Metoda obrazowania przepływu krwi w neokorze za pomocą obrazowania dwufotonowego przez okno czaszkowe

Podsumowanie

Dynamikę przepływu krwi w korze mózgu można badać in vivo, obrazując fluorescencyjne barwniki dekstranowe wstrzyknięte do żyły ogonowej gryzoni za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Niniejszy film pokazuje, jak obrazować dynamikę przepływu krwi w neocortex myszy przy użyciu preparatu okna czaszkowego przykrytego szkłem.

Streszczenie

Zdolność do obrazowania naczyń krwionośnych mózgu (od dużych naczyń po kapilary) oraz rejestrowania dynamiki przepływu krwi w nienaruszonym mózgu żywych gryzoni jest potężną techniką. Dzięki zastosowaniu mikroskopii dwufotonowej in vivo przez okno czaszkowe możliwe jest obrazowanie barwników fluorescencyjnych wstrzykiwanych dożylnie. Pozwala to na obrazowanie naczyń korowych, a także na pomiar przepływu krwi. Technika ta została pierwotnie opracowana przez Davida Kleinfelda i Winfrieda Denka. Metoda ta może być wykorzystywana do badania dynamiki przepływu krwi podczas lub po niedokrwieniu mózgu, w chorobach neurodegeneracyjnych, w nowotworach mózgu lub w fizjologii zdrowego mózgu. Przykładowo, wykorzystano ją do zbadania, w jaki sposób udar powoduje zmiany kierunku przepływu krwi oraz zmiany prędkości lub strumienia erytrocytów w obrębie i wokół obszaru zawału. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak wykorzystać mikroskopię dwufotonową do obrazowania dynamiki przepływu krwi w neokorze żywych myszy przy użyciu barwników fluorescencyjnych wstrzykiwanych do żyły ogonowej.

Protokół

Iniekcje fluorescencyjnych barwników dekstranowych do żyły ogonowej

1. Aby obrazować naczynia krwionośne mózgu, zwierzęta muszą otrzymać dożylny zastrzyk z barwnika fluorescencyjnego. Stosujemy barwniki sprzężone z dekstranem, ponieważ frakcja dekstranu zapobiega przenikaniu barwnika przez barierę krew-mózg i jego wyciekaniu z naczyń krwionośnych.
2. Myszy poddaje się anestezji izofluranem (4% do indukcji, 1,5-2% podczas wstrzykiwania).
3. Ogon zostaje zdezynfekowany 70% alkoholem.
4. Za pomocą igły o rozmiarze 26 G wstrzyknięto do żyły ogonowej, w połowie długości ogona, 75-100 µl 5% v/v roztworu dekstranu z rodamyną rozpuszczonego w soli fizjologicznej.
5. Obrazowanie zwierząt można przeprowadzić niezwłocznie po wstrzyknięciu do żyły ogonowej, aż do momentu wydalenia barwnika z moczem, który w przypadku użycia barwnika z rodamyną zabarwi się na różowo po około 2 godzinach.

Obrazowanie przepływu krwi za pomocą mikroskopii dwufotonowej (całkowity czas trwania 30-60 min na sesję, w zależności od liczby obrazowanych naczyń)

1. Po wstrzyknięciu fluorescencyjnego barwnika dekstranowego mysz zostaje znieczulona izofluranem (4% do indukcji, 1-1,5% podczas obrazowania).
2. Mysz zostaje mocno przymocowana za pomocą tytanowego pręta do stolika mikroskopu, który jest wyposażony w termoregulowaną podkładkę grzewczą w celu utrzymania ciepłoty ciała zwierzęcia. W celu nawilżenia oczu stosuje się maść do oczu.
3. Szkiełko przykrywowe okna czaszkowego zostaje oczyszczone 70% alkoholem.
4. Okno ustawia się równolegle do płaszczyzny ogniskowej i centruje w polu widzenia pod obiektywem 4X.
5. Zaleca się wykonanie fotografii naczyń powierzchniowych mózgu za pomocą aparatu cyfrowego. Zdjęcie to będzie służyć jako obraz referencyjny w kolejnych sesjach obrazowania, aby umożliwić powtarzalne odnajdywanie obrazowanego obszaru z dnia na dzień.
6. Obiektyw 4X zastępuje się obiektywem imersyjnym w wodzie 40X bez przesuwania stolika. Ponownie wykonuje się cyfrowe zdjęcie pola widzenia. Współrzędne na manipulatorze stolika ustawia się na zero.
7. Jako oprogramowanie do akwizycji obrazu wykorzystujemy ScanImage. Zostało ono napisane w MatLab przez Toma Pologruto i Bernardo Sabatiniego w laboratorium Karela Svobody (Pologruto et al., 2003). Następnie włączamy pozostały sprzęt: laser, miernik mocy, fotopowielacze, wzmacniacze itp.
8. Obszar okna nadający się do obrazowania jest krótko skanowany przy niskim powiększeniu w celu znalezienia najlepszych regionów. Po ich zidentyfikowaniu wykonuje się stos obrazów (stack) wybranego regionu przy niskim powiększeniu i zapisuje jego współrzędne XY.
9. Do rejestracji dynamiki przepływu krwi w małych naczyniach lub kapilarach stosujemy skanowanie liniowe wzdłuż co najmniej 40 µm badanego naczynia. Te pojedyncze „przesunięcia” (sweeps) trwające jedną sekundę są wykonywane przy użyciu jak najmniejszej mocy lasera, a współrzędne i kąt skanowania zostają zapisane.
10. Po zakończeniu sesji obrazowania zwierzę zostaje przeniesione do ciepłej komory, w której może dojść do wybudzenia z narkozy.

Dyskusja

Dynamikę przepływu krwi w korze mózgu można badać in vivo, obrazując fluorescencyjne barwniki dekstranowe wstrzykiwane do żyły ogonowej gryzoni za pomocą mikroskopii dwufotonowej. W tym filmie zaprezentowano metodę obrazowania dynamiki przepływu krwi w nowokorze myszy z wykorzystaniem preparatu okna czaszkowego pokrytego szkłem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dekstran znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny	Odczynnik	Sigma-Aldrich	FD500S	mol wt 500,000
Dekstran znakowany izotiocyjanianem rodaminy B	Odczynnik	Sigma-Aldrich	R9379	mol wt ~70,000