR040ADo klonowania molekularnego
Proteinaza KMerck539480Do ekstrakcji genomowego DNA
pT3TS (T3: zCas9-UTRglobin)Centrum zasobów dla danio pręgowanego w Chinach (CZRC)Szablon plazmiduCZP11
Wirówka z chłodzeniemDowolna markaNie dotyczyDo wirowania związanego z RNA
SkalaSartoriusBCE124-1CCNDo odlewania płytek iniekcyjnych i żeli agarozowych
NożyczkiDowolna markaNie dotyczy Doprzycinania ogonów dorosłych ryb
SDSSangonA600485Do przygotowania
buforu do lizyMałe pędzleDowolna markaNie dotyczy Dodelikatnie poruszających się zarodków na płytkach do mikroiniekcji
SpektrofotometrThermofisherNanoDrop 2000Do pomiarów stężenia DNA/RNA
Mikrometr stolikowyDowolna markaDIV (Podział) = 0,01 mmDo ilościowego oznaczania kropli 1-nL
Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjnyOlympusSZX16Do obserwacji ekspresji genów
Mikroskop stereoskopowyMoticSMZ-168Do obserwacji i mikroiniekcji
T7 RiboMAX Express System produkcji RNA na dużą skalęPromegaP1320Transkrypcja in-vitro sgRNA, bez RNaz
Inkubator z kontrolowaną temperaturąDowolna markaNie dotyczyDo inkubacji zarodków
TIDEhttps://tide.nki.nl/Do analizy wydajności sgRNA 
Metanosulfonian trikainySigmaA5040Do przygotowania roztworu trikainy
TrisSangonA600194Do roztworu trikainy, buforu do lizy i preparatu buforu TAE
TryptonOXOIDLP0042Do płytek LB
PęsetaDowolna markaNieDo cięcia igieł iniekcyjnych
XbaINEBR0145SDo enzymatycznego trawienie
Ekstrakt drożdżowyOXOIDLP0021Do płyt LB
System akwariowy dla danio pręgowanegoESENESEN-AW-S1Do hodowli dorosłych ryb
Zbiorniki godowe danio pręgowanego (z przegrodą)Dowolna markaNie dotyczy Dokrycia ryb
Zeiss LSM 900+Airyscan2ZEISSZeiss LSM900Do obrazowania konfokalnego ryb znakowanych fluorescencyjnie i analizy danych
Strona internetowa ZFINZFINhttp://zfin.org/Aby znaleźć informacje o genach
dotyczy dotyczy dotyczy dotyczy marki Cas9 dotyczy

Bibliografia

  1. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).
  2. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  3. Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis. Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).
  4. Gomes, M. C., Mostowy, S. The case for modeling human infection in zebrafish. Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).
  5. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
  6. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  7. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  8. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Sci Rep. 6, 29490(2016).
  9. He, M. D., et al. Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos. Mutat Res. 780, 86-96 (2015).
  10. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Sci Rep. 5, 8841(2015).
  11. Luo, J. J., et al. CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy. FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).
  12. Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. Elife. 9, e53968(2020).
  13. Liu, J., et al. Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish. Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).
  14. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  15. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282(2014).
  16. Hirata, H., et al. Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish. J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).
  17. Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein. Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).
  18. Urushibata, H., et al. Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
  19. Yu, D., et al. Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking. Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obrazowanie rybek zebrafishCRISPR Knock Inznakowanie gen wmikroiniekcja rybek zebrafishprojektowanie sgRNAkonstrukcja plazmidu donoraobrazowanie ywych rybek zebrafishledzenie bia ek

Powiązane artykuły