Method Article

Ustalenie i porównanie metod wykrywania aktywności T6SS opartych na fluorescencji u Acinetobacter baumannii

DOI:

10.3791/67772

⸱

June 20th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University, 2Department of Respiratory Medicine, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj proponujemy ilościową metodę wykrywania opartą na znakowaniu fluorescencyjnym (zwłaszcza lucyferazy), aby skutecznie i dokładnie ocenić aktywność bakteryjnej T6SS, która jest odpowiednia do wysokoprzepustowej analizy szczepów klinicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System wydzielania typu VI (T6SS) jest kluczowym mechanizmem pośredniczącym w interakcjach międzykomórkowych u bakterii Gram-ujemnych, szczególnie u gatunków chorobotwórczych, takich jak Acinetobacter baumannii. Wcześniejsze badania wykazały, że duży plazmid pAB3 w szczepie A. baumannii ATCC 17978 koduje białko podobne do TetR, które hamuje ekspresję podstawowych genów T6SS. W przeciwieństwie do tego, szczep WTR-, który nie ma pAB3, może stabilnie wyrażać i wydzielać białko efektorowe T6SS Hcp i wykazuje zdolność do zabijania E. coli. Gen tssM, jeden z podstawowych genów T6SS, jest niezbędny do jego aktywności; jego usunięcie bezpośrednio prowadzi do dezaktywacji T6SS. Jednak tradycyjne metody wykrywania aktywności T6SS, takie jak testy uśmiercania, charakteryzują się niską przepustowością i niewystarczającą czułością. Aby zaradzić tym ograniczeniom, opracowaliśmy ilościowe metody wykrywania oparte na znakowaniu fluorescencyjnym.

Aby poprawić wykrywanie aktywności T6SS, opracowaliśmy trzy metody znakowania fluorescencyjnego: (1) Ilościową metodę wykrywania opartą na znakowaniu lucyferazy, która charakteryzuje się wysoką specyficznością, czułością i odtwarzalnością, dzięki czemu nadaje się do analizy o wysokiej przepustowości; (2) Metoda wykrywania oparta na znakowaniu białkiem zielonej fluorescencji (GFP), która, mimo że jest podatna na zakłócenia środowiskowe, ma zaletę w postaci wysokiej przepustowości; (3) Wykrywanie za pomocą cytometrii przepływowej, które może ilościowo ocenić żywotność bakterii, ale jest skomplikowane operacyjnie i kosztowne. Po kompleksowym porównaniu, metoda etykietowania oparta na lucyferazie okazała się najbardziej dokładna, czuła i przyjazna dla użytkownika. Po zastosowaniu do 20 izolatów klinicznych A. baumannii, potwierdzono, że metoda ta szybko i dokładnie ocenia aktywność T6SS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System wydzielania typu VI (T6SS) jest ważnym systemem wydzielania białek u bakterii Gram-ujemnych, szeroko zaangażowanym w konkurencję bakteryjną, antagonizm wobec gospodarzy eukariotycznych i regulację odpowiedzi immunologicznej gospodarza1,2. Poprzez wstrzykiwanie toksycznych białek efektorowych do sąsiednich bakterii lub komórek eukariotycznych, T6SS pomaga bakteriom utrzymać przewagę konkurencyjną w złożonych środowiskach. W ostatnich latach znacząca rola T6SS w zdolności adaptacyjne bakterii, chorobotwórczości i interakcjach mikrobiologicznych sprawiła, że stał się on gorącym punktem badań, zwłaszcza w przypadku patogenów wielolekoopornych, gdzie jego funkcje stanowią potencjalne cele dla rozwoju nowych strategii przeciwbakteryjnych3,4,5.

Acinetobacter baumannii (Ab) to Gram-ujemny patogen oportunistyczny szeroko rozpowszechniony w warunkach szpitalnych. Ze względu na wysoką lekooporność i silne zdolności adaptacyjne stał się ważnym patogenem szpitalnym na całym świecie6,7,8. Przetrwanie A. baumannii w złożonych środowiskach mikrobiologicznych zależy od wielu systemów wydzielania, wśród których T6SS odgrywa kluczową rolę w konkurencji z innymi drobnoustrojami i interakcjach z gospodarzem. Dzięki wysoce konserwatywnemu klastrowi genów T6SS i dobrze zdefiniowanym funkcjom, A. baumannii stał się idealnym modelem do badania mechanizmów T6SS. Co więcej, unikalna konstrukcja T6SS w A. baumannii zapewnia wyjątkową perspektywę do dalszego ujawniania różnorodności i funkcji T6SS.

Klaster genu T6SS A. baumannii zawiera 12 podstawowych genów białkowych (takich jak tssA-tssM, brak tssJ) i kilka genów o nieznanych funkcjach (takich jak tagX, tagN, tagF, itp.)2,9,10. Wśród nich białko współregulowane hemolizyną (Hcp) jest ważnym składnikiem T6SS, a jego wydzielanie jest uważane za cechę charakterystyczną funkcjonalnej T6SS. Badania wykazały, że duży plazmid pAB3 w A. baumannii hamuje ekspresję T6SS poprzez kodowanie białka regulatorowego podobnego do TetR. W przeciwieństwie do tego, szczepy, które utraciły pAB3 (takie jak WTR-) mogą stabilnie wyrażać i wydzielać Hcp, wykazując znaczącą aktywność T6SS 11. Gen tssM jest jednym z podstawowych genów T6SS, a jego delecja bezpośrednio prowadzi do inaktywacji T6SS.

Jednak tradycyjne metody wykrywania aktywności T6SS (takie jak testy zabijania) mają ograniczenia, takie jak niska przepustowość, słaba odtwarzalność i niewystarczająca czułość, co poważnie ogranicza dogłębne badania i powszechne zastosowanie T6SS5. W związku z tym opracowanie wydajnych i dokładnych metod wykrywania aktywności T6SS stało się pilną potrzebą w obecnych badaniach. Badanie to ma na celu ustalenie i porównanie metod wykrywania aktywności T6SS opartych na znakowaniu fluorescencyjnym w celu przezwyciężenia niedociągnięć tradycyjnych metod. Dzięki technologii etykietowania fluorescencyjnego udało nam się osiągnąć ilościowe monitorowanie aktywności T6SS w czasie rzeczywistym, zapewniając bardziej precyzyjne i niezawodne narzędzie do badania interakcji bakteryjnych. Badanie to potwierdziło skuteczność metod znakowania fluorescencyjnego, a poprzez porównanie zalet i wad różnych strategii znakowania fluorescencyjnego zapewniło nowe perspektywy i wsparcie metodologiczne dla przyszłych badań. Nie tylko oferuje nowe środki techniczne do badań nad T6SS, ale także stanowi naukowe podstawy do zrozumienia złożonych mechanizmów interakcji bakteryjnych i opracowania nowych przeciwbakteryjnych strategii terapeutycznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Źródła szczepów i plazmidów

  1. Użyj standardowego szczepu A. baumannii ATCC 17978, E. coli (pZY01) i klinicznego szczepu A. baumannii wyizolowanego z Wydziału Medycyny Laboratoryjnej w Pierwszym Szpitalu Uniwersytetu Jilin.
  2. Użyj plazmidu pZY01-GFP (zawierającego gen oporności na kanamycynę, zdolny do stabilnej ekspresji u A. baumannii), który został zmodyfikowany i zachowany w laboratorium, oraz zakupiony na rynku plazmid pGEN-luxCDABE (zawierający gen oporności na ampicylinę).
  3. Hodowla A. baumannii i E. coli w pożywce Luria-Bertani (LB) lub minimalnej pożywce zawierającej: 50 mM buforu fosforanu potasu (pH 7,4), 15 mM (NH4)2SO4, 2 mMMgSO4, 0,2% (w/v) bursztynian sodu jako jedyne źródło węgla oraz 0,01% (w/v) ekstrakt drożdżowy12. W razie potrzeby dodać antybiotyki w następujących stężeniach: E. coli: ampicylina (100 μg/ml) i kanamycyna (50 μg/ml); A. baumannii: streptomycyna (100 μg/ml).
    UWAGA: E. coli (pZY01) i E. coli (pZY01-GFP) wyrażają oporność na kanamycynę. E. coli (pZY01) nie ma markera fluorescencyjnego, więc w poniższym tekście może być określana jako E. coli.

2. Przygotowanie szczepów bakteryjnych przed eksperymentem

  1. Szczepy bakterii należy pobrać z zamrażarki w temperaturze -80 °C na 2 dni przed eksperymentem. Zaszczepić szczepy bakteryjne na płytkach agarowych LB zawierających odpowiednie antybiotyki. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie komórki zachowują plazmidy na początku eksperymentu.
  2. Wybierz dwie niezależne pojedyncze kolonie każdego szczepu bakteryjnego na 1 dzień przed eksperymentem. Zaszczepić każdą kolonię osobno w dwóch oddzielnych probówkach zawierających 5 ml płynnego podłoża LB. Inkubować kultury przez noc w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 200 obr./min. Użyj tych kultur do kolejnych eksperymentów.
    UWAGA: Zoptymalizuj czas inkubacji w oparciu o tempo wzrostu bakterii, aby zapewnić uzyskanie odpowiedniej ilości biomasy bakteryjnej.

3. Przygotowanie szczepów E. coli (GFP)/ E. coli (Lucyferazy)

  1. przekształcenie
    1. Dodaj 50 ng plazmidowego DNA (pZY01-GFP lub pGEN-luxCDABE, oznaczonego ilościowo za pomocą NanoDrop w A260/A280) do 100 μl komórek E. coli DH5α kompetentnych odpowiednio i delikatnie wymieszaj.
    2. Inkubować na lodzie przez 30 minut, szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 60 s i natychmiast umieścić na lodzie na 30 s.
    3. Dodać 700 μl bulionu LB bez antybiotyków i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 180 obr./min przez 2 godziny.
  2. Posiewanie i hodowla zwierząt
    1. Wirować przy 420 × g przez 2 minuty, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl bulionu LB bez antybiotyków.
    2. Rozprowadzić produkt przemiany pZY01 (GFP) na płytkach agarowych LB zawierających 50 μg/ml kanamycyny.
    3. Rozprowadzić produkt przemiany pGEN-luxCDABE na płytkach agarowych LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  3. Weryfikacja klonów z wynikiem dodatnim
    1. Wybierz pojedyncze kolonie i wyekstrahuj DNA jako matryce reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) następnego dnia. Wykonaj amplifikację PCR i sprawdź za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
    2. Potwierdź dodatnie szczepy i oznacz je jako E. coli (GFP) i E. coli (Lucyferaza).
      UWAGA: Upewnij się, że jakość kompetentnych komórek jest wysoka, aby zapewnić wydajną transformację. Unikaj nadmiernej ilości płynu bakteryjnego podczas posiewu, aby zapobiec zakłóceniom w izolacji pojedynczej kolonii.

4. Western blotting

  1. Przygotowanie próbki
    1. Zebrać kultury bakterii i odwirować (1500 × g, 10 min, 4 °C) w celu oddzielenia osadu komórkowego i supernatantu.
    2. Dodać odpowiednią ilość bufora ładującego zarówno do osadu ogniwa, jak i supernatantu. Gotować w temperaturze 100 °C w metalowej łaźni przez 10 minut. Odwirować (1500 g, 10 min, 4 °C) i zebrać supernatanty jako próbki białka.
    3. Zmierz stężenie białka za pomocą kwasu bicinchoninowego (BCA) lub metody Bradforda i dostosuj do tego samego stężenia.
  2. Elektroforeza w żelu dodecylosiarczanowo-poliakryloamidowym (SDS-PAGE)
    1. Przygotuj żele SDS-PAGE o odpowiednich stężeniach (np. 12% żel separujący, 5% żel do układania)13.
    2. Załaduj 20 μg próbek białka do studzienek żelowych wraz z 1-2 μl wstępnie wybarwionego markera białkowego. Przeprowadzić elektroforezę pod napięciem 100-120 V, aż wskaźnik błękitu bromofenolowego dotrze do dna żelu.
      UWAGA: Bufor do biegania: Tris 25 mM, glicyna 192 mM, SDS 0,1% (w/v), woda destylowana do 1 l.
  3. Transfer (Western Blotting)
    1. Usuń żel ze szklanych płytek i zanurz go w buforze transferowym. Przygotować membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) lub nitrocelulozy (NC), aktywować membranę PVDF metanolem, a następnie zanurzyć ją w buforze transferowym.
      UWAGA: Bufor transferowy: 25 mM Tris, 192 mM glicyna, 20% metanol
    2. Zmontować aparat transferowy w strukturę "warstwową" (bibuła filtracyjna-żel-membrana-bibuła filtracyjna). Przenoszenie pod napięciem 100 V przez 60-90 minut (dostosować czas w zależności od masy cząsteczkowej białka; Białka komórek gospodarza (HCP) mają masę cząsteczkową około 17 kDa).
      UWAGA: Umieść zbiornik transferowy w lodowatej wodzie i dodaj okłady z lodu, aby utrzymać niską temperaturę. Jeśli czas transferu jest długi, wymień okłady z lodu w połowie.
  4. Blokowanie
    1. Po przeniesieniu umieść membranę w 5% odtłuszczonym roztworze blokującym mleko. Blokować w temperaturze pokojowej (RT) na wytrząsarce przez 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 4 °C.
  5. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
    1. Przemyć membranę trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS) zawierającą 0,1% buforu Tween 20 (TBST), za każdym razem po 5 minut. Inkubować błonę z rozcieńczonymi przeciwciałami pierwszorzędowymi (mysie przeciwciało anty-Hcp w rozcieńczeniu 1:1000; przeciwciało przeciwko dehydrogenazie antyizocytrynianowej (ICDH) u myszy w rozcieńczeniu 1:1000) w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  6. Inkubacja przeciwciał wtórnych
    1. Przemyć membranę buforem TBST 3 razy po 5 minut. Inkubować błonę z rozcieńczonym przeciwciałem drugorzędowym (IgG sprzężoną z peroksydazą chrzanową [HRP], rozcieńczenie 1:3000) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  7. wykrywanie
    1. Przemyć membranę buforem TBST 3 razy po 5 minut. Przygotować podłoże chemiluminescencyjne ECL i równomiernie nałożyć je na membranę.
    2. Wykrywaj sygnały za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego i rejestruj obrazy (białko HCP ma masę cząsteczkową około 17 kDa, ICDH jest cytoplazmatycznym enzymem metabolicznym o oczekiwanej masie cząsteczkowej około 45 kDa u A. baumannii).
      UWAGA: ICDH jest ważnym markerem kontroli jakości, który można wykryć tylko we frakcji osadu komórkowego (zawierającej nienaruszone bakterie), a nie we frakcji supernatantu (zawierającej wydzielane białka), wykazując w ten sposób, że podczas przygotowywania próbki nie doszło do lizy komórek. Wydzielanie Hcp (17 kDa) powinno być widoczne tylko w supernatantach ze szczepów aktywnych T6SS.

5. Przygotowanie 96-dołkowych płytek z podłożem agarowym LB

  1. Szybko dodaj autoklawowane, wolne od antybiotyków podłoże agarowe LB, wstępnie podgrzane, do sterylnej 96-dołkowej płytki, 50 μl na studzienkę. Pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę, aby zapewnić całkowite zestalenie podłoża.
  2. Do wykrywania fluorescencji GFP należy używać płytek o czarnych ściankach z przezroczystym dnem.
  3. Używaj światłoodpornych 96-dołkowych płytek do wykrywania fluorescencji lucyferazy, aby uniknąć zakłóceń fluorescencji krzyżowej.
    UWAGA: Unikaj generowania pęcherzyków podczas dodawania pożywki, aby zapewnić jednolitą grubość żelu, co sprzyja optymalnemu kontaktowi i rozwojowi bakterii.

6. Test zabijania A. baumannii

  1. Standardowy test uśmiercania
    1. Hodowla zmutowanych szczepów WTR- i ΔtssM przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem w pożywce LB uzupełnionej 100 μg/ml streptomycyny, oddzielnie hodować E. coli w pożywce LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny w identycznych warunkach.
    2. Umyj kultury bakteryjne dwukrotnie sterylnym PBS i ponownie zawieś je w świeżej, wolnej od antybiotyków pożywce LB. Dostosuj OD600 do 1.0 w celu standaryzacji.
    3. Zmutowane szczepy WTR i ΔtssM należy zmieszać z E. coli w stosunku 1:1.
    4. Umieścić 10 μl mieszaniny zawiesiny bakteryjnej na płytkach agarowych LB bez antybiotyków i inkubować w temperaturze 37 °C przez 6 godzin.
    5. Zeskrobać plamki bakteryjne i ponownie je zawiesić w 1 ml PBS. Wykonaj pięć 10-krotnych rozcieńczeń seryjnych.
    6. Umieścić 10 μl rozcieńczonych zawiesin bakteryjnych na płytkach LB zawierających kanamycynę i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    7. Przeanalizuj zależną od T6SS aktywność przeciwbakteryjną zmutowanych szczepów WTR i ΔtssM przez zliczanie kolonii.
      UWAGA: Zapewnić dokładne wymieszanie zawiesin bakteryjnych, aby uniknąć błędów eksperymentalnych. Należy wykonać co najmniej trzy niezależne powtórzenia dla każdej próby, aby zapewnić wiarygodność danych.
  2. Ilościowe wykrywanie aktywności T6SS za pomocą znakowania lucyferazy
    1. Standaryzacja OD600 mutantów E. coli (Lucyferaza), WTR-, ΔtssM i innych szczepów (np. ATCC 17978, E. coli, Ab#40, Ab#170, Ab#180) do 1,0. Dodać 5 μl zawiesiny bakteryjnej do 96-dołkowej płytki zawierającej agar LB bez antybiotyków. Po wysuszeniu na powietrzu w ciemności zmierz bioluminescencję na bazie lucyferazy, aby zweryfikować specyficzność luminescencji E. coli (Lucyferazy).
    2. Wykonaj 5-krotne seryjne rozcieńczanie E. coli (Lucyferazy). Umieścić 10 μl rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej na 96-dołkowej płytce z agarem LB i pustą płytką 96-dołkową (obie odporne na światło). Zmierz bioluminescencję na bazie lucyferazy, aby ocenić czułość metody wykrywania opartej na lucyferazie i potwierdzić, czy agar LB zakłóca sygnał luminescencji.
    3. Wymieszaj E. coli (lucyferazę) z mutantami WTR-, ΔtssM i 20 szczepami klinicznymi (OD600 standaryzowany na 1,0) w stosunku 1:1. Rozcieńczyć 10-krotnie, dodać 5 μl do płytki 96-dołkowej i ustawić trzy kontrpróby techniczne.
    4. Po wysuszeniu na powietrzu w ciemności zmierz bioluminescencję. Inkubować w temperaturze 37 °C w ciemności przez 4-6 godzin, a następnie ponownie zmierzyć bioluminescencję (długość fali emisji: 562 nm).
    5. Ilościowa ocena aktywności przeciwbakteryjnej zależnej od T6SS, porównując wartości bioluminescencji przed i po wspólnej hodowli.
      UWAGA: Zapewnić dokładne wymieszanie zawiesin bakteryjnych, aby uniknąć błędów eksperymentalnych. Należy wykonać co najmniej trzy niezależne powtórzenia dla każdej próby, aby zapewnić wiarygodność danych. Użyj testu t-Studenta do analizy statystycznej.
  3. Wykrywanie aktywności T6SS za pomocą etykietowania GFP
    1. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co w eksperymencie znakowania lucyferazy (długość fali wzbudzenia: 480 nm, długość fali emisji: 509 nm).
    2. Wymieszać E. coli (GFP) z mutantami WTR i ΔtssM (OD600 standaryzowany na 1,0) w stosunku 1:1. Umieść 10 μl na płytkach agarowych LB bez antybiotyków. Po wysuszeniu powietrzem w RT wykonać obrazy za pomocą kanału fluorescencyjnego GFP (program Alex488, wzbudzenie: 488 nm, emisja: 509 nm) wielofunkcyjnego systemu obrazowania.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C w ciemności przez 4-6 godzin, a następnie ponownie uchwycić obrazy. Oceń aktywność T6SS na podstawie zmian intensywności fluorescencji plam bakteryjnych.
      UWAGA: Wykonuj wszystkie kroki w ciemności, aby uniknąć zakłóceń sygnałów fluorescencyjnych. Zapewnić dokładne wymieszanie zawiesin bakteryjnych, aby uniknąć błędów eksperymentalnych. Należy wykonać co najmniej trzy niezależne powtórzenia dla każdej próby, aby zapewnić wiarygodność danych.
  4. Detekcja cytometrii przepływowej
    1. Zmieszać WTR- z E. coli (GFP) i mutantyΔ tssM z E. coli (GFP) w stosunku 1:1. Pobrać odpowiednią ilość mieszaniny zawiesiny bakteryjnej i rozcieńczyć ją do odpowiedniego stężenia (zwykle OD600 0,1-0,5) przy użyciu sterylnego PBS lub 1× buforu.
      UWAGA: Bufor 1× odnosi się do buforu barwiącego do cytometrii przepływowej (1×), składniki obejmują: 1× PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4), uzupełniony o: 2-5% (v/v) inaktywowany termicznie FBS (lub 1% BSA jako alternatywa), 2 mM EDTA.
    2. Odwirować rozcieńczoną mieszaninę zawiesiny bakteryjnej o sile 300 x g przez 2 minuty i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml sterylnego PBS lub 1× buforu i delikatnie wymieszać. Przefiltruj ponownie zawieszony roztwór przez sitko o wielkości 35 μm, aby usunąć agregaty i zapewnić zawiesinę jednokomórkową.
    3. Włącz cytometr przepływowy, rozgrzej laser i skalibruj przyrząd.
      1. Ustaw parametry wykrywania: użyj lasera o długości fali 488 nm, aby wzbudzić GFP. Kanał detekcji: FL1 (zwykle filtr 530/30 nm do wykrywania fluorescencji GFP). Ustaw parametry rozpraszania do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC), aby rozróżnić komórki bakteryjne.
      2. Użyj nieznakowanej E. coli jako kontroli negatywnej, dostosuj napięcie i wzmocnienie oraz upewnij się, że populacja GFP-ujemna znajduje się na linii podstawowej sygnału fluorescencji.
    4. Delikatnie wymieszać przefiltrowaną próbkę i przenieść 100 μl do probówki do cytometrii przepływowej.
      1. Analizuj próbki przy użyciu następujących ustawień urządzenia: Ustaw próg FSC-H na 19 000, aby wykluczyć zanieczyszczenia, z wartościami wzmocnienia 100 (FSC), 110 (SSC) i 80 (FITC).
      2. W przypadku bramkowania należy najpierw wykluczyć szczątki i sygnały niebędące celem na wykresie punktowym FSC-A vs. SSC-A, a następnie przeprowadzić analizę populacji w kanale FITC. Pozyskanie co najmniej 10 000 zdarzeń z populacji docelowej (zdefiniowanej przez charakterystykę FSC/SSC) dla każdej próby.
    5. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej (np. FlowJo, BD FACSDiva).
      1. Wykreśl wykresy punktowe FSC i SSC, aby przebramować docelową populację bakterii. Wykreśl histogramy fluorescencji FL1 w celu rozróżnienia populacji GFP-dodatnich i GFP-ujemnych.
      2. Obliczyć procent komórek GFP-dodatnich i średnią intensywność fluorescencji (MFI).
    6. Pozostałą mieszaninę zawiesiny bakteryjnej o stężeniu 300 g odwirować przez 2 minuty i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 10 μl sterylnej wody i umieścić go na płytkach agarowych LB bez antybiotyków.
    7. Inkubować w temperaturze 37 °C w ciemności przez 5 godzin, a następnie zeskrobać plamki bakteryjne i ponownie zawiesić je w 500 μl 1× PBS. Pobrać 100 μl zawieszonego roztworu, odpowiednio rozcieńczyć i przeprowadzić wykrywanie metodą cytometrii przepływowej, powtarzając kroki 6.4.4-6.4.5.
    8. Porównaj procent komórek GFP-dodatnich i intensywność fluorescencji przed i po kohodowli. Oceń efekt zabijania mutantów WTR- i ΔtssM na E. coli (GFP).
      UWAGA: Upewnij się, że zawiesina jest pojedyncza komórka, aby uniknąć wpływu agregacji komórek na wyniki wykrywania. Skalibruj przyrząd przed wykryciem, aby zapewnić dokładność i odtwarzalność sygnałów fluorescencyjnych. Unikaj wystawiania próbek na działanie silnego światła podczas eksperymentu, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji GFP. Wykonaj co najmniej trzy powtórzenia dla każdej próbki, aby zapewnić wiarygodność danych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjne metody wykrywania aktywności T6SS zazwyczaj polegają na wspólnej hodowli szczepów drapieżników i docelowych na wolnych od antybiotyków płytkach agarowych LB przez 5 godzin, a następnie na skrobaniu plam bakteryjnych, ponownym ich zawieszaniu i przeprowadzaniu seryjnych rozcieńczeń. Rozcieńczona zawiesina bakteryjna jest następnie nakrapiana na selektywne płytki agarowe. Zliczając kolonie szczepu docelowego na płytkach następnego dnia, można jakościowo ocenić aktywność T6SS. Metoda ta ma jednak ograniczenia, w ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System wydzielania typu VI (T6SS) jest złożoną maszynerią wielobiałkową, której funkcje są realizowane przede wszystkim poprzez wydzielanie białek efektorowych. Te białka efektorowe pośredniczą w konkurencji międzybakteryjnej poprzez zabijanie lub hamowanie innych gatunków bakterii, zapewniając w ten sposób bakterii gospodarza przewagę konkurencyjną w zbiorowiskach drobnoustrojów15. Poza rolą w konkurencji, badania wykazały, że T6SS bierze udział w różnych procesach komórkowych, w tym kolonizacji ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy i dziękujemy wszystkim autorom, jak również całemu laboratorium, za pomoc w zakresie wsparcia technicznego i recenzji manuskryptu. Prace te były wspierane przez Projekt Bethune Uniwersytetu Jilin 2024B20 oraz Projekt Rozwoju Nauki i Technologii Miasta Changchun 23YQ10 oraz Niezakaźne Choroby Przewlekłe - Narodowy Projekt Nauki i Technologii 2024ZD0529700.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10%, 15% SDS-PAGE Zestaw do przygotowania żeluEpizymePG112-20
° C ZamrażarkaHaierHYCD-290
37 ° C InkubatorBluepard181254254
4 ° C LodówkaHaierHYC390-80
° C ZamrażarkaHaierDW-86L726G(726L)
Płytka 96-dołkowaJETTCP010096
AgarBiofrox8211KG001
Nadsiarczan amonu (APS)Thermo7727-54-0
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoESCOAC2-4S1 
Waga elektronicznaSartorius AGBSA124S-CW
Aparatura do elektroforezyBIO-RADPOWER POWER
Wytwornica lodu płatkowegoCytometrXB70
BECKMAN COULTERAW38143
Bufor do barwienia cytometrii przepływowejżelowego Proteintech
BIO-RADGel Doc 2000
GlicynaZikeZK-L2577
Wirówka szybkoobrotowaEppendorf5405IN106358
Przeciwciało wtórne królika/myszy sprzężone z HRPproteintechSA00001-2
LBBulion SolarbioL8291
Wirówka wysokotemperaturowaThermo17R
MethanolThermoR40121
Spektrofotometr Micro UV-VisThermoNanodrop jedna
mikrowirówkaallshengMini-6k
Czytnik mikropłytekBio-TekH1M
NuPAGE LDS Bufor do próbekThermoNP0007
Bufor fosforanowy (PBS)ZikeZK-L1649
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610374
SDS Bufor do ładowania próbkiBeyotimepoo15L
Odtłuszczone mleko w proszkuThermoLP0033B
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Zikezk6885
Termostatyczna kąpiel wodnaJingHongDK-420S
Aparatura transferowaBio-RadPowerPac HC
Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)ZikeZK-L2557
Pionowa aparatura do elektroforezyBio-RadMii-PROTEAN Tetra
PAC1000 przepływowy GRANT System obrazowania PF00018

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapitein, N., Mogk, A. Type VI secretion system helps find a niche. Cell Host Microbe. 16 (1), 5-6 (2014).
  2. Carruthers, M. D., Nicholson, P. A., Tracy, E. N., Munson, R. S. Jr Acinetobacter baumannii utilizes a type VI secretion system for bacterial competition. PLoS One. 8 (3), e59388(2013).
  3. Kandolo, O., et al. Acinetobacter type VI secretion system comprises a non-canonical membrane complex. PLoS Pathog. 19 (9), e1011687(2023).
  4. Boyer, F., Fichant, G., Berthod, J., Vandenbrouck, Y., Attree, I. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome-wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources. BMC Genomics. 10, 104(2009).
  5. Russell, A. B., Peterson, S. B., Mougous, J. D. Type VI secretion system effectors: poisons with a purpose. Nat Rev Microbiol. 12 (2), 137-148 (2014).
  6. Pogue, J. M., Kaye, K. S., Cohen, D. A., Marchaim, D. Appropriate antimicrobial therapy in the era of multidrug-resistant human pathogens. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 302-312 (2015).
  7. McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiol Rev. 37 (2), 130-155 (2013).
  8. Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clin Microbiol Rev. 30 (1), 409-447 (2017).
  9. de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol Syst Biol. 4, 174(2008).
  10. Weber, B. S., et al. Genetic dissection of the type VI secretion system in Acinetobacter and identification of a novel peptidoglycan hydrolase, TagX, required for its biogenesis. mBio. 7 (5), e01253-e01316 (2016).
  11. Scherzinger, E., et al. Replication of the broad host range plasmid RSF1010: requirement for three plasmid-encoded proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (3), 654-658 (1984).
  12. Weber, B. S., Ly, P. M., Irwin, J. N., Pukatzki, S., Feldman, M. F. A multidrug resistance plasmid contains the molecular switch for type VI secretion in Acinetobacter baumannii. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9442-9447 (2015).
  13. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 10 (unit 10.2A), (2012).
  14. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  15. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends Microbiol. 24 (1), 51-62 (2016).
  16. Hood, R. D., et al. A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
  17. Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and regulation of the type VI secretion system. Annu Rev Microbiol. 66, 453-472 (2012).
  18. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes Dev. 21 (5), 601-614 (2007).
  19. Repizo, G. D., et al. Differential role of the T6SS in Acinetobacter baumannii virulence. PLoS One. 10 (9), e0138265(2015).
  20. Lin, J., et al. A Pseudomonas T6SS effector recruits PQS-containing outer membrane vesicles for iron acquisition. Nat Commun. 8, 14888(2017).
  21. Bernard, C. S., Brunet, Y. R., Gueguen, E., Cascales, E. Nooks and crannies in type VI secretion regulation. J Bacteriol. 192 (15), 3850-3860 (2010).
  22. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  23. Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
  24. Meighen, E. A. Bacterial bioluminescence: organization, regulation, and application of the lux genes. Faseb J. 7 (11), 1016-1022 (1993).
  25. Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS One. 5 (8), e12441(2010).
  26. Pletzer, D., et al. The Pseudomonas aeruginosa PA14 ABC transporter NppA1A2BCD is required for uptake of peptidyl nucleoside antibiotics. J Bacteriol. 197 (13), 2217-2228 (2015).
  27. Szittner, R., Meighen, E. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium. J Biol Chem. 265 (27), 16581-16587 (1990).
  28. Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Sci Rep. 6, 37246(2016).
  29. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Type VI SecretionT6SS ActivityAcinetobacter BaumanniiFluorescence DetectionLuciferase LabelingGFP LabelingFlow CytometryBacterial Killing AssayHcp SecretionTssM Gene
Video Coming Soon

Related Articles