Metoda obrazowania 2-fotonowego przepływu krwi w korze nowej przez okienko czaszki

Podsumowanie

Korowa dynamika przepływu krwi może być badana in vivo, obrazując fluorescencyjne barwniki dekstranowe wstrzykiwane do żyły ogonowej gryzoni za pomocą mikroskopii 2-fotonowej. Ten film pokazuje, jak obrazować dynamikę przepływu krwi w korze nowej myszy przez szklane okno czaszki.

Streszczenie

Zdolność do obrazowania naczyń mózgowych (od dużych naczyń krwionośnych do naczyń włosowatych) i rejestrowania dynamiki przepływu krwi w nienaruszonym mózgu żywych gryzoni jest potężną techniką. Za pomocą mikroskopii 2-fotonowej in vivo przez okienko czaszki możliwe jest zobrazowanie barwników fluorescencyjnych wstrzykiwanych dożylnie. Pozwala to na obrazowanie naczyń korowych, a także na uzyskanie pomiarów przepływu krwi. Technika ta została pierwotnie opracowana przez Davida Kleinfelda i Winfrieda Denka. Metoda może być stosowana do badania dynamiki przepływu krwi w trakcie lub po niedokrwieniu mózgu, w zaburzeniach neurodegeneracyjnych, w guzach mózgu lub w prawidłowej fizjologii mózgu. Na przykład, został wykorzystany do zbadania, w jaki sposób udar powoduje zmiany w kierunku przepływu krwi i zmiany prędkości lub strumienia czerwonych krwinek w zawale i wokół niego. Tutaj pokazujemy, jak używać mikroskopii 2-fotonowej do obrazowania dynamiki przepływu krwi w korze nowej żywych myszy za pomocą barwników fluorescencyjnych wstrzykiwanych do żyły ogonowej.

Protokół

Iniekcje fluorescencyjnych barwników dextrans do żył ogonowych

1. Aby zobrazować unaczynienie mózgu, zwierzętom należy wstrzyknąć dożylnie barwnik fluorescencyjny. Używamy barwników sprzężonych z dekstranem, ponieważ ugrupowanie dekstranu zapobiega przenikaniu barwnika przez barierę krwionośną mózgu i wyciekaniu z naczyń krwionośnych.
2. Myszy znieczula się izofluranem (4% do indukcji, 1,5-2% podczas wstrzyknięcia).
3. Ogon jest dezynfekowany 70% alkoholem.
4. Za pomocą igły o rozmiarze 26 wstrzykuje się 75-100 μl 5% v/v roztworu dekstranu rodaminy rozpuszczonego w soli fizjologicznej przez żyłę ogonową, w połowie długości trzonu ogona.
5. Zwierzęta mogą być obrazowane natychmiast po wstrzyknięciu żyły ogonowej, aż barwnik zostanie wydalony z moczem, który zmieni kolor na różowy w przypadku użycia barwnika rodaminy w ciągu około 2 godzin.

Obrazowanie przepływu krwi za pomocą mikroskopii dwufotonowej (całkowity czas trwania 30-60 minut na sesję, w zależności od liczby obrazowanych naczyń)

1. Po wstrzyknięciu fluorescencyjnego barwnika dekstranowego mysz jest znieczulana izofluranem (4% do indukcji, 1-1,5% do obrazowania).
2. Mysz jest mocno przymocowana za pomocą tytanowego pręta do stolika mikroskopu, który zawiera termoregulowaną poduszkę grzewczą, aby utrzymać zwierzę w cieple. Nakłada się maść do oczu, aby oczy były wilgotne.
3. Szybę nakrywkową okna czaszki czyści się 70% alkoholem.
4. Okienko jest ustawione równolegle do płaszczyzny ogniskowej i wyśrodkowane w polu widzenia pod obiektywem 4X.
5. Najlepiej jest wykonać zdjęcie naczyń na powierzchni mózgu za pomocą aparatu cyfrowego. Obraz ten zostanie wykorzystany jako obraz referencyjny w kolejnych sesjach obrazowania w celu wielokrotnego znajdowania obrazowanego obszaru z dnia na dzień.
6. Obiektyw 4X zostaje zastąpiony obiektywem 40X zanurzonym w wodzie bez przesuwania sceny. Ponownie wykonywane jest cyfrowe zdjęcie pola widzenia. Współrzędne manipulatora stolika są ustawione na zero.
7. Używamy ScanImage jako oprogramowania do akwizycji obrazów. Zostało to napisane w MatLab przez Toma Pologruto i Bernardo Sabatiniego w laboratorium Karela Svobody'ego (Pologruto et al., 2003). Następnie włączamy wszystkie inne urządzenia: laser, miernik mocy, lampy powielaczy zdjęć, wzmacniacze itp.
8. Obszar okna nadający się do zobrazowania jest krótko skanowany w małym powiększeniu, aby znaleźć najlepsze obszary. Po ich zidentyfikowaniu wykonywany jest stos wybranego obszaru do sfotografowania w małym powiększeniu, a jego współrzędne XY są opisywane.
9. Aby zarejestrować dynamikę przepływu krwi w małych naczyniach lub naczyniach włosowatych, używamy skanów liniowych wzdłuż co najmniej 40 μm naczynia będącego przedmiotem zainteresowania. Te pojedyncze "przemiatanie" trwające jedną sekundę są wykonywane przy użyciu jak najmniejszej mocy lasera, a współrzędne i kąt skanowania są zapisywane.
10. Po zakończeniu sesji obrazowania zwierzę jest przenoszone do ciepłej komory, gdzie może dojść do siebie po znieczuleniu.

Dyskusja

Dynamikę przepływu krwi w korze mózgowej można badać in vivo, obrazując fluorescencyjne barwniki dekstranowe wstrzykiwane do żyły ogonowej gryzoni za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Ten film pokazał metodę obrazowania dynamiki przepływu krwi w korze nowej myszy przez szklane okno czaszkowe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik izotiocyjanian-dekstran fluoresceiny		Sigma-Aldrich	FD500S	mol 500 000
Rodamina B izotiocyjanian-dekstran	Odczynnik	Sigma-Aldrich	R9379	mol wt ~ 70 000